用于治疗视网膜疾病的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于治疗视网膜疾病的试剂盒。本发明所提供的用于治疗视网膜疾病试剂盒及药物，其特征在于：有效成分为可过表达RNA结合蛋白Lin28B的腺病毒。采用本发明所提供的试剂盒治疗视网膜疾病时，不需要多次注射，经视网膜下腔注射可以最大化地激活视网膜内源性干细胞，并促进内源性干细胞分化为视网膜神经元。
【专利说明】用于治疗视网膜疾病的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学分子生物学领域，尤其涉及用于治疗视网膜疾病的试剂盒。
【背景技术】
[0002]任何影响视网膜正常功能所造成的眼部疾病被称为视网膜疾病，如视网膜色素变性(RP)、其它遗传性视网膜变性、糖尿病视网膜病(DR)、视网膜血管闭塞、视网膜脱离、视网膜撕裂、年龄相关性黄斑变性(AMD)等。这些疾病都可以影响视觉信息的处理，并明显影响到病人的视功能，严重的则可以导致视盲。其中，湿性和干性年龄相关性黄斑变性是造成发达国家老年人视盲的首要原因，是由视网膜色素上皮细胞(RPE)功能失调引起。此外，RP代表的遗传性视网膜变性，以光感受器细胞和RPE的破坏为主要病变特点、视盲为结局。与中枢神经系统疾病类似，由视网膜或视神经变性疾病引起的视盲，尚无有效治疗手段。然而，近年来伴随干细胞研究的兴起，干细胞移植使视网膜再生及功能重建已成为研究热点。这一策略代表了全新的治疗选择，为盲人重见光明带来了希望，具有广泛的应用前景。干细胞移植治疗分别包括了外源性干细胞移植治疗与内源性干细胞激活治疗两种策略。
[0003]但是，在我们前期分别利用视网膜色素上皮细胞(RPE)、视网膜前体干细胞(RPC)的移植研究中，我们首先发现外源性的干细胞在进入新的微环境(niche)中缺乏维持其自我更新的能力，从而在数量上难以达到修复病损视网膜的目的；其次，外源性干细胞的来源、免疫排斥、迁移分化及与宿主细胞整合的不确定性等一直是外源性干细胞治疗中难以解决的问题。这些因素都极大地制约了外源性干细胞移植的临床治疗应用。
[0004]激活内源性干细 胞并使之定向分化是视网膜疾病治疗的发展方向。1985年，学者Sarthy发现哺乳动物视网膜损伤后MUller细胞重新进入细胞周期，并且体外也能存活。2003年，Fischer&Reh用NMDA (N-甲基-D-天冬氨酸受体)特异性损伤视网膜内核层细胞，随后内核层有大量细胞增殖，这些增殖的细胞表达MUller细胞特异性标记物谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)及视网膜祖细胞标记,如bHLH转录因子CASH-1,同源转录因子PAX6和CHX10，表明这些具有祖细胞特性的细胞源于MUller细胞，意即在哺乳动物视网膜的MUller细胞中确实包含了一定数量的干细胞。但是在哺乳动物视网膜中，Milller细胞在正常情况下无法重新进入细胞周期开始逆分化，只有在一些急性损伤的情况下，如:应用NMDA造成小鼠视网膜神经节细胞和无长突细胞死亡、应用MNU造成大鼠视网膜光感受器细胞死亡或是应用激光造成小鼠视网膜急性损伤后，少数视网膜MUller细胞可重新进入细胞周期并逆分化为视网膜前体细胞。此外，我们也对慢性视网膜色素变性(RCS大鼠)病变过程中MUller细胞的逆分化进行了详尽的研究并发现:尽管内源性干细胞可以被激活、逆分化，但是这个过程是一个瞬时即逝的，同样，病变、缺损部位很快被胶质瘢痕所填补。理论上，干/祖细胞可以源源不断的增生，并且在正确信号的刺激下，干/祖细胞可以分化为各种类型的细胞；然而，实际上这种自发的再生根本不足以修复受损视网膜的结构与功能，而是以胶质瘢痕为结局。
[0005]因此，如果希望将内源性干/祖细胞活化的特性应用于临床，必须增强内源性干细胞的活化。研究者发现，多种生长因子或细胞因子，如胰岛素(insulin)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)，胶质源性生长因子(⑶NF)，或脑源性神经营养因子(BDNF)能刺激Milller细胞重新进入分裂周期和去分化，其中部分细胞分化为无长突细胞，表达无长突细胞特异性标志物钙视网膜蛋白(Calretinin)，NeuN, Proxl和GAD67-GFP等。在我们的前期实验中，我们将BDNF注射进入视网膜下腔或将BDNF与视网膜干细胞联合注入视网膜下腔，结果显示:BDNF不仅可以延长对内源性干细胞的激活时间，而且延长了供体干细胞在宿主的存活时间。
[0006]但是，这类方法的缺点在于:外源性营养性因子的作用是短暂的，若反复视网膜下腔或玻璃体腔内注射，易造成眼内感染，严重的如视网膜感染、脱离等并发症，且挽救的光感受器是否还有功能，还是个问题。
[0007]MircoRNA是近来发现并已经成为研究热点的一类重要的非编码RNA，它参与了发育、寿命、细胞增殖、分化、信号通路、凋亡、新陈代谢和应激反应等多种基础生物进程，因此在干细胞的更新分化、体细胞性状与数量的维持、甚至肿瘤细胞的恶性增生等生物学过程中都具有重要的调控作用。MircoRNA通过与靶位点结合，快速有效地降解靶基因mRNA或抑制靶蛋白的翻译。为了明确有效的内源性干细胞激活调控因子，我们利用MircoRNA芯片，分析并比较了视网膜色素变性(RCS)大鼠与其对照大鼠间的差异MircoRNA表达。基因芯片筛查结果发现，出生后15天或30天的RCS大鼠变性早期(P15，P30)其Let-7Mirc0RNA家族分子Let-7C、Let-7e和Let_7i较对照组大鼠表达增加，特别是Let_7e和Let_7i分别增加了 4和12倍。我们的原位杂交也证实了这一结果。提示:Let-7e和Let_7i的高表达可能阻碍了视网膜变性早期MUller细胞的去分化和增殖。
[0008]Let-7家族是一种重要的miRNA调控子。其基因组有多种序列。人类有13种前体序列，最终形成10种成熟序列。各研究已证实Let-7家族中各成员在不同的细胞有不同的功能。虽然其具体功能不详，但它们能调控细胞周期进程和细胞增殖。受到调控的基因包括细胞命运决定基因、致癌基因和细胞周期调控子。Let-7基因敲除或低表达能刺激细胞周期、DNA合成和细胞分裂。斑马鱼视网膜损伤后，Let-7a和Let_7f miRNA表达降低，Milller细胞去分化为祖细胞，促进视网膜再生和修复。此外，Let-7家族是高度失调的miRNA。RNA结合蛋白Lin28是Let-7家族的上游分子,通过结合到Let_7miRNA前体分子结构域末端，从而阻碍Let-7miRNA的转录并抑制其活性。Lin28有两个同源亚型，序列和结构高度保守，对Let-7家族都能选择性抑制。
【发明内容】
[0009]在本发明中发现，与对照大鼠相比，RCS大鼠Lin28A的表达不仅没有降低，反而略有升高；相反，Lin28B的表达仅在RCS大鼠刚睁眼时(P15)有升高，此后明显降低。RT-PCR证实，Lin28B表达较对照组增加，随后明显降低。这提示:在哺乳动物视网膜内Lin28B (而不是Lin28A)对Let-7家族的Let7e和Let7i具有负性调控作用。
[0010]根据以上发现，本发明提供一种用于治疗视网膜疾病的试剂盒，其特征在于:包括可过表达RNA结合蛋白Lin28B的腺病毒。
[0011]所述腺病毒的制备方法制备过程如下:
[0012] (I)构建穿梭质粒 pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG ；[0013](2)将穿梭质粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG与腺病毒基因组质粒pBHGlox Δ El, 3Cre共转染HEK293细胞，包装产生所述腺病毒。
[0014]所述试剂盒还包含用于悬浮所述腺病毒的缓冲液，所述缓冲液的配方为:30g蔗糖，8gNaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4, IL ddH20, PH 值为 7.4。
[0015]本发明的另一目的是提供一种治疗视网膜疾病的药物，其有效成分为:可过表达RNA结合蛋白Lin28B的腺病毒。
[0016]所述腺病毒为:将穿梭质粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG与腺病毒基因组质粒pBHGlox Δ El, 3Cre共转染HEK293细胞，包装产生所得。
[0017]所述药物为悬浮剂，悬浮剂为所述腺病毒悬浮于缓冲液中，所述缓冲液的配方为:30g 蔗糖，8g NaCl,0.2g KCl，1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4, IL ddH20, PH 值为 7.4。
[0018]为了避免多种生长因子或细胞因子短暂的作用以及由于反复玻璃体腔内注射造成视网膜感染、脱离等并发症，本发明构建了 Lin28B过表达腺病毒，经视网膜下腔注射可以最大化地激活视网膜内源性干细胞，不需要多次注射。本发明优势是:
[0019](I)因为短暂关闭或者开放信号通路传导是调控MUller细胞增殖去分化的一种新的重要方式。当视网膜下腔注射Adeno/Lin28B腺病毒后，可短暂地开放Lin28B所控制的信号传导通路。
[0020](2)视网膜再生需要MUller细胞去分化后再横向分化。与腺相关病毒AAV或慢病毒不同，腺病毒不整合到宿主基因组，不会长期持续表达，因此感染的MUller细胞短暂去分化后可以随即转分 化为视网膜神经元，而不是维持在干细胞状态。如果MUller细胞始终处于干细胞/祖细胞状态，则会引起功能性Kir通道下调，膜去极化，碳酸酐酶和CRALBP下调，GS下调引起谷氨酸清除障碍，破坏胶质-神经元相互作用，以及酸碱、离子、渗透压平衡，导致细胞水肿，谷氨酸中毒，神经元过度兴奋，最终引起神经元变性。
[0021 ] (3 )体外研究发现Lin28A和Lin28B持续过表达作用类似于原癌基因，可引起细胞恶变。而短暂的Lin28B表达可以避免细胞恶变。
[0022](4)腺病毒载体已经成为各类细胞短期基因表达的重要工具。它的优势还包括制备容易，滴度高，在休眠和活化细胞均能高效转染，短期基因表达水平高，而不整合到基因组引起突变。
[0023]在本发明的研究中，我们以Ad/GFP作为对照、分别以培养的MU11 er细胞(体外实验)和RCS大鼠为模型(体内实验)，观察了 Lin28B对MUller细胞的作用。通过一系列体内、外实验证实我们的假说——RNA结合蛋白Lin28B可以最大化地激活Milller细胞增生、逆分化反应并促进逆分化的MUller横向分化为视网膜神经元。
[0024]术语界定:
[0025]Mo1:本领域中moi有多种理解，本发明中采用的术语moi理解为:感染复数，它是一个比值，含义是感染时病毒颗粒与细胞数目的比值)
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为体外MUller细胞感染Ad/Lin28B后细胞的增殖情况。
[0027]图2为体外MUller细胞感染Ad/Lin28B后细胞自我更新能力分析结果。
[0028]图3为体外MUller细胞感染Ad/Lin28B后的流式细胞周期分析结果。[0029]图4为体外MUller细胞感染Ad/Lin28B后干细胞标记的表达情况。
[0030]图5为体内MUller细胞感染Ad/Lin28B后Let7e的表达情况。
[0031]其中ONL (视网膜外核层，outer nuclear layer), OPL (视网膜外网层，outerplexiform layer), INL (视网膜内核层，inner nuclear layer), IPL (视网膜内网层，innerplexiform layer)和 GCL (视网膜节细胞层，ganglion cell layer)
[0032]图6为体内MUller细胞感染Ad/Lin28B后Let7i的表达情况。
[0033]图7为体内MUller细胞感染Ad/Lin28B后BrdU阳性细胞数量分析结果。
[0034]图8为体内MUller细胞感染Ad/Lin28B后干细胞标记PAX6的表达情况。
[0035]图9为体内MUller细胞感染Ad/Lin28B后干细胞标记S0X2的表达情况。
[0036]图10为体内MUller细胞感染Ad/Lin28B后干细胞标记Nestin的表达情况。
[0037]图11为体内MUller细胞感染Ad/Lin28B后干细胞标记CHX10的表达情况。
[0038]图12 为体内 MUller 细胞感染 Ad/Lin28B 后 S0X2, Nestin, CHX10, BrdU, PAX6 阳性细胞数量的定量分析结果。
[0039]图13为体内MUller细胞感染Ad/Lin28B后锥杆同源框蛋白(Crx)的表达情况。
[0040]图14为体内MUller细胞感染Ad/Lin28B后视蛋白(opsin)的表达情况。
[0041]图15为体内MUller细胞感染Ad/Lin28B后视网膜紫质(rhodopsin)的表达情况。
[0042]图16为体内MUller细胞感染Ad/Lin28B后感光细胞特异性结合蛋白(recoverin)的表达情况。
[0043]图17为体内MUller细胞感染Ad/Lin28B后蛋白激酶Ca (PKCa)的表达情况。
[0044]图18为体内MUller细胞感染Ad/Lin28B后钙结合蛋白(calbindin)的表达情况。
[0045]图19为体内MUller细胞感染Ad/Lin28B后GFAP的表达情况。
[0046]图20为体内注射Ad/Lin28B后RCS大鼠视功能的改善情况。
[0047]其中Lin28B意为此眼视网膜下腔注射腺病毒Adeno/Lin28B, Control意为此眼视网膜下腔注射对照腺病毒Adeno/GFP。Lin28B_2w，Lin28B_4w和Lin28B_6w分别为感染Adeno/Lin28B 后的 2 周，4 周和 6 周。Control_2w,Control_4w 和 Control_6w 分别为感染对照腺病毒Adeno/GFP后的2周,4周和6周。
[0048]图21.腺病毒穿梭载体pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG的制备流程
[0049]图22pAV-MCMV_GFP-3FLAG 载体线性化图谱
[0050]图23PCR扩增目的片段凝胶电泳图谱
[0051]DL2, 000DNA Marker:2kb, 1Kb, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp
[0052]图24pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG 的菌落阳性鉴定图
[0053]其中:I.阴性对照(H2O )，
[0054]2.阴性对照(空载体)，
[0055]3.DL2, 000DNA Marker:2kb, 1Kb, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp4_ll 挑取的 8 个转化子。
【具体实施方式】
[0056]实施例1、过表达RNA结合蛋白Lin28B的重组腺病毒的制备制备
[0057] 步骤(1)制备Lin28B编码基因[0058]人Lin28B 编码基因序列:(GenBank:DQ127228.1)
[0059]大鼠Lin28B 编码基因序列:(NCBI Reference Sequence:ΧΜ_001069344.2)
[0060]步骤(2)制备腺病毒穿梭载体pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG
[0061]包括以下主要步骤:
[0062]以化学合成的LIN28B基因为模板PCR扩增目的基因。
[0063]表达载体酶切后进行胶回收载体片段。
[0064]目的基因与载体片段同源重组后转化E.coli感受态细胞。
[0065]用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序，测序验证无误的为腺病毒穿梭载体pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG。克隆进行质粒抽提。
[0066]实验流程如图21，详述如下:
[0067]实验材料描述:
[0068]试剂
[0069]
【权利要求】
1.一种用于治疗视网膜疾病的试剂盒，其特征在于:包括可过表达RNA结合蛋白Lin28B的腺病毒。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述腺病毒由以下制备方法制备而得: (1)构建穿梭质粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG ； (2)将穿梭质粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG 与腺病毒基因组质粒 pBHGlox Δ El, 3Cre共转染HEK293细胞，包装产生而得。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，还包含用于悬浮所述腺病毒的缓冲液，所述缓冲液的配方为:30g 蔗糖，8g NaCl, 0.2g KCl，1.44g Na2HP04,0.24g KH2P04, IL ddH20, PH 值为.7.4。
4.一种治疗视网膜疾病的药物，其有效成分为:可过表达RNA结合蛋白Lin28B的腺病毒。
5.根据权利要求4所述的药物，所述腺病毒为:将穿梭质粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG 与腺病毒基因组质粒 pBHG 1x Λ El, 3Cre 共转染 HEK293 细胞，包装产生所得。
6.根据权利要求4或5所述的药物，所述药物为悬浮剂，悬浮剂为所述腺病毒悬浮于缓冲液中，所述缓冲液的配方为:30g 蔗糖，8g NaCl,0.2g KCl，1.44g Na2HP04,0.24g KH2P04，IL ddH20, PH 值为 7.4。
【文档编号】A61K9/10GK104017777SQ201410007027
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年1月7日 优先权日:2014年1月7日
【发明者】李瑶琛, 阴正勤 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院