Hip-55蛋白在开发抑制肿瘤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种HIP-55蛋白的新用途。本发明提供的重组载体，为将编码干扰HIP-55蛋白表达siRNA的DNA分子插入表达载体，得到重组载体；所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。还提供了HIP-55蛋白或含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体在制备具有如下1）和/或2）功能的产品中的应用：1）促进肿瘤细胞迁移；2）促进肿瘤细胞侵袭；所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，通过在肺癌细胞中过表达该蛋白的基因，则促进肿瘤形成、促进肺癌细胞迁移和肺癌细胞侵袭；因此，HIP-55为临床诊断、治疗及新药开发提了供新的靶点，可以用于在筛选、开发和/或设计预防和/或治疗肿瘤产品。
【专利说明】HIP-55蛋白在开发抑制肿瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种HIP-55蛋白在开发抑制肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002]HIP-55(hematopoietic progenitor kinase I[HPK1]-1nteracting proteinof55kDa ;也称为 drebrin-like protein DBNL>mAbpl 或 SH3P7)是一个包含多功能域的蛋白质。其结构主要包含着N端的F-actin蛋白结合结构域和C端SH3结构域。HIP-55参与突触发生、受体内吞、骨架重排及信号转导。目前对HIP-55功能了解较少，已知HIP-55通过调节T细胞受体内吞、细胞因子释放和B细胞受体呈递等在免疫系统起着重要作用。最近研究表明HIP-55通过与N-WASP和Arp2/3相互作用在神经系统中调节骨架重排。但其在肿瘤中的作用均尚无研究。
【发明内容】
[0003]本发明的一个目的是提供一种重组载体。
[0004]本发明提供的重组载体，为将编码干扰HIP-55蛋白表达siRNA的DNA分子插入表达载体，得到重组载体；所述HIP -55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0005]上述重组载体中，所述编码干扰HIP-55蛋白表达siRNA的DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列5。在本发明的实施例中，所述表达载体为pSilenCer5.1 ;重组载体为pSilencer5.1-siRNA,为将编码 siRNA 的 DNA 分子(序列 5)插入 pSilencer5.1 载体的 BamHI和HindIII酶切位点间，得到表达序列3所示的HIP-55siRNA的载体。
[0006]上述的重组载体在制备具有如下1)-7)中至少一种功能的产品中的应用也是本发明保护的范围:
[0007]I)抑制细胞增殖；
[0008]2)促进细胞凋亡；
[0009]3)抑制肿瘤细胞迁移；
[0010]4)抑制肿瘤细胞侵袭；
[0011]5)抑制肿瘤细胞克隆形成；
[0012]6)抑制肿瘤形成；
[0013]7)预防和/或治疗肿瘤。
[0014]上述应用中，所述产品为药物。
[0015]上述应用中,所述肿瘤为肺癌；所述肿瘤细胞为肿瘤细胞。
[0016]上述应用中，所述肿瘤细胞为肺癌细胞；所述肺癌细胞具体为人非小细胞肺癌细胞。
[0017]本发明的另一个目的是提供HIP-55蛋白或其编码基因或含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体的应用。[0018]本发明提供的HIP-55蛋白或其编码基因或含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体在制备具有如下I)和/或2)功能的产品中的应用:
[0019]I)促进肿瘤细胞迁移；
[0020]2)促进肿瘤细胞侵袭；
[0021]所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0022]上述应用中，所述HIP-55蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I。
[0023]上述应用中，所述产品为药物。
[0024]上述应用中，所述肿瘤为肺癌；
[0025]所述肿瘤细胞为肿瘤细胞；所述肿瘤细胞为肺癌细胞；在本发明的实施例中，所述肺癌细胞为人非小细胞肺癌细胞，具体为人非小细胞肺癌细胞A549。
[0026]HIP-55蛋白在筛选、开发和/或设计预防和/或治疗肿瘤产品中的应用也是本发明保护的范围；所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0027]本发明的实验证明，本发明发现HIP-55在临床肺癌病人组织样本中明显高表达，进一步研究表明HIP-55的功能:通过在肺癌细胞中过表达该蛋白的基因，可以促进肿瘤形成、促进肺癌细胞迁移和肺癌细胞侵袭；通过RNA干扰沉默HIP-55蛋白，可以明显抑制肿瘤形成、促进凋亡、抑制增殖、细胞克隆形成、细胞迁移和/或细胞侵袭，可用来制备预防和/或治疗肿瘤产品。因此 ，HIP-55为临床诊断、治疗及新药开发提了供新的靶点，可以用于在筛选、开发和/或设计预防和/或治疗肿瘤产品。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为RNA干扰HIP-55的细胞中蛋白表达
[0029]图2为过表达HIP-55的细胞中蛋白表达
[0030]图3为RNA干扰HIP-55的细胞增殖
[0031]图4为过表达HIP-55的细胞增殖
[0032]图5为HIP-55对肺癌细胞A549凋亡的影响
[0033]图6为HIP-55对细胞凋亡标记物的影响
[0034]图7为HIP-55对细胞克隆形成能力的影响
[0035]图8为划痕试验检测HIP-55对细胞迁移的影响
[0036]图9为Transwell检测HIP-55对细胞迁移的影响
[0037]图10为HIP-55对细胞侵袭影响
[0038]图11为HIP-55对成瘤的影响
[0039]图12为HIP-55在肺癌患者组织样本中高表达
【具体实施方式】
[0040]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0041]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0042]下述实施例中定量实验均重复三次，结果取平均值。
[0043]下述实施例中Ant1-HIP-55 抗体购自 BD Bioscience (San Diego, CA)。
[0044]下述实施例中人非小细胞肺癌A549(美国ATCC，产品目录号CCL-185?)在含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的高糖DMEM的培养液中培养，并放置在37°C、5%浓度的二氧化碳培养箱中。A549细胞经过消化传代，取对数生长期细胞待用。
[0045]人HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，编码该蛋白的基因的核苷酸序列为序列表中的序列I。
[0046]实施例1、过表达HIP-55的A549细胞和敲减HIP-55的A549细胞的构建
[0047]一、HIP_55siRNA 的获得
[0048]针对人HIP-55蛋白编码基因设计并合成如下siRNA序列:
[0049]HIP-55 siRNA,其核苷酸序列为 5’-GAUCCG CAGUGAACGUAGAGAAUUGUUCAAGAGACAAUUCUCUACGUUCACUGUU UUUUGGAAA-3，(序列 3)；
[0050]对照Scramble siRNA,其核昔酸序列为 5’ -GAUCCGCACUACCGGUUGUAUAGGUGUUCAAGAGA CACCUAUACAAAGGUAGUG UUUUGGAAA-3，(序列 4)。
[0051]二、过表达HIP-55的重组载体和RNA干扰HIP-55的重组载体的构建
[0052]1、过表达 HIP-55 的重组载体 pLenti6/V5-HIP_55 构建
[0053]以上述序列表中序列I所示的HIP-55的基因为模板，用
[0054]Forward:’ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGCGGCGAACCTGAGCC-3，和
[0055]Reverse: 5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTCAATGAGCTCCACGTAGT-3 ’引物进行扩增，得到1356bp的PCR产物。
[0056]将1356bp的PCR产物与pD0NR221载体(购自Invitrogen，产品目录号为12536017)进行 BP 反应，得到重组载体 pD0NR221_HIP_55，再将 pD0NR221_HIP_55 与pLenti6/V5-DEST (购自Invitrogen，产品目录号为V49610X)进行LR反应，得到重组载体pLenti6/V5-HIP_55。经过测序,该重组载体pLenti6/V5-HIP_55为将序列表中的序列I所示的DNA分子插入表达载体的pLenti6/V5-DEST间得到的载体。
[0057]2、RNA 干扰 HIP-55 的重组载体 pSilencer5.Ι-siRNA 的构建
[0058]合成编码HIP-55 siRNA的DNA分子，其核苷酸序列为；5’-GATCCGCAGTGAACGTAGAGAATTG TTCAAGAGA CAATTCTCTACGTTCACTGTT TTTTGGAAA-3’(序列5);由两条单链DNA退火形成，其中一条单链DNA的核苷酸序列为F:5’-GATCCGCAGTGAACGTAGAGAATTG TTCAAGAGA CAATTCTCTACGTTCACTGTT TTTTGGAAA-3’另一条单链 DNA 的核苷酸序列为 R:5’-AGCTITTCCAAAA AACAGTGAACGTAGAGAATTGTCTCTTGAACAATTCTCTACGTTCACTG CG-3’ 。
[0059]RNA 干扰载体 pSilencer5.Ι-siRNA 为将编码 HIP-55 siRNA 的 DNA 分子(序列 5)插入pSilencer5.1 (Invitrogen, AM5782)载体的BamHI和HindIII酶切位点间，得到表达序列3所示的HIP-55 siRNA的载体。
[0060]该DNA分子由正向DNA片段、间隔片段和反向DNA片段组成；其中正向DNA片段为序列表中序列5自5’末端第7-25位核苷酸、间隔片段为序列表中序列5自5’末端第26-34位核苷酸和反向DNA片段为序列表中序列5自5’末端第35-53位核苷酸所不的DNA分子。
[0061]对照RNA 干扰载体 pSilencer5.1-Scramble:为将编码 Scramble siRNA 的 DNA 分子插入pSilencer5.1载体的BamHI和HindIII位点间，得到表达序列4所示的ScramblesiRNA的载体。
[0062]上述编码Scramble siRNA的DNA分子，其核苷酸序列为5’ -GATCCGCACTACCGGTTGTATAGGTG TTCAAGAGA CACCTATACAAAGGTAGTG TTTTGGAAA-3’(序列
6);该DNA分子由正向DNA片段、间隔片段和反向DNA片段组成；其中正向DNA片段为序列表中序列6自5’末端第7-25位核苷酸、间隔片段为序列表中序列6自5’末端第26-34位核苷酸和反向DNA片段为序列表中序列6自5’末端第35-53位核苷酸。
[0063]三、过表达HIP-55的A549细胞和RNA干扰HIP-55的A549细胞的构建
[0064]1、过表达HIP-55的A549细胞的构建
[0065]将上述二得到的重组载体pLenti6/V5-HIP-55感染A549细胞中，得到A549/pLenti6/V5-HIP-550
[0066]2、对照过表达HIP-55的A549细胞的构建
[0067]将表达载体pLenti6/V5-DEST 感染 A549 细胞中，得到 A549/pLenti6/V5。
[0068]3、RNA干扰HIP-55的A549细胞的构建
[0069]将上述二得到的RNA干扰载体pSilencer5.Ι-siRNA脂质体法转染A549细胞中，嘌呤霉素(puromycin, 1.25 μ g/ml)筛选病毒感染阳性细胞克隆，得到A549/pSilencer5.1-siRNA。
[0070]4、对照RNA干扰A549细胞的构建
[0071]将上述二得到的对照RNA干扰载体pSilencer5.1-Scramble脂质体法转染A549细胞中，嘌呤霉素(puromycin，1.25 μ g/ml)筛选病毒感染阳性细胞克隆，得到A549/pSilencer5.l—Scramble。
[0072]4、western blot 鉴定
[0073]在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养A549/pLenti6/V5对照细胞(Con )、A549/pLenti6/V5-HIP-55 细胞(HIP-55)、A549/pSilencer5.Ι-siRNA 细胞(HIP-55KD)、A549/pSilencer5.1-Scramble 细胞(scr)和 A549 细胞(parental/par) 36 小时；离心收集上清液；用 western blot 检测(Ant1-HIP-55, BD Biosciences,产品目录号:612615)。
[0074]结果如图1和图2所示，图1为RNA干扰HIP-55的细胞中蛋白表达，图2为过表达HIP-55的细胞中蛋白表达；
[0075]图1 中 Αδ49 细胞(parental/par)和 A549/pSilencer5.1-Scramble 细胞(scr)中均有目的蛋白HIP-55的表达，而与A549/pSilencer5.1-Scramble细胞(scr)相比，RNA干扰 HIP-55 的细胞 A549/pSilencer5.Ι-siRNA 细胞(HIP-55KD)中 HIP-55 蛋白的表达量明显减低，且敲减效率在90%以上。
[0076]A549/pSilencer5.1-Scramble 细胞(scr)结果与 A549 细胞(parental/par)无显
著差异。
[0077]图2 中 A549/pLenti6/V5-HIP-55 细胞(HIP-55)和 A549/pLenti6/V5 对照细胞(Con)相比，A549/pLenti6/V5-HIP-55细胞(HIP-55)中的HIP-55蛋白表达量明显高于A549/pLenti6/V5 对照细胞(Con)。
[0078]采用同样的方法将空载体pSilencer5.1转染A549细胞，得到转空载体细胞A549/pSilencer5.1。
[0079]实施例2、HIP-55的功能研究
[0080]一、HIP-55对A549细胞增殖和凋亡影响
[0081]1、HIP-55对肺癌A549细胞增殖的影响[0082]采用磺酰罗丹明(SRB)显色法检测:
[0083]将A549 细胞(parental/par)、A549/pLenti6/V5 (con)细胞、由实施例1 得到的 A549/pLenti6/V5-HIP-55 细胞(HIP-55)、A549/pSilencer5.Ι-siRNA 细胞(HIP-55KD)、A549/pSilencer5.1-ScrambIe细胞(Scr)培养结束后，取出培养板，每孔加入50% (质量/体积)的三氯乙酸(TCA) 50 μ L固定细胞，TCA的终浓度为10%，轻柔地加在每孔液面上，然后在4°C冰箱中放置lh。培养板各孔用去离子水洗涤5遍，以去除TCA。在空气中干燥后，每孔加0.4%的SRB100LL，室温下放置10~30min，弃去各孔内液体后用1%乙酸洗涤5遍，去除未结合的染料，空气中干燥后用pH为10.5、10mmol/L unbuffered Tris base(三轻甲基胺基甲烷)溶解，在平板振荡器上振荡5min，在酶联免疫检测仪于波长为490nm测定OD值。以 A549/pSilencer5.1 细胞和 A549/pLenti6/V5 (con)细胞为对照。
[0084]结果如图3和图4所示，图中的数值是以第一天OD值为I，其余为其比值；
[0085]图3为RNA干扰HIP-55的细胞增殖，其中A549细胞(parental/par)细胞在培养1、2、3、4、5、6天的细胞增殖比例分别为 1、1.402,2.218,2.569,3.661,5.703 ；
[0086]A549/pSilencer5.l-Scramble 细胞(Scr)细胞在培养 1、2、3、4、5、6 天的细胞增殖比例分别为 1、1.467,2.560,2.688,4.197,7.140 ；
[0087]A549/pSilencer5.1-siRNA 细胞(HIP-55KD)在培养 1、2、3、4、5、6 天的细胞增殖比例分别为 1、1.052、1.579、1.983,2.705,3.05 ；
[0088]图4为过表达HIP-55的细胞增殖，其中，A549/pLenti6/V5 (con)细胞在培养1、
2、3、4、5、6天的细胞增殖比例分别为 1、1.276、1.688,3.339,3.845,4.882 ；
[0089]A549/pLenti6/V5-HIP-55 细胞(HIP-55)在培养 1、2、3、4、5、6 天的细胞增殖比例分别为 1、1.640,2.716,5.513,6.957,9.402 ；
[0090]A549细胞和A549/pSilencer5.1结果无显著差异。
[0091]结果表明，与A549 细胞(parental, par)及 A549/pSilencer5.1-ScrambIe 细胞(Scr)相比，敲减 HIP-55 后细胞 A549/pSilencer5.1-siRNA (HIP-55KD)的增殖明显减弱；与之相反，与 A549/pLenti6/V5(con)相比，过表达 HIP-55 后细胞 A549/pLenti6/V5-HIP-55细胞(HIP-55)的增殖明显增强。
[0092]因此敲减HIP-55抑制细胞增殖；过表达HIP-55可提高细胞增殖。
[0093]2、HIP-55对肺癌细胞A549凋亡的影响
[0094]将由实施例1 得到的 A549/pSilencer5.Ι-siRNA 细胞(HIP-55KD)、A549/pSilencer5.1-Scramble细胞(Scr)接种于12孔板,完全培养基中培养24h,加入肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor- α , TNF- α ;BD 公司，货号:354066)诱导凋亡(lOOng/ml)，在不同时间收集细胞并用PBS洗三遍，7-AAD和Annexin5_PE染色，混匀，室温避光反应15min,流式细胞仪(Guava flow cytometer systems, Millipore)检测凋亡率。
[0095]结果如图5所示，
[0096]A549/pSilencer5.l-Scramble 细胞(Scr)在 0、6、9h 的凋亡率分别为 7.2%、11.3%、29.3% ；
[0097]A549/pSilencer5.1-siRNA (HIP-55KD)在 0、6、9h 的凋亡率分别为 12.8%、30%、54.8% ；
[0098]应用western blot检测细胞凋亡标记物Cleaved Caspase-3 (出售公司cel I signaling ;产品目录号 #9664)和 Parp(出售公司 cel I signaling ;产品目录号 #9532),结果如图6所示，在A549细胞中敲减HIP-55后，剪切形式的caspase 3和Parp明显增加，表明细胞凋亡明显增加，而在A549细胞过表达HIP-55后则完全逆转这一生物学过程。
[0099]上述结果表明，在A549细胞中敲减HIP-55后，可以促进细胞凋亡，提高凋亡率。
[0100]二、HIP-55对细胞克隆形成能力的影响
[0101]采用软琼脂克隆形成分析，以1%的琼脂糖凝胶作为储备胶，冷却至50°C时，与培养基按比例混合配制0.6%的底层胶铺于培养皿中；再冷却至42°C时，按比例与细胞悬液混合，0.2%的上层琼脂.待上层琼脂凝固后在其表面覆盖一层完全培养基以防止琼脂表面干燥，然后放入细胞培养箱中培养，每日镜下观察，并补充培养基，2周后光镜下细胞克隆群落集落形成。
[0102]上述细胞悬液为将细胞在培养基中培养2周时间得到的悬浮液。
[0103]上述细胞为A549 细胞(parental/par)、A549/pSilencer5.Ι-siRNA 细胞(HIP-55KD)、A549/pSilencer5.1-Scramble 细胞(Scr)。以 A549/pSilencer5.1 为对照。
[0104]结果如图7 (其中左图为拍照结果，右图为克隆数统计结果)所示，
[0105]A549 细胞(parental/par)的细胞克隆数为 76.6 ；
[0106]A549/pSilencer5.l-Scramble 细胞(Scr)的细胞克隆数为 105
[0107]A549/pSilencer5.1-siRNA 细胞(HIP-55KD)的细胞克隆数为 38 ；
[0108]A549 细胞(parental/par)和 A549/pSilencer5.1 结果无显著差异。
[0109]上述结果表明，在A549细胞中敲减HIP-55后，与A549细胞(parental，par)及A549/pSilencer5.1-Scramble细胞(Scr)相比,细胞克隆形成能力明显降低。
[0110]三、HIP-55对细胞迁移影响
[0111]I)划痕试验
[0112]6孔板内铺入细胞，待细胞融合后，用200 μ L无菌移液枪头划痕，PBS小心洗去漂浮细胞重复3次，培养24h后显微镜下观察。
[0113]上述细胞为A549 细胞(parental/par)、A549/pSilencer5.Ι-siRNA 细胞(HIP-55KD)、A549/pSilencer5.1-Scramble 细胞(Scr)。以 A549/pSilencer5.1 为对照。
[0114]结果如图8所示，可以看出，在A549细胞中敲减HIP-55后，与A549细胞(parental/par)及siRNA无关序列对照细胞(scramble, scr)相比，细胞迁移能力明显降低。
[0115]A549 细胞(parental/par)和 A549/pSilencer5.1 结果无显著差异。
[0116]2) Transwell细胞迁移实验
[0117]Transwell (8 μ mporesize; BD Biosciences 小室每孔加入 I X IO5 个细胞，小室下室加入含胎牛血清的DMEM，37°C培养24h后，用棉签擦去微孔膜上层的和未侵袭人基底膜的细胞，将侵袭至下层面的细胞用甲醇固定，苏木素染色。在倒置显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞，置入750mL / L酒精固定15min，结晶紫染色15min，PBS反复漂洗，洗去多余的结晶紫。200倍显微镜下观察，随机计数5个视野，取均值。
[0118]上述细胞为A549 细胞(parental/par)、A549/pSilencer5.Ι-siRNA 细胞(HIP-55KD), A549/pSilencer5.1-Scramble 细胞(Scr)、A549/pLenti6/V5 细胞(Con)、A549/pLenti6/V5-HIP-55 细胞(HIP-55);以 A549/pSilencer5.1 为对照。[0119]结果如图9所示，A为干扰结果，B为过表达结果，其中左图均为显微镜拍照结果，右图均为统计图；可以看出，
[0120]A549 (parental/par)穿过 Transwell 小室膜的细胞数量为 281 ；
[0121]A549/pSilencer5.l-siRNA(HIP_55KD)穿过 Transwell 小室膜的细胞数量为 103 ；
[0122]A549/pSilencer5.l-Scramble (Scr)穿过 Transwell 小室膜的细胞数量为 306。
[0123]A549/pLenti6/V5对照细胞(Con)穿过Transwell小室膜的细胞数量为220 ；
[0124]A549/pLenti6/V5-HIP-55 细胞(HIP-55)穿过 Transwell 小室膜的细胞数量为468。
[0125]可以看出，在A549细胞中敲减HIP-55后，与A549细胞(parental/par)及siRNA无关序列对照细胞(scramble, scr)相比,细胞迁移能力明显降低。
[0126]在A549细胞中过表达HIP-55后，与A549细胞(Con)相比，细胞迁移能力明显增加。
[0127]四、HIP-55对细胞侵袭影响
[0128]Transwell上室底部预先包被Matrigel胶,使用前加人少量无血清的培养基水化。其余同Transwell小室迁移 实验。
[0129]干扰组中细胞为A549 细胞(parental/par)、A549/pSilencer5.Ι-siRNA 细胞(HIP-55KD)、A549/pSilencer5.1-Scramble 细胞(Scr)；
[0130]过表达组中细胞为A549/pLenti6/V5 对照细胞(Con)、A549/pLenti6/V5-HIP_55细胞(HIP-55)。
[0131]结果如图10所示，A为干扰结果，B为过表达结果，其中左图均为显微镜拍照结果，右图均为统计图；
[0132]A549细胞(parental/par)侵袭Matrigel穿过Transwell小室膜的细胞数量为471 ；
[0133]A549/pSilencer5.1-siRNA 细胞(HIP-55KD)侵袭 Matrigel 穿过 Transwell 小室膜的细胞数量为150 ；
[0134]A549/pSilencer5.l-Scramble 细胞(Scr)侵袭 Matrigel 穿过 Transwell 小室膜的细胞数量为565。
[0135]表明，在A549细胞中敲减HIP-55后，与A549细胞(parental,par)及siRNA无关序列对照细胞(scramble, scr)相比,细胞侵袭能力明显降低。
[0136]A549/pLenti6/V5对照细胞(Con)侵袭Matrigel穿过Transwell小室膜的细胞数量为84 ；
[0137]A549/pLenti6/V5-HIP-55 细胞(HIP-55)侵袭 Matrigel 穿过 Transwell 小室膜的细胞数量为238。
[0138]表明，在A549细胞中过表达HIP-55后，与A549/pLenti6/V5对照细胞(Con)相比，细胞侵袭能力明显增加。
[0139]五、HIP-55对成瘤的影响
[0140]体外培养的细胞，收集细胞并调整到适宜浓度重悬于PBS中，取200 μ I细胞悬液(2Χ IO6细胞)于Balb/c裸鼠(4_5周)腋下皮下注射。饲养裸鼠4周，肉眼可见明显瘤体，取瘤测量瘤体重量并拍照。[0141]上述细胞为A549 细胞(parental/par)、A549/pSilencer5.Ι-siRNA 细胞(HIP-55KD)、A549/pLenti6/V5-HIP-55 细胞(HIP-55/WT)、A549/pSilencer5.1-Scramble细胞(Scr)。
[0142]结果如图11所示，左图为检测HIP-55表达的Western blot图，右图为统计肿瘤
重量图；
[0143]AA549/pLenti6/V5-HIP-55 细胞(HIP-55/WT)注射后，肿瘤重量为 1.418g ；
[0144]A549/pSilencer5.1-siRNA 细胞(HIP-55KD)注射后，肿瘤重量为 0.253g ；
[0145]A549/pSilencer5.1-Scramble 细胞(Scr)注射后，肿瘤重量为 0.92g ；
[0146]A549 细胞(parental/par)与 A549/pSilencer5.1-Scramble 细胞(Scr)结果无显
著差异。
[0147]结果表明，在A549细胞中敲减HIP-55后裸鼠肿瘤重量明显降低，而过表达HIP-55
后瘤体重量明显升高。
[0148]六、HIP-55在肺癌患者组织样本中高表达
[0149]为明确HIP-55在肺癌患者的表达情况，应用免疫组织化学方法检测了正常肺(已经确诊，且患者知情)组织与肺癌患者(已经确诊，且患者知情)肺组织中HIP-55的表达。
[0150]结果如图12所示，`上图为免疫组化结果，下图为统计图；结果表明与正常肺组织相比肺癌患者肺组织中HIP-55极其明显高表达(图12下图)。
[0151]同时，应用制备HIP-55抗体的多肽封闭肺癌组织样本后免疫组织化学检测HIP-55表达的方法明确所得阳性结果是否来自非特异性染色。结果表明，制备HIP-55抗体的多肽封闭肺癌组织样本后能够完全阻断HIP — 55抗体对肺癌组织的染色，说明阳性染色是HIP — 55抗体特异性的(图12上图)。
【权利要求】
1.一种重组载体，为将编码干扰HIP-55蛋白表达SiRNA的DNA分子插入表达载体，得到重组载体；所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于:所述编码干扰HIP-55蛋白表达siRNA的DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列5。
3.权利要求1或2所述的重组载体在制备具有如下I)-7)中至少一种功能的产品中的应用: 1)抑制细胞增殖； 2)促进细胞凋亡； 3)抑制肿瘤细胞迁移； 4)抑制肿瘤细胞侵袭； 5)抑制肿瘤细胞克隆形成； 6)抑制肿瘤形成； 7)预防和/或治疗肿瘤。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述产品为药物。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于:所述肿瘤为肺癌； 所述肿瘤细胞为肿瘤细胞。
6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于:所述肿瘤细胞为肺癌细胞；所述肺癌细胞具体为人非小细胞肺癌细胞。
7.HIP-55蛋白或其编码基因或含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体在制备具有如下I)和/或2)功能的产品中的应用: 1)促进肿瘤细胞迁移； 2)促进肿瘤细胞侵袭； 所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于: 所述HIP-55蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于: 所述产品为药物； 所述肿瘤为肺癌； 所述肿瘤细胞为肿瘤细胞；所述肿瘤细胞具体为肺癌细胞； 所述肺癌细胞尤其具体为人非小细胞肺癌细胞。
10.HIP-55蛋白在筛选、开发和/或设计预防和/或治疗肿瘤产品中的应用；所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
【文档编号】A61K48/00GK103773802SQ201410045873
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年2月8日 优先权日:2014年2月8日
【发明者】李子健, 付海安, 石智, 李增刚 申请人:北京大学第三医院