用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的基于MicroRNA的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的新的方法和组合物。本发明还提供了鉴定抗乳腺癌试剂的方法。
【专利说明】用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的基于MicroRNA的方法和组合物
[0001]本申请是分案申请，其直接母案申请是申请日为2006年7月31日、申请号为201110319534.7的同名发明专利申请；其原始母案申请是申请日为2006年7月31日、申请号为200680036598.3的同名发明专利申请。
[0002]发明背景
[0003]乳腺癌是美国和全球范围内的妇女的重大健康问题。尽管在疾病的检测和治疗上已取得了进步，但乳腺癌仍然是妇女中癌症相关性死亡的第二大病因，在美国其每年影响着180，000多位妇女。对于北美的妇女，一生中患乳腺癌的概率现在为八分之一。
[0004]目前没有用于治疗或预防乳腺癌的普遍成功的方法。目前乳腺癌的治疗依赖于早期诊断(例如，通过常规的乳腺筛查方法)和侵入性治疗的组合，其可包括多种治疗例如手术、放射疗法、化学疗法和激素疗法中的一种或多种。通常基于许多预后参数(包括特异性肿瘤标记的分析)来选择特定乳腺癌的疗程。参见，例如，Porter-Jordan和Lippman, BreastCancer8:73-100(1994)。
[0005]尽管BRCAl和BRCA2的发现在鉴定参与乳腺癌的关键遗传因素中是非常重要的步骤，但已逐渐清楚BRCAl和BRCA2的突变只解释部分对乳腺癌的遗传易感性(Nathanson，K.L.等人，Human Mol.Gen.10(7):715-720 (2001);Anglican Breast Cancer StudyGroup.Br.J.Can cer83(10):1301-08(2000);和 Syrjakoski K.，等人，J.Natl.CancerInst.92:1529-31 (2000))。尽管对乳腺癌的治疗进行了大量研究，但乳腺癌仍然难以有效地诊断和治疗，并且乳腺癌患者中观察到的高死亡率表明疾病的诊断、治疗和预防需要提闻。
[0006]MicroRNA(微RNA)是通过与信使RNA (mRNA)靶杂交和引发其的翻译抑制或较不常见地引起其降解来控制基因表达的小的、非编码RNA种类。miRNA的发现和研究已揭示在生物发育和各种细胞过程例如细胞分化、细胞生长和细胞死亡中发挥重要作用的miRNA介导的基因调控机制(Cheng，A.M.，等人，Nucleic Acids Res.33:1290-1297(2005))。近年来的研究表明特定miRNA的异常表达可参与人的疾病例如神经障碍(neurological disorder)(Ishizuka, A.,等人，Genes Dev.16:2497-2508 (2002))和癌症。具体地，已在人慢性淋巴细胞性白血病中发现miR-16-l和/或miR_15a的不当表达(misexpression) (Calin, G.A.,等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.99:15524-15529 (2002))。
[0007]包含所有已知的人microRNA的微阵列的发展和应用已允许同时分析样品中的每一种 miRNA 的表达(Liu, C.G.，等人，Proc Natl.Acad.Sci U.S.A.101:9740-9744 (2004))。这些microRNA微阵列不仅已用于确认miR-16-l在人CLL细胞中摆脱控制，而且还用于产生与良好建立的人CLL的临床病理特征关联的miRNA表达特征谱(Calin，G.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.101:1175-11760 (2004))。
[0008]使用miCToRNA微阵列鉴定microRNA组群(其在正常细胞和乳腺癌细胞之间差异表达)(即，表达特征谱或表达谱)的用途可帮助精确识别参与乳腺癌的特异性miRNA。此外，这些miRNA的假定的靶的鉴定可帮助阐明它们的致病作用。本发明提供了用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的新的方法和组合物。
[0009]发明概述
[0010]本发明部分基于相对于正常对照细胞，在乳腺癌细胞中差异表达的miRNA的乳腺癌特异性特征谱(Signature)的鉴定。
[0011]因此，本发明包括诊断受试者是否具有乳腺癌或处于发生乳腺癌的风险中的方法，该方法包括测量来自受试者的受试样品中的至少一种miR基因产物的水平和将受试者样品中的miR基因产物的水平与对照样品中的相应的miR基因产物的水平比较。相对于对照样品中的相应的miR基因产物的水平，受试样品中的miR基因产物的水平的改变(例如增加、降低)表明受试者具有乳腺癌或处于发生乳腺癌的风险中。在某些实施方案中，所述至少一种 miR 基因产物选自 miR-125b-l、miR125b-2、miR-145、miR-21、miR-155、miR-10b 和其组合。
[0012]可使用许多本领域技术人员熟知的技术测量所述至少一种miR基因产物的水平。在一个实施方案中，使用Northern印迹分析测量所述至少一种miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，可这样测量至少一种miR基因产物的水平:从获自受试者的受试样品反转录RNA以提供一组靶寡聚脱氧核苷酸，使靶寡聚脱氧核苷酸对包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供受试样品的杂交谱(hybridization profile),然后将受试样品的杂交谱与从对照样品产生的杂交谱进行比较。相对于对照样品，受试样品中至少一种miRNA的信号的改变表明受试者具有乳腺癌或处于发生乳腺癌的风险中。在特定的实施方案中，微阵列包含相当大部分的人miRNome的miRNA特异性探针寡核苷酸。在其他实施方案中，微阵列包含选自miR-145、miR-21、miR-155、miR-10b、miR-009-1 (miR131_l)、miR-34 (miR-170)、miR-102 (miR_29b)、miR-123 (miR-126)、miR-140-as、miR_125 a、miR-125b_l、miR-125b_2、miR-194、miR-204、miR-213、let_7a_2、let_7a_3、let_7d(let-7d_vl)、let_7f-2、let_7i(let-7d_v2)、miR-101-1、miR_122a、miR-128b、miR-136、miR-143、miR-149、miR-191、miR-196-l、miR-196-2、miR-202、miR-203、miR-205、miR-206、miR-210和其组合的一种或多种miRNA的miRNA特异性探针寡核苷酸。
[0013]本发明也提供了诊断与一种或多种预后标记关联的乳腺癌的方法，该方法包括测量来自受试者的乳腺癌受试样品中的至少一种miR基因产物的水平和将所述乳腺癌受试样品中的至少一种m i R基因产物的水平与对照样品中相应的m i R基因产物的水平进行比较。可使乳腺癌与一种或多种与乳腺癌相关的不利预后标记例如但不限于雌激素受体的表达、孕酮受体的表达、阳性淋巴节转移、高增殖指数、可检测的P53的表达、晚期肿瘤期和高血管侵袭关联。在一个实施方案中，这样测量所述至少一种miR基因产物的水平，即从获自受试者的受试样品反转录RNA以提供一组靶寡聚脱氧核苷酸，使靶寡聚脱氧核苷酸对包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供受试样品的杂交谱，然后将受试样品的杂交谱与从对照样品产生的杂交谱进行比较。相对于对照样品，受试样品中至少一种miRNA的信号的改变表明受试者具有与该一种或更多种预后标记关联的乳腺癌或处于发生与该一种或更多种预后标记关联的乳腺癌的风险中。在特定的实施方案中，微阵列包含选自 miR-26a、miR_26b、miR-102 (miR_29b)、miR-30a_5p、miR_30b、miR_30c、miR_30d、miR-185、miR-191、miR-206、miR-212、let_7c、miR-9-2、miR-15-a、miR-21、miR-30a_s、miR-133a-l、miR-137、miR-153-2、miR-154、miR_181a、miR-203、miR-213、let_7f_l、let_7a_3、let_7a_2、miR-9-3、miR-10b、miR_27a、miR_29a、miR-123、miR-205、let_7d、miR-145、miR-16a、miR-128b和其组合的miRNA的至少一种miRNA特异性探针寡核苷酸。
[0014]本发明也包括治疗受试者中的乳腺癌的方法，其中至少一种miR基因产物在受试者的癌细胞中摆脱控制(例如，下调，上调)。当该至少一种分离的miR基因产物在乳腺癌细胞中被下调时，该方法包括施用有效量的该至少一种分离的miR基因产物，从而使受试者中的癌细胞的增殖被抑制。在一个实施方案中，方法包括施用有效量的该至少一种分离的miR基因产物，条件是该miR基因不是miR-15a或miR-16-l，这样受试者的癌细胞的增殖被抑制。当所述至少一种分离的miR基因产物在癌细胞中被上调时，所述方法包括给受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少一种miR基因表达的化合物，这样乳腺癌细胞的增殖被抑制。
[0015]在相关的实施方案中，本发明提供了治疗受试者的乳腺癌的方法，其包括确定相对于对照细胞，来自受试者的乳腺癌细胞中的至少一种miR基因产物的量。如果miR基因产物在乳腺癌细胞中脱离控制，则该方法进一步包括改变在乳腺癌细胞中表达的该至少一种miR基因产物的量。如果癌细胞中表达的miR基因产物的量低于对照细胞中表达的miR基因产物的量，那么该方法包括施用有效量的至少一种分离的miR基因产物。在一个实施方案中，miR基因产物不是miR-15a或miR-16-l。如果癌细胞中表达的miR基因产物的量比对照细胞中表达的miR基因产物的量大，那么该方法包括给受试者施用有效量的至少一种用于抑制该至少一种miR基因的表达的化合物。在一个实施方案中，miR基因产物不是miR-15a 或 miR-16-l。
[0016]本发明还提供了用于治疗乳腺癌的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种分离的miR基因产物和药学上可接受的载体。在特定的实施方案中，该至少一种miR基因产物相应于miR基因产物，该基因产物相对于合适的对照细胞在乳腺癌细胞中具有减少的表达水平。 在某些实施方案中，分离的miR基因产物选自miR-145、miR-10b、miR-123 (miR-126)、miR-140-as、miR_125a、miR-125b_l、miR-125b_2、miR-194、miR-204、let-7a-2、let_7a_3、let_7d (let-7d_vl)、let_7f_2、miR-101-1、miR-143 和其组合。
[0017]在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种miR表达抑制性化合物。在特定的实施方案中，该至少一种m i R表达抑制性化合物对于m i R基因是特异性的，所述miR基因的表达在乳腺癌细胞中比在对照细胞中强。在某些实施方案中，miR表达抑制化合物对于选自 miR-21、miR-155、miR-009-1 (miR131_l)、miR-34 (miR-170)、miR-102(miR-29b)、miR_213、let_7i(let-7d_v2)、miR-122a、miR-128b、miR-136、miR-149、miR-191、miR-196-1、miR-196-2、miR-202、miR-203、miR-206、miR-210、miR-213 和其组合的一种或多种miR基因产物是特异性的。
[0018]本发明还包括鉴定抗乳腺癌试剂的方法，其包括对细胞提供受试试剂和测量细胞中至少一种miR基因产物的水平。在一个实施方案中，该方法包括对细胞提供受试试剂和测量至少一种与乳腺癌细胞中减少的表达水平相关的miR基因产物的水平。相对于合适的对照细胞，细胞中miR基因产物水平的增加表明受试试剂为抗乳腺癌试剂。在特定的实施方案中，所述与乳腺癌细胞中减少的表达水平相关的至少一种miR基因产物选自miR-145、miR-10b、miR-123 (miR-126)、miR-140-as、miR_125a、miR-125b_l、miR-125b_2、miR-194、miR-204、let_7a_2、let_7a_3、let_7d (let-7d_vl)、let-7f-2、miR-101_l、miR-143 和其组合
[0019]在其他实施方案中，该方法包括对细胞提供受试试剂，和测量至少一种与乳腺癌细胞中增加的表达水平相关的miR基因产物的水平。相对于合适的对照细胞，细胞中miR基因产物水平的减少表明受试试剂为抗乳腺癌试剂。在特定的实施方案中，所述与乳腺癌细胞中增加的表达水平相关的至少一种miR基因产物选自miR-21、miR-155、miR-009-1 (miR131_l)、miR-34 (miR-170)、miR-102 (miR_29b)、miR-213、let-7i (let-7d-v2)、miR_122a、miR_128b、miR-136、miR-149、miR-191、miR-196-1、miR-196-2、miR-202、miR-203、miR-206、miR-210、miR-213 和其组合。
[0020]附图概述
[0021]本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请的拷贝在请求和支付必要的费用后由专利局提供。
[0022]图1描述了由聚类分析产生的显示基于差异microRNA表达(P〈0.05)区分乳腺癌组织与正常组织的树。图底部的条块标示癌症组群(红色)或正常乳腺组织(黄色)。
[0023]图2是描述基于PAM分析，各样品为癌组织或正常组织的概率(0.0至1.0)的图。借助表2中显示的miR特征谱正确地预测了所有乳腺癌和正常组织。
[0024]图3A是描述使用miR_125b互补探针检测的miR_125b在正常样品和来自乳腺癌患者(P)的几个肿瘤样品中的表达水平的Northern印迹。U6探针用于标准化各样品的表达水平。
[0025]图3B是描述使用miR-145互补探针检测的miR-145在正常样品和来自乳腺癌患者(P)的几个肿瘤样品中的表达水平的Northern印迹。U6探针用于标准化各样品的表达水平。
[0026]图3C是描述使用miR-21互补探针检测的miR-21在正常样品和来自乳腺癌患者(标记为编号的患者)的几个肿瘤样品中的表达水平的Northern印迹。U6探针用于标准化各样品的表达水平。
[0027]图3D是描述microRNA miR-125b、miR_145和miR-21在不同乳腺癌细胞系中的表达水平的Northern印迹。也确定了各microRNA在来自正常组织样品中的表达水平。U6探针用于标准化各样品的表达水平。
[0028]图4A是列出在与雌激素受体的存在(ER+)或不存在(ER-)相关的乳腺癌样品中差异表达的miRNA的表。
[0029]图4B是列出在与孕酮受体的存在(PR+)或不存在(PR-)相关的乳腺癌样品中差异表达的miRNA的表。
[0030]图4C是列出在与肿瘤的I期(pTl)或2或3期(pT2_3)相关的乳腺癌样品中差异表达的miRNA的表。
[0031]图4D是列出在与淋巴结转移的存在(pNO)或不存在(pN10+)相关的乳腺癌样品中差异表达的miRNA的表。
[0032]图4E是列出在与血管侵袭的存在或不存在相关的乳腺癌样品中差异表达的miRNA的表。
[0033]图4F是列出在与高(MIB-D30)或低(MIB_1〈20)增殖指数(PI)相关的乳腺癌样品中差异表达的miRNA的表。[0034]图4G是列出在与p53的阳性(p53+)或阴性(p53_)免疫染色相关的乳腺癌样品中差异表达的miRNA的表。
[0035]发明详述
[0036]本发明部分基于特定miRNA和microRNA的鉴定，所述miRNA的表达相对于正常对照细胞，在乳腺癌细胞中发生改变，所述microRNA的表达在与特定的预后特征相关的乳腺癌细胞中相对于缺乏这些特征的乳腺癌细胞发生改变。
[0037]如在此处可互换使用，“miR基因产物”、“microRNA”、“miR”或“miRNA”意指来自miR基因的未加工的或加工的RNA转录物。由于miR基因产物不翻译成蛋白质，术语“miR基因产物”不包括蛋白质。未加工的miR基因转录物也称为“miR前体”，其通常包含长度大约为70-100个核苷酸的RNA转录物。可通过使用RNA酶(例如，Dicer,Argonaut或RNA酶III，例如大肠杆菌(E.coli)RNA酶III))进行降解来将miR前体加工成具有活性的19-25个核苷酸的RNA分子。该19-25个核苷酸的活性RNA分子也称为“经加工的”miR基因转录物或“成熟的” miRNA。
[0038]可通过天然加工途径(例如，使用完整的细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如，使用分离的加工酶例如分离的Dicer、Argonaut或RNA酶III)从miR前体获得具有活性的19-25个核苷酸的RNA分子。要理解也可通过生物学或化学合成直接产生19-25核苷酸的活性RNA分子，而不用从miR前体加工而来。
`[0039]表1中提供了 187个miR基因产物的序列。以5’至3’的方向给出此处的所有核酸序列。此外，用斜体字表示基因，用正常型表示基因产物；例如，mir-17是基因，而miR-17是基因产物。
[0040]本发明包括诊断受试者是否具有乳腺癌或处于发生乳腺癌的风险中的方法，该方法包括测量来自受试者的乳腺癌受试样品中的至少一种miR基因产物的水平和将受试样品中的miR基因产物的水平与对照样品中相应的miR基因产物的水平进行比较。如此处所用的，“受试者”可以是具有或怀疑具有乳腺癌的任何哺乳动物。在特定的实施方案中，受试者是具有或怀疑具有乳腺癌的人。
[0041]乳腺癌可以是乳腺癌的任何形式和可以与一种或更多种预后标记或特征(包括，但不限于，雌激素受体的表达、孕酮受体的表达、淋巴节转移、高增殖指数、可检测的p53的表达、晚期肿瘤期和高血管侵袭)相关。预后标记可以与不利的或消极的预后关联，或其可与好的或积极的预后关联。
[0042]表1-人miR基因产物序列
[0043]
【权利要求】
1.miRNA特异性探针寡核苷酸在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于通过测量来自受试者的受试样品中的至少一种miR基因产物的水平来诊断所述受试者是否具有乳腺癌或处于发生乳腺癌的风险中，其中相对于对照样品中的相应miR基因产物的水平，受试样品中的miR基因产物水平的改变表明受试者具有乳腺癌或处于发生乳腺癌的风险中， 其中所述至少一种miR基因产物是miR-155。
2.权利要求1的用途，其中使用Northern印迹分析法测量所述至少一种miR基因产物的水平。
3.miRNA特异性探针寡核苷酸在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于通过测量来自受试者的乳腺癌样品中至少一种miR基因产物的水平来诊断所述受试者中与一种或多种预后标记相关的乳腺癌，其中相对于对照样品中相应miR基因产物的水平，受试样品中所述至少一种miR基因产物的水平的改变表明受试者患有与所述一种或多种预后标记相关的乳腺癌， 其中所述miR基因产物是miR-155。
4.miRNA特异性探针寡核苷酸在制备微阵列中的用途，所述微阵列用于通过如下步骤诊断受试者是否具有乳腺癌或处于发生乳腺癌的风险中，所述步骤包括: (1)从获自受试者的受试样品反转录RNA以提供一组靶寡聚脱氧核苷酸； (2)使靶寡聚脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供受试样品的杂交谱；和 (3)将受试样品的杂交谱与从对照样品产生的杂交谱进行比较， 其中至少一种miRNA的信号的改变表明受试者具有乳腺癌或处于发生乳腺癌的风险中；和` 其中所述微阵列包含至少一种包含miR-155的miRNA的miRNA特异性探针寡核苷酸。
5.权利要求4的用途,其中相对于从对照样品产生的信号,至少一种miRNA的信号被上调。
6.权利要求4的用途，其中微阵列还包含一种或多种选自miR-21、miR-10b、miR-145、miR-009-1 (miR131_l)、miR-34 (miR-170)、miR-102 (miR_29b)、miR-123 (miR-126)、miR-140-as、miR_125a、miR-125b_l、miR-125b_2、miR-194、miR-204、miR-213、let_7a_2、let_7a_3、let_7d(let-7d_vl)、let_7f_2、let_7i(let-7d_v2)、miR-101-1、miR_122a、miR-128b、miR-136、miR-143、miR-149、miR-191、miR-196-l、miR-196-2、miR-202、miR-203、miR-206、miR-210和其组合的miRNA的miRNA特异性探针寡核苷酸。
7.miRNA特异性探针寡核苷酸在制备微阵列中的用途，所述微阵列用于通过如下步骤诊断受试者是否具有与受试者中一种或多种不利预后标记相关的乳腺癌或处于发生这种乳腺癌的风险中，所述步骤包括: (1)从获自受试者的受试样品反转录RNA以提供一组靶寡聚脱氧核苷酸； (2)使靶寡聚脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供所述受试样品的杂交谱；和 (3)将受试样品的杂交谱与从对照样品产生的杂交谱进行比较， 其中信号的改变表明受试者具有具有与一种或多种不利预后标记相关的乳腺癌或处于发生这种乳腺癌的风险中；和其中所述微阵列包含至少一种包含miR-155的miRNA的至少一种miRNA特异性探针寡核苷酸。
8.权利要求7的用途，其中所述一种或多种不利的预后标记选自雌激素受体的表达、孕酮受体的表达、阳性淋巴节转移、高增殖指数、可检测的P53的表达、晚期肿瘤期和高血管侵袭。
9.权利要求7的用途，其中微阵列还包含选自miR-26a、miR-26b、miR-102(miR-29b)、miR-30a_5p、miR_30b、miR_30c、miR_30d、miR-185、miR-191、miR-206、miR-212、let_7c、miR-9-2、miR-15-a、miR-21、miR-30a_s、miR-133a_l、miR-137、miR-153_2、miR-154、miR-181a、miR-203、miR_213、let_7f-l、let_7a_3、let-7a-2、miR-9-3、miR-10b、miR_27a、miR-29a、miR-123、miR-205、let_7d、miR-145、miR_16a、miR_128b 和其组合的 miRNA 的至少一种miRNA特异性探针寡核苷酸。
10.抑制miR-155表达的化合物在制造用于治疗乳腺癌的药剂中的用途。
11.权利要求10的用途，其中抑制miR-155表达的化合物按配方制造为包含所述化合物或其生理上可接受的盐，以及药学上可接受的载体的药物组合物。
12.抑制miR-155 表达的化合物在制造用于抑制癌细胞增殖的药剂中的用途。
【文档编号】A61K45/00GK103882124SQ201410086814
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2006年7月31日 优先权日:2005年8月1日
【发明者】C·M·克劳斯, G·A·卡琳 申请人:俄亥俄州立大学研究基金会