赛葵总黄酮提取物及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供了赛葵总黄酮提取物，总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于1%。本发明还提供了该提取物的制备方法和用途。本发明赛葵总黄酮提取物质量稳定，可控，提取工艺简便可行，不污染环境，适合大规模提取。赛葵总黄酮提取物用于治疗前列腺疾病，尤其是治疗前列腺增生、前列腺炎或前列腺癌以及非细菌性前列腺炎，药效明确，安全，为临床提供了一种新的用药选择。
【专利说明】赛葵总黄酮提取物及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及赛葵提取物，属药物领域。
【背景技术】[0002]赛葵Malvastrum coromandelianum(L.) Garcke为锦葵科亚灌木植物,别名黄花草或黄花棉。为多年生锦葵目草本，原产于美洲，现以广布于全球的热带区域。我国主要分布于台湾、福建、广东、香港、海南、广西、云南。赛葵以全草入药，性苦、淡，凉。具有清热利湿，解毒散瘀之功效。主治湿热泻痢、黄疸、肺热咳嗽、咽喉肿痛、痔疮、痈肿疮毒、跌打损伤、前列腺炎。民间常用来治疗黄疸型肝炎，药理实验有报道证明赛葵具有解热镇痛抗炎作用(田辉，等，赛葵的生药学研究，中药材第29卷第8期2006年8月)。
[0003]目前针对赛葵中的活性成分或有效部位尚无相关文献报道。
【发明内容】
[0004]本发明的技术方案是提供了一种赛葵提取物。本发明的另一技术方案是提供了该提取物的制备方法和用途。
[0005]本发明提供了一种赛葵总黄酮提取物，总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于1%。进一步的，总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于3% ;进一步优选地，总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于20% ;更进一步优选地，总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于55%,以杨梅素含量计不少于50%。
[0006]它是由水或有机溶剂提取制备而成。
[0007]进一步优选地，所述的有机溶剂是浓度为70%以上的乙醇。
[0008]本发明赛葵总黄酮提取物是由由水或有机溶剂，采用回流提取、索氏提取、超声提取、微波提取、超临界CO2萃取、浸溃或渗漉提取方法制备而成。
[0009]本发明还提供了一种制备所述的赛葵总黄酮提取物的方法，它包括如下步骤:
[0010]a、称取赛葵，加水或有机溶剂浸泡；
[0011]b、采用水浴加热回流提取、索氏提取、超声提取、微波提取、超临界CO2萃取、浸溃或渗漉提取方法；残渣用相应溶剂洗涤，合同滤液，过滤，即得本发明赛葵总黄酮提取物。
[0012]其中，所述的有机溶剂为70%以上的乙醇。
[0013]其中，还包括步骤c:纯化，具体纯化方法如下:
[0014]①用乙醇浸泡生药量的AB-8型大孔树脂后，上柱进行预处理，用体积分数95%乙醇流动清洗，至流出的乙醇液至乙醇液与水1:5混合不呈白色混浊为止，然后以蒸馏水冲洗至水洗液无醇味；
[0015]②取b步骤的赛葵提取液上样，先用4倍柱体积的水洗脱，弃去洗脱液；继用4倍柱体积10%的乙醇洗脱，弃去洗脱液；然后用8倍40%的乙醇洗脱，收集洗脱液,减压回收乙醇，浓缩至干，即得赛葵总黄酮；总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于55%，以杨梅素含量计不少于50%。[0016]本发明还提供了所述的赛葵总黄酮提取物在制备治疗前列腺疾病的药物中的用途。
[0017]其中，所述的药物是治疗前列腺增生、前列腺炎或前列腺癌的药物。
[0018]本发明还提供了所述的药物是治疗非细菌性前列腺炎的药物。
[0019]本发明赛葵总黄酮提取物质量稳定，可控，提取工艺简便可行，不污染环境，适合大规模提取。赛葵总黄酮提取物用于治疗前列腺疾病，尤其是治疗前列腺增生、前列腺炎或前列腺癌以及非细菌性前列腺炎，药效明确，安全，为临床提供了一种新的用药选择。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1各组大鼠前列腺组织的病理变化[0021 ] 图2各组大鼠前列腺组织病理变化
【具体实施方式】
[0022]实施例1赛葵提取物的制备(回流提取法)
[0023]称取赛葵20g，分别加入200ml的70%乙醇浸泡30min后，在水浴上加热回流提取2次.每次lh，趁热过滤，残渣洗涤2~3次，合并滤液回收至无醇味，加水溶解至每ImL含
0.5g生药,离心(4000r / min) 15min,过滤,备用。取1.0mL取置于25mL量瓶中，加水6.0mL ；加入5% (质量分数)亚硝酸钠溶液1.0mL，使混匀，放置6min ;加入10% (质量分数)硝酸铝1.0mL,摇匀，放置6min ;再加入4% (质量分数)NaOH溶液10.0mL,加水至刻度，摇匀，放置15min ;照分光光度法(中国药典2010版一部附录VB)于500nm的波长处测定吸光度A。样品溶液中总黄酮的提取率(总黄酮提取率=总黄酮质量/赛葵质量X 100% )。赛葵总提取物质量约为3.0g，总黄酮的含量以芦丁计为0.526g，占总提取物的17.5%，总黄酮提取率为2.63%。
[0024]实施例2赛葵提取物的制备(索氏提取法)
[0025]称取赛葵5g，分别加入50ml的70%乙醇浸泡30min后，将温度控制在85°C，提取4h,趁热抽滤。残渣用相应溶剂洗涤2~3次，合并滤液回收至无醇味，加水溶解至每ImL含0.5g生药,离心(4000r/min) 15min,过滤,备用。按上述分光光度法测定总黄酮,此法提取得到的赛葵总提取物质量约为0.9g，总黄酮的含量以芦丁计为0.140g,占总提取物16%，总黄酮提取率为2.79%。
[0026]实施例3赛葵提取物的制备(超声提取法)
[0027]称取赛葵20g，分别加入200ml的70%乙醇浸泡30min后，超声(300W)提取2次，每次30min，趁热抽滤。残渣用相应溶剂洗涤2~3次，合并滤液回收至无醇味，加水溶解至每ImL含0.5g生药,离心(4000r / min) 15min,过滤,备用。按上述分光光度法测定总黄酮，此法提取得到的赛葵总提取物质量约为3.5g，总黄酮的含量以芦丁计为0.716g,占总提取物20%，总黄酮提取率为3.58%。
[0028]实施例4赛葵提取物的制备(微波提取法)
[0029]称取赛葵5g，分别加入200ml的70%乙醇浸泡30min后，微波(400W)提取5min，趁热抽滤，残渣用相应溶剂洗涤2~3次，合并滤液回收至无醇味，加水溶解至每ImL含0.5g生药，离心(4000r/min) 15min,过滤，备用。按上述分光光度法测定总黄酮，此法提取得到的赛葵总提取物质量约为2.0g,总黄酮的含量以芦丁计为0.149g,占总提取物7%，总黄酮提取率为2.97%。
[0030]实施例5赛葵提取物的制备(超临界CO2萃取法)
[0031]称取赛葵5g,装入萃取爸中，在以lmL/g的无水乙醇为夹带剂，萃取温度60°C，萃取压力35MPa，萃取时间lh，CO2流量SOkg/tT1的CO2超临界萃取系统中萃取，收集萃取液，回收至无醇味，加水溶解至每ImL含0.5g生药,离心(4000r / min) 15min,过滤,备用。按上述分光光度法测定总黄酮，此法提取得到的赛葵总提取物质量约为2.0g，总黄酮的含量以芦丁计为0.099g,占总提取物5%，总黄酮提取率为1.97%。
[0032]实施例6赛葵提取物的制备(浸溃法)
[0033]称取赛葵5g，于70%乙醇、料液比1: 20、浸溃6h、室温条件下浸溃提取，抽滤，残渣用相应溶 剂洗涤2~3次，合并滤液回收至无醇味，加水溶解至每ImL含0.5g生药，离心(4000r / min)15min，过滤，备用。按上述分光光度法测定总黄酮，此法提取得到的赛葵总提取物质量约为2.0g,总黄酮的含量以芦丁计为0.066g,占总提取物3%，总黄酮提取率为 1.31%。
[0034]实施例7赛葵提取物的制备(渗漉提取法)
[0035]称取赛葵20g，用80%乙醇润湿后装入渗漉柱中，加溶剂浸泡24h后开始渗漉，控制流速3mL/min,收集渗漉液，回收至无醇味，加水溶解至每ImL含0.5g生药,离心(4000r / min)15min，过滤，备用。按上述分光光度法测定总黄酮，此法提取得到的赛葵总提取物质量约为2.5g，总黄酮的含量以芦丁计为0.414g,占总提取物17%，总黄酮提取率为
2.07%。
[0036]实施例8赛葵总黄酮的纯化
[0037]用乙醇浸泡4倍生药量的AB-8型大孔树脂24h后，上柱进行预处理，用体积分数95%乙醇流动清洗，至流出的乙醇液至乙醇液与水1:5混合不呈白色混浊为止，然后以蒸馏水冲洗至水洗液无醇味。取赛葵提取液40mL (每ImL含0.5g生药，总黄酮含量不得少于1%)上样，先用4倍柱体积的水洗脱，弃去洗脱液；继用4倍柱体积10%的乙醇洗脱，弃去洗脱液；然后用8倍40%的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至干，即得总黄酮。纯化得到的总黄酮的提取率约为3%，从提取液中的转移率为84%。
[0038]其中，实施例1-7中提取方法得到的都是粗黄酮，经过实施例8的纯化，得到本发明赛葵总黄酮，所述的赛葵总黄酮中总黄酮的百分含量，以芦丁计，不少于55%，以杨梅素计不得少于50%。
[0039]具体含量测定方法及检测数据为:
[0040]以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法测定赛葵总黄酮含量。即精密称取芦丁对照品23.0mg，置50mL量瓶中，加95%乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。精密吸取对照品溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL，分别置于25mL量瓶中，加水至6.0mL ;加入5%亚硝酸钠溶液1.0mL，使混匀，放置6min ;加入10%硝酸铝1.0mL，摇匀，放置6min ;再加入4%氢氧化钠溶液10.0mL，加水至刻度，摇匀，放置15min ;照分光光度法(中国药典2010版一部附录VB)于500nm的波长处测定吸光度A，计算得出回归方程。精密吸取样品溶液1.0mL置IOmL量瓶中，再精密吸取溶液1.0mL，按以上方法，自“加水至6.0mL”起依法测定吸光度，代入回归方程计算出样品溶液中总黄酮的百分含量。(总黄酮的百分含量=总黄酮的含量/总提取物)
[0041]经三次实验，纯化得到赛葵总黄酮百分含量分别为58%、54%、61%，结果得赛葵总黄酮平均百分含量约为58%。
[0042]以杨梅素为对照品，采用紫外分光光度法测定赛葵总黄酮含量。取杨梅素对照品
14.18m g,置于25mL容量瓶中，加入甲醇溶解，定容于25mL，制得浓度为0.1592mg/mL的标准品储备液，精密量取杨梅素标准品储备液适量0、4、8、12、16、20 μ L,分别置于ImL容量瓶中。分别加入5%氯化铝3mL，用甲醇定容于10mL，放置20min，随行试剂为空白，在270nm波长处测定吸光度，计算得出回归方程。精密吸取样品溶液1.0mL置IOmL量瓶中，再精密吸取溶液1.0mL，按以上方法，测定吸光度，代入回归方程计算出样品溶液中总黄酮的百分含量。(总黄酮的百分含量=总黄酮的含量/总提取物)
[0043]经三次实验，纯化得到的赛葵总黄酮百分含量分别49%、53%、51%，结果得赛葵总黄酮平均百分含量为51%。
[0044]以下通过具体药效学试验或体外实验证明本发明的有益效果。
[0045]试验例I赛葵提取物对非细菌性前列腺炎的保护作用
[0046]1 材料 [0047]1.1动物SD大鼠，清洁级，雄性，180~220g ；KM小鼠，清洁级，雄性，体重18~22g，均由福建中医药大学实验动物中心提供。
[0048]1.2药品与试剂赛葵提取物(实施例3制得)；舍尼通由南京美瑞制药有限公司生产，批号20070514 ;消痔灵注射液由北京双鹤高科天然药物有限责任公司生产，批号061212 ;角叉菜胶购自Sigma公司；速尿注射液(SN)购自常州康普药业有限公司，ELISA试剂盒均由Uscn Life Science Inc.公司提供。
[0049]2 方法
[0050]2.1赛葵提取物对慢性非细菌性前列腺炎的保护作用将SD大鼠麻醉后剪除下腹部被毛，在无菌条件下腹部切口深入腹腔，暴露前列腺，以25%消痔灵注射液注射至2个前列腺侧叶，缝合腹壁。术后第7天将大鼠随机分成6组，即空白组，模型组，赛葵提取物低、中、高剂量组(8、4、2g*kg-l)，阳性药舍尼通组(60mg ^kg-1),每组10只，按体重连续灌胃给药30d，每天给药I次，空白组和模型组给予等量生理盐水。末次给药后处死大鼠，腹主动脉取血，离心，取血清，采用ELISA法检测大鼠血清IL-1 β，IL-2及TNF- α的含量各组大鼠腹主动脉取血，2000Xg离心lOmin，取血清。操作严格按照试剂盒说明书进行。剖取前列腺组织，肉眼观察前列腺病变状态并称湿重，计算前列腺指数；取前列腺按摩液10 μ L放入白细胞稀释液中，光学显微镜下观察，计数白细胞总数；另取一滴前列腺液涂片，镜下观察卵磷脂小体密度，评分标准为:卵磷脂小体满视野(+++)为4分，1/2视野(++)为3分，1/4视野(+)为2分，低倍镜下仅见数个为I分。取另一侧前列腺侧叶，置于10%福尔马林溶液中固定，常规脱水透明，石蜡切片一部分HE染色，于光学显微镜下观察组织形态变化。
[0051]2.2角叉菜胶致大鼠急性前列腺炎试验将SD大鼠(350~400g)随机分成6组，即空白组、模型组、赛葵提取物低剂量组(2g/kg)、赛葵提取物中剂量组(4g/kg)、赛葵提取物高剂量组(8g/kg)、阳性药舍尼通组(60mg/kg),每组10只。按体重预先连续灌胃给药7d,每天给药一次，空白组和模型组给予等量生理盐水。第6天给药后30min，将大鼠麻醉，下腹部正中切口，暴露前列腺，在前列腺侧叶上的精液囊注入0.1%无菌角叉菜胶生理盐水溶液，然后缝合腹壁。24h后称重，处死大鼠，剖取前列腺称湿重，计算前列腺指数；取前列腺按摩液IOyL放入白细胞稀释液中，光学显微镜下观察，计数白细胞总数(WBC);另取一滴前列腺液涂片，镜下观察卵磷脂小体密度，评分标准为:卵磷脂小体满视野(+++)为4分，1/2视野(++)为3分，1/4视野(+)为2分，低倍镜下仅见数个为I分。
[0052]2.3 二甲苯致小鼠耳肿胀试验将KM小鼠随机分为6组，即空白组、模型组、赛葵提取物低剂量组(2g/kg)、赛葵提取物中剂量组(4g/kg)、赛葵提取物高剂量组(8g/kg)、阳性药舍尼通组(60mg/kg)，每组10只。每鼠左耳两面涂致炎液0.05mL，右耳作空白对照。分别灌胃给药7d，每天给药一次，空白组和模型组给予等量生理盐水。最后一天给药0.5h后处死小鼠，分别在同一部位打孔，分析天平称重，计算肿胀率。
[0053]2.4小鼠棉球肉芽肿试验将KM小鼠随机分为6组，即空白组、模型组、赛葵提取物低剂量组(2g/kg)、赛葵提取物中剂量组(4g/kg)、赛葵提取物高剂量组(8g/kg)、阳性药舍尼通组(60mg/kg)，每组10只。除空白组外，小鼠腋窝皮下手术植入灭菌棉球(10.0±0.5)mg。连续灌胃给药7d，每天给药一次，空白组和模型组给予等量生理盐水。7d后称重，处死小鼠。剥离肉芽组织，于60°C烘箱中烘干，称重，计算肉芽肿重量。
[0054]2.5对雌性小鼠热板致痛的影响取体重20±2g的雌性小鼠，按热板法于试验前在热板测痛仪上测定痛阈值在5s-30s内的小鼠60只，按体重随机分为6组，即空白组、模型组、赛葵提取物低剂量组(2g/kg)、赛葵提取物中剂量组(4g/kg)、赛葵提取物高剂量组(8g/kg)、阳性药舍尼通组(60mg/kg)，每组10只。以出现舔后足反应为观察指标。分别于每鼠灌胃以上药物，0.2mL/只。0.5h后按上法测定痛阈值，然后按前法给药，测定lh、l.5h、2h的痛阈值。比较给药前后痛阈的变化，并按(用药后-用药前平均痛阈值)/用药前平均痛阈值X 100%计算痛阈提高百分率。
[0055]2.6水负荷大鼠排尿量试验将健康SD雄性大鼠(180~220g)预先放置于代谢笼中I~2d适应环境，选取自由饮水条件下尿量稳定的大鼠50只，随机分为正常对照组、阳性对照组(速尿注射液10mg/kg)和赛葵提取物低、中、高剂量组，每组10只。连续灌胃给药7d，最后一天给药前18h禁食不禁水，给药前各组按2mL/100g体重剂量腹腔注射生理盐水，然后灌胃给药，对照组给予等量蒸馏水。给药后立即将大鼠放入代谢笼中，每笼一只，1、2，4h后分别测量各组动物的尿量。
[0056]2.7统计学处理采用SPSS统计软件进行统计学处理。数据以i ± S表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
[0057]3 结果
[0058]3.1赛葵提取物对消痔灵诱导的慢性非细菌性前列腺炎的影响肉眼所见前列腺组织外观:空白组大鼠前列腺组织呈粉红色，质软、有光泽，与周围组织无粘连；模型组大鼠前列腺腺体呈暗红色或棕黄色，普遍与周围组织粘连，质硬，有明显的硬结，并有水肿；舍尼通组大鼠前列腺腺体与周围组织粘连较轻，部分腺体质硬，有结节，色棕黄；赛葵提取物8、4g.kg-1剂量组前列腺腺体与周围组织粘连轻，硬结小，部分腺体呈棕黄色，有轻度水肿，个别腺体柔软、红润、有光泽，外观与正常前列腺组织相似。
[0059]赛葵提取物的抗炎作用:模型组与空白组比较，前列腺液中WBC数增加、卵磷脂小体密度减少，呈现慢性前列腺炎的病理变化，表明造模成功。赛葵提取物8g.kg-1剂量组与模型组比较，WBC数减少、卵磷脂小体密度增加，表明该药对消痔灵诱导的慢性前列腺炎有一定的抗炎作用，见表1。
[0060]表1赛葵提取物对消痔灵诱导的大鼠慢性非细菌性前列腺炎的影响(无士s，n=10)
【权利要求】
1.赛葵总黄酮提取物，其特征在于:总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于1%。
2.根据权利要求1所述的赛葵总黄酮提取物，其特征在于:总黄酮的重量百分含量以芦丁计，不少于55%，以杨梅素重量百分含量计不少于50%。
3.根据权利要求1或2所述的赛葵总黄酮提取物，其特征在于:它是由水或有机溶剂提取制备而成。
4.根据权利要求3所述的赛葵总黄酮提取物，其特征在于:所述的有机溶剂是70%以上的乙醇。
5.一种制备权利要求1-4任意一项所述的赛葵总黄酮提取物的方法，它包括如下步骤: a、称取赛葵,加水或有机溶剂浸泡； b、采用水浴加热回流提取、索氏提取、超声提取、微波提取、超临界CO2萃取、浸溃或渗漉提取方法；残渣用相应溶剂洗涤，合同滤液，过滤，即得本发明赛葵总黄酮提取物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于:所述的有机溶剂为70%以上的乙醇。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于:还包括步骤c:纯化，具体纯化方法如下: ①用乙醇浸泡生药量的AB-8型大孔树脂后，上柱进行预处理，用体积分数95%乙醇流动清洗，至流出的乙醇液至乙醇液与水1:5混合不呈白色混浊为止，然后以蒸馏水冲洗至水洗液无醇味； ②取b步骤的赛葵提取液上样，先用4倍柱体积的水洗脱，弃去洗脱液；继用4倍柱体积10%的乙醇洗脱，弃去洗脱液；然后用8倍40%的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至干，即得赛葵总黄酮。
8.权利要求1-4任意一项所述的赛葵总黄酮提取物在制备治疗前列腺疾病的药物中的用途。
9.根据权 利要求8所述的用途，其特征在于:所述的药物是治疗前列腺增生、前列腺炎或前列腺癌的药物。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于:所述的药物是治疗非细菌性前列腺炎的药物。
【文档编号】A61P35/00GK103830288SQ201410089748
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2014年3月12日
【发明者】徐伟, 洪振丰 申请人:福建中医药大学