猪鼻支原体菌株及其灭活疫苗和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了猪鼻支原体菌株及其灭活疫苗和应用。本发明利用从猪场分离到的一株猪鼻支原体强毒菌株，筛选培育出免疫原性好、效价稳定的猪鼻支原体强毒菌株，其保藏编号为：CGMCC?NO.8701；在用该强毒菌株制备灭活疫苗时，本发明优化了所用到灭活剂种类、佐剂种类及其它工艺条件。本发明对灭活疫苗的生产工艺、安全性、保护率、免疫程序、最小剂量、抗体持续期和保存期等进行了试验测定，最终证明本发明制备的灭活疫苗安全有效，能有效防治由猪鼻支原体引起的猪多发性浆膜炎、肺炎、心包炎、胸膜炎、关节炎或中耳炎等多种疾病。
【专利说明】猪鼻支原体菌株及其灭活疫苗和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株支原体菌株，尤其涉及一株分离的猪鼻支原体强毒菌株，本发明进一步涉及由该猪鼻支原体强毒菌株制备的灭活疫苗，本发明进一步涉及它们在预防或治疗由猪鼻支原体引起的猪各种疾病中的应用，属于猪鼻支原体菌株的分离和应用领域。
【背景技术】
[0002]猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhini s,Mhr)是引起猪多
发性浆膜炎、肺炎、心包炎、胸膜炎、关节炎、中耳炎等疾病的主要病原，该病在猪群中发病率高，死亡率低。临床上M h r常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(P RRS V)和猪圆环病毒2型(P C V 2)等混合感染，造成严重的猪呼吸道综合征，致使断奶仔猪的死亡率显著升高，给养猪业造成巨大的经济损失。目前，中国育肥猪、母猪及种公猪猪鼻支原体阳性率高达60%以上。采用猪鼻支原体灭活疫苗接种猪是预防由猪鼻支原体引起的各种疾病的有效措施，但前提是需要分离获得免疫原性良好、效价稳定的猪鼻支原体菌株。
【发明内容】
[0003]本发明的目的之一是提供一株免疫原性良好、效价稳定的猪鼻支原体菌株；
[0004]本发明的目的之二是将所述的猪鼻支原体菌株制备成灭活疫苗用于预防或治疗由猪鼻支原体引起的猪 多发性浆膜炎、肺炎、心包炎、胸膜炎、关节炎或中耳炎等各种疾病；
[0005]为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段:
[0006]本发明人从河北省某猪场分离到一株猪鼻支原体菌株，经实验室鉴定为强毒菌株，该强毒菌株在培养基传代后的第7代菌株，经检测，其效价稳定、免疫原性良好，将该菌株命名为WH — C株；其微生物保藏编号为:C GMC C N 0.8701 ;分类命名为:猪鼻支原体Mycoplasma hyorhini s ;保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2013年12月30日:保藏地址:中国北京朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0007]本发明分离的W H - C菌株是从妊娠母猪所产发生典型PMWS弱仔中分离获得的，与分离到的其它菌株相比，本发明W H — C菌株在细胞上的增殖滴度高，对猪的免疫原性好。经传代后作为疫苗毒种，效检用强毒为W H — C株第7~10代，该菌株可以在培养基中达到IO13个/ mL 。
[0008]本发明还提供了所述的猪鼻支原体菌株在制备猪鼻支原体灭活疫苗中的应用。
[0009]本发明的另一个目的是用所分离的WH — C株制备成猪鼻支原体灭活疫苗。
[0010]由此，本发明提供了一种猪鼻支原体灭活疫苗的制备方法，包括:
[0011](I)培养所分离的猪鼻支原体W H — C株，得到菌液；
[0012](2)向菌液中加入灭活剂，将菌液灭活；
[0013](3)向灭活后的菌液中加入佐剂，混合均匀，乳化，即得。[0014]优选的，采用以下方式对菌液进行灭活:向菌液中加入甲醛至其终浓度为0.2%(V / V )，在37°C条件下灭活96小时后终止灭活。
[0015]其中，所述的佐剂优选为法国赛比克公司的商品化M ο n t a n i d e TM GE L佐剂；其中，按体积比计，佐剂与灭活后的菌液的比例优选为15:85。
[0016]在本发明灭活疫苗的制备方法过程中，乳化前将灭活的同批猪鼻支原体液解冻混合，在无菌室内用匀浆机以200 r / m i η搅拌均匀，然后按照水相抗原与油相佐剂8.5:
1.5的体积配比；乳化程序为先将水相放入乳化器中进行搅拌，然后缓缓加入油相佐剂，以800 r / m i η连续搅拌30分钟；生产得到的疫苗属水包油剂型，为了稳定界面和消除气泡，获得最佳乳化效果，静止30分钟后再进行分装。
[0017]本发明利用从猪场分离到一株猪鼻支原体强毒菌株，筛选培育出免疫原性良好、效价稳定的猪鼻支原体强毒W H — C菌株，本发明优化了用该菌株制造灭活疫苗的灭活剂、佐剂及其它工艺条件。本发明对灭活疫苗的生产工艺、安全性、保护率、免疫程序、最小剂量、抗体持续期和保存期等都进行了试验测定，并获得了大量的试验数据，最终证明本发明制备的灭活疫苗安全有效。在此基础上，本发明进行了中试生产，经抽样检验，全部符合拟定的质量标准，并对中试产品进行了安全试验和效力试验，其结果也证实本发明灭活疫苗能有效预防由猪鼻支原体引起的猪多发性浆膜炎、肺炎、心包炎、胸膜炎、关节炎、中耳炎等各种疾病。[0018]作为参考，本发明猪鼻支原体灭活疫苗(WH — C株)的免疫剂量及程序如下:仔猪2~3月龄免疫I次，2~4周后加强免疫I次；母猪、公猪每年免疫两次；每次免疫的最小免疫剂量确定为1.5 m I /头份，使用剂量为2.0 m I /头份。
[0019]本发明所涉及到术语及定义:
[0020]术语“灭活疫苗”是指包含不能再复制或生长的感染性生物或病原体的疫苗组合物。病原体可以是细菌、病毒或原生动物来源的。灭活可以通过多种方法来完成，包括冻融、化学处理、超声处理、辐射、热或足以阻止感染性生物或病原体复制或生长同时保留其免疫原性的任何其他常规方法。
[0021]术语“佐剂”是指加入疫苗中以增加疫苗的免疫原性的物质。
[0022]术语“药学上可接受的载体”指用于包含疫苗抗原的可以注射入宿主而无不良效应的流体媒介物。本领域已知的合适的药学上可接受的载体包括但不限于无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖或缓冲溶液。载体可以包含辅助试剂，包括但不限于稀释剂、稳定剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂、P H缓冲剂、黏度增强添加剂或着色剂等。
[0023]术语“疫苗组合物”包括在药学上可接受的载体中用于在宿主中诱导免疫应答的至少一种抗原或免疫原。疫苗组合物可以以剂量或通过兽医学领域技术人员所熟知的技术或剂量进行施用，在施用剂量时可以综合考虑动物的年龄、性别、体重和得病状况等因素；施用途径可以是经皮例如皮肉、肌肉、皮下等；疫苗组合物可以单独施用，或可以与其它处理或治疗共同施用。疫苗组合物中还可以包含辅助物质，例如:湿润或乳化剂、P H缓冲剂、佐剂、黏度增强添加剂或着色剂等。
[0024]术语“免疫应答”指在动物引发的应答。免疫应答可以指细胞免疫、体液免疫或同时包含二者。【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为本发明分离的支原体WH — C株在电镜下形态学观察照片结果。
[0026]图2为本发明分离的支原体W H — C株在固体培养基上的形态。
[0027]图3为本发明分离的支原体WH —C株16 s R N A基因P C R扩增结果:1.ma r k e r ；2.阴性对照；3.W H —C株扩增结果。
【具体实施方式】
[0028]通过下列实施例将更具体说明本发明的实施方式，但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0029]实施例1猪鼻支原体W H-C株的分离及培养鉴定
[0030]I菌种来源及标准
[0031]根据新生物制品申报要求，结合本发明获得的大量的试验数据，参照《中国兽药典》(2005年版)，对制 苗用菌种进行了鉴定。
[0032]1.1菌种来源
[0033]用于本发明用的菌种为猪鼻支原体W H — C株，是本发明人从发病猪只自行分离驯化后获得，由于这一菌株是从妊娠母猪所产发生典型P MW S、患有呼吸道综合征的弱仔中分离获得的，并且与分离到的其它菌株相比在培养基上的增殖滴度高，对猪的免疫原性好，所以选择其用于疫苗的生产。经猪鼻支原体用培养基(马血清(H P S)为P A A公司的产品，PPLO肉汤为B D公司产品，酵母提取物为英国OXOI D公司产品)传代后作为疫苗菌种，效检用强毒为WH — C株第7~10代。该毒种为在猪鼻支原体用培养基上传代后的第7代病菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为:C GMC C N0.8701，保藏日期为2013年12月30日。
[0034]1.2菌种标准
[0035]1.2.1菌株形态学鉴定
[0036]将分离的W H - C菌株培养物纯化后用电子显微镜进行负染观察，菌株外观呈多形性，多数菌体直径为500~600 μ m，以鸭梨形、烧瓶状、纺锤形或球形为多见，有突出的颈部，末端略膨大或钝圆，呈小帽状(图1)。
[0037]1.2.2菌株分离纯化
[0038]经处理的病料接种于专用液体培养基，37°C震荡培养96~120 h，收获培养物进行次代培养。取第2代培养物作1:10系列稀释，分殖于含有固体培养基的6孔板内，每个稀释度接I个孔，逐日镜下观察，待长成煎蛋样菌落时，进行单菌落培养。将获得的单菌落培养物进行血清学和分子生物学鉴定，获得的菌株命名为WH — C株。该菌株在固体培养形成的单菌落如图2所示。
[0039]1.2.3分子生物学鉴定
[0040]从WH—C菌液中提取核酸，以16 s RN A基因特异性引物进行P C R扩增片段长度为1000 b P (图3)，片段大小与预期一致。[0041]1.2.4含量测定试验
[0042]以PBS将WH - C菌种作连续10倍系列稀释，每个稀释度作8个重复，测定均数。含量结果为:每毫升不低于IO13个。
[0043]1.2.5毒力试验
[0044]猪鼻支原体代次为WH — C株第7~10代；攻毒剂量为每毫升1.8X IO9 C C U /
m L )经气管内和腹腔接种剂量各5 m L /头，接种试验猪5头，同设未接种5头作对照组。试验接种猪隔离饲养，感染组试验猪主要表现为食欲不振、精神沉郁、眼结膜炎、皮肤发红、过度伸展动作、便秘、鼻镜干燥、消瘦、跛行、喜卧、被毛粗乱等临床症状。未接种菌体对照组积分值均无明显临床变化，属正常健康猪水平。
[0045]1.2.6免疫原性试验
[0046]将WH - C菌株种同步接种S T细胞进行增殖，收获培养液，用甲醛灭活后，加MontanideTMISA 15 A V G佐剂混合乳化制成水包油型灭活疫苗，用健康易感猪5头，25~30日后，连同条件相同的对照猪5头，按照1.2.5的方式攻毒后。对照组5头均出现发病症状，免疫组5头均获得保护，无发病症状。
[0047]1.2.5纯净检验
[0048]对建立的猪鼻支原体W H — C株的原始种子批第10~11代、基础种子批第12~21代和生产种子批第22~25代进行了细菌、霉菌检验，并对第11、12和24代次毒种进行了外源病毒的检验，结果表明，本发明建立的原始种子批、基础种子批、生产种子批均无细菌、霉菌和外源病毒污染，均纯净。
[0049]1.2.6特异性试验
[0050]用培养液将W H-C菌种稀释至200 T C I D 5Q / 0.1 m I，与灭活的抗猪鼻支
原体特异性血清等量混匀，置37°C中和I小时，接种专用培养基，同时设阳性对照、正常培养基对照和阴性血清对照，置37°C、含5%的C O 2培养箱中，培养5~7日。中和组和正常对照组不出现浑浊；阳性对照组和阴性血清对照组均出现C P E。
[0051]1.2.7使用代次
[0052]将原始分离得到的猪鼻支原体W H — C株，连续传40代，测定了每一代的菌数，选择第15、20、25、30、35、40代分别灭活后制成疫苗，接种5月龄后备猪，35天时进行攻毒。结果表明，第7代以后各代次菌数含量稳定，菌数均不低于1013，已经达到了做疫苗的标准。攻毒试验表明，第15、20、25、30代制备的疫苗免疫猪在对猪鼻支原体界:《—0株攻击的保护性无显著差异；第35和40代制备的疫苗免疫后攻毒各有2头和I头出现症状，而对照组4头猪均有不同程度的症状。根据以上结果，为保证生产菌种良好的免疫原性和安全性，本发明确定了菌种的传代最高次数在28代，原始菌种为7~11代，基础菌种为第12~21代，生产用菌种最高传代次数限制在3代(第22~25代)以内。
[0053]1.2.8菌种保存期的确定
[0054]将猪鼻支原体W H — C株冻干菌种保存在一 20°C和一 70°C下，于保存后不同时间取样进行复活和菌数测定，结果显示于一 20°C下保存36个月的效价略有下降，，而在一70°C下保存48个月的没有明显的变化，保存60个月下降明显。考虑到在保存时存在的其他不利因素，保证保存期可靠性，所以冻干菌种在一 20°C的保存时间定为36个月；冻干菌种在一 70°C的保存时间为48个月。[0055]实施例2灭活疫苗的制备
[0056]猪鼻支原体W H-C株的制备工艺流程是按照目前已经成熟的商品化疫苗制备工艺制备。从本发明人实验室制备的3批疫苗和中间试制的5批疫苗质检结果来看，用该工艺流程制备的疫苗产品质量稳定，效检结果完全符合所制定的质量标准。
[0057]I菌液的制备
[0058]在繁殖过程中，很多因素会影响猪鼻支原体W H-C株的增殖。经过一系列比较试验，选用猪鼻支原体用培养基的各成分为:马血清(HP S )为P A A公司的产品，PPLO肉汤为B D公司产品，酵母提取物为英国OXOI D公司产品；均能获得高含量的菌液。
[0059]在本实施例中，接菌时按照I % (V / V)的接种剂量接入猪鼻支原体W H —C株第7代，收获时间为72小时。
[0060]2灭活工艺
[0061]选择终浓度为0.1%,0.2%,0.3%、0.4%的甲醛溶液对猪鼻支原体W H —C株进行灭活比较试验，试验结果表明，0.2%的甲醛在37°C条件下96小时后可将猪鼻支原体WH — C株完全灭活，而选用其它的灭活条件均不将猪鼻支原体W H — C株彻底灭活。
[0062]3乳化工艺
[0063]采用法国赛比克公司的商品化M ontanideTM GE L佐剂，除菌后可直接用于疫苗乳化制备；乳化前将灭活的同批菌液解冻混合，在无菌室内用匀浆机以200r / m i η搅拌均匀，然后 按照水相抗原与油相佐剂8.5:1.5的体积配比；乳化程序为先将水相放入乳化器中进行搅拌，然后缓缓加入油相佐剂，以800 r /m i η连续搅拌30分钟；生产得到的疫苗属水包油剂型，为了稳定界面和消除气泡，获得最佳乳化效果，需要静止30分钟后分装。
[0064]4半成品检验质量标准
[0065]4.1无菌检验
[0066]按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
[0067]4.2菌液含量测定
[0068]以P B S将菌种作连续10倍系列稀释，每个稀释度作8个重复，测定均数。结果:每毫升不低于IO13个。
[0069]4.3灭活检验
[0070]取灭活后的菌液，按菌液与生长液1: 10的比例接种于猪鼻支原体用培养基3支，37°C培养观察5日，对无浑浊再盲传2代，同时设阳性对照。结果无浑浊。实验室生产的3批半成品均合格。
[0071]5关于成品检验质量标准
[0072]5.1安全检验标准
[0073]为了保证灭活疫苗的安全性，本发明对实验室制备的5批疫苗先后进行了 “对小白鼠的安全性试验”、“对仔猪单剂量接种、单剂量重复接种、一次性超剂量(2倍剂量)接种的安全性试验”、“对后备母猪单剂量接种、单剂量重复接种、一次性超剂量(2倍剂量)接种的安全性试验”、对妊娠母猪单剂量接种、单剂量重复接种、一次性超剂量(2倍剂量)接种的安全性试验”。试验结果表明:各免疫动物单剂量接种、单剂量重复接种、一次性大剂量接种后，猪只状态均良好，采食饮水正常，无异常反应；疫苗接种后对妊娠母猪的繁殖功能也无明显影响。以上试验均证明疫苗是安全的。通过试验观察本发明总结出只要接种疫苗后21日内不出现局部红肿、溃疡、糜烂以及神经萎缩、采食减少等现象，以后就不会出现因为疫苗接种而引起的不良反应，就可以证明疫苗的安全性。因此，在试行规程(草案)中规定:用10~20 k g健康易感仔猪2头，各深部肌肉注射疫苗4 m I，另取条件相同的2头猪不接种作为对照，连续观察21日。在观察期内应不出现由疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应。
[0074]5.2效力检验标准的制定
[0075]5.2 .1抗体效价与免疫攻毒保护相关性试验
[0076]将安全性试验合格的本发明灭活疫苗按照不同剂量0.5 m I /头份、I m I /头份、2 ml /头份、4 ml /头份分别免疫3~5月龄的健康猪，并按照1.2.5的方式进行攻毒实验，以确定抗体滴度与免疫攻毒保护的相关性。
[0077]试验结果表明，当血清E L I S A抗体效价在不低于1:64时，健康成活率达97.5%，其中一组中仅有一头有症状，但P C R检测仔猪鼻支原体分离率为0，也无其它引起发病的病原感染。以上结果表明在试验条件下，当E L I S A抗体效价在不低于1:64时，本发明制备的灭活疫苗能有效阻止猪鼻支原体侵袭。因而确定疫苗效力检验时，检验标准为免疫28日后，其血清E L I S A抗体效价不低于1:64。
[0078]5.2.2最小免疫剂量和最小使用剂量试验
[0079]将安全性试验合格的3批灭活疫苗1201、1202和1203，按照不同剂量0.5 m I /头份、I ml /头份、1.5 ml /头份、2 m I /头份分别免疫3~5月龄的健康猪，于免疫后28日采血进行E L I S A抗体检测。结果显示，Wlml/头份剂量免疫猪28日后EL I S A抗体效价平均值不低于1:64，而1.5 m I /头份以上剂量免疫猪28日后E L IS A抗体效价均不低于1:64。根据E L I S A抗体效价与攻毒保护相关性试验结果，确定在免疫后28天猪鼻支原体E L I S A抗体效价达到1:64以上时，可以完全保护猪鼻支原体强毒的攻击。考虑到疫苗的保存、运输和使用过程中可能存在的效价降低因素。本发明将猪鼻支原体灭活疫苗(W H — C株)的最小免疫剂量确定为1.5ml /头份，使用剂量确定为2.0 m I /头份。
[0080]6抗体消长规律与免疫持续期试验
[0081]将安全性试验合格的3批猪鼻支原体灭活疫苗1201、1202和1203分别免疫健康育肥猪。为进一步掌握免疫效力及免疫持续期，制定合理的免疫程序，保证免疫猪群保持高而持久的抗体水平，对免疫猪不同时间进行抗体检测，以掌握其抗体消长规律。
[0082]试验结果表明，健康育肥猪免疫2 m I /头份，2~3周后加强免疫一次，28日后其血清E L I S A抗体不低于1:64，免疫后抗体高峰在2~6个月内，其后抗体水平逐渐下降，至9个月仍达1:64，为保证疫苗的免疫保护效果，确定其免疫持续期为7个月。
[0083]7免疫程序的确定
[0084]根据仔猪母源抗体的持续时间，初次免疫应在2~3月龄，因为这时母源抗体已下降到较低水平。
[0085]根据实际情况，本发明确定了猪鼻支原体灭活疫苗(WH — C株)的免疫程序为:仔猪2~3月龄免疫I次，2~4周后加强免疫I次；母猪、公猪每年免疫两次。每次免疫均为2 m I /头。[0086]8疫苗的保存期
[0087]本发明对实验室制备的3批灭活疫苗(1201、1202、1203)保存期进行了试验研究，将3批疫苗在2~8°C条件下保存9个月、12个月、15个月、18个月，在各个时间段分别取样对其性状、安全性及免疫效力检测。
[0088]试验结果显示，3批疫苗在2~8°C条件下保存18个月性状不发生明显变化，无菌检验和安全性都符合质量 标准的要求。效力检验中1201批疫苗保存18个月样品免疫后有一头抗体效价为1:32 ; 1201和1202批疫苗保存18个月样品免疫猪后均有一头猪抗体效价为1:32，但免疫猪平均抗体水平为1:64，考虑到疫苗在运输和使用过程中造成的效价损耗，本发明将疫苗的保存期定为2~8°C条件下保存15个月。
【权利要求】
1.一株猪鼻支原体(M ycoplasma hyorhinis)菌株，其特征在于，其微生物保藏编号为:C GMC C N 0.8701。
2.权利要求1所述的猪鼻支原体菌株在制备预防或治疗由猪鼻支原体引起的猪各种疾病药物中的用途。
3.按照权利要求2所述的用途，所述的由猪鼻支原体引起的猪各种疾病包括:猪多发性浆膜炎、猪肺炎、猪心包炎、猪胸膜炎、猪关节炎或猪中耳炎。
4.一种预防或治疗由猪鼻支原体引起的猪各种疾病的疫苗组合物，其特征在于:含有预防或治疗上有效量的灭活的权利要求1所述的猪鼻支原体菌株以及药学上可接受的载体。
5.按照权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于:所述的由猪鼻支原体引起的猪疾病包括:猪多发性浆膜炎、猪肺炎、猪心包炎、猪胸膜炎、猪关节炎或猪中耳炎。
6.一种制备猪鼻支原体灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤: (O培养权利要求1所述的猪鼻支原体菌株，得到菌液； (2)向菌液中加入灭活剂，将菌液灭活； (3)向灭活后的菌 液中加入佐剂，混合均匀，乳化，即得。
7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，采用以下方式对菌液进行灭活:按体积比计，向菌液中加入甲醛至其终浓度为0.2%，在37°C条件下灭活96小时后终止灭活。
8.按照权利要求6所述的方法，其特征在于:按体积比计，佐剂与灭活后的菌液的比例为 15:85o
【文档编号】A61P19/02GK103937706SQ201410105458
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】刘继红 申请人:北京和安恒盛生物科技有限公司