一种靶向治疗和检测双功能的抗肿瘤双特异性小型化抗体的制作方法

一种靶向治疗和检测双功能的抗肿瘤双特异性小型化抗体的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物工程制药、蛋白质多肽类药物及生物医学工程领域，涉及对人类表皮生长因子受体EGFR1和HER2均具有高亲和力的小型化融合抗体的设计、构建及其在肿瘤靶向诊断和治疗中的应用。该双特异性抗体由HER2特异性结构域和EGFR1特异性结构域通过(G4S)3连接肽串联后经基因重组表达获得，融合蛋白编码基因全长为804bp，编码268个氨基酸，融合蛋白分子量为29kD，其氨基酸序列为SEQ?ID?No:1所示序列。本发明的双特异性小型化抗体相较于EGFR1和HER2抗体联合使用有显著的体内外活性优势，且具有低毒性、非肿瘤部位体内清除快速等优点，在靶向诊断和治疗中均具有高效率，可用于肿瘤诊断和治疗中。
【专利说明】一种靶向治疗和检测双功能的抗肿瘤双特异性小型化抗体
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种对人类表皮生长因子受体EGFRl和HER2均具有高亲和力的小型化融合抗体及其应用，其可用于癌症诊断和治疗。
【背景技术】
[0002]受体酪氨酸激酶ErbB家族在细胞的生长、增殖和分化等生理过程中起到重要的作用。该受体家族包括四个成员:表皮生长因子受体(EGFRUErbBl或HER1)、HER2(ErbB2)、HER3 (ErbB3)和HER4 (ErbB4)。该家族成员均由胞外配体结合结构域、胞内激酶结构域以及跨膜结构域组成，与肿瘤细胞的生物学过程具有密切的联系。
[0003]表皮生长因子(EGF)是EGFRl的天然配体。其与EGFRl结合后，激活了 EGFRl的受体酪氨酸激酶活性，进而激活下游一系列信号通路(如PI3K/Akt)，最终对肿瘤细胞的生长、增殖、分化、迁移起到促进作用。HER2无天然配体，但其能与家族其它受体成员发生异二聚化。当 EGFR 与 HER2 发生二聚化时，HER2 下游通路(RAS/RAF/MAPK、PI3K/Akt、STAT,PLC)也被激活，促进一系列细胞行为。而目前研究表明，HER2高表达的肿瘤通常更具侵袭性，病人也往往预后不良。EGFRl和HER2在多种如乳腺癌、肺腺癌等肿瘤中呈阳性表达，这使它们成为很有前景的肿瘤细胞靶点。并且研究显示，EGFRl和HER2通常在肿瘤细胞行为中协同发生作用，两者共同导致细胞的癌变。当ErbB家族其它成员过表达时，单独靶向于其中单一家族成员的抗肿瘤药物起不到很好的疗效。
[0004]鉴于EGFRl和HER2在肿瘤发生中所扮演的重要角色，大量针对EGFRl和HER2的药物陆续上市，其主要分为大分子单克隆抗体(如西妥昔、赫赛汀)和小分子酪氨酸激酶抑制剂类药物(如伊马替尼、达沙替尼、尼罗替尼和拉帕替尼等)。单克隆抗体类药物分子量通常在150kD左右，其过大的分子量使其进入肿瘤组织细胞的效率较低，体内代谢时间过长，从而导致了其治疗效率较低、体内积蓄毒性较高等缺点；另一方面，目前上市的单克隆抗体都是单一靶向于EGFRl和HER2，由于EGFRl和HER2的协同作用，这些抗体对于EGFR1/HER2双阳性肿瘤显示不出很好的疗效。而小分子酪氨酸激酶抑制剂类药物虽然易于进入肿瘤细胞组织，但缺乏肿瘤主动靶向性是其重要缺陷，而且酪氨酸激酶在人体正常的细胞生理活动中也起着重要的作用，该类药物对非肿瘤部位酪氨酸激酶的无差别抑制也导致了较大的体内毒性；尽管拉帕替尼对于EGFRl和HER2酪氨酸激酶均有较好的抑制效果，但由于靶向特异性缺失所导致的体内毒性也使得该类药物的研发和使用进入了一个瓶颈阶段。

【发明内容】

[0005]本发明公开了一种双重靶向EGFRl和HER2的小型化双特异性抗体，其具有分子量小(只有29kD)且易于进入肿瘤组织、双靶点特异靶向等优点，对于EGFR/HER2过表达肿瘤的治疗具有至关重要的作用。
[0006]体内体外实验均表明本发明的双特异性小型化抗体具有低毒性、非肿瘤部位体内清除快速等优点。其在体内体外均能与表达表皮生长因子受体EGFRl和HER2的肿瘤细胞特异性结合，且对EGF和EGFRl的结合具有强烈的拮抗作用，能够对EGFRl和HER2下游肿瘤增殖、迁移、侵袭相关信号通路进行调控。在艾氏腹水癌小鼠移植瘤治疗试验中，该抗体疗效显著，可用于癌症诊断和治疗。此外，该抗体能够偶联抗肿瘤药物和近红外荧光染料进行活体肿瘤治疗和检测，具有很高的肿瘤治疗和检测效率。
[0007] 最重要的是，无论在体内还是体外，该双特异性抗体均展现了强于相同摩尔浓度的EGFRl特异性抗体和HER2特异性抗体联合使用的靶向活性，起到了协同的效果。
[0008]本发明的EGFR1/HER2双特异性小型化抗体命名为MaAbNA，其能够对EGFR和HER2高表达肿瘤进行体内体外诊断，并单独或偶联传统化疗药成为一种肿瘤治疗药物。该双特异性抗体由HER2(编码氨基酸1-124)和EGFRl (编码氨基酸140-268)特异性结构域依次串联而成，由于其不含抗体恒定区，不仅大大降低了该抗体的分子量(仅为29kD)，使其更易进入肿瘤细胞组织中，在体内代谢更快不会在肾脏中长期积蓄导致肾毒性。为避免各分子之间空间结构的相互干扰，在依次相连的分子中间设计了由(G4S)3组成的柔性连接肽，见图1。
[0009]本发明构建的融合蛋白编码基因全长为804bp，编码268个氨基酸，融合蛋白分子量为29kD，其氨基酸序列为SEQ ID No:1所示序列，其基因编码序列为SEQ ID No: 2所示序列。
[0010]本发明的抗体MaAbNA能与荧光染料罗丹明B通过共价键偶联，用作肿瘤靶向探针。
[0011]本发明的抗体MaAbNA还能与近红外染料通过共价键偶联，用作肿瘤靶向探针。其中近红外染料优选吲哚菁绿(简称ICG)。
[0012]上述肿瘤靶向探针可以按常规方法添加辅料后制备成肿瘤诊断试剂盒。
[0013]本发明的抗体MaAbNA还能够和抗肿瘤药物通过双羧基聚乙二醇共价连接进行肿瘤治疗。优选的抗肿瘤药物是:阿霉素、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶以及阿糖胞苷。
[0014]下面是本发明的抗体MaAbNA体内外活性的试验:
[0015]1.细胞激光共聚焦细胞摄取分析
[0016]人肺腺癌A549细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人乳腺癌MCF-7细胞在共聚焦皿中培养12小时后，加入标记了染料罗丹明B的MaAbNA体外靶向探针(结构为MaAbNA-NH-CO-罗丹明B)共孵育2小时后，吸弃培养液，并用PBS缓冲液洗涤2次后在共聚焦显微镜下观察其荧光强度。结果表明:与标记了罗丹明B的MaAbNA共同孵育的EGFR1/HER2双阳性细胞A549和EGFRl阳性细胞MDA-MB-231均具有较高的荧光强度值，而对EGFRl和HER2低表达细胞MCF-7荧光强度较低，三种细胞的平均荧光强度按如A549>MDA-MB-231>MCF-7的顺序排列，见图2，这说明了本发明双特异性小型抗体MaAbNA对EGFR1/HER2阳性细胞的亲合力。
[0017]MaAbNA的EGFRl特异性结构域和HER2特异性结构域分别来源于EGFRl纳米抗体和HER2亲和抗体。为比较MaAbNA相对于EGFRl纳米抗体、HER2亲和抗体以及两种抗体联合使用的体外亲和力。在激光共聚焦试验中，与MaAbNA探针相同摩尔浓度的EGFRl纳米抗体探针和HER2亲和抗体探针以及两种抗体探针的混合溶液分别作为对照用于A549细胞摄取。结果表明=MaAbNA组平均荧光强度为436±31，EGFRl纳米抗体组为252±19，HER2亲和抗体组为274± 17，两种抗体联合使用组为351 ±21，见图3。这说明了 MaAbNA拥有相较于EGFRl纳米抗体、HER2亲和抗体以及两种抗体联合使用的体外亲和力优势。
[0018]2.EGF体外竞争性试验:
[0019]将A549、MDA-MB-231细胞从12孔板上消化后重悬于PBS溶液，每种细胞分别与罗丹明B标记的表皮生长因子(EGF-罗丹明B) (50nmol/L)共孵育2小时，并通过流式细胞术检测其平均荧光强度。不同浓度的未标记染料的EGF或MaAbNA抗体被加入到孵育后细胞，与染料标记EGF竞争结合细胞膜受体。随着EGF或MaAbNA浓度的升高，细胞平均荧光强度在一定EGF或MaAbNA浓度范围内呈线性下降。无论在A549还是MDA-MB-231细胞中，MaAbNA竞争组的斜率均大于EGF组，这表明MaAbNA对EGF具有显著的竞争性拮抗作用作用，见图4。这进一步证明了 MaAbNA对EGF结合EGFRl的竞争抑制作用。
[0020]3.融合蛋白的活体肿瘤靶向:
[0021]MaAbNA在标记了近红外染料ICG后，作为一种近红外探针被用于体内肿瘤亲合力检测，其结构为MaAbNA-NH-CO-1CG。A549、MDA-MB-231、MCF-7荷瘤裸鼠均被尾静脉给药以MaAbNA-1CG探针。该探针对A549和MDA-MB-231裸鼠移植瘤展示了优秀的靶向能力，而对阴性肿瘤MCF-7靶向效果甚微。在A549和MDA-MB-231移植瘤中，该探针在2小时左右即可靶向到肿瘤部位，在此后72小时内其他脏器的荧光信号逐渐消失，而肿瘤部位荧光信号一直保持较高的信噪比，而MCF-7信噪比较低，三种细胞移植瘤的近红外荧光信噪比按以下顺序排列:A549>MDA-MB-231>MCF-7，见图5。靶向试验结果表明=MaAbNA能够在活体内部环境下靶向至EGFR1/HER2阳性肿瘤，从而使其能够用于活体肿瘤靶向和诊断。
[0022]为比较MaAbNA相对于EGFRl纳米抗体、HER2亲和抗体以及两种抗体联合使用的体内亲和力。在活体肿瘤靶向试验中，与MaAbNA探针相同摩尔浓度的EGFRl纳米抗体探针和HER2亲和抗体探针以及两种抗体探针的混合溶液分别作为对照用于A549细胞移植瘤靶向。结果表明=MaAbNA组肿瘤部位近红外荧光信噪比为436±31，EGFRl纳米抗体组为252±19，HER2亲和抗体组为274± 17，两种抗体联合使用组为351 ±21，见图6。这说明了MaAbNA拥有相较于EGFRl纳米抗体、HER2亲和抗体以及两种抗体联合使用的体内亲和力优势。
[0023]4.体内代谢试验:
[0024]将MaAbNA-1CG探针通过尾静脉给药的方式注入正常裸鼠体内，在24小时内实时检测裸鼠体内近红外荧光信号。结果显示=MaAbNA在进入体内30分钟后就迅速分布到全身，并在4小时后开始从肾脏代谢，24小时后体内就检测不到任何荧光信号，见图7，。这表明MaAbNA的低分子量使其在体内代谢迅速，不会再肾脏内蓄积，不会导致药物的肾脏毒性。
[0025]5.MTT增殖抑制试验:
[0026]A549、MDA_MB_2 31、MCF-7细胞以及正常人肺上皮L2细胞分别于37°C、5% CO2培养箱中培养，待长满90%以上时，用0.25%胰蛋白酶液消化后，制备成单细胞悬液(完全生长培养基)，以3000个细胞/孔铺96孔板，于37°C，5% CO2培养箱中培养，24小时后换用1% FBS的低血清培养液，然后加入MaAbNA抗体至梯度终浓度(2、4、8、16、32、64mg/mL)。以相同浓度梯度的阿霉素和5-氟尿嘧啶为阳性对照，不加药组为阴性对照，同时设置空白对照(不加细胞，其余操作均相同)。72小时后每孔加10 μ L ΜΤΤ，继续于37°C，5% CO2培养箱中培养，4小时后吸弃培养基，每孔加150 μ L DMSO显色，酶标仪检测A570nm-A630nm。细胞增殖抑制率=(A样品-A空)/ (A对-A空)*100%。试验结果(见图8)表明MaAbNA抗体对A549细胞增殖具有显著的抑制能力，该效果强于对照抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶。其对于MDA-MB-231细胞也有一定的抑制效果，而对于阴性细胞MCF-7增殖抑制能力较低。此外，MaAbNA对正常细胞L2几乎没有毒性，与此相对的是传统抗肿瘤药物阿霉素对L2细胞的毒性相当大。
[0027]为检验MaAbNA共价偶联阿霉素后作为抗肿瘤复合药物的细胞增殖抑制效果，以双羧基聚乙二醇(PEG)为Iinker(HOOC-PEG-COOH)两端分别连接MaAbNA和阿霉素上的氨基，形成以MaAbNA为靶向性“弹头”，阿霉素为肿瘤杀伤药物的复合肿瘤靶向治疗药物MaAbNA-阿霉素(结构为 MaAbNA-NH-CO-PEG-CO-NH-阿霉素)。A549、MDA-MB-231 细胞分别于37°C、5% CO2培养箱中培养，待长满90%以上时，用0.25%胰蛋白酶液消化后，制备成单细胞悬液(完全生长培养基)，以3000个细胞/孔铺96孔板，于37 °C，5% CO2培养箱中培养，24h后换用1% FBS的低血清培养液，然后加入梯度终浓度的MaAbNA-阿霉素，相同浓度梯度的阿霉素作为对照组药物。试验结果见图9，显示MaAbNA-阿霉素对A549和MDA-MB-231细胞的增殖抑制能力相较于阿霉素有了显著的增强。该结果表明MaAbNA对于EGFRl或HER2阳性细胞的靶向能力能够更好地使阿霉素进入肿瘤细胞，发挥出更强的肿瘤细胞杀伤能力。这证明了连接传统化疗药物后的MaAbNA是一种高选择性高效的抗肿瘤复合药物。
[0028]6.体内治疗实验:
[0029]将24只肿瘤大小、体重相近的艾氏腹水(EAC)移植瘤分为4组，每组6只，分别给药MaAbNA抗体、阿霉素、5-氟尿嘧啶、生理盐水，给药剂量均为6mg/kg，给药方式为尾静脉注射。试验期间每2天给一次药，测一次肿瘤直径和体重，根据公式V = ab2/2计算肿瘤体积(a为肿瘤长径，b为肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率，观察体重变化。同时根据小鼠的存活情况绘制存活 曲线。15天后处死小鼠，剥离肿瘤拍照并进行组织切片研究。在试验中，MaAbNA展示了很好的治疗效果，见图10。研究结果表明:MaAbNA给药组的肿瘤生长速率远低于生理盐水给药组小鼠，其抑瘤率为45.7%，疗效强于5-氟尿嘧啶，而略弱于阿霉素；相对于阿霉素给药组小鼠明显下降的体重和较高的死亡率，MaAbNA给药组小鼠体重下降较不明显，15天存活率为100%，这展现了其对正常细胞组织的低毒性。
[0030]为比较MaAbNA相对于EGFRl纳米抗体和HER2亲和抗体联合使用的抑瘤率，EGFRl纳米抗体和HER2亲和抗体的混合溶液也被作为药物注射到一组荷瘤小鼠中，每2天给一次药。15天后处死小鼠，将肿瘤剥离并拍照。结果表明MaAbNA组抑瘤率为45.7%，大于联合治疗组的37.3%，图11，这证明了 MaAbNA相对于EGFRl纳米抗体和HER2亲和抗体联合使用更高的抑瘤效率。
[0031]综上所述，激光共聚焦体内亲和力试验、体外EGF拮抗试验、体内近红外染料标记抗体荷瘤鼠靶向试验、MTT细胞增殖抑制试验、共价偶联阿霉素后MaAbNA的MTT增值抑制试验、艾氏腹水癌小鼠移植瘤治疗试验均证明了 MaAbNA的EGFR1/HER2靶向活性，对EGF结合EGFRl的竞争性拮抗作用，对正常组织细胞的低毒性，以及对EAC移植瘤小鼠的治疗活性。
[0032]并且在以上试验中MaAbNA体现了相较于EGFRl纳米抗体、HER2亲和抗体以及两者联合使用的活性优势。究其原因，是因为当联合使用EGFRl纳米抗体和HER2亲和抗体时，两者之间的空间位阻会使其相互干扰，降低其分别结合EGFRl和HER2的效率。而MaAbNA设计了(G4S)3柔性肽连接双功能结构域，有效避免了结构域之间的空间位阻，提高了其结合特异性受体的效率。
[0033] 本发明的MaAbNA抗体分子量小(仅29kD)、体内代谢快、肿瘤穿透力强，对正常组织细胞毒性低，对于EGFRl和HER2均有靶向性，具有对EGFR1/HER2阳性肿瘤生长的抑制能力，既可以作为一种高特异性肿瘤靶向探针，能够携带荧光染料进行肿瘤诊断和治疗，也可以单独或与传统化疗药物复合作为一种高效、小型化抗肿瘤药物，具有良好的应用前景。
【专利附图】

【附图说明】
[0034]图1是本发明双特异性抗体的结构设计示意图
[0035]图2是激光共聚焦分析A549、MDA-MB-231、MCF-7细胞对MaAbNA体外探针的摄取
[0036]图3是MaAbNA相对于EGFRl纳米抗体、HER2亲和抗体以及两种抗体联合使用的体外亲和力比较
[0037]图4是MaAbNA竞争性拮抗EGF结合A549、MDA-MB-231细胞
[0038]图5是MaAbNA体内探针靶向A549、MDA_MB_231、MCF-7细胞移植瘤
[0039]图6是近红外成像比较EGFRl纳米抗体/HER2亲和抗体联合使用和MaAbNA的体内肿瘤靶向性
[0040]图7是体内近红外检测MaAbNA在小鼠体内的代谢情况
[0041 ] 图8是MTT试验检测MaAbNA对A549、MDA_MB_231、MCF-7、L2细胞的增殖抑制
[0042]图9是MTT试验检测MaAbNA-阿霉素复合药物对A549和MDA-MB-231细胞的增殖抑制
[0043]图10是体内治疗试验，其中A为抑瘤率，B为剥离肿瘤照片，C为小鼠体重曲线，D为小鼠生存曲线，E为肿瘤组织切片分析
[0044]图11是体内治疗试验中比较EGFRl纳米抗体/HER2亲和抗体联合使用和MaAbNA的抑瘤率
[0045]图12是双特异性抗体的表达质粒构建示意图
[0046]图13是不同浓度咪唑HisTrap Ni2+柱洗脱液SDS-PAGE电泳分析，其中1、2、3、4、
5、6、7、8 分别为 0、5、10、20、50、100、500mmol/L 咪唑洗脱液
[0047]图14是MaAbNA电泳分析分子量
[0048]图15是MaAbNA紫外吸收
【具体实施方式】
[0049]实施例1
[0050]重组表达质粒pET22b_MaAbNA的构建:
[0051](I)EGFRl (基因编码序列1_372)和HER2 (基因编码序列420-804)特异性结构域的蛋白序列由文献中获得，通过(G4S) 3柔性肽将HER2特异性结构域和EGFRl特异性结构域依次串联后，根据其整体氨基酸序列反推出DNA序列，并根据大肠杆菌偏好密码子优化，即为SEQ ID No:2所示MaAbNA基因编码序列。该重组基因序列在5’端和3’端分别引入限制性内切酶(BamHI和NcoI)酶切位点后由南京金斯瑞生物科技公司合成。基因合成采用化学合成法，其合成从SEQ ID No:2所示DNA序列的3’端碱基开始,具体反应步骤如下:[0052]①脱保护基
[0053]用三氯乙酸脱去连结在可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass,CPG)固相合成柱上的核苷酸的保护基团二甲氧基三苯甲基(DMT)，获得游离的5’ -羟基端，以供下一步缩合反应。
[0054]②活化
[0055]将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3’ -端已被活化，但5’ -端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
[0056]③连接
[0057]亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’ -羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
[0058]④封闭
[0059]缩合反应后为了防止连在CPG上的未参与反应的5’-羟基在随后的循环反应中被延伸，通过乙酰化来封闭此端羟基，乙酰化试剂采用乙酸酐/N-甲基咪唑溶液。
[0060]⑤氧化
[0061]缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱 水解，用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。
[0062]经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5’-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程至SEQ ID No:2所示DNA序列的5’端碱基为止，即可得到DNA片段粗品。经脱保护基和高效液相色谱(HPLC)纯化后即可得到SEQ ID No: 2所示DNA序列片段。
[0063](2)合成基因序列和pET22b表达载体在37°C下均由BamHI和NcoI限制性内切酶双酶切3小时。双酶切后合成基因序列和pET22b表达载体以1:3的比例通过T4连接酶作用16°C下反应12小时后，MaAbNA基因序列被插入至pET22b表达载体，得到重组表达载体pET22b-MaAbNA，见图 12。
[0064]实施例2
[0065]融合蛋白的表达纯化与复性:
[0066](I)将重组质粒pET22b-MaAbNA转化入大肠杆菌BL21star?(DE3)，用含Amp抗性的SOB平板筛选阳性克隆。转化菌株在37°C，200rpm条件下培养过夜后，1:100转接至新鲜LB培养基中，继续培养至菌液OD值约为600，加入终浓度为lmmol/L IPTG诱导蛋白表达，5小时后终止诱导，将菌液离心并收集菌体。将诱导后的重组菌体重悬并超声裂解后，取沉淀溶解于8mol/L尿素溶液中。
[0067](2)使用HisTrap Ni2+柱对MaAbNA重组蛋白包涵体进行纯化，将包涵体溶液上样后，依次用平衡缓冲液、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L>200mmol/L>500mmol/L咪唑洗脱，收集洗脱组分，SDS-PAGE电泳检测后发现MaAbNA在100mmol/L咪唑洗脱液中，见图13。在4°C条件下，将HisTrap Ni2+柱纯化获得的MaAbNA重组蛋白包涵体溶液通过梯度透析复性。复性蛋白经S印hadex G-75分子筛进一步纯化。最终产物即为SEQID No:1所示的氨基酸序列。SDS-PAGE蛋白电泳分析其分子量为29kD，见图14，紫外吸收光谱也只在波长280nm处有单吸收峰，图15。
[0068]实施例3
[0069]MaAbNA-罗丹明B体外诊断探针的合成:
[0070](I)取罗丹明B4.79mg及(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 2.1lmg两者混合溶解于Iml 二甲基甲酰胺(DMF)后于室温避光搅拌反应2小时。反应后溶液再加入1.38mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和6mg MaAbNA继续避光搅拌反应，12小时后停止反应。
[0071](2)反应产物上样S印hadex G-75分子筛柱，并以PBS缓冲液(ρΗ8.0)冲柱，收集红色聚集色带。收集产物即为MaAbNA-罗丹明B体外诊断探针。
[0072]实施例4
[0073]MaAbNA-1CG体内诊断探针的合成
[0074](I)取ICGlOmg及(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 2.1 Img两者混合溶解于Iml 二甲基甲酰胺(DMF)后于室温避光搅拌反应2小时。反应后溶液再加入1.38mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和6mg MaAbNA继续避光搅拌反应，12小时后停止反应。
[0075](2)反应产物上样S印hadex G-75分子筛柱，并以PBS缓冲液(ρΗ8.0)冲柱，收集蓝色聚集色带。收集产物即为MaAbNA-罗丹明B体外诊断探针。
[0076]实施例5
[0077]MaAbNA-阿霉素抗肿瘤复合药物的合成:
[0078](I)将其中一端羧基酯化保护后的双羧基PEG200(结构为H00C-PEG-C0-0_CH2-CH3) 6.5mg与(3- 二甲氛基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 4.22mg两者混合溶解于Iml 二甲基甲酰胺(DMF)后于室温避光搅拌反应2小时，再加入2.76mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1.5mg阿霉素，避光搅拌反应6小时后将反应产物通过葡聚糖凝胶柱纯化。
[0079](2)将纯化产物pH用氢氧化钠溶液调至12.0后,在80°C水浴锅中反应5分钟，以水解为保护双羧基PEG —端羧基的酯键(反应后结构为阿霉素-PEG-COONa)。将反应后溶液用盐酸调pH至7.0后，透析脱盐并冻干。
[0080](3)取4mg冻干后产物与2.llmg(3_ 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)混合溶解于Iml 二甲基甲酰胺(DMF)后于室温避光搅拌反应2小时，再加入1.38mgN-羟基丁二酰亚胺(NHS)和6mg MaAbNA，避光搅拌反应12小时。
[0081](4)反 应产物上样S印hadex G-75分子筛柱，并以PBS缓冲液(ρΗ8.0)冲柱，收集红色聚集色带。收集产物即为MaAbNA-阿霉素抗肿瘤复合药物。
[0082]
【权利要求】
1.一种靶向抗肿瘤抗体，其序列为SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
2.一种肿瘤靶向探针，由权利要求1的抗肿瘤抗体与荧光染料罗丹明B通过共价键偶联。
3.一种肿瘤靶向探针，由权利要求1的抗肿瘤抗体与近红外染料通过共价键偶联。
4.权利要求3的靶向探针，其中近红外染料是吲哚菁绿。
5.一种肿瘤诊断试剂盒，含有权利要求2或3的靶向探针及辅料。
6.一种抗肿瘤药物，由权利要求1的抗体和抗肿瘤药物通过双羧基聚乙二醇共价连接。
7.权利要求 2或3的靶向探针用于制备肿瘤诊断试剂盒的用途。
【文档编号】A61K47/42GK103951754SQ201410117420
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年3月26日 优先权日:2014年3月26日
【发明者】顾月清, 丁笠 申请人:中国药科大学