一种增强免疫力及改善睡眠的保健食品及其二步发酵制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种增强免疫力及改善睡眠的保健食品及其二步发酵制备方法，该方法包括：灵芝固体发酵：以含有增强免疫力功能的天然组分为药性培养基质，接种灵芝液体菌种进行双向固体发酵制备具有增强免疫力功能的药性菌质；乳酸菌液体深层发酵；以药性菌质为原料，粉碎后添加酵母粉、谷氨酸钠、水制成发酵培养基，接种乳酸菌进行液体深层发酵生产促进睡眠的γ-氨基丁酸，制备同时具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；采用发酵液，制备成不同剂型的增强免疫力和改善睡眠的保健食品。本发明制备的保健食品同时具有增强免疫力和改善睡眠的功能，市场前景广阔，该制备方法稳定，适合大规模生产。
【专利说明】一种增强免疫力及改善睡眠的保健食品及其二步发酵制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物保健食品及其制备领域，具体涉及一种增强免疫力及改善睡眠的保健食品及采用灵芝、乳酸菌固液二步发酵制备该保健食品的方法。
【背景技术】
[0002]随着老年人口的不断增长，中国已迈入老龄化社会，老年化进程在不断加速，据统计到2013年老年人口数量达到2.02亿，老龄化水平达到14.8%，提高老年人的健康和生活质量已成为社会焦点。免疫力低下和睡眠障碍是影响老年人健康和生活质量的重大问题，因此增强免疫力和改善睡眠的保健食品有巨大的市场前景。
[0003]灵芝味甘、性平，具有扶正固本的功效，被《神农本草经》列为上品，现代医学研究证明灵芝是最佳的免疫功能调节剂和激活剂，可显著提高机体的免疫功能。目前已商业化生产的灵芝产品很多，根据国家药监局网站数据统计已批准的增强免疫力和改善睡眠的灵芝保健食品有16款，这些产品大多以灵芝孢子粉、灵芝或灵芝提取物为原料，存在成本高、周期长、林木资源消耗量大等问题。以生物发酵的灵芝菌丝体为原料则可解决这些问题，如专利200910186521.X《复方发酵灵芝胶囊及其制备方法》以发酵灵芝菌粉和硒元素配方制成具有增强免疫力、改善睡眠的复方产品，专利96109095.2《中国灵芝保健饮料》以灵芝液体深层发酵制备灵芝保健饮料。
[0004]除传统的灵芝固体发酵和液体发酵外，近年来有学者提出灵芝新型固体发酵技术一双向发酵技术，即利用中药等含生物活性成分的药性基质和灵芝进行发酵，此过程中药性基质对灵芝菌丝体生长产生影响，灵芝真菌酶系对药性基质改造产生1+1>2的生理效果，目前已有大量灵芝与中药双向发酵的报道，如灵芝-黄芪、灵芝-丹参、灵芝-川穹、灵芝-草乌、灵芝-银杏、灵芝-雷公藤等、灵芝-巴豆等的双向发酵，证明经过双向发酵灵芝活性成分显著提高，同时灵芝发酵对药性基质也具有增效减毒的作用。目前灵芝双向发酵仅限于灵芝与单一药材的发酵，并无灵芝与具有同一功效的多种药材间的双向发酵。
[0005]灵芝除了具有增强免疫力功效外，还具有改善睡眠的功效，但是它起效慢，需要长期服用才能起效。Y-氨基丁酸是一种重要的抑制性神经递质，现代研究证明它可起到快速促进睡眠的作用，是一种速效助眠因子。Y-氨基丁酸和灵芝复方可起到速效和长效改善睡眠的效果，目前并无Y-氨基丁酸和灵芝复方产品的报道。
[0006]卫生部2009年第12号公告批准乳酸菌发酵法制备的Y-氨基丁酸为新资源食品。从传统发酵食品中筛选的乳酸菌安全性高，可用于Y-氨基丁酸的生产，如专利200780006225.6《能够生产Y -氨基丁酸的乳酸菌》从未精制的酱油中分离到的乳酸菌凝乳酶乳酸杆菌，专利200910183478.1《一株高效转化L-谷氨酸为Y -氨基丁酸乳酸菌的选育》从自制酸菜中筛选的植物乳杆菌。但是乳酸菌只能利用单糖、二糖等小分子碳源，不能直接利用含淀粉以及纤维质的天然基质，而灵芝具有降解淀粉和纤维质的酶系，可将淀粉质、纤维质分解为可供乳酸菌利用的小分子碳源，将灵芝发酵与乳酸菌发酵相耦合进行分步发酵不仅可解决这一问题，乳酸菌还可对灵芝菌质进行进一步分解和转化，更易吸收和利用。
【发明内容】
[0007]针对目前并无灵芝和Y -氨基丁酸复方产品，本发明提供一种以功能强化的灵芝药性菌质和Y-氨基丁酸配方，同时具有增强免疫力和改善睡眠功能的保健食品，同时提供该保健食品利用灵芝、乳酸菌二步发酵的制备方法。
[0008]一种增强免疫力和改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，包括如下步骤:
[0009](I)灵芝固体发酵:以含有增强免疫力功能的天然组分为药性培养基质，接种灵芝液体菌种进行双向固体发酵制备具有增强免疫力功能的药性菌质；
[0010](2)乳酸菌液体深层发酵；以步骤(I)的药性菌质为原料，粉碎后添加酵母粉、谷氨酸钠、水制成发酵培养基，接种乳酸菌进行液体深层发酵生产促进睡眠的Y-氨基丁酸，制备同时具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；
[0011](3)采用步骤(2)的发酵液，制备成不同剂型的增强免疫力和改善睡眠的保健食
品O
[0012]本发明第一步以含有增强免疫力功能的天然组分作为药性培养基质，接种灵芝进行双向固体发酵，通过药性培养基质对灵芝菌丝体生长代谢过程的影响和灵芝真菌酶系对药性培养基质改造在内的双向性固体发酵后，得到兼具药性基质和灵芝增强免疫力功能的药性菌质；第二步以灵芝降解后含有小分子碳源等营养物质的药性菌质为原料，添加酵母粉以及谷氨酸钠制作液体培养基，接种可产生Y -氨基丁酸的乳酸菌进行发酵，制备具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；最后，发酵液经过过滤、浓缩、喷雾干燥、造粒、装囊、压片等工艺制备成保健食品。
[0013]步骤(I)中，所述的灵芝菌种可采用现有技术，灵芝液体菌种采用现有的常规工艺制得，灵芝菌种为灵芝ACCC50621，即中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)保藏的菌种。
[0014]步骤(I)中，所述的灵芝液体菌种的接种量为2%_10%，即所述的灵芝液体菌种的加入的体积量(HiL)为药性培养基质的质量(g)的2%-10% (mL/g),以IOOg药性培养基质为基准，加入2-10mL的灵芝液体菌种。
[0015]步骤(I)中，所述的药性培养基质的制备:先称取以下重量百分含量的原料:全粒大麦70%-80%、山药10%-20%、黄芪2%-3%、铁皮枫斗1%_2%、西洋参1%_2%、杜仲1%_2%、淫羊藿1%-2%、石膏粉0.5%-1.5%，将各组分混合、粉碎，然后加水至水分含量为60%-65%，1160C -126°C灭菌0.5h-l.5h。优选的，所述的药性培养基质的制备:先称取以下重量百分含量的原料:全粒大麦75%、山药13%、黄芪3%、铁皮枫斗2%、西洋参2%、杜仲2%、淫羊藿2%、石膏粉1% ;将各组分混合、粉碎，然后加水至水分含量为60%-65%，121°C灭菌lh。
[0016]步骤(I)中，所述的双向固体发酵的条件为:发酵温度在25_28°C，发酵时间在20-25天，以该灵芝固体发酵条件为宜。
[0017]步骤(2)中，所述的乳酸菌为植物乳酸菌，优选的为从四川泡菜中筛选的植物乳杆菌LW106 (保藏编号为=CGMCC N0.5655)，即采用中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC保藏的菌种，植物乳酸菌液体菌种采用MRS培养基28°C静置培养48h获得。
[0018]步骤(2)中，所述的发酵培养基采用以下重量份的原料:水1000重量份、药性菌质40-50重量份、酵母粉5-10重量份、谷氨酸钠15-20重量份，将药性菌质、酵母粉和谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5-6的缓冲液，1160C _126°C灭菌20min-40min。作为优选，所述的发酵培养基采用以下重量份的原料:水1000重量份、药性菌质50重量份、酵母粉7.5重量份、谷氨酸钠20重量份，将药性菌质、酵母粉和谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5.5的缓冲液，121°C灭菌30min。
[0019]步骤(2)中，所述的乳酸菌的接种量为1%_5%，即所述的乳酸菌的加入的体积量为发酵培养基体积的1%_5%。
[0020]步骤(2)中，所述的液体深层发酵的条件为:发酵温度在28_32°C，发酵时间在48-72h，以该发酵条件为宜。
[0021]步骤(2)中，所述的发酵液中Y-氨基丁酸的含量为9_12g/L。
[0022]步骤(3)中，所述的发酵液，通过过滤、浓缩、喷雾干燥、制粒、装囊、压片等工艺制备成不同剂型的保健食品。
[0023]所述的增强免疫力和改善睡眠的保健食品的剂型为口服剂型，优选为片剂或胶囊，发酵液经过滤、浓缩、喷雾干燥、制粒、压片后得到片剂，发酵液经过滤、浓缩、喷雾干燥、制粒、装囊后得到胶囊。具体地，发酵液首先经过过滤、浓缩、喷雾干燥成粉末，粉末过筛后经沸腾制粒得干燥颗粒，颗粒用颗粒整粒机以20目筛进行整粒，整粒所得颗粒加入相对于整粒所得颗粒的重量0.5%崩解剂羧甲淀粉钠和相对于整粒所得颗粒的重量0.1%润滑剂硬脂酸镁在多维运动混合机中充分混匀5分钟灌胶囊或压成片剂，每粒胶囊/片剂0.35g。
[0024]通过上述二步发酵制备方法制备的增强免疫力和改善睡眠的保健食品，具有同时增强免疫力和改善睡眠的保健功效。
[0025]灵芝与增强免疫力的药性培养基质双向发酵可制备增强免疫力功能显著的药性菌质，而药性培养基质通过灵芝的降解作用，可为乳酸菌发酵产Y -氨基丁酸提供营养和碳源，同时通过乳酸菌的降解转化，药性培养基质更易吸收和利用，因此采用灵芝和乳酸菌二步发酵可制备可同时增强免疫力和改善睡眠的保健食品。
[0026]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0027]( I)本发明根据灵芝具有增强免疫力和改善睡眠功能，Y -氨基丁酸具有快速改善睡眠功能，二者配伍具有显著增强免疫力和改善睡眠的功能，提供了一种以功能强化的灵芝药性菌质和Y-氨基丁酸配伍的可同时增强免疫力和改善睡眠的保健食品及其制备方法，该方法采用二步发酵法将食用菌发酵与乳酸菌发酵有机结合，其中第一步利用灵芝和具备增强免疫力功能药性培养基质的双向固体发酵制备兼具灵芝和药性基质增强免疫力功能的药性菌质，该过程不仅能产生1+1 > 2的生理功效，还可将药性培养基质中的大分子碳源降解为乳酸菌易于利用的小分子碳源，为第二步乳酸菌液体深层发酵产生改善睡眠的Y -氨基丁酸提供必要的营养和碳源，同时通过乳酸菌的降解和转化药性菌质也更易吸收、利用。
[0028](2)本发明制备的保健食品经实验证明具有增强免疫力和改善睡眠化功能。
[0029](3)本发明采用的制备方法，不仅原料成本低，整个生产过程都采用低温发酵，条件温和，没有毒害物质的摄入，产品安全性、附加值高，可实现规模化生产，市场前景广阔。
[0030](4)本发明制备的保健食品采用片剂、胶囊剂型，方便携带及服用。【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为本发明增强免疫力及改善睡眠保健食品的二步发酵制备方法流程图。【具体实施方式】
[0032]以下按照图1工艺流程对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。以下没有特别说明的情况下，百分数均是指重量百分数。
[0033]实施例1
[0034]1、灵芝固体发酵:
[0035]①药性培养基质的制作
[0036]配方:全粒大麦80%、山药13.5%、黄芪2%、铁皮枫斗1%、西洋参1%、杜仲1%、淫羊藿1%、石骨粉0.5% ；
[0037]配制方法:按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分重量含量为65% ;121°C灭菌lh，得到药性培养基质；
[0038]②接种发酵
[0039]将灵芝ACCC50621的液体菌种(常规工艺制备)按3%体积质量比接种到①中药性培养基质，即灵芝ACCC50621液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的3% (mL/g)，25°C培养25天制备具有增强免疫力功能的药性菌质；
[0040]2、乳酸菌液体深层发酵:
[0041]①发酵培养基制作
[0042]配方:药性菌质40g、酵母粉5g,谷氨酸钠15g,自来水IL (即IOOOg)；
[0043]配制方法:按配方比例将药性菌质、酵母粉、谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成PH为5.5的缓冲液，121°C灭菌30min，得到发酵培养基；
[0044]②接种发酵
[0045]将从四川泡菜中筛选的植物乳杆菌LW106 (保藏编号为:CGMCCN0.5655)液体菌种(MRS培养基28°C静置培养48h)按1%比例接种到①中发酵培养基，即植物乳杆菌的加入的体积量为发酵培养基体积的1%，28°C静置培养72h制备具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；
[0046]3、第2步制备的发酵液首先经过过滤、浓缩、喷雾干燥成粉末，粉末过筛后经沸腾制粒得干燥颗粒，颗粒用颗粒整粒机以20目筛进行整粒，整粒所得颗粒加入相对于整粒所得颗粒重量的0.5%崩解剂羧甲淀粉钠和相对于整粒所得颗粒重量的0.1%润滑剂硬脂酸镁在多维运动混合机中充分混匀5分钟压成片剂，每片0.35g。
[0047]实施例2
[0048]1、灵芝固体发酵:
[0049]①药性培养基质的制作
[0050]配方:全粒大麦80%、山药13.5%、黄芪2%、铁皮枫斗1%、西洋参1%、杜仲1%、淫羊藿1%、石骨粉0.5% ；
[0051]配制方法:按配方比例将各组分混合、粉碎,加水至水分重量含量为60% ;121°C灭菌lh，得到药性培养基质；
[0052]②接种发酵[0053]将灵芝ACCC50621的液体菌种(常规工艺制备)按3%体积质量比接种到①中药性培养基质，即灵芝ACCC50621液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的3% (mL/g)，25°C培养25天制备具有增强免疫力功能的药性菌质；
[0054]2、乳酸菌液体深层发酵:
[0055]①发酵培养基制作
[0056]配方:药性菌质40g、酵母粉5g,谷氨酸钠15g,自来水IL (即IOOOg)；
[0057]配制方法:按配方比例将药性菌质、酵母粉、谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成PH为5.5的缓冲液，121°C灭菌30min，得到发酵培养基；
[0058]②接种发酵
[0059]将从四川泡菜中筛选的植物乳杆菌LW106 (保藏编号为:CGMCCN0.5655)液体菌种(MRS培养基28°C静置培养48h)按1%比例接种到①中发酵培养基，即植物乳杆菌的加入的体积量为发酵培养基体积的1%，28°C静置培养72h制备具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；
[0060]3、第2步制备的发酵液首先经过过滤、浓缩、喷雾干燥成粉末，粉末过筛后经沸腾制粒得干燥颗粒，颗粒用颗粒整粒机以20目筛进行整粒，整粒所得颗粒加入相对于整粒所得颗粒重量的0.5%崩解剂羧甲淀粉钠和相对于整粒所得颗粒重量的0.1%润滑剂硬脂酸镁在多维运动混合机中充分混匀5分钟装成胶囊，每粒0.35g。
[0061]实施例3
[0062]1、灵芝固体发酵:
[0063]①药性培养基质的制作
[0064]配方:全粒大麦75%、山药13%、黄芪3%、铁皮枫斗2%、西洋参2%、杜仲2%、淫羊藿2%、石骨粉1% ；
[0065]配制方法:按配方比例将各组分混合、粉碎,加水至水分重量含量为63% ;121°C灭菌lh，得到药性培养基质；
[0066]②接种发酵
[0067]将灵芝ACCC50621的液体菌种(常规工艺制备)按5%体积质量比接种到①中药性培养基质，即灵芝ACCC50621液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的5% (mL/g)，28°C培养20天制备具有增强免疫力功能的药性菌质；
[0068]2、乳酸菌液体深层发酵:
[0069]①发酵培养基制作
[0070]配方:药性菌质50g、酵母粉7.5g,谷氨酸钠20g,自来水IL (即IOOOg)；
[0071]配制方法:按配方比例将药性菌质、酵母粉、谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成PH为5.5的缓冲液，121°C灭菌30min，得到发酵培养基；
[0072]②接种发酵
[0073]将从四川泡菜中筛选的植物乳杆菌LW106 (保藏编号为:CGMCCN0.5655)液体菌种(MRS培养基28°C静置培养48h)按1%比例接种到①中发酵培养基，即植物乳杆菌的加入的体积量为发酵培养基体积的1%，32°C静置培养48h制备具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；
[0074]3、第2步制备的发酵液首先经过过滤、浓缩、喷雾干燥成粉末，粉末过筛后经沸腾制粒得干燥颗粒，颗粒用颗粒整粒机以20目筛进行整粒，整粒所得颗粒加入相对于整粒所得颗粒重量的0.5%崩解剂羧甲淀粉钠和相对于整粒所得颗粒重量的0.1%润滑剂硬脂酸镁在多维运动混合机中充分混匀5分钟压成片剂，每片0.35g。
[0075]实施例4
[0076]1、灵芝固体发酵:
[0077]①药性培养基质的制作
[0078]配方:全粒大麦75%、山药13%、黄芪3%、铁皮枫斗2%、西洋参2%、杜仲2%、淫羊藿2%、石骨粉1% ；
[0079]配制方法:按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分重量含量为62% ;121°C灭菌lh，得到药性培养基质；
[0080]②接种发酵
[0081]将灵芝ACCC50621的液体菌种(常规工艺制备)按5%体积质量比接种到①中药性培养基质，即灵芝ACCC50621液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的5% (mL/g)，28°C培养20天制备具有增强免疫力功能的药性菌质；
[0082]2、乳酸菌液体深层发酵:
[0083]①发酵培养基制作
[0084]配方:药性菌质50g、酵母粉?.5g,谷氨酸钠20g,自来水IL (即1000g)；
[0085]配制方法:按配方比例将药性菌质、酵母粉、谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成PH为5.5的缓冲液，121°C灭菌30min，得到发酵培养基；
[0086]②接种发酵
[0087]将从四川泡菜中筛选的植物乳杆菌LW106 (保藏编号为:CGMCCN0.5655)液体菌种(MRS培养基28°C静置培养48h)按1%比例接种到①中发酵培养基，即植物乳杆菌的加入的体积量为发酵培养基体积的1%，32°C静置培养48h制备具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；
[0088]3、第2步制备的发酵液首先经过过滤、浓缩、喷雾干燥成粉末，粉末过筛后经沸腾制粒得干燥颗粒，颗粒用颗粒整粒机以20目筛进行整粒，整粒所得颗粒加入相对于整粒所得颗粒重量的0.5%崩解剂羧甲淀粉钠和相对于整粒所得颗粒重量的0.1%润滑剂硬脂酸镁在多维运动混合机中充分混匀5分钟装成胶囊，每粒0.35g。
[0089]试验例I
[0090]毒理试验:
[0091]试验目的:检验产品是否具有毒性
[0092]试验材料:实施例4制得的胶囊。
[0093] 样品:人体口服推荐摄入量为每日两次，每次两粒，每粒0.35g/粒(体重按60kg计),0.03g/kg.bw,取胶囊内容物进行试验。
[0094]实验动物:清洁级ICR小鼠、SD大鼠及饲料。
[0095]饲养条件:温度20-25°C、相对湿度40%_70%的屏障系统。
[0096]试验方法:
[0097]小鼠急性经口毒性试验:取实施例4制得的胶囊内容物，用无菌水配制成0.500g/mL,按最大灌胃量20mL/kg.bw —日内二次性灌胃给养,受试物给予剂量为20.0g/kg.bw。[0098]Ames试验:取实施例4制得的胶囊内容物，用无菌水配制成0.500g/mL,为5000ug/皿的剂量，试验设5个剂量，1000、200、40、8ug/皿4个剂量用无菌水按一定倍比逐级稀释配制成10、2、0.4,0.08mg/mL，加样量均为0.1mL/皿，加入0.1mL/皿，同时设阳性、阴性及溶剂对照，计数每皿回变菌落数。
[0099]小鼠骨髓细胞微核试验:以40mg/kg *bw剂量的环磷酰胺为阳性对照,无菌水为阴性对照，试验组3个剂量分别为10.0g/kg.bw、5.0g/kg.bw、2.5g/kg.bw,取实施例4制得的胶囊内容物用无菌水配制成0.5,0.25,0.125g/mL,以20mL/kg -bw灌胃2次，采用30h给受试物法，两次给样间隔24h，第二次给样6h后处死动物，取胸骨常规制片、镜检、每鼠计数1000个骨髓嗜多染红细胞，观察含微核的嗜多染红细胞并观察微核发生率。
[0100]小鼠精子畸形试验:以40mg/kg *bw剂量的环磷酰胺为阳性对照，无菌水为阴性对照，试验组3个剂量分别为10.0g/kg *bw、5.0g/kg *bw、2.5g/kg *bw,取实施例4制得的胶囊内容物用无菌水配制成0.5,0.25,0.125g/mL,以20mL/kg.bw灌胃，每天I次，连续5d。于首次给样后的第35天处死动物，取两侧附睾精子滤液按常规制片、镜检，每鼠计数1000个完整的精子，计算精子畸形发生率。
[0101]30天喂养试验:实施例4制得的胶囊人体推荐量1.4g/人/天，按人体推荐量的30、65、100 倍设 0.70g/kg.bw/d、l.52g/kg.bw/d、2.33g/kg.bw/d 设三个剂量组，另设一个空白对照组Og/kg.bw,受试样品掺入基础饲料中饲喂大鼠,连续喂养30天,每周称I次体重和2次食物摄入量，计算每周及总的食物利用率，每天观察有无中毒变现和死亡，试验结束观察血液学、血液生化、脏器系数指标，并进行病理学检查。
[0102]试验结果:
[0103]1、急性经口毒性试验结果:受试样品对雌雄性小鼠急性经口的最大耐受量(MTD)均大于20.0g/kg.bw,属无毒级。
[0104]2、三项遗传毒性试验结果:Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验结果均为阴性。
[0105]3、30天喂养试验结果:实验期间，动物生长发育良好，各剂量组体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变，血液学指标与生化各项指标均在正常范围，各脏器病理学检查均未见与受试品相关的病理改变、给予人体推荐量100倍的受试物未观察到有害作用。
[0106]试验例2
[0107]增强免疫力功能试验:
[0108]试验目的:检验产品是否具有增强免疫力的功能
[0109]试验材料:实施例4制得的胶囊。
[0110]样品:人体口服推荐摄入量为每日两次，每次两粒，每粒0.35g/粒(体重按60kg计),0.03g/kg.bw,取胶囊内容物进行试验。
[0111]实验动物:清洁级ICR小鼠及饲料。
[0112]饲养条件:温度20-25°C、相对湿度40%_70%的屏障系统。
[0113]试验方法:按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)评价标准进行动物实验，设低、中、高3个剂量和阴性对照组(无菌水)，低、中、高3个剂量组分别相当于人用最大推荐剂量的 5 倍、10 倍、30 倍，即 0.15g/kg.bw/d,0.30g/kg.bw/d,0.90g/kg.bw/d,低、中、高3个剂量配制浓度分别为15、30、90mg/mL。经口每日一次给予小鼠相应剂量的受试物，小鼠灌胃量为10mL/kg.bw，连续灌胃一个月后测定各增强免疫力功能指标。
[0114]实验结果如表1、2 和 3 所示,经口给小鼠 0.15g/kg.bw/d, 0.30g/kg.bw/d, 0.90g/kg.bw/d低、中、高3个剂量的受试样品，中、高剂量组能显著提高小鼠脾淋巴细胞转化、提高小鼠抗体生成细胞，P〈0.05，高剂量组能提高小鼠NK细胞活性，P〈0.01。受试物对小鼠体重、胸腺/体重比值、脾脏/体重比值、迟发型变态反应、血清溶血素以及单核巨噬细胞功能未见明显影响(P>0.05)，说明该样品具有增强免疫力的功能。
[0115]具体实验结果数据如下:
[0116]表1对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖能力的影响(n=10,x土s)
[0117]
【权利要求】
1.一种增强免疫力和改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)灵芝固体发酵:以含有增强免疫力功能的天然组分为药性培养基质，接种灵芝液体菌种进行双向固体发酵制备具有增强免疫力功能的药性菌质； (2)乳酸菌液体深层发酵；以步骤(I)的药性菌质为原料，粉碎后添加酵母粉、谷氨酸钠、水制成发酵培养基，接种乳酸菌进行液体深层发酵生产促进睡眠的Y-氨基丁酸，制备同时具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液； (3)采用步骤(2)的发酵液，制备成不同剂型的增强免疫力和改善睡眠的保健食品。
2.根据权利要求1所述的增强免疫力和改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的灵芝液体菌种的接种量为2%-10%。
3.根据权利要求1所述的增强免疫力和改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的药性培养基质的制备:先称取以下重量百分含量的原料:全粒大麦70%-80%、山药10%-20%、黄芪2%-3%、铁皮枫斗1%_2%、西洋参1%_2%、杜仲1%_2%、淫羊藿1%-2%、石膏粉0.5%-1.5%，将各组分混合、粉碎，然后加水至水分含量为60%-65%，116。。_126°C灭菌 0.5h-l.5h。
4.根据权利要求3所述的增强免疫力和改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的药性培养基质的制备:先称取以下重量百分含量的原料:全粒大麦75%、山药13%、黄芪3%、铁皮枫斗2%、西洋参2%、杜仲2%、淫羊藿2%、石膏粉1% ;将各组分混合、粉碎，然后加水至水分含量为60%-65%，121°C灭菌lh。
5.根据权利要求1所述的增强免疫力和改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的双向固体发酵的条件为:发酵温度在25-28°C，发酵时间在20-25 天。
6.根据权利要求1所述的增强免疫力和改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的发酵培养基采用以下重量份的原料:水1000重量份、药性菌质40-50重量份、酵母粉5-10重量份、谷氨酸钠15-20重量份，将药性菌质、酵母粉和谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成PH为5-6的缓冲液，116°C _126°C灭菌20min_40mino
7.根据权利要求1所述的增强免疫力和改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的乳酸菌的接种量为1%_5%。
8.根据权利要求1所述的增强免疫力和改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的液体深层发酵的条件为:发酵温度在28-32°C，发酵时间在48-72h。
9.根据权利要求1所述的增强免疫力和改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的增强免疫力和改善睡眠的保健食品为片剂或胶囊。
10.根据权利要求1?9任一项所述的制备方法制备的增强免疫力和改善睡眠的保健食品。
【文档编号】A61P37/04GK103948023SQ201410136604
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】徐娟, 吴学谦, 李青青, 熊科辉, 许海顺, 党亚丽, 俞盈 申请人:浙江省医学科学院