分化无核细胞及其制备方法

分化无核细胞及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种分化无核细胞及其制备方法。所述方法包括：在诱导分化成红细胞的试剂存在下培养条件永生化造血干细胞，其中所述试剂为IL-3和EPO；其中所述试剂将条件永生化造血干细胞诱导分化为成熟红细胞。所述红细胞可以治疗选自由以下组成的群组的病症：表征为成熟红细胞的缺陷的病症、表征为失血的病症、贫血、高歇氏病、溶血、嗜中性白血球减少症、血小板减少症、粒细胞减少和血友病。
【专利说明】分化无核细胞及其制备方法
[0001] 本申请是申请日为2009年7月21日、申请号为200980126312.4、发明名称为“分化无核细胞及其制备方法”的发明专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请案交叉参考
[0003]本申请案主张2008年7月21日申请的标题为分化细胞及其制备方法(Differentiated Cells and Processes for Preparing the Same)的美国临时申请案第61/082,410号的优先权，其全部内容以引用方式并入本文中。
【技术领域】
[0004]本申请涉及分化无核细胞及其制备方法。
【背景技术】
[0005]无核细胞包括(但不限于)红细胞及凝血细胞。红细胞及凝血细胞来源于造血干细胞分化。

【发明内容】

[0006]在某些实施例中，本发明揭示制备多种无核细胞的方法，其包含:在至少一种引导朝向无核细胞分化的细胞因子存在下培养条件永生化干细胞；其中通过以下来产生所述条件永生化干细胞:(a)使用第一载体转染多种干细胞，所述第一载体包含编码MYC分子的核酸序列；(b)使用第二逆转录病毒载体转染所述干细胞，所述第二载体包含编码Bcl-2、Bcl-X或其组合的核酸序列；及(c)将所述干细胞与IL-3、IL-6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养；且其中在分化之前已抑制所述Myc分子的活性。在一些实施例中，引导朝向无核细胞分化的细胞因子是IL-3、EP0或其组合。在一些实施例中，MYC分子是c-Myc、1-Myc、n-Myc、s-Myc或其组合。在一些实施例中，第一载体进一步包含人类雌激素受体的激素结合结构域。在一些实施例中，所述方法进一步包含诱导Myc分子移位至细胞核。在一些实施例中，所述方法进一步包含使所述多种干细胞与雌二醇(E2)、4_羟基他莫昔芬(4-OHT)或二者接触。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是鼠科动物干细胞病毒(MSCV)或其衍生物。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是MSCV- (IRES) -GFP或其衍生物。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是MSCV-(IRES)-GFP，且进一步包含土拨鼠乙型肝炎病毒RNA调控元件(WRE)。
[0007]在某些实施例中，本发明揭示产生多种无核细胞的方法，其包含:在至少一种引导朝向无核细胞分化的细胞因子存在下培养条件永生化干细胞；其中通过以下来产生所述条件永生化干细胞:(a)使多种干细胞与外源合成的第一肽接触，所述第一肽包含移位至细胞核的MYC分子；(b)使所述干细胞与外源合成的第二肽接触，所述第二肽包含Bcl-2、BCL-X或其组合；及(c)将所述干细胞与IL-3、IL-6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养；且其中在分化之前使所述第一肽与所述条件永生化干细胞不接触。在一些实施例中，第一肽进一步包含人类雌激素受体的激素结合结构域。在一些实施例中，第一肽、第二肽、或第一肽与第二肽二者包含转运蛋白序列。在一些实施例中，第一蛋白质、第二蛋白质、或第一蛋白质与第二蛋白质二者包含TAT序列。在一些实施例中，所述方法进一步包含使所述多种干细胞与雌二醇(E2)、4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或二者接触。
[0008]在某些实施例中，本发明揭示制备多种无核细胞的方法，其包含:(a)使用第一载体转染多种干细胞(例如，造血干细胞)，所述第一载体包含编码MYC分子的核酸序列；(b)使用第二 Y逆转录病毒载体转染所述多种干细胞(例如，造血干细胞)，所述第二载体包含编码Bcl-2、Bcl-X或其组合的核酸序列；(c)将所述多种干细胞(例如，造血干细胞)与IL-3、IL-6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养；(d)抑制所述Myc分子的活性 '及(c)在至少一种引导朝向无核细胞分化的细胞因子存在下培养所述条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)。在一些实施例中，引导朝向无核细胞分化的细胞因子是IL-3、EPO或其组合。在一些实施例中，MYC分子是c-Myc、1-Myc、n-Myc, s-Myc或其组合。在一些实施例中，第一载体进一步包含人类雌激素受体的激素结合结构域。在一些实施例中，所述方法进一步包含诱导Myc分子移位至细胞核。在一些实施例中，所述方法进一步包含使所述多种干细胞(例如，造血干细胞)与雌二醇(E2)、4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或二者接触。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是鼠科动物干细胞病毒(MSCV)或其衍生物。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是MSCV-(IRES )-GFP或其衍生物。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是MSCV-(IRES)-GFP，且进一步包含土拨鼠乙型肝炎病毒RNA调控元件(WRE)。
[0009]在某些实施例中，本发明揭示产生多种无核细胞(例如，造血干细胞)的方法，其包含:(a)使多种干细胞(例如，造血干细胞)与以下物质接触:(i)外源合成的第一肽，其包含移位至细胞核的MYC分子；及(ii)外源合成的第二肽，其包含Bcl-2、BCL-X或其组合；(b)将所述多种干细胞(例如，造血干细胞)与IL-3、IL-6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养；(c)移除第一肽；及(d)在至少一种引导朝向无核细胞分化的细胞因子存在下培养所述条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)。在一些实施例中，第一肽进一步包含人类雌激素受体的激素结合结构域。在一些实施例中，第一肽、第二肽、或第一肽与第二肽二者包含转运蛋白序列。在一些实施例中，第一蛋白质、第二蛋白质、或第一蛋白质与第二蛋白质二者包含TAT序列。在一些实施例中，所述方法进一步包含使所述多种干细胞(例如，造血干细胞)与雌二醇(E2)、4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或二者接触。
[0010]在某些实施例中，本发明揭示根据本文所揭示方法制备的凝血细胞。
[0011]在某些实施例中，本发明揭示根据本文所揭示方法制备的红细胞。
[0012]在某些实施例中，本发明揭示治疗特征在于缺乏无核细胞的病症的方法，其包含:投予根据本文所揭示方法制备的无核细胞。在一些实施例中，所述病症是贫血(例如，再生障碍性贫血、恶性贫血、缺铁性贫血、镰状细胞性贫血、球形细胞增多症、溶血性贫血)、高歇氏病(Gaucher' s disease)、溶血、嗜中性白血球减少症、血小板减少症、粒细胞减少、血友病、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤、B细胞慢性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt' s lymphoma)、滤泡样淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性髓样白血病、前B急性淋巴细胞白血病、前T急性淋巴细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、难治性白血病或其组合。在某些情形下，特征在于缺乏无核细胞的病症是由化学疗法引起(部分或完全)。在一些实施例中，通过本发明所揭示方法产生的无核细胞与化学疗法共投予。
【专利附图】

【附图说明】
[0013]本发明的新颖特征详细阐述于随附权利要求书中。参考阐述利用本发明原理的例示性实施例的下文详细说明和附图将会更好地了解本发明的特征及优点，在附图中:
[0014]图1显示产生ctlt-造血干细胞系的途径。图1A显示用于使用Myc-ER及Bcl_2转导原代鼠科动物HSC细胞的逆转录病毒构建体的图示。图1B显示自5-氟尿嘧啶治疗供体获得的HSC在转导后的FACS 分析。图1C显示移植经转导HSC的小鼠中白血病发生的动力学。图1D显示自白血病小鼠的骨髓回收后不久ctlt-造血干细胞的FACS分析。图1E显示已建立ctlt-造血干细胞系的FACS分析。图1F显示C57/BL6小鼠骨髓的正常未经处理造血干细胞中干细胞标记的FACS分析。
[0015]图2显示通过逆转录病毒插入物的PCR扩增而实施的ctlt-造血干细胞系的无性系形成能力的分析。
[0016]图3显示在移植ctlt-造血干细胞后产生的成熟免疫细胞的表征。图3A显示移植后淋巴组织中衍生自ctlt-造血干细胞的细胞频率。图3B显示骨髓中GFP+髓系细胞的检测。图3C显示脾中外周成熟淋巴细胞的分析。图3D显示ctlt-造血干细胞第二连续传代后移植物受体小鼠中外周成熟淋巴细胞的分析。
[0017]图4显示ctlt-造血干细胞长期拯救而脱离致死辐照的危险。
[0018]图5显示ctlt-造血干细胞在活体外分化成表达Ter-119的红系祖细胞(erythroid progenitor)。
[0019]图6显示致死辐照后通过ctlt-造血干细胞移植物实施的活体内红细胞重构的视图。
[0020]图7显示致死辐照后通过ctlt-造血干细胞移植物实施的活体内红细胞重构的视图。
[0021]图8显示致死辐照后通过ctlt-造血干细胞移植物实施的活体内红细胞重构的视图。
【具体实施方式】
[0022]本发明揭示制备多种无核细胞的方法、所得无核细胞以及储存及使用所述无核细胞的方法。具体来说，自经合适基因及/或蛋白质修饰的干细胞(统称为改造的干细胞)离体产生所述无核细胞。所述改造的干细胞是有核干细胞，且进一步经条件永生化。所述改造的有核干细胞通过使细胞失去条件永生化并视需要分化而提供无核细胞。
[0023]在某些实施例中，本发明揭示制备多种无核细胞的方法，其包含:在至少一种引导朝向无核细胞分化的细胞因子存在下培养条件永生化干细胞；其中通过以下来产生所述条件永生化干细胞:(a)使用第一载体转染多种干细胞，所述第一载体包含编码MYC分子的核酸序列；(b)使用第二逆转录病毒载体转染所述干细胞，所述第二载体包含编码Bcl-2、Bcl-X或其组合的核酸序列；及(c)将所述干细胞与IL-3、IL-6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养；且其中在分化之前已抑制所述Myc分子的活性。在一些实施例中，引导朝向无核细胞分化的细胞因子是IL-3、EP0或其组合。在一些实施例中，MYC分子是c-Myc、1-Myc、n-Myc、s-Myc或其组合。在一些实施例中，第一载体进一步包含人类雌激素受体的激素结合结构域。在一些实施例中，所述方法进一步包含诱导Myc分子移位至细胞核。在一些实施例中，所述方法进一步包含使所述多种干细胞与雌二醇(E2)、4_羟基他莫昔芬(4-OHT)或二者接触。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是鼠科动物干细胞病毒(MSCV)或其衍生物。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是MSCV- (IRES) -GFP或其衍生物。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是MSCV-(IRES)-GFP，且进一步包含土拨鼠乙型肝炎病毒RNA调控元件(WRE)。
[0024]在某些实施例中，本发明揭示产生多种无核细胞的方法，其包含:在至少一种引导朝向无核细胞分化的细胞因子存在下培养条件永生化干细胞；其中通过以下来产生所述条件永生化干细胞:(a)使多种干细胞与外源合成的第一肽接触，所述第一肽包含移位至细胞核的MYC分子 ；(b)使所述干细胞与外源合成的第二肽接触，所述第二肽包含Bcl-2、BCL-X或其组合；及(c)将所述干细胞与IL-3、IL-6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养；且其中在分化之前使所述第一肽与所述条件永生化干细胞不接触。在一些实施例中，第一肽进一步包含人类雌激素受体的激素结合结构域。在一些实施例中，第一肽、第二肽、或第一肽与第二肽二者包含转运蛋白序列。在一些实施例中，第一蛋白质、第二蛋白质、或第一蛋白质与第二蛋白质二者包含TAT序列。在一些实施例中，所述方法进一步包含使所述多种干细胞与雌二醇(E2)、4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或二者接触。
[0025]在某些实施例中，本发明揭示制备多种无核细胞的方法，其包含:(a)使用第一载体转染多种干细胞(例如，造血干细胞)，所述第一载体包含编码MYC分子的核酸序列；(b)使用第二 Y逆转录病毒载体转染所述多种干细胞(例如，造血干细胞)，所述第二载体包含编码Bcl-2、Bcl-X或其组合的核酸序列；(c)将所述多种干细胞(例如，造血干细胞)与IL-3、IL-6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养；(d)抑制所述Myc分子的活性 '及(c)在至少一种引导朝向无核细胞分化的细胞因子存在下培养所述条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)。在一些实施例中，引导朝向无核细胞分化的细胞因子是IL-3、EPO或其组合。在一些实施例中，MYC分子是c-Myc、1-Myc、n-Myc, s-Myc或其组合。在一些实施例中，第一载体进一步包含人类雌激素受体的激素结合结构域。在一些实施例中，所述方法进一步包含诱导Myc分子移位至细胞核。在一些实施例中，所述方法进一步包含使所述多种干细胞(例如，造血干细胞)与雌二醇(E2)、4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或二者接触。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是鼠科动物干细胞病毒(MSCV)或其衍生物。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是MSCV-(IRES)-GFP或其衍生物。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是MSCV- (IRES) -GFP,且进一步包含土拨鼠乙型肝炎病毒RNA调控元件(WRE)。
[0026]在某些实施例中，本发明揭示产生多种无核细胞(例如，造血干细胞)的方法，其包含:(a)使多种干细胞(例如，造血干细胞)与以下物质接触:(i)外源合成的第一肽，其包含移位至细胞核的MYC分子；及(ii)外源合成的第二肽，其包含Bcl-2、BCL-X或其组合；(b)将所述多种干细胞(例如，造血干细胞)与IL-3、IL-6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养；(c)移除第一肽；及(d)在至少一种引导朝向无核细胞分化的细胞因子存在下培养所述条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)。在一些实施例中，第一肽进一步包含人类雌激素受体的激素结合结构域。在一些实施例中，第一肽、第二肽、或第一肽与第二肽二者包含转运蛋白序列。在一些实施例中，第一蛋白质、第二蛋白质、或第一蛋白质与第二蛋白质二者包含TAT序列。在一些实施例中，所述方法进一步包含使所述多种干细胞(例如，造血干细胞)与雌二醇(E2)、4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或二者接触。
[0027]在某些实施例中，本发明揭示根据本文所揭示方法制备的凝血细胞。
[0028]在某些实施例中，本发明揭示根据本文所揭示方法制备的红细胞。
[0029]在某些实施例中，本发明揭示治疗特征在于缺乏无核细胞的病症的方法，其包含:投予根据本文所揭示方法制备的无核细胞。
[0030]在某些实施例中，本发明提供产生多种分化细胞的方法。在一些实施例中，本发明提供产生多种无核细胞的方法，其包含:
[0031](a).提供永生化干细胞；及
[0032](b).诱导所 述永生化干细胞分化成所选类型的细胞。
[0033]一般定义
[0034]类似或等效于用于实践或测试本文所述实施例的本文所述方法和材料的任何方法和材料均视为本发明的一部分。
[0035]除非上下文另外明确指出，否则本说明书及随附权利要求书中所用的单数形式“一(a、an)”及“所述(the) ”包括多个指示物。因此，例如，提及“核酸”包括一或多种核酸、及/或在阅读本揭示内容后所属领域的技术人员显而易见的本文所述类型的组合物等。除非另有说明，否则本文中提及的所有“或”均意欲涵盖“及/或”。
[0036]本文所用的“干细胞(例如，造血干细胞)”是指如业内通常所了解的术语。例如，与来源无关，干细胞(例如，造血干细胞)是能够长期分裂并自我更新、非特化(未分化)、且具有产生(分化成)特定细胞类型的能力(即，其为多种不同特定细胞类型的祖细胞或前体细胞)的细胞。在本文某些情形下，本文所述的“干细胞(例如，造血干细胞)”是指长期干细胞(例如，造血干细胞)。
[0037]当与干细胞(例如，造血干细胞)结合使用时，视干细胞的具体类型而定，“长期”是指干细胞(例如，造血干细胞)在长时间段(例如，I个月、2个月、3个月、4个月、6个月、8个月、9个月、12个月、2年、3年)内通过分裂成相同的非特化细胞类型而自我更新的能力。在某些情形下，通过以下细胞表面标记的存在来识别干细胞(例如，造血干细胞):c-kit+、Sca-1+、⑶34ffi/_、⑶38+及/或Thyl+/气在一些情形下，通过以下标记的存在来识别人类干细胞(例如，造血干细胞):CD34+、CD38ffi/_、c-kif/ffiS/或Thyl+。在某些情形下，人类及鼠科动物干细胞(例如，造血干细胞)均缺乏细胞谱系标记，例如⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶8、NKl.l、B220、Ter-119 及 / 或 Gr-1。
[0038]本文所用的“永生化剂”是指诱导、促进或能够实现细胞生存、细胞存活及/或细胞增殖的试剂。“永生化剂”是指诱导、促进或能够实现细胞生存、细胞存活及/或细胞增殖的任何适宜试剂。所述术语涵盖诱导细胞生存、细胞存活及/或细胞增殖的所有化学化合物，例如有机及无机分子，包括DNA、RNA、多肽、碳水化合物、脂质及小有机分子。[0039]“诱导永生性的条件激活剂”是指诱导细胞生存、细胞存活及/或细胞增殖的试剂，视需要诱导或启动其功能。例如，在多肽情形下，通过激活编码所述多肽的基因的(例如)表达、转录或转译来实施条件激活。在其它情形下，通过向多肽上的受体添加配体(例如，使包含ER的多肽暴露于雌激素或使包含GR的多肽暴露于米非司酮(mifepristone))来诱导条件激活多肽的功能。
[0040]术语“癌肽”与“癌蛋白”在本文中可互换使用，且是指由癌基因或原癌基因编码的氨基酸残基、其片段或类似物的多聚体。在某些情形下，癌肽诱导细胞生存、细胞存活及/或细胞增殖。本文中某些实施例的描述针对“癌肽”。应了解，在一些实施例中，所述揭示内容包括使用诱导干细胞生存、存活及/或增殖的任何多肽的揭示内容。
[0041]“永生化剂的内源拮抗剂的抑制剂”是指通过减少、降低或阻止拮抗永生化剂的内源剂的活性、浓度或表达来诱导细胞永生性的试剂。例如，某些内源转录阻抑蛋白抑制起诱导细胞生存、细胞存活及/或细胞增殖作用的多肽的表达。一具体实例是拮抗Myc癌基因家族的MAD转录阻抑蛋白家族，例如，MAD-1。 因此，内源转录阻抑蛋白(例如，MAD-1)的抑制剂通过减少、降低或阻止所述转录阻抑蛋白的活性、浓度或水平而起诱导细胞永生性的作用。
[0042]在其它实施例中，例如，细胞永生性诱导物是细胞周期蛋白依赖性激酶。内源细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如，pl6、pl9、p21及p27)起拮抗细胞周期蛋白依赖性激酶所引起的细胞永生性促进的作用。因此，在一些实施例中，“细胞永生性诱导物的内源拮抗剂的抑制剂”是相对于相同类型的野生型干细胞减少、降低或阻止细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的活性、浓度或水平的试剂。
[0043]类似地，“促细胞凋亡多肽的抑制剂”通过减少、降低或阻止促细胞凋亡多肽(例如，内源多肽)的活性、浓度或水平而起诱导细胞永生性的作用。“促细胞凋亡多肽的抑制剂”通过任何适宜手段来减少、降低或阻止促细胞凋亡多肽的活性、浓度或水平，包括抑制多肽的表达、转录或转译，或直接作用于多肽，例如，通过与多肽结合、使多肽变性、占据多肽的活性位点或阻断多肽与其靶标的相互作用。
[0044]在某些实施例中，本文所述诱导永生性的多肽的相似物(homologue)、类似物(analogue)或片段包括与诱导永生性的多肽至少40%至100%—致的氨基酸序列，例如，更少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或介于约40%至约100%之间的任何其它百分比
的一致。
[0045]本文所用的术语17(:”、“(^^”、“1^(3蛋白”及“Myc多肽”可互换使用，且在某些情形下是指NCBI登记号NP002458.2、其功能相似物、类似物或片段。在一些实施例中，Myc的同义词包括(但不限于)c-Myc、v-Myc、Myc原癌基因蛋白及转录因子p64。在一些实施例中，Myc多肽包含与NCBI登记号NP002458.2的序列至少40%至100% —致的氨基酸序列，例如，至少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或介于约40%至约100%之间的任何其它百分比的一致。在一些实施例中，Myc多肽包含与NCBI登记号NP002458.2的序列至少50%至100%—致的长度为40个氨基酸或更多的多肽序列，例如，至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98% 或介于约50%至约100%之间的任何其它百分比的一致。在一些实施例中，Myc多肽包含与NCBI登记号NP002458.2的序列至少50%至100%—致的长度为40个氨基酸或更多的多肽序列，例如，至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或介于约50%至约100%之间的任何其它百分比的一致，其中所述Myc多肽诱导细胞生存、细胞永生性、细胞生长及/或细胞增殖。
[0046]为测定两个氨基酸序列或两个核酸间的同源百分比(percent homology),比对所述序列以进行最佳比较(例如，在第一氨基酸序列或核酸序列中引入空位以与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。随后可比较对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置与第二序列中的对应位置由相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则在所述位置处所述分子一致。两个序列间的同源百分比是序列共有一致位置数的函数(即，％—致性=一致位置数/位置(例如，重叠位置)总数xlOO)。在一些实施例中，两个序列具有相同长度。
[0047]为测定两个序列间的同源百分比，使用如卡琳(Karlin)及奥斯舒尔(Altschul)(1993)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)90:5873-5877中改进的卡琳(Karlin)及奥斯舒尔(Altschul) (1990)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)87 =2264-2268的算法。所 述算法已纳入奥斯舒尔(Altschul)等人(1990)分子生物学期刊(J.Mol.Biol.) 215 =403-410 的 NBLAST 及 XBLAST 程序中。使用 NBLAST 程序(分值=100，字长=12)来实施BLAST核苷酸搜索以获得与本文所述或所揭示核酸分子同源的核苷酸序列。使用XBLAST程序(分值=50，字长=3)来实施BLAST蛋白质搜索。为获得空位比对以进行比较，如奥斯舒尔(Altschul)等人(1997)核酸研究(Nucleic Acids Res.) 25:3389-3402中所述使用空位型BLAST (Gapped BLAST)。当使用BLAST及空位型BLAST程序时，可使用各程序(例如，XBLAST及NBLAST)的缺省参数。更多细节可参见国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的网站(在万维网(WorldWide Web)上，网址为ncb1.nlm.nih.gov)。适用于本文所述方法的蛋白质还包括与本文所述任何蛋白质的氨基酸序列相比具有I至15个氨基酸变化的蛋白质，所述变化是例如1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代、缺失或添加。在其它实施例中，所述经改变的氨基酸序列与本文所述任何蛋白质抑制剂的氨基酸序列至少75%—致，例如，77%,80%,82%,85%,88%,90%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100%—致。所述序列变体蛋白质适用于本文所述方法，只要所述经改变的氨基酸序列保留足够的生物活性以在本文所述组合物及方法中发挥作用即可。在某些情形下，使用保守氨基酸取代。氨基酸间的例示性保守取代在以下群组的每一者范围内:(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸，(3)丝氨酸及苏氨酸，(4)天冬氨酸盐及谷氨酸盐，
(5)谷氨酰胺及天冬酰胺，及(6)赖氨酸、精氨酸及组氨酸。BL0SUM62表是衍生自蛋白质序列区段的约2，000个局部多重比对的氨基酸取代矩阵，其代表多于500个相关蛋白质群组的高度保守区域(赫内科夫(Henikoff)等人(1992)，美国国家科学院院刊(Pioc.Natl.Acad.Sc1.USA), 89:10915-10919)。利用BL0SUM62取代频率来定义在一些实施例中引入本文所述或所揭示氨基酸序列中的保守氨基酸取代。尽管可仅基于化学特性来设计氨基酸取代(如上文所述)，但用语“保守氨基酸取代”优选是指由大于-1的BL0SUM62值表示的取代。例如，如果取代的特征在于BL0SUM62值为0、1、2或3，则氨基酸取代是保守的。根据所述系统，优选的保守氨基酸取代的特征在于BL0SUM62值至少为I (例如，1、2或3)，而更优选的保守氨基酸取代的特征在于BL0SUM62值至少为2 (例如，2或3)。
[0048]本文所用的术语“核酸”是指通过组合或插入一或多种核酸以将通常不共同存在于自然界中的序列组合在一起而进行改造的核酸。在一些实施例中，核酸包含诱导物或增强子。在一些实施例中，核酸包含限制性酶位点。在一些实施例中，核酸编码多肽。在一些实施例中，核酸包含突变。
[0049]本文所用的术语“多肽”是指由核酸产生的多肽。
[0050]本文所用的术语“Myc多肽”包含由核酸产生的Myc多肽。
[0051]本文所用的术语“转基因”是指将编码多肽的核酸整合至动物、细菌、病毒或细胞的基因组DNA中。
[0052]本文所用的术语“TRE”是指四环素反应元件。
[0053]本文所用的“过表达”是指与相同多肽或蛋白质在相同细胞内的内源表达水平相比表达水平较高。在某些情形下，“过表达”是指多肽的表达。在一些实施例中，较高表达水平包含增高2%至200%。在一些实施例中，较高表达水平包含增高2倍至1000倍。在一些实施例中，较高表达水平包含增高2倍至1000倍。在一些实施例中，较高表达水平包含增高2倍至10，000倍。 在一些实施例中，较高表达水平包含与先前不可检测到的表达水平相比为可检测到的表达水平。在一些实施例中，“过表达”是指外源多肽或蛋白质的任何可检测到的表达水平。
[0054]术语“多肽”、“肽”及“蛋白质”在本文中可互换使用，其均指氨基酸残基的多聚体。所述术语适用于天然存在的氨基酸多聚体以及其中一或多个氨基酸残基是非天然存在氨基酸(例如，氨基酸类似物)的氨基酸多聚体。如本文所用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接在一起。
[0055]1.永牛化细朐
[0056]干细胞
[0057]拟进行永生化或条件永生化的干细胞(例如，造血干细胞)可自任何适宜来源获得。在某些实施例中，所用干细胞(例如，造血干细胞)来自动物，例如，人类、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、猴、大鼠、小鼠或诸如此类。在一些实施例中，干细胞自个体的骨髓、外周血、脐带或胎儿组织获得，或者从自个体骨髓、外周血、脐带或胎儿组织获得干细胞的来源得到。
[0058]在某些实施例中，自人类脐带或胎盘收获多种干细胞(例如，造血干细胞)。多种干细胞(例如，造血干细胞)的另一来源是胎儿动物的发育中的血液产生组织。在人类中，在约12至18周的人类胎儿的循环血液中发现多种干细胞(例如，造血干细胞)。在一些实施例中，自任何来源获得多种干细胞(例如，造血干细胞)，例如，A+、A-、B+、B-、O+、O-、AB+及AB-型血供体的骨髓、脐带、外周血或胎儿组织。在一些实施例中，通过麻醉干细胞供体、使用针刺穿后上髂嵴(posterior superior iliac crest)并使用注射器抽吸骨髓细胞来获得多种干细胞(例如，造血干细胞)。
[0059]与其余骨髓细胞的处理有关的其它步骤包含通过离心收集细胞、将细胞再悬浮于培养基或适于随后处理的缓冲液中。在一些实施例中，自循环血液收获多种干细胞(例如，造血干细胞)。在一些实施例中，通过给干细胞供体注射细胞因子(例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF))来诱使骨髓中的多种干细胞(例如，造血干细胞)以较大数量自骨髓迁移至循环血液中。
[0060]在本文所述的某些方面中，多种干细胞(例如，造血干细胞)自不同血型或主要组织相容性复合物(MHC)或人类白细胞抗原(HLA)匹配来源获得。在一些实施例中，自外周血抽取包含在收获细胞之前数天注射粒细胞刺激因子(G-CSF)。在一些实施例中，获得多种干细胞(例如，造血干细胞)包含自骨髓抽取多种干细胞(例如，造血干细胞)，其包含注射5-氟尿嘧啶(5-FU)以通过诱导所述细胞增殖来富集多种干细胞(例如，造血干细胞)。
[0061]可任选地使用任何适宜识别方法来识别自供体获得的干细胞。例如，在一些实施例中，识别多种干细胞(例如，造血干细胞)包含使用与多种干细胞(例如，造血干细胞)相关或与系统的终末分化细胞特定相关的细胞表面标记。在一个实施例中，标记包括c-kit、Sca-1、CD34、CD38、ThyU CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD43、CD45、CD59、CD90、CD105、CD133、ABCG2、NK1.1、B220、Ter-119、Flk-2、CDCP1、内皮唾粘蛋白(Endomucin)或 Gr-1 中的一或多者。在另一实施例中，标记包括⑶150、⑶244或⑶46中的一或多者。
[0062]以任何适宜方式(例如，作为非限制性实例，荧光激活细胞分选术(FACS)或磁激活细胞分选术(MACS))将自供体获得的多种干细胞(例如，造血干细胞)与不是所述多种干细胞(例如，造血干细胞)的细胞分开。
[0063]在一个 非限制性实例中，将鼠科动物骨髓细胞与识别细胞表面分子的抗体一起培育，所述细胞表面分子是例如 c-kit、Sca-l、CD34、CD38、Thyl、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD43、CD45、CD59、CD90、CD105、CD133、ABCG2、NK1.l、B220、Ter-119、Flk_2、CDCPl、内皮唾粘蛋白或 Gr-1 中的一或多者。使 CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NKL l、B220、Ter_119 及 Gr-1 抗体与磁性珠粒接合。在MACS设备中，表面上含有CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NKl.1、B220、Ter-119或Gr-1的细胞保留在柱中，所述柱经装备以捕获磁性珠粒及附接至接合磁性珠粒的抗体的细胞。对未被MACS柱俘获的细胞实施FACS分析。实施FACS分析时，使诸如c-kit、Sca-1、CD34、CD38、Thyl等表面分子的抗体与荧光物质接合。根据与细胞结合的荧光抗体的类型自剩余试样中分离出(:-1^^、50&-1+、0)34<￡/_、0)38+、11^1+/<￡细胞。所述细胞以鼠科动物长期干细胞(例如，造血干细胞)形式提供以用于本文所述的其它方法。在其它实施例中，使用不同标记集合自骨髓、脐带血、胎儿组织及外周血细胞分离鼠科动物长期干细胞(例如，造血干细胞)。
[0064]在另一非限制性实例中，将人类外周血细胞与识别c-kit、Sca-U⑶34、⑶38、Thyl、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD43、CD45、CD59、CD90、CD 105、CD133、ABCG2、NKl.1、B220、Ter-119、Flk-2、CDCPl、内皮唾粘蛋白或 Gr-1 的抗体一起培育。使 CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NKl.1、B220、Ter-119 及 Gr-1 抗体与磁性珠粒接合。表达 CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NKl.1、B220、Ter-119或Gr-1的细胞保留在柱中，所述柱经装备以捕获磁性珠粒及附接至接合磁性珠粒的抗体的细胞。对未被MACS柱俘获的细胞实施FACS分析。使c-kit、Sca-l、⑶34、CD38、Thyl抗体与业内已知的荧光物质接合。根据与细胞结合的荧光抗体的类型自剩余试样中分离出⑶34+、⑶38低/'C-1dtv^Thyl+细胞。所述细胞以人类长期干细胞(例如，造血干细胞)形式提供以用于本文所揭示的其它方法。
[0065]在再一非限制性实例中，使用接合磁性珠粒的抗体(对抗⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶8、NKl.UB220,Ter-119或Gr-1中一或多者的抗体)及接合荧光物质的CD150、CD244及/或CD48抗体的相同集合来标记自个体获得的细胞。自试样中移除被接合磁性珠粒的抗体俘获的细胞后，通过FACS分析试样，且⑶150+、⑶244-及⑶48-细胞留作长期干细胞(例如，造血干细胞)。
[0066]在一些实施例中，用于本文所述任一方法中的多种干细胞(例如，永生化或干细胞)包含一或多种以下标记:c-kit\ Sca-、CD34ffi/' CD38+、Thyl+/低、CD34+、CD38ffi/'c-kit_/ffi及/或11^1+。在一些实施例中，用于本文所述任一方法中的干细胞(例如，永生化或干细胞)缺少一或多种以下标记:CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NK1.1、B220、Ter-119及/或Gr-1。在某些实施例中，用于本文所述任一方法中的干细胞(例如，永生化或干细胞)是A+、A-、B+、B-、O+、0_、AB+ 或 AB-型。
[0067]在一些实施例中，提供永生化干细胞包括提供至少一种永生化或干细胞。在某些实施例中，提供至少一种永生化干细胞包括提供多种永生化或干细胞(例如，造血干细胞)。在一些实施例中，提供永生化干细胞包含产生永生化或干细胞。在具体实施例中，提供永生化干细胞包含产生多种永生化或干细胞(例如，造血干细胞)。在其它实施例中，通过自任何来源获取来提供永生化或干细胞。
[0068]永生化
[0069]在某些实施例中，将条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)在适宜条件下连续保持适宜时间段，以成 功地建立永生化或条件永生化干细胞系。
[0070]在某些实施例中，根据本文所述任一方法诱导条件永生化干细胞增殖包括诱导条件永生化干细胞永生化且由此使条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)增殖。在一些实施例中，诱导增殖包含诱导永生性诱导剂的表达。在某些实施例中，在包含编码永生性诱导剂的转基因的条件永生化细胞中诱导永生性诱导剂的表达，其中编码永生化剂的转基因是一或多种TRE。
[0071]在某些实施例中，永生化干细胞是(作为非限制性实例)永生化造血干细胞、永生化间充质干细胞、永生化神经干细胞、永生化上皮干细胞、永生化肠干细胞、永生化祖心肌细胞干细胞、永生化皮肤干细胞、永生化毛囊干细胞、永生化骨骼肌干细胞、永生化成骨细胞前体干细胞、永生化肝脏干细胞、永生化胚胎干细胞或诸如此类。在具体实施例中，永生化干细胞是永生化造血干细胞。
[0072]在一些实施例中，通过使条件永生化干细胞与永生性诱导剂接触来产生永生化干细胞。在一些实施例中，条件永生化干细胞的永生化避免了如相同谱系的正常或野生型干细胞一样不能在长时间(例如，长于6小时、12小时、24小时、3天、I周、2周、I个月、3个月等)后离体存活、增殖及/或分化。在某些实施例中，永生化剂被条件激活。
[0073]在一些实施例中，永生化剂是诱导永生性的癌肽。例如，在某些实施例中，诱导永生性的适宜癌肽是:生长因子及/或促细胞分裂原、受体酪氨酸激酶(尤其组成性活性的受体酪氨酸激酶)、细胞质酪氨酸激酶、细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶及其调控亚基、调控性GTP酶、转录因子、端粒末端转移酶逆转录酶及/或激活其它癌肽的因子。在一些实施例中，永生化干细胞经修饰以表达或条件表达癌肽。此外，在一些实施例中，癌肽的功能或表达被条件激活。
[0074]在一些实施例中，永生化剂抑制永生性诱导物的内源拮抗剂。例如，在一些实施例中，永生性诱导剂包含转录阻抑蛋白的抑制剂，所述转录阻抑蛋白拮抗诱导永生性的基因的表达。在某些实施例中，转录阻抑蛋白拮抗癌肽(例如，Myc)。
[0075]在一些实施例中，永生性诱导剂是抑制细胞凋亡的多肽(例如，抗细胞凋亡多肽)。在一些实施例中，永生化干细胞表达及/或条件表达抑制细胞凋亡的多肽，例如，所述细胞包含表达或条件表达抑制细胞凋亡的多肽的转基因。在一些实施例中，永生性诱导剂是抑制促细胞凋亡多肽(例如，内源促细胞凋亡多肽)的试剂。
[0076]在一些实施例中，通过使干细胞与永生性诱导剂(例如，癌肽或表达或过表达癌肽的转基因)接触来产生永生化或条件永生化干细胞。在一些实施例中，通过使干细胞与永生性诱导剂(例如，癌肽或表达或过表达癌肽的转基因)及选自以下的至少一种其它试剂接触来产生永生化或条件永生化干细胞:永生性诱导剂(例如，另一癌肽及/或表达或过表达癌肽的另一转基因)、细胞永生性诱导物的内源拮抗剂的抑制剂、抗细胞凋亡多肽、促细胞凋亡多肽的抑制剂或其组合。
[0077]用于 本文所述方法中的永生化或条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)是以任何适宜方式来制备。在一些实施例中，通过使条件永生化干细胞与多肽及/或编码诱导永生性的多肽的转基因(例如，癌基因或原癌基因)接触来产生条件永生化干细胞。在某些实施例中，通过使条件永生化干细胞与癌肽(例如，Myc)及/或编码癌肽(例如，Myc)的转基因接触来产生条件永生化干细胞。在用于本文所述方法中的永生化或条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)包含编码癌肽的转基因的一些实施例中，本文所述的任一方法任选地进一步包含在分化之前自永生化或条件永生化干细胞的细胞核或在分化之后自所选类型细胞的细胞核切除所述转基因。
[0078]可以任何适宜方式将编码永生性诱导剂的转基因递送至干细胞中，所述永生性诱导剂是例如癌肽、抗细胞凋亡多肽、促细胞凋亡多肽的抑制剂或细胞永生性诱导物的内源拮抗剂的抑制剂等。在某些情形下，使用载体将编码永生性诱导剂的转基因转染至干细胞中。如本文所用，将核酸插入至细胞中任选地包含(作为非限制性实例)显微注射、基因转染、基因转导、电穿孔或类似方法。在一些情形下，将编码永生性诱导剂的转基因转导至条件永生化干细胞中。在一些实施例中，将编码永生性诱导剂的转基因转染或转导至干细胞中的方法如美国专利第2007/0116691号中所陈述，所述专利的本揭示内容以引用方式并入本文中。可以任何适宜方式将诱导永生性的多肽递送至干细胞中，所述多肽是例如癌肽、抗细胞凋亡多肽、促细胞凋亡多肽的抑制剂或细胞永生性诱导物的内源拮抗剂的抑制剂等。在一些实施例中，通过表达编码多肽的转基因将多肽引入细胞中。在某些实施例中，多肽是包含多肽转导结构域的融合多肽，并通过将条件永生化干细胞与所述融合多肽一起培养来将所述多肽引入条件永生化干细胞中。在一些实施例中，将多肽引入干细胞中的方法如美国专利第2007/0116691号中所陈述，所述专利的本揭示内容以引用方式并入本文中。
[0079]在一些实施例中，用于本文所述任一方法中的永生化干细胞包含细胞永生性诱导剂。在一些实施例中，细胞永生性诱导剂包含表达或过表达诱导细胞永生性的多肽的转基因。在一些实施例中，细胞永生性诱导剂包含诱导细胞永生性的多肽。在一些实施例中，诱导细胞永生性的多肽是癌肽。癌肽是诱导细胞永生性的任何适宜种类。例如，在某些实施例中，诱导细胞永生性的适宜癌肽是:生长因子及/或促细胞分裂原(例如，PDGF衍生生长因子，例如c-Sis);受体酪氨酸激酶，尤其组成性活性的受体酪氨酸激酶(例如，表皮生长因子受体(EGFR)、衍生自凝血细胞的生长因子受体(TOGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)及HER2/neu);细胞质酪氨酸激酶(例如，Src-家族、Syk_ZAP-70家族及BTK酪氨酸激酶家族)；细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶及其调控亚基(例如，Raf激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶、Akt家族成员);调控性GTP酶(例如，Ras蛋白);转录因子(例如，Myc及HIF-1a)；端粒末端转移酶逆转录酶(例如，TERT或hTERT);及/或激活其它癌肽的因子(例如细胞周期蛋白，包括细胞周期蛋白A、B、D及/或E，例如细胞周期蛋白Dl及D3)。在某些实施例中，癌肽是Myc、HIF-la、Notch-1、Akt、hTERT或细胞周期蛋白。在一些实施例中，癌肽是诱导细胞生存、细胞存活及/或细胞增殖的任一癌肽的功能片段、相似物或类似物，例如，Myc、HIF-la、Notch-1、Akt, hTERT或细胞周期蛋白的功能片段、相似物或类似物。 [0080]在一些实施例中，细胞永生性诱导剂抑制细胞永生性诱导物的内源拮抗剂。例如，所述试剂是基因抑制剂或小分子抑制剂(例如，拮抗剂)。例如，在一些实施例中，细胞永生性诱导剂包含转录阻抑蛋白的抑制剂，所述转录阻抑蛋白抑制诱导细胞永生性的基因的表达。在某些实施例中，转录阻抑蛋白拮抗调控诱导细胞永生性的基因的表达的癌肽(例如，Myc)。例如，在一些实施例中，细胞永生性诱导剂包含抑制至少一个MAD转录阻抑蛋白家族成员(例如，MAD-1)的试剂。在某些其它实施例中，细胞永生性诱导剂包含细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如，pl6、pl9、p21或p27)的抑制剂。
[0081]相对于相同类型的野生型干细胞抑制细胞永生性诱导剂的内源拮抗剂的任何试剂均适用于本文所揭示的方法。细胞永生性诱导剂的内源拮抗剂的抑制剂试剂在任何阶段或通过任何机制减少、抑制或降低拮抗剂的活性或水平。例如，在一些情形下，所述试剂在例如转译水平或转录水平上干扰拮抗细胞永生性诱导剂活性的试剂的表达。在某些实施例中，干扰拮抗细胞永生性诱导剂活性的试剂的表达的试剂是能够进行RNA干扰的试剂(RNAi分子)。在一些实施例中，通过裂解编码多肽(例如，癌肽)的mRNA或与其结合来产生RNAi分子。通过任何适宜手段来产生RNAi分子，包括小干扰RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)、双链RNA(dsRNA)或小发夹RNA (shRNA)。在某些实施例中，干扰拮抗细胞永生性诱导剂活性的试剂的表达的试剂是小分子，例如，小有机分子。
[0082]在一些实施例中，抑制细胞永生性诱导剂的内源拮抗剂的试剂直接作用于所述拮抗剂。例如，在一些实施例中，细胞永生性诱导剂包含结合细胞永生性诱导剂的内源拮抗剂并抑制其活性的试剂，例如抗体或小分子。例如，在一些实施例中，适宜试剂是结合或干扰癌肽拮抗剂的试剂，例如结合一或多种MAD家族转录阻抑蛋白(例如，MAD-1)或细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如，pl6、pl9、p21或p27)并破坏其天然功能的抗体或小分子。
[0083]在一些实施例中，细胞永生性诱导剂是表达或过表达抗细胞凋亡多肽的转基因。在一些实施例中，细胞永生性诱导剂是抗细胞凋亡多肽。在一些实施例中，干细胞或细胞表达的主干(stem)中的抗细胞凋亡多肽包含一或多个Bcl-2同源结构域。在一些具体实施例中，包含一或多个Bcl-2同源结构域(例如，BH1、BH2、BH3及/或BH4)的抗细胞凋亡多肽是例如 Bcl-2、Bcl-x, Bcl-XL, Mcl-1、CED-9、Al、Bfi_l、Bcl_w 或诸如此类。
[0084]在一些实施例中，相对于相同类型的野生型干细胞，细胞永生性诱导剂是干细胞内的促细胞凋亡多肽(例如，内源促细胞凋亡多肽)的抑制剂。在某些实施例中，促细胞凋亡多肽包含一或多个Bcl-2同源结构域(例如，BH1、BH2、BH3及/或BH4)。在具体实施例中，促细胞凋亡多肽包含 BH3，例如，BIM, PUMA、NOXA, BAK、BAX、BIK、BAD、BID、EGL-1 及 / 或诸如此类。在具体实施例中，促细胞凋亡多肽是仅含有BH3的多肽，例如，BM、PUMA、N0XA、BAD、BID、EGL-1及/或诸如此类。
[0085] 相对于相同类型的野生型干细胞抑制干细胞内促细胞凋亡多肽的活性或水平的任何试剂适宜作为细胞永生性诱导剂。在某些实施例中，降低条件永生化干细胞中促细胞凋亡多肽的水平的试剂是干扰促细胞凋亡多肽表达的试剂。在一些实施例中，干扰促细胞凋亡多肽表达的试剂在转译表达水平或转录表达水平上干扰表达。在某些实施例中，干扰促细胞凋亡多肽表达的试剂是RNAi分子(例如，通过裂解编码促细胞凋亡多肽的mRNA或与其结合而干扰RNA的分子，所述mRNA是例如编码包含BH3结构域的多肽的mRNA)。在一些实施例中，通过任何适宜手段来产生RNAi分子，包括siRNA、miRNA、dsRNA及/或shRNA。在某些其它实施例中，干扰促细胞凋亡多肽表达的试剂是小分子，例如，小有机分子。
[0086]在一些实施例中，相对于相同类型的野生型干细胞抑制干细胞内促细胞凋亡多肽的活性或水平的试剂直接作用于促细胞凋亡多肽。例如，在一些实施例中，细胞永生性诱导剂包含结合促细胞凋亡多肽并抑制其活性的试剂，例如结合促细胞凋亡多肽并破坏其天然功能的抗体或小分子。
[0087]在某些实施例中，细胞永生性诱导剂(例如，多肽或编码诱导永生性的多肽的转基因)是(作为非限制性实例)n-Myc、c-MyC、l-MyC、v-Myc、mTOR、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白 D3、STAT3、STAT5、AML-ETO, AKT、ICN-1、hTERT、PDK-1、MLL-ENL, IL3 受体β 链、β-连环蛋白、刺猬(Hedgehog)家族(Shh> Ihh、Dhh)、Bm1-U c_Jun、Wnt> Bcl_2、Bcl-6、Bcl-10、表皮生长因子受体(EGFR、ErbB-1、HER1)、ErbB-2 (HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、EGFR配体家族；胰岛素样生长因子受体(IGFR)家族、IGF结合蛋白质(IGFBPs)、IGFR配体家族；血小板衍生生长因子受体(I3DGFR)家族、I3DGFR配体家族；成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、FGFR配体家族、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族、VEGF家族；HGF受体家族；TRK受体家族；蝶素(EPH)受体家族;AXL受体家族；白细胞酪氨酸激酶(LTK)受体家族；TIE受体家族、血管生成素1，2 ;受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)受体家族；盘状结构域受体(DDR)家族；RET受体家族；KLG受体家族；RYK受体家族；MuSK受体家族；转化生长因子β (TGF-β)受体、TGF-.β.;细胞因子受体、I类(血细胞生成素家族)及II类(干扰素/IL-10家族)受体、肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族(TNFRSF)、死亡受体家族；癌症-睾丸(CT)抗原、谱系特异性抗原、分化抗原、α -辅肌动蛋白-4、ARTC1、断裂点簇集区-阿布尔森(Abelson) (Bcr-abl)融合产物、B-RAF、半胱天冬酶-5(CASP-5)、半胱天冬酶-8(CASP-8)、β -连环蛋白(CTNNBl)、细胞分裂周期27 (CDC27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4 (CDK4)、CDKN2A、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD-2、延伸因子2(ELF2)、Ets变体基因6/急性髓样白血病I基因ETS (ETC6-AML1)融合蛋白、纤维连接蛋白(FN)、GPNMB、低密度脂质受体/⑶P-L岩藻糖:i3-D半乳糖2-a-L岩藻糖基转移酶(LDLR/FUT)融合蛋白、HLA-A2基因中α 2_结构域α -螺旋的残基170处精氨酸换成异亮氨酸的 HLA-A2(HLA-A*201-R170I)、HLA-A11、热休克蛋白 70-2 突变体(HSP70-2M)、KIAA0205、MART2、黑色素瘤遍在突变体(melanoma ubiquitous mutated) 1、2、3 (MUM_1、2、3)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、neo-PAP、I类肌球蛋白、NFYC, 0GT、0S_9、pml-RARα融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras (KRAS2)、N-ras (NRAS)、HRAS、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSXl或 SYT-SSX2 融合蛋白、磷酸丙糖异构酶、BAGE, BAGE-U BAGE-2，3，4，5、GAGE-1,2,3,4,5，6，7，8、GnT-V (异常 N-乙酰基葡糖胺基转移酶 V，MGAT5)、HERV-K-MEL, KK-LC, KM-HN-ULAGE, LAGE-1、黑色素瘤上的 CTL 识别抗原(CAMEL)、MAGE-Al (MAGE-1)、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-AlO, MAGE-AlU MAGE-Al2, MAGE-3,MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-CU MAGE-C2、粘蛋白 I (MUCl)、MART-1/Melan-A (MLANA)、gplOO、gp100/Pmell7 (SILV)、酪氨酸酶(TYR)、TRP-K HAGE, NA-88、NY-ESO-1、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Spl7、SSX-1, 2，3，4、TRP2-1NT2、癌胚抗原(CEA)、激肽释放酶4、乳腺珠蛋白-A、0A1、前列腺特异性抗原(PSA)、TRP-l/gp75、TRP-2、脂肪分化相关蛋白(adipophilin)、干扰素诱导蛋白(黑色素瘤缺乏因子2，AIM-2)、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白D1、上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)、EphA3、成纤维细胞生长因子-5 (FGF-5)、糖蛋白 250 (gp250)、EGFR (ERBBl)、HER-2/neu(ERBB2)、白细胞介素 13 受体 α2 链(ILI3Ra2)、IL-6 受体、肠羧酸酯酶(iCE)、a -甲胎蛋白(AFP)、M-CSF, mdm_2、MUCl、p53 (TP53)、PBF、PRAME, PSMA, RAGE-K RNF43、RU2AS、S0X10、STEAP1、存活素(BIRC5)、人类端粒末端转移酶逆转录酶(hTERT)、端粒末端转移酶、维尔姆斯氏肿瘤(Wilms' tumor)基因(WTl)、SYCPU BRDT, SPANX, XAGE, ADAM2、PAGE-5, LIPU CTAGE-U CSAGE, MMAU CAGE、BORIS、H0M-TES-85、AF15ql4、HCA661、LDHC、MORC, SGY-1、SP011、TPX1、NY-SAR-35、FTHLl7, NXF2、TDRDU TEX15、FATE、TPTE、免疫球蛋白特异型、本周蛋白(Bence-Jones protein)、雌激素受体(ER)、雄激素受体(AR)、CD40、CD30、CD20、CD19、CD33、癌抗原 72_4(CA72_4)、癌抗原15-3 (CA15-3)、癌抗原 27-29 (CA27-29)、癌抗原 125 (CA125)、癌抗原 19-9 (CA19-9)、β -人绒毛膜促性腺素、鳞状细胞癌抗原、神经元特异性烯醇酶、热休克蛋白gp96、GM2、沙格司亭(sargramostim)、CTLA_4、707丙氨酸脯氨酸(707-AP)、T细胞识别的腺癌抗原4 (ART-4)、癌胚抗原肽-1 (CAP-1)、钙激活氯离子通道-2 (CLCA2)、亲环蛋白B (Cyp-B)、人类印戒肿瘤-2(HST-2)、猿猴病毒40(S V40)衍生的转化基因及蛋白质、人类乳头状瘤病毒(HPV)蛋白(HPV-E6、HPV-E7、主要或次要壳体抗原、其它)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus) (EBV)蛋白(EBV潜在膜蛋白一LMP1、LMP2 ;其它)、乙型肝炎或丙型肝炎病毒蛋白、人类免疫缺陷病毒(HIV)蛋白、其功能相似物、功能类似物或功能片段。在某些实施例中，用于本文所述任一方法中的编码癌肽的转基因、其它永生化转基因、其功能相似物、功能类似物或功能片段包括编码诱导细胞生存、存活及/或增殖的多肽的转基因。
[0088]在某些实施例中，条件过表达诱导细胞永生性的多肽(例如，癌肽)的转基因包含对四环素或其类似物(例如，多西环素(doxycycline))起反应的元件。在某些情形下，编码本文所述任一多肽(例如，癌肽)的转基因由tTA或rtTA驱动(例如，TRE-Myc)。因此，在某些实施例中，本文所述条件永生化干细胞包含编码可诱导细胞永生性的多肽的第一转基因，其中所述第一转基因包含一或多种TRE，且进一步包含编码可条件激活所述一或多种TRE的多肽的第二转基因(例如，tTA或rtTA)。
[0089]在某些实施例中，用于本文所述任一方法中的条件永生化干细胞包含表达诱导细胞永生性的条件激活多肽(例如，癌肽)的转基因，其中由所述转基因表达的多肽是融合多肽。在一些实施例中，多肽的融合多肽包含受体(例如，雌激素受体(ER))，其中对受体进行调节(例如，激动、拮抗及/或与配体结合)使融合多肽的存活及增殖特征激活。例如，在某些实施例中，条件激活多肽是癌肽的融合多肽，例如，作为非限制性实例，Myc-ER。在一些实施例中，通过使条件永生化干细胞与诱导细胞永生性的条件激活多肽(例如，癌肽)(例如，Myc-ER)接触来产生条件永生化干细胞。[0090]在一些情形下，任选地在条件永生化干细胞的外部表达或合成永生性诱导剂(例如，癌肽或抗细胞凋亡多肽)，并随后递送至条件永生化干细胞中以使其永生化或条件永生化。在某些实施例中，通过使条件永生化干细胞与能够将多肽递送至条件永生化干细胞中的转导结构域接触来产生在条件永生化干细胞的外部表达或合成并随后递送至条件永生化干细胞中的细胞永生性诱导剂。在某些具体实施例中，在条件永生化干细胞的外部表达或合成并随后递送至条件永生化干细胞中的细胞永生性诱导剂是例如Tat-Myc、Vpr-Myc>VP22-Myc、Tat-Bcl-2、Vpr-Bcl-2、VP22_Bcl_2、Tat-Bcl-x、Vpr-Bcl-x、VP22_Bcl_x、Tat-Bcl-XL、Vpr-Bc 1-XL, VP22_Bcl_XL、Tat-Mc 1-1, Vpr-Mcl-l、VP22_Mcl_l、Tat-CED-9、Vpr-CED-9、VP22-CED-9、Tat-AU Vpr-AU VP22-A1、Tat-Bf1-U Vpr-Bfl-U VP22-Bfl_l、Tat-Bcl-w、Vpr-Bcl-w及/或VP22-Bcl-w。在某些实施例中，包含受体(例如，ER或GR)的癌肽还进一步包含能够将多肽递送至条件永生化干细胞中的转导结构域，例如，Tat-Myc > Vpr-Myc > Tat-Myc-ER、Vpr-Myc-ER、VP22-Myc_ER、Tat-Myc-GR、Vpr-Myc-GR 及 /或 VP22-Myc-GR。
[0091]在某些情形下，通过将干细胞与包含转导结构域的多肽一起培养来制备包含细胞永生性诱导剂(包含转导结构域)的条件永生化干细胞。在具体实施例中，通过将干细胞与以下物质一起培养来制备条件永生化干细胞:(l)Tat_Myc、Vpr-Myc> Tat_Myc_ER、Vpr-Myc-ER, VP22-Myc_ER、Tat-Myc-GR, Vpr-Myc-GR 或 VP22-Myc_GR ；及(2) Tat-Bcl-2、Vpr-Bcl-2、VP22-Bcl-2、T at-Bcl-x、Vpr-Bc 1-x, VP22_Bcl_x、Tat-Bcl-XL, Vpr-Bc 1-XL,VP22-Bcl-XL、Tat-Mcl-1、Vpr-Mc 1-1, VP22_Mcl_l、Tat-CED-9, Vpr-CED-9, VP22-CED-9、Tat-Al、Vpr-Al、VP22-A1、Tat-Bf1-U Vpr-Bfl-U VP22-Bfl_l、Tat-Bcl-w、Vpr-Bc1-w或VP22-Bcl-w。在一些实施例中，包含转导结构域且由原癌基因编码的多肽是例如Tat-Myc> Vpr-Myc> Tat-Myc-ER、Vpr-Myc-ER、VP22-Myc_ER、Tat-Myc-GR、Vpr-Myc-GR 或VP22-Myc-GR。在某些实施例中，条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)是阐述于美国专利第2007/0116691号中者或通过阐述于美国专利第2007/0116691号中的方法制备者，所述专利的本揭示内容以引用方式并入本文中。
[0092]在一些实施例中，通过使干细胞与永生性诱导剂(例如，癌肽或表达或过表达癌肽的转基因)接触来产生永生化或条件永生化干细胞。在一些实施例中，通过使干细胞与永生性诱导剂(例如，癌肽或表达或过表达癌肽的转基因)及选自以下的至少一种其它试剂接触来产生永生化或条件永生化干细胞:永生性诱导剂(例如，另一癌肽及/或表达或过表达癌肽的另一转基因)、细胞永生性诱导物的内源拮抗剂的抑制剂、抗细胞凋亡多肽、促细胞凋亡多肽的抑制剂或其组合。
[0093]用于本文所述方法中的永生化或条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)是以任何适宜方式来制备。在一些实施例中，通过使条件永生化干细胞与多肽及/或编码诱导永生性的多肽的转基因(例如，癌基因或原癌基因)接触来产生条件永生化干细胞。在某些实施例中，通过使条件永生化干细胞与癌肽(例如，Myc)及/或编码癌肽(例如，Myc)的转基因接触来产生条件永生化干细胞。在用于本文所述方法中的永生化或条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)包含编码癌肽的转基因的一些实施例中，本文所述的任一方法任选地进一步包含在分化之前自永生化或条件永生化干细胞的细胞核或在分化之后自所选类型细胞的细胞核切除所述转基因。[0094]在某些实施例中，用于本文所揭示方法的干细胞(例如，造血干细胞)包含癌肽或表达癌肽的转基因与至少一种诱导细胞永生性的其它试剂的组合。所述组合的具体实例包括癌肽或表达癌肽的转基因(例如，Myc、Myc-ER、Tat-Myc> Vpr-Myc> Tat-Myc-ER、Vpr-Myc-ER, VP22-Myc_ER、Myc-GR、Tat-Myc-GR, Vpr-Myc-GR, VP22-Myc_GR、细胞周期蛋白Dl、细胞周期蛋白D3及/或HIF-la)与细胞永生性诱导剂的内源拮抗剂的抑制剂(例如，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如，pl6、pl9、p21或p27)的抑制剂及/或抑制诱导细胞永生性的基因表达的转录阻抑蛋白(例如，MAD转录阻抑蛋白家族成员(例如，MAD-1))的抑制剂)。
[0095]在其它实施例中，永生性诱导剂的组合包括癌肽或表达癌肽的转基因(例如，Myc> Myc-ER、Tat-Myc> Vpr-Myc> Tat-Myc-ER、Vpr-Myc-ER、VP22-Myc_ER、Myc-GR>Tat-Myc-GR、Vpr-Myc-GR、VP22-Myc-GR、细胞周期蛋白 Dl、细胞周期蛋白 D3 及 / 或HIF-la)与包含一或多个Bcl-2同源结构域的抗细胞凋亡多肽(例如，Bcl-2、Bcl-x、Bcl-XL、Mcl-l、CED-9、Al、Bfl-U Bc li或诸如此类);及/或促细胞凋亡多肽(例如，BIM, PUMA、NOXA,BAK、BAX、BIK、BAD、BID、EGL-1)的抑制剂。在某些实施例中，用于本文所揭示方法的诱导干细胞(例如，造血干细胞)永生性的试剂的具体组合是:Myc多肽与Bcl-2多肽；Myc多肽与促细胞凋亡多肽(例如，BIM)的抑制剂。在某些实施例中，所述抑制剂包含核酸、氨基酸，或者是小有机分子。
[0096]在一些其它实施例中，用于本文所揭示方法的干细胞(例如，造血干细胞)包含干细胞永生化诱导物的内源拮抗剂的抑制剂与至少一种诱导干细胞永生化的其它试剂的组合，所述其它试剂是例如干细胞永生化诱导物的内源拮抗剂的另一抑制剂、及/或癌肽、及/或抗细胞凋亡多肽、及/或促细胞凋亡多肽的抑制剂。所述组合的具体非限制性实例包括MAD-1抑制剂与Bcl-2多肽、及MAD-1抑制剂与促细胞凋亡多肽(例如，BIM)的抑制剂。
[0097]在某些实施例中还包括细胞永生性诱导剂的组合，其中至少一种试剂(多达及包括所有试剂)被条件表达或激活。例如，所述组合包括(作为非限制性实例)条件激活癌妝(例如，Myc-ER、Tat-Myc > Vpr-Myc > Tat-Myc-ER、Vpr-Myc-ER、VP22-Myc_ER、Myc-GR、Tat-Myc-GR、Vpr-Myc-GR 及 / 或 VP22-Myc_GR)与抗细胞凋亡多肽(例如，Bcl-2,Tat_Bcl_2、Vpr_Bcl_2> VP22_Bcl_2> Tat-Bcl-X> Vpr-Bcl-X> VP22_Bcl_x、Tat_Bcl_XL、Vpr-Bcl-XL、VP22_Bcl_XL、Tat-Mcl-1、Vpr-Mc1-U VP22_Mcl_l、Tat-CED-9, Vpr-CED-9,VP22-CED-9、Tat-Al、Vpr-AU VP22-A1、Tat-Bf1-U Vpr-Bfl-U VP22-BA-1、Tat-Bcl-w,Vpr-Bcl-w 或 VP22_Bcl_w)的组合。
[0098]以任何适宜方式将本文所述的转基因及多肽递送至多种干细胞(例如，造血干细胞)中以使其永生化或条件永生化，所述适宜方式是例如(作为非限制性实例)利用载体转染至干细胞中、显微注射、转染、转导、电穿孔或类似方法。在某些情形下，通过任何适宜技术将转基因构建至载体中，包括例如利用聚合酶链反应自基因组分离一种基因或一或多种基因的片段、利用限制性酶来修饰自基因组分离的一种基因或一或多种基因的片段、利用核酸修饰酶(例如拓扑异构酶、DNA连接酶、DNA核酸酶)、及利用与自细胞获得mRNA并将mRNA转化成cDNA并将cDNA克隆至适宜载体中有关的方法实施进一步克隆。
[0099]在某些实施例中，利用蛋白质转导将永生化剂引入细胞中。例如，对于蛋白质转导，在转导之前融合蛋白已经纯化。因此，使细胞条件永生化不需要对细胞进行遗传修饰。[0100] 在某些实施例中，利用病毒转导。在一些实施例中，将永生化基因(例如Myc或Bcl-2)克隆至病毒载体中，其中在各种病毒诱导物(例如单纯疱疹病毒胸苷激酶诱导物或HIV LTR(长末端重复(long term repeat))诱导物)控制下获得基因表达。在具体实施例中，使多种干细胞(例如，造血干细胞)与包含编码Myc基因、Bcl-2基因或其组合的核酸序列的病毒载体接触。在一些实施例中，使多种干细胞(例如，造血干细胞)与包含编码Myc基因、Bcl-2基因或其组合的核酸序列的逆转录病毒载体接触。在一些实施例中，使多种干细胞(例如，造血干细胞)与包含编码Myc基因、Bcl-2基因或其组合的核酸序列的腺病毒载体接触。在一些实施例中，使多种干细胞(例如，造血干细胞)与包含编码Myc基因、Bcl-2基因或其组合的核酸序列的慢病毒载体接触。在一些实施例中，利用细胞转染方法来递送转基因。因此，在一些实施例中，将基因克隆至哺乳动物表达载体中，并由市售细胞转染剂基于例如阳离子脂质技术来递送含有转基因的载体。在一些实施例中，任选地利用电穿孔方法(其为转染方法的变化形式)来递送哺乳动物表达载体。在某些情形下，在转染之前将载体线性化以有效转染。
[0101]在一些实施例中，使用包含编码永生性诱导多肽(例如，癌肽)的转基因的永生化或干细胞的任一本文所述方法进一步包含在分化之前自干细胞或在分化之后自分化细胞切除转基因。在某些实施例中，通过使用Cre-1oxP或类似系统来达成转基因的切除。在所述系统中，编码诱导细胞存活、细胞生存及/或细胞增殖的多肽的转基因包含在转基因之前及之后插入的序列元件，例如，1xP基因座(5' -ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3' (SEQ ID NO:1))。在某些情形下，由重组酶(例如，Cre)来识别1xP序列，任选地使用重组酶来切除位于两个1xP之间的转基因(例如，编码诱导细胞存活、细胞生存及/或细胞增殖的多肽的序列元件)。在使用Cre-1oxP系统的一个实施例中，构建其中融合转基因(例如，Tat-Myc、Vpr-Myc、Tat-Myc_ER或Tat-MYC)两侧侧接两个1xP序列的病毒质粒。在某些实施例中，通过任何适宜方法(例如，转导)将转基因整合至多种干细胞(例如，造血干细胞)的基因组中。
[0102]分化
[0103]在一些实施例中，本发明提供制备多种所选类型细胞的方法，其包含:
[0104](a).提供干细胞；
[0105](b).将编码永生性诱导剂或诱导永生性的癌肽的转基因引入条件永生化干细胞中以产生条件永生化干细胞；及
[0106](c).诱导多种永生化干细胞(例如，造血干细胞)分化成多种细胞类型。
[0107]在某些实施例中，用于本文所述任一方法中的永生化干细胞是条件永生化干细胞(ctlt-干细胞)。在一些实施例中，在未诱导条件永生化干细胞永生化的条件下实施条件永生化干细胞的分化。在其它实施例中，在诱导条件永生化干细胞永生化的条件下实施条件永生化干细胞的分化。
[0108]在一些实施例中，本文所揭示方法进一步包含使条件永生化干细胞与诱导分化的多肽及/或编码诱导分化的多肽的转基因接触。在一些实施例中，多肽包含输出序列(export sequence)及质膜保留兀件(plasma membrane retention element)。在某些实施例中，当细胞中的或由细胞表达的多肽保留在质膜上时，所述多肽进一步包含有助于自细胞表面移除多肽的序列。在某些实施例中，有助于自细胞表面移除多肽的序列是蛋白酶裂解位点。在一些实施例中，蛋白酶裂解位点是血清蛋白酶的底物。
[0109]在某些实施例中，诱导分化的多肽是细胞因子。在某些实施例中，细胞因子是生长及/或分化因子。在某些实施例中，生长及/或分化因子是EPO、THPO或G-CSF。
[0110]通过本文所述方法产生的细胞是可自正常或野生型干细胞分化的任何细胞。例如，本发明提供自永生化或条件永生化干细胞制备红细胞(红细胞)、淋巴样细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、天然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、凝血细胞或诸如此类的方法。在具体实施例中，自永生化或条件永生化干细胞制备红细胞。在其它具体实施例中，自永生化或条件永生化干细胞制备凝血细胞。在一些实施例中，根据本文所述任一方法制备的分化细胞是无核细胞，例如，红细胞。
[0111]此外，通过根据本文所述任一方法使永生化或条件永生化干细胞分化而制备的所选类型细胞包括(作为非限制性实例)淋巴祖细胞、淋巴母细胞、幼淋巴细胞、幼稚T细胞、T辅助细胞、天然杀伤细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调控T细胞、Y δ T细胞、祖B细胞、早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、不成熟B细胞、成熟B细胞、浆B细胞、记忆B细胞、B-1细胞、淋巴树突细胞、共同髓样祖细胞(common myeloid progenitorcell)、原巨核细胞、幼巨核细胞、巨核细胞、凝血细胞、原红细胞、嗜碱性成红血细胞、多染性成红血细胞、正染性成红血细胞、网织红细胞、红细胞、原粒细胞、嗜碱性早幼粒细胞、嗜碱性中幼粒细胞、嗜 碱性晚幼粒细胞、嗜碱性杆状核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性早幼粒细胞、嗜中性中幼粒细胞、嗜中性晚幼粒细胞、嗜中性杆状核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性早幼粒细胞、嗜酸性中幼粒细胞、嗜酸性晚幼粒细胞、嗜酸性杆状核细胞、嗜酸性粒细胞、成单核细胞、幼单核细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样树突细胞及肥大细胞。而且，在一些实施例中，永生化或条件永生化干细胞分化成非谱系细胞，例如上皮、肝脏、肺、胃肠道、脑、心脏、骨骼肌及皮肤细胞。
[0112]在一些实施例中，自永生化或条件永生化间充质干细胞制备骨细胞(bone cell或 osteocyte)、软骨细胞(cartilage cell 或 chondrocyte)、脂肪细胞(fat cell 或adipocyte)、肺细胞或诸如此类。在某些实施例中，自永生化或条件永生化神经干细胞制备神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞或诸如此类。在一些实施例中，自永生化或条件永生化上皮干细胞制备上皮细胞(例如，组织上皮的组成细胞(component cell))。在某些实施例中，自永生化或条件永生化皮肤干细胞制备角质形成细胞或诸如此类。在一些实施例中，自永生化或条件永生化毛囊干细胞制备毛囊细胞、表皮细胞或诸如此类。
[0113]在某些实施例中，以任何适宜方式使永生化或条件永生化干细胞分化成所选类型的细胞。在一些实施例中，通过使永生化或条件永生化干细胞与诱导分化的试剂(例如，细胞因子)接触来使所述细胞分化。在某些实施例中，使永生化或条件永生化干细胞与诱导永生化或条件永生化干细胞分化的试剂接触包含将试剂(或试剂组合)与永生化或条件永生化干细胞一起培养。在某些情形下，细胞因子由细胞表面上的多种细胞受体识别，且触发与所述受体功能相关的细胞反应。一方面，本文所用的细胞因子是指任何种类的细胞因子，包括自分泌细胞因子、旁分泌细胞因子或内分泌细胞因子。任选地使用用于诱导分化的试剂(例如，细胞因子)或试剂组合。在具体实施例中，用于使永生化或条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)分化的试剂(例如，细胞因子)包括(作为非限制性实例)以下试剂中的一或多者:IL-1至IL-35范围内的白细胞介素(IL)家族、干扰素(IFN)、白细胞迁移抑制因子(LMIF)、白血病抑制因子(LIF)、制癌蛋白M(OSM)、骨桥蛋白、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(THPO)、转化生长因子β (TGFi3)、肿瘤坏死因子(TNF)、干细胞因子(SCF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、β -凝血球蛋白、C家族趋化因子、CC家族趋化因子、CXC家族趋化因子、CX3C家族趋化因子、凝血细胞因子4、巨噬细胞炎性蛋白、肿瘤自分泌活动因子、肝细胞生长因子、神经白细胞素、T细胞抑制因子、B细胞激活因子、外胚层发育不良因子(ectodysplasins)、Fas-配体蛋白、0X40配体、RANK配体、淋巴毒素或其组合。
[0114]例如，在一些实施例中，根据本文所述任一方法诱导永生化或条件永生化干细胞分化成红细胞或祖红细胞包括使永生化或条件永生化干细胞与EPO接触(例如，一起培养)。在其它实施例中，根据本文所述任一方法诱导永生化或条件永生化干细胞分化成红细胞或祖红细胞包括使永生化或条件永生化干细胞与IL-3、IL-6、G-CSF及EPO接触(例如，一起培养)。此外，在某些实施例中，根据本文所述任一方法诱导永生化或条件永生化干细胞分化成凝血细胞包括使永生化或条件永生化干细胞与THPO接触(例如，一起培养)。在其它实施例中，根据本文所述任一方法诱导永生化或条件永生化干细胞分化成祖凝血细胞包括使永生化或条件永生化干细胞与IL-3、IL-6、G-CSF及THPO接触(例如，一起培养)。在一些实施例中，在本文所述的分化方法中使用细胞因子，例如地塞米松(dexamethasone)、B-雌二醇、胰岛素生长因子-1及/或环孢菌素A (cyclosporin A)。
[0115]在一些情形下，在使多种干细胞(例如，造血干细胞)与诱导分化的试剂接触之前，自条件永生化干细胞切除永生化诱导剂(例如，癌肽及/或编码癌肽的转基因及/或抗细胞凋亡肽)。以任何适宜方式来达成永生化诱导剂的切除，包括经由细菌重组酶(例如，Cre 或 Flp)。
[0116]在具体实施例中，本发明提供产生多种分化细胞的方法，其包含:
[0117](d).提供干细胞；
[0118](e).将编码永生性诱导剂或永生性诱导多肽的转基因引入条件永生化干细胞中以产生永生化或条件永生化干细胞；及
[0119](f).诱导永生化干细胞分化成所选类型的细胞。
[0120]在多个实施例中，条件永生化干细胞是(作为非限制性实例)干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、肠干细胞、祖心肌细胞干细胞、皮肤干细胞、毛囊干细胞、骨骼肌干细胞、成骨细胞前体干细胞、肝脏干细胞、胚胎干细胞或诸如此类。在具体实施例中，自任何适宜来源获得多种干细胞(例如，造血干细胞)。例如，在一些实施例中，干细胞自个体的骨髓、外周血、脐带或胎儿组织获得，或者从自个体骨髓、外周血、脐带或胎儿组织获得干细胞的来源得到。在一些实施例中，通过麻醉干细胞供体、使用针刺穿后上髂嵴并使用注射器抽吸骨髓细胞来获得多种干细胞(例如，造血干细胞)。在一些实施例中，自循环血液收获多种干细胞(例如，造血干细胞)。在一些实施例中，通过给干细胞供体注射细胞因子(例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF))来诱使骨髓中的多种干细胞(例如，造血干细胞)以较大数量自骨髓迁移至循环血液中。在某些实施例中，自人类脐带或胎盘收获多种干细胞(例如，造血干细胞)。在一些实施例中，多种干细胞(例如，造血干细胞)的来源是胎儿动物的发育中的血液产生组织。在人类中，在约12至18周的人类胎儿的循环血液中发现干细胞(例如，造血干细胞)。[0121]此外，在一些实施例中，本发明提供制备本文所述任一细胞的祖细胞或前体的方法。例如，在一些实施例中，利用本文所述任一方法来制备红细胞或凝血细胞的祖细胞或前体。所述祖细胞或前体包括(作为非限制性实例)髓样祖细胞。祖细胞是具有有限分化潜能的细胞。其自多种干细胞(例如，造血干细胞)产生，且产生终末分化的特定细胞亚群。例如，髓样祖细胞产生髓系细胞，而淋巴祖细胞产生淋巴祖细胞，例如T细胞或B细胞。在某些实施例中,根据本文所述任一方法来产生祖细胞。
[0122]在某些实施例中，对通过本文所述任一方法制备的细胞实施进一步分离以达到最终细胞产物的同质性。例如，红细胞在分化方法期间经历多个具有不同形态及特征的阶段。在某些实施例中，为收集基本上同质的多种红细胞，利用各种方法根据形状、大小、重量及/或体积来分离红细胞。各种分离方法包括(作为非限制性实例)离心、使用分选机或过滤。在某些实施例中，当终末分化产物不能容易地与培养物中的非分化细胞区分开来时，通过与终末分化形式的细胞特定相关的标记的存在来分离终末分化产物。例如，在一些实施例中，为分离终末分化的巨噬细胞，使用接合荧光物质的Gr-1抗体来处理含有巨噬细胞、永生化或条件永生化干细胞及其它祖细胞的混合物的培养物以识别培养物中的巨噬细胞。在一些实施例中，通过使用FACS设备将所识别的巨噬细胞分离成同质群体。
[0123]在某些实施例中，通过本文所述的任一方法来产生非终末分化的祖细胞。例如，在一些实施例中，给需要持续血液供应而非立即输注大量红细胞的个体递送根据本文所述方法制备的网织红细 胞或原红细胞以在活体内持续产生红细胞。在某些实施例中，为有助于自永生化或条件永生化干细胞分化祖细胞而非终末分化细胞，任选地对细胞因子选择、浓度及/或自培养基的移除时间进行调节。例如，通过调节所述参数，红细胞分化朝向有利于产生原红细胞而非终末分化红细胞的状态。在某些实施例中，以任何适宜方式来识别及/或分离祖细胞。在某些实施例中，通过(作为非限制性实例)使用FACS设备来达成分离、识别及/或分开。在一些实施例中，基于附接至Ter-119抗体的能力来识别及/或分离祖红细胞。图5显示条件永生化的多种干细胞(例如，造血干细胞)在活体外分化成表达Ter-119的红系祖细胞。
[0124]红细胞及凝血细胞
[0125]此外，本发明提供根据本文所述任一方法制备的分化细胞(例如，红细胞、凝血细胞或其祖细胞)。
[0126]在一些实施例中，本发明提供制备红细胞的方法，其包含:
[0127](g).提供条件永生化干细胞；及
[0128](h).诱导条件永生化干细胞分化成红细胞或祖红细胞。
[0129]在具体实施例中，诱导条件永生化干细胞分化成红细胞或其祖细胞包含使条件永生化干细胞与红细胞生成素(EPO)接触。
[0130]在一些实施例中，根据本文所述任一方法诱导永生化或条件永生化干细胞分化成红细胞或祖红细胞包括使永生化或条件永生化干细胞与EPO接触(例如，一起培养)。在其它实施例中，根据本文所述任一方法诱导永生化或条件永生化干细胞分化成红细胞或祖红细胞包括使永生化或条件永生化干细胞与G-CSF及EPO接触(例如，一起培养)。在一些实施例中，根据本文所述任一方法诱导永生化或条件永生化干细胞分化成红细胞或祖红细胞包括使永生化或条件永生化干细胞与IL-3、G-CSF及EPO接触(例如，一起培养)。在某些实施例中，根据本文所述任一方法诱导永生化或条件永生化干细胞分化成红细胞或祖红细胞包括使永生化或条件永生化干细胞与IL-3、G-CSF、IL-6及EPO接触(例如，一起培养)。在其它实施例中，根据本文所述任一方法诱导永生化或条件永生化干细胞分化成红细胞或祖红细胞包括使永生化或条件永生化干细胞与IL-3、G-CSF、环孢菌素A及EPO接触(例如，一起培养)。在其它实施例中，根据本文所述任一方法诱导永生化或条件永生化干细胞分化成红细胞或祖红细胞包括使永生化或条件永生化干细胞与G-CSF及EPO以及IL-3、IL-6、环孢菌素A或TNF-α中的一或多者接触(例如，一起培养)。
[0131]在一些实施例中，本发明提供制备凝血细胞的方法，其包含:
[0132](i).提供条件永生化干细胞；及
[0133](j).诱导条件永生化干细胞分化成凝血细胞或祖凝血细胞。
[0134]在具体实施例中，诱导条件永生化干细胞分化成红细胞或其祖细胞包含使条件永生化干细胞与血小板生成素(THPO)接触。
[0135]I1.筛诜方法
[0136]在某些实施例中，本发明提供用于识别选择性地诱导条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)分化的化合物的方法及试剂盒，其通过以下来实施:
[0137](a).提供条件永生化干细胞；
[0138](b).使条件永生化干细胞与化合物接触；
[0139](c).检测或测量化合物对条件永生化干细胞分化状态的影响；及
[0140](d).在与永生化干细胞接触时化合物身份未知的情况下，任选地分离及表征与永生化干细胞接触的化合物。
[0141]在诱导条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)分化成所选类型细胞的化合物的筛选方法中使用本文所揭示的任一永生化或条件永生化干细胞。
[0142]在某些实施例中，使条件永生化干细胞与化合物接触包含使条件永生化干细胞与化合物在其中条件永生化干细胞未处于永生化状态的条件下接触(即，用于条件诱导永生化状态的外部因子或分子已自条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)移除或尚未暴露于条件永生化干细胞(例如，造血干细胞))。例如，在通过使条件永生化干细胞与Myc-ER或Myc-GR多肽接触来产生条件永生化干细胞的一些实施例中，使条件永生化干细胞与化合物于不存在雌激素受体调节剂或配体(例如，他莫昔芬或4-羟基他莫昔芬)或糖皮质激素受体配体(例如，米非司酮)下接触。因此，在所述具体实施例中，ER或GR未激活且融合多肽的Myc结构域仍然不具有功能。在一些实施例中，条件永生化细胞包含TRE-Myc，例如，由tTA或rtTA激活的Myc，并使条件永生化干细胞与化合物接触但TRE-Myc不激活，例如在tTA激活的Myc情况下不存在四环素时及在rtTA激活的Myc情况下存在多西环素时。
[0143]在一些情形下，在使多种干细胞(例如，造血干细胞)与筛选方法中的化合物接触之前，自条件永生化干细胞切除永生化诱导剂(例如，癌肽及/或编码癌肽的转基因及/或抗细胞凋亡肽)。以任何适宜方式来达成永生化诱导剂的切除，包括经由细菌重组酶(例如，Cre 或 Flp)。
[0144]在某些实施例中，在不存在EPO下实施识别诱导分化的化合物的筛选。在所述情形下，通过所述筛选识别的化合物在没有EPO帮助下诱导条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)分化成所选类型的细胞(例如，红细胞)。在一些实施例中，当在不存在EPO下实施筛选时，EPO受体的表达受到破坏。在治疗上投予通过本文所揭示筛选方法识别的在不存在EPO下诱导多种干细胞(例如，造血干细胞)分化成红细胞的化合物不会有长期投予EPO而引起的发生红白血病(erythroleukemia)的风险。
[0145] 在其它实施例中，在存在EPO下实施诱导多种干细胞(例如，造血干细胞)分化的化合物的筛选。当存在EPO时，通过所述筛选方法识别的化合物调节(例如，增加或降低)EPO的活性。通过本文所揭示筛选方法识别的调节EPO活性的化合物可有效治疗红系白血病(erythroid leukemia)。
[0146]在某些实施例中，在不存在THPO下实施识别诱导分化的化合物的筛选。在所述情形下，在所述筛选中识别的化合物在没有THPO帮助下诱导条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)分化成所选类型的细胞(例如，凝血细胞)。在一些实施例中，当在不存在THPO下实施筛选时，THPO受体的表达受到破坏。在其它实施例中，在存在THPO下实施筛选。当存在THPO时，通过所述筛选方法识别的化合物调节(例如，增加或降低)ΤΗΡ0的活性。
[0147]在某些实施例中，通过任何适宜方法来检测或测量化合物对条件永生化干细胞分化状态的影响，包括(作为非限制性实例)功能获得筛选(gain-of-function screen)、基因表达及微阵列分析、免疫细胞化学、细胞标记的标记抗体检测或测量、细胞分子标签的HPLC分析、小分子荧光团筛选及细胞功能分析。
[0148]在某些实施例中，通过所属领域的技术人员已知的适宜方法来分离与细胞接触的化合物，例如(作为非限制性实例)，气相色谱、高效液相色谱、快速色谱、沉淀及结晶。在某些实施例中，利用业内已知的适宜方法来表征所表征的化合物，例如(作为非限制性实例)，NMR, IR、质谱及X射线晶体学。
[0149]在一些实施例中，本发明提供通过本文所述任一方法识别的化合物。通过筛选各个化合物或化合物的混合物来识别化合物。任选地使条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)与各个化合物或化合物的集合(例如，化合物的组合文库)接触。以高通量方式利用比色分析来筛选化合物以识别诱导分化或调节其它分化剂活性的化合物。
[0150]在某些实施例中，用于识别适于诱导多种干细胞(例如，造血干细胞)、尤其条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)分化的化合物的试剂盒包含多种干细胞(例如，造血干细胞)，尤其条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)，其中所述试剂盒描述本文所述的用于识别诱导多种干细胞(例如，造血干细胞)分化的化合物的筛选方法。
[0151]II1.治疗方法
[0152]在治疗上或作为研究的细胞来源而任选地使用根据本文任一方法制备的细胞。
[0153]无核细胞缺乏症
[0154]在某些实施例中，本发明揭示治疗特征在于缺乏无核细胞的病症的方法，其包含:投予根据本文所揭示方法制备的无核细胞。在一些实施例中，所述病症是贫血(例如，再生障碍性贫血、恶性贫血、缺铁性贫血、镰状细胞性贫血、球形细胞增多症、溶血性贫血)、高歇氏病、溶血、嗜中性白血球减少症、血小板减少症、粒细胞减少、血友病、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、B细胞慢性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、滤泡样淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性髓样白血病、前B急性淋巴细胞白血病、前T急性淋巴细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、难治性白血病或其组合。在某些情形下，特征在于缺乏无核细胞的病症是由化学疗法引起(部分或完全)。在一些实施例中，通过本发明所揭示方法产生的无核细胞与化学疗法共投予。
[0155]在一些实施例中，将凝血细胞、红细胞或其祖细胞投予或输注至有需要的个体(例如，患有失血)。在一些实施例中，通过给予髓样前体细胞以弥补髓样细胞缺乏来治疗患有髓样细胞亚群数量低的患者。在需要立即输注的某些实施例中，将根据本文所述方法制备的大量红细胞及/或凝血细胞投予至个体。在一些实施例中，期望持续输注血液及/或凝血细胞,且将红细胞及/或凝血细胞的祖细胞投予至个体。
[0156]在各种病状个体的细胞替代疗法及/或补充疗法中任选地使用根据本文所述任一方法制备的所选类型的细胞，所述病状包括(作为非限制性实例)贫血、嗜中性白血球减少症、血小板减少症、粒细胞减少、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、B细胞慢性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、滤泡样淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性髓样白血病、前B急性淋巴细胞白血病、前T急性淋巴细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、难治性白血病或其组合。
[0157]递送装置
[0158]任选地将根据本文所揭示任一方法制备的细胞作为目标多肽的递送运载体投予至患者以用于例如治疗或诊断目的。例如，使用根据本文所述方法制备的细胞(例如，红细胞及凝血细胞)递送蛋白质的主要优势包括细胞的短暂性、不含完全成熟的无核细胞中的遗传物质、以及个体产生的淋巴室(lymphoid compartment)能耐受用于递送的“自容器”。
[0159]在一些实施例中，多 肽是治疗上有益的多肽。在其它实施例中，多肽是诊断性多肽。在某些实施例中，多肽不是癌肽。在一些实施例中，多肽包含输出序列及质膜保留元件，由此细胞中的或由细胞表达的多肽保留在质膜上。在一些非限制性实施例中，质膜保留元件是GPI连接蛋白、CD8或CD16。在某些实施例中，当细胞中的或由细胞表达的多肽保留在质膜上时，所述多肽进一步包含有助于自细胞表面移除多肽的序列，例如蛋白酶裂解位点。在一些实施例中，蛋白酶裂解位点是血清蛋白酶(例如，人类血清蛋白酶)的底物。使用以此方式产生的细胞通过将特定肽引入患者的外周血中来将所述特定肽递送至患者中，在外周血中血清蛋白酶将自细胞表面裂解及释放肽。在质膜上表达所选多肽(包括可裂解多肽)的以本文所揭示方式产生的细胞是递送治疗性蛋白质的运载体。例如，在某些实施例中，当使用红细胞作为蛋白质递送的运载体时，主要优势包括红细胞及其递送的编码蛋白的短暂性、不含完全成熟的无核红细胞中含有的遗传物质、使用能被个体产生的淋巴室所耐受的蛋白质递送容器以及能够产生用于活体外递送的细胞。
[0160]在一些实施例中，多肽是诱饵受体。在某些实施例中，诱饵受体是细胞因子受体。在一些实施例中，细胞因子受体是可溶性的。在某些实施例中，诱饵受体是IL3R-FC、IL6R-Fc、TNF- a R-FC, IFN- a R-Fc 或 BAFFR-Fc。
[0161]在其它实施例中，多肽是毒素。在某些实施例中，毒素是蓖麻毒蛋白或白喉毒素。
[0162]在一些实施例中，多肽是血管生成抑制剂。
[0163]在其它实施例中，多肽是促血管生成因子。
[0164]在又一些其它实施例中，多肽是淋巴管生成因子(lymphangiogenic factor)。
[0165]在其它实施例中，多肽是血管扩张肽。
[0166]在其它实施例中，多肽是抗原。
[0167]在又一些其它实施例中，多肽是蛋白酶。在某些实施例中，所述蛋白酶对栓塞团块(embolitic mass)中的纤维化组织具有特异性。
[0168]在一些实施例中，多肽是诸如病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫等微生物的受体。在一些具体实施例中，所述微生物受体是遗传修饰的微生物受体，其由于对微生物具有较高结合亲和性而超过微生物的内源受体。
[0169]在一些实施例中，通过本发明所揭示方法产生的细胞是多肽血管生成抑制剂的递送运载体。在其它实施例中，多肽是促血管生成因子及/或淋巴管生成因子，且将通过本发明所揭示方法产生的所述细胞投予至患者以递送用于治疗例如冻疮、与癌症相关的血管收缩或风湿性关节炎的多肽。
[0170]在又一些其它实施例中，根据本文所揭示任一方法制备的细胞中的或由所述细胞表达的多肽是血管扩张肽。以此方式，通过本文所揭示方法产生的细胞是用于递送用以治疗心肌梗塞、胎儿分娩或偏头痛期间的血管收缩的蛋白质的运载体。
[0171]在其它实施例中，多肽是抗原。通过本文所揭示方法产生的表达抗原的细胞是用于递送抗原以产生免疫 反应的运载体。
[0172]在一些实施例中，将所述细胞与铎样受体配体(TLR配体)一起递送至患者以加强终生免疫性。
[0173]在又一些其它实施例中，多肽是蛋白酶。在某些实施例中，所述蛋白酶对栓塞团块中的纤维化组织具有特异性。例如，在某些实施例中，将表达对栓塞团块中的纤维化组织具有特异性的蛋白酶的通过本文所揭示方法产生的细胞投予至患者以减少血凝块形成或降低肺栓塞的风险。
[0174]在一些实施例中，多肽是病毒受体。在一些实施例中，将表达病毒受体的通过本文所揭示方法产生的细胞投予至患者以例如通过将病毒与其天然靶细胞隔离而降低病毒载量。
[0175]图6显示致死辐照后通过条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)移植物实施的活体内红细胞重构-宏观视图1。图7显示致死辐照后通过条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)移植物实施的活体内红细胞重构-宏观视图1I。图8显示致死辐照后通过条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)移植物实施的活体内红细胞重构-无核红细胞的显微镜视图。
[0176]IV.牛物反应器
[0177]在一些实施例中，通过使用生物反应器来产生分化的血细胞(例如，红细胞或凝血细胞)。在某些实施例中，生物反应器是流动反应器或间歇反应器。在具体实施例中，流动反应器是连续流动反应器或间歇流动反应器。在某些实施例中，通过在容器中接种永生化或条件永生化干细胞群体而在反应器中实施合成。在一些实施例中，诱导或使永生化或条件永生化干细胞群体增殖(例如，缘于由其中的多肽引起的对细胞存活、生存及/或增殖的促进)。在制备足够永生化或条件永生化干细胞群体(例如，至少0.1kg、1kg、IOkg或100kg)后，使所述条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)与诱导条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)分化成期望细胞(例如，根据本文所述任一方法)的培养基接触。在某些实施例中，随后收集期望的分化细胞(例如，祖细胞及/或终末分化细胞)。
[0178]本文所述的永生化或条件永生化干细胞能够冷藏保存(例如，短于约I天、约I天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约I个月、约3个月、约4个月、约6个月、约8个月、约9个月、约12个月)。此特征使得能够方便地大规模按需合成所选类型的细胞。在某些实施例中，对永生化或条件永生化干细胞进行处理以移除永生化基因，且随后冷藏保存以用于将来分化。在某个实施例中，使永生化或条件永生化干细胞分化成祖细胞(例如原巨核细胞)，并冷藏保存以用于立即产生凝血细胞。
[0179] 在某些实施例中，本发明提供反应器系统，其包含:
[0180](k).进料容器，其包含多种条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)；
[0181](I).反应容器，其包含多种条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)及诱导条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)分化成红细胞或凝血细胞的试剂，其中所述反应容器与所述进料容器连通 '及
[0182](m).与所述反应容器连通的下游收获容器，所述收获容器包含多种红细胞或凝血细胞。
[0183]在某些实施例中，所述进料容器进一步包含诱导条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)增殖的试剂。在一些实施例中，所述系统进一步包含反应器管控系统，其调控反应容器与进料容器之间以及反应容器与下游收获反应器之间的连通。在某些实施例中，通过使条件永生化干细胞与Myc基因或多肽及任选地Bcl-2基因(即，Bcl-2转基因)或多肽接触来产生条件永生化干细胞。在一些实施例中，通过使条件永生化干细胞与Myc-ER融合基因或融合多肽及任选地Bcl-2基因或多肽接触来产生条件永生化干细胞。在某些实施例中，诱导多种干细胞(例如，造血干细胞)增殖的试剂是雌激素受体调节剂。在一些实施例中，诱导条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)分化成红细胞的试剂是IL-3及ΕΡ0。在某些实施例中，诱导条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)分化成凝血细胞的试剂是IL-3及 THPO。
[0184]实例
[0185]实例I
[0186]图1A显示用于使用MYC.ER及Bcl-2转导原代鼠科动物HSC细胞的逆转录病毒构建体的图示。产生PMSCV骨架的变体以编码人类MYC.ER或Bcl-2以及IRES元件及报告基因(EGFP)的cDNA。所得病毒产生双顺反子转录物，由此报告基因的表达水平与第一 cDNA的表达水平相关。图1B显示自5-氟尿嘧啶治疗供体获得的HSC在使用pMIG-MYC.ER及pMIG-Bcl-2转导后的流式细胞术分析。图1C显示移植显示于图B中的经转导HSC的小鼠中白血病发生的动力学。给致死辐照的小鼠群移植105个经pMIG-MYC.ER及pMIG-Bcl-2转导的HSC。移植后一周，每周给小鼠注射一次40HT。曲线表示开始注射40HT (在图中为第O天)后给定时间点时存活小鼠的百分比。所有小鼠一律死于AML样白血病。此处显示的数据来自4个独立实验中的一个代表实验。图1D显示自白血病小鼠的骨髓回收后不久ctlt-造血干细胞的FACS分析。在建立条件永生化造血干细胞系方法的早期阶段，细胞一律表达高水平的GFP，最显著地表达高水平的c-kit及Sca-1，但不表达Flk_2、⑶34或谱系标记，例如CD19、B220(显示于图中)或Thyl.2、Mac-l、Gr-l、Ter-119。图1E显示已建立的条件永生化造血干细胞系的FACS分析。扩增条件永生化造血干细胞系并冷藏保存后，其保持稳定的表面表型，此表示于图B中。所述细胞表达高水平的Sca-1，但具有较低的c-Kit表面水平，且 Flk-2、CD34、B220、CD19 或其它谱系标记(Thyl.2、Gr-l、Mac-l、Ter_119 ;未显示)仍为阴性。c-kit表面水平的降低似乎为连续信号传导的结果，这是因为其需要G-CSF来保持其HSC样表型。图1F显示野生型C57/BL6小鼠骨髓的正常未经处理造血干细胞中干细胞标记的FACS分析。骨髓干细胞自野生型未经处理的C57/BL6小鼠获得。使用c_kit、sca-UFlk-2及⑶34的抗体对细胞进行染色，以比较正常HSC及ctlt-造血干细胞系中标记蛋白质的表达水平。
[0187]实例2
[0188]图2显示通过逆转录病毒插入物的PCR扩增而实施的条件永生化造血干细胞系的无性系形成能力的分析。我们从获自C57/BL6小鼠的正常骨髓细胞、或两种亲代细胞系、或七种衍生自亲代细胞系的单细胞无性系的细胞系分离基因组DNA。使用嵌套式两阶段PCR程序来扩增整合的逆转录病毒插入物。泳道I显示正常C57/BL6细胞的图谱(pattern)。泳道2及3显示多克隆细胞系中逆转录病毒整合体的图谱。泳道4至10显示最初衍生自任一亲代细胞系的单细胞无性系的细胞系中逆转录病毒插入物的图谱。与亲代细胞系一样，克隆群体能够拯救小鼠脱离致死辐照的危险并产生造血细胞谱系。
[0189]实例3 [0190]图3显示在移植ctlt-造血干细胞后产生的成熟免疫细胞的表征。图3A显示移植后淋巴组织中衍生自ctlt-造血干细胞的细胞频率。将C57/BL6小鼠群致死辐照，并给予由IO3个ctlt-造血干细胞及3xl05个自Rag-1+小鼠获得的载体全骨髓细胞组成的移植物。通过逆转录病毒编码的报告基因GFP在活体内追踪自条件永生化造血干细胞产生的细胞。嵌合小鼠的骨髓、胸腺、脾及淋巴结中表达GFP的造血细胞的频率表示于图A中。所述直方图是自例示5只小鼠组成的群内每一者的一只小鼠的器官获得。图3B显示骨髓中GFP+髓系细胞的检测。针对Mac-1及Gr-1对骨髓细胞进行染色。图B显示尽管并非嵌合小鼠骨髓中发现的所有髓样细胞均表达逆转录病毒编码的报告基因，但相当大一部分是GFP+，且因此衍生自ctlt-造血干细胞。图3C显示脾中外周成熟淋巴细胞的分析。通过流式细胞术针对成熟T及B细胞对嵌合小鼠的脾进行分析。C图显示存在CD4或CD8单一阳性的TCRaB T细胞。另外，C图还显示检测到表面上表达IgM及IgD的⑶19+B细胞。尽管所述脾中成熟T细胞的频率与野生型未经处理的C57/BL6小鼠中所发现者相当，但B细胞的发育延迟。图3D显示条件永生化造血干细胞第二连续传代后移植物受体小鼠中外周成熟淋巴细胞的分析。自嵌合小鼠收集脾，并制备单细胞悬浮液并且用于FACS分析。比较受体及野生型C57/BL6小鼠中发现的成熟T及B细胞的频率。图D显示在所述脾中以类似于正常小鼠的频率存在成熟⑶4或⑶8单一阳性TCRa β T细胞。存在⑶19+IgM+及IgD+B细胞，尽管其频率较正常小鼠低。
[0191]实例4
[0192]图4显示ctlt-造血干细胞长期拯救而脱离致死辐照的危险。单独条件永生化造血干细胞移植未赋予可脱离由失去红细胞诱导的危险的辐射防护。绘制经致死辐照并给予移植物的小鼠群的卡普兰/麦耶尔(Kaplan/Mayer)存活曲线，所述移植物由IO3个或IO5个来自两种不同条件永生化造血干细胞系的细胞(条件永生化造血干细胞或条件永生化造血干细胞.2)组成。所有群均由10只小鼠组成，且所述动物一律死于严重贫血。另外，我们还给出了经致死辐照并给予3xl05个自Rag-1+小鼠获得的载体全骨髓细胞以及IO3个来自任一细胞系的条件永生化造血干细胞的两个小鼠群的死亡率曲线。每一群由3至4只小鼠组成，且动物在移植后长达6个月仍保持活着且健康。[0193]实例5-通过投予通过本发明所揭示方法产生的红细胞来活体内治疗贫血
[0194]给予两个健康小鼠群亚致死剂量的辐照以诱导贫血。给第一贫血小鼠群组投予存于适宜载剂中的红细胞(如本文所揭示而产生)。仅给第二小鼠群组(对照小鼠)投予适宜载剂。比较两个小鼠群组的死亡率以测定投予本文所揭示红细胞拯救小鼠脱离贫血危险的功效。
_5] 实例6-在肾衰竭小鼠模型中活体内治疗贫血.[0196]如文献哈马莫瑞(Hamamori)等人，临床研究期刊(J.Clin.1nvest.) (1995) ,95:1808-1813中所报导，在肾衰竭小鼠模型中诱导贫血。简单来说，对7至8周龄的雄性裸小鼠实施两步骤肾切除术。通过测量血细胞比容水平来证实小鼠贫血。将接受投予通过本发明所揭示方法产生的红细胞的小鼠的死亡率与仅接受细胞载剂的小鼠的死亡率进行比较，以测定投予本文所揭示红细胞对于治疗由肾衰竭引起的贫血的功效。
[0197]尽管已在本文中显示及阐述本发明的优选实施例，但所属领域的技术人员显然了解所述实施例仅作为实例提供。所属领域的技术人员现将构想出许多变更、改变及替代，此并不背离本发明。应了解，可在本发明实践中使用本文所述本发明实施例的各种替代实施例。本发明的范围 打算由以下权利要求书界定，且因此在所述权利要求书和其等效内容的范围内的方法和结构均涵盖在本发明内。
【权利要求】
1.一种制备成熟红细胞的方法，其包含:在诱导分化成红细胞的试剂存在下培养条件永生化造血干细胞，其中所述试剂为IL-3和EPO ;其中所述试剂将条件永生化造血干细胞诱导分化为成熟红细胞； 其中通过以下来产生所述条件永生化造血干细胞: a.使用第一核酸转导多个造血干细胞，所述第一核酸包含编码MYC分子的核酸序列； b.使用第二核酸转导所述造血干细胞，所述第二核酸包含编码Bcl-2、Bcl-X或其组合的核酸序列；及 c.将所述造血干细胞与IL-3、IL-6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养； 且其中在分化之前已抑制所述Myc分子的一种或多种活性，或已抑制Myc分子的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一核酸进一步包含人类雌激素受体的激素结合结构域。
3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含诱导所述Myc分子移位至细胞核。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述第二核酸编码Bcl-2。
5.—种产生成熟红细胞的方法，其包含:在诱导分化成红细胞的试剂存在下培养条件永生化造血干细胞，所述试剂为IL-3和EPO ;其中所述试剂将条件永生化造血干细胞诱导分化为成熟红细胞； 其中通过以下来产生所述条件永生化造血干细胞: a.使多个造血干细胞与重组的第一肽接触，所述第一肽包含移位至细胞核的MYC分子，所述第一肽具有MYC生物活性； b.使所述造血干细胞与重组的第二肽接触，所述第二肽包含Bcl-2、BCL-X或其组合，所述第二肽在所述细胞内具有抗凋亡功能；及 c.将所述造血干细胞与IL-3、IL-6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养； 且其中在分化之前所述第一肽的活性或存在降低。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一肽、所述第二肽、或所述第一肽与所述第二肽二者包含转运蛋白序列。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述第一肽、所述第二肽、或所述第一肽与所述第二肽二者包含TAT序列。
8.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其中所述MYC分子是c-Myc、1-Myc、n-Myc、s-Myc 或其组合。
9.根据权利要求5至7中任一权利要求所述的方法，其中所述第二肽是Bcl-2。
10.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其进一步包含使所述造血干细胞与雌二醇(E2)、4_羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen) (4-OHT)或二者接触。
11.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其中所述造血干细胞进一步包含编码目标多肽的核酸。
12.—种成熟的红细胞，其由根据权利要求1至6中任一权利要求所述的方法所产生。
13.—种组合物，包括:根据权利要求12所述的成熟的红细胞，所述组合物用于治疗选自由以下组成的群组的病症:表征为成熟红细胞的缺陷的病症、表征为失血的病症、贫血、高歇氏病、溶血、嗜中性 白血球减少症、血小板减少症、粒细胞减少和血友病。
【文档编号】A61P7/06GK103937749SQ201410168106
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2009年7月21日 优先权日:2008年7月21日
【发明者】优素福·里菲利, 布赖恩·柯蒂斯·特纳 申请人:泰加生物工艺学公司