一种小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物及其制备方法和应用，所述前体药物的分子结构中包括叶酸、氨基酸和紫杉醇，其中叶酸为靶向配体，氨基酸为连接子，该前体药物中还包括荧光染料；本发明相比现有技术的优点在于：本发明解决了紫杉醇的水溶性和靶向性问题，并降低了紫杉醇药物的毒性，提高了其治疗效果，避免了大分子蛋白所引起的机体免疫原毒性，同时解决了用脂质体作为难溶性药物载体所存在的包封率差、结构不稳定等缺陷。
【专利说明】一种小分子修饰的朝向性紫杉醇前体药物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种紫杉醇前体药物，属于生物医药领域，尤其涉及的是一种小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]紫杉醇是从红豆杉属植物树皮中提取的一种抗癌活性物质，1992年以来，美国FDA相继批准紫杉醇用于治疗晚期卵巢癌、转移性乳腺癌、非小细胞肺癌以及与艾滋病有关的Kaposis恶性肿瘤，1998年FDA批准半合成紫杉醇与顺钼联合使用治疗晚期卵巢癌，2001年紫杉醇的销售额高达20亿美元。
[0003]紫杉醇是一种天然的三环二萜物质，结构十分复杂，有一个庞杂的环状结构及众多疏水性取代基，在水中的溶解性很差，制约了紫杉醇广泛地应用，需要开发溶解性好，且具有靶向性的紫杉醇前药。现有技术中，靶向性紫杉醇释药系统的构建多采用大分子作为紫杉醇药物的载体，其制备方法主要包括大分子蛋白作为紫杉醇载体的合成法，或是传统的药物剂型，如利用大分子材料(即脂质体)包封作为紫杉醇载体的制备方法。但使用大分子蛋白作为药物载体，外源性蛋白会诱导机体免疫原毒性，而传统的脂质体也会存在包封率不同和渗漏等问题，如现在已经上市的注射用紫杉醇(白蛋白型)，以人血白蛋白作为辅料起分散、稳定微粒和运载主药，用药后最多见的为中性粒细胞缺乏，低血压，心电图异常，呼吸困难，咳嗽。神经病 变，转氨酶升高，恶心呕吐，腹泻和无力等不良反应。注射用紫杉醇脂质体(力朴素)可用于卵巢癌的一线化疗及以后卵巢癌转移性癌的治疗，作为一线化疗药物注射后由于缺乏靶向性，会引起过敏反应、骨髓抑制、神经毒性、心血管毒性和肝脏毒性等不良反应。CN101224306B中公开了一种叶酸-多肽复合物介导的靶向抗肿瘤前体药物及其制备方法，该方法以丙氨酰-丝氨酰-甘氨酰-脯氨酰多肽为连接子，成功合成携带有在肿瘤间质细胞周围选择性水解的多肽结构和对肿瘤细胞上的叶酸受体有高亲和力的靶向性抗肿瘤前体药物，加快了抗肿瘤药物主动向特定肿瘤组织的富集速度。此发明也是以叶酸作为药物“导向基团”，以多肽-树脂作为药物大分子载体合成叶酸-多肽复合物，无法克服大分子药物载体带来的免疫毒性的问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物及其制备方法和应用，以提供一种新的紫杉醇修饰技术和低毒的紫杉醇前体药物，解决用大分子蛋白作为载体时产生的免疫原毒性和用脂质体作为载体时的包封率不同和渗透问题。
[0005]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0006]—种小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物，所述前体药物的分子结构中包括叶酸、氨基酸和紫杉醇，所述氨基酸具有氨基保护基团或羧基保护基团，选自精氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、丝氨酸和赖氨酸中的一种，该前体药物中，叶酸为靶向配体，氨基酸为连接子。
[0007]优选地，所述前体药物的分子结构中还包括荧光染料，所述荧光染料选自异硫氰酸荧光素FITC、氨基荧光素或近红外荧光染料中的一种，所述荧光染料能与氨基酸的氨基发生反应，从而共轭结合至前体药物的分子结构中进行修饰，利用小分子的荧光染料做修饰,能够增大紫杉醇的水溶性，同时还能标记紫杉醇,实现离体检测肿瘤细胞和组织。
[0008]优选地，所述氨基酸为精氨酸或谷氨酸，所述荧光染料为异硫氰酸荧光素FITC或氨基荧光素。
[0009]优选地，所述叶酸、氨基酸、紫杉醇或荧光染料的摩尔质量比为1:1:1:1。
[0010]一种上述小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物的制备方法，包括以下步骤:
[0011](I)将氨基酸和紫杉醇溶于二氯甲烷中，所述氨基酸和紫杉醇的摩尔质量比为1:1，滴加2，2_二羟甲基丁酸DMPA，至溶液澄清，冰浴搅拌，再滴加已溶于二氯甲烷的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC.HCl溶液进行反应，获得氨基酸-紫杉醇反应液；
[0012](2)将步骤(1)的氨基酸-紫杉醇反应液中加入二氯甲烷稀释，获得稀释液，将稀释液先用水洗2次，再用食盐水洗2次，用分液漏斗分离出溶有氨基酸-紫杉醇二氯甲烷溶液，用无水硫酸镁除水，抽滤，旋干后用二氯甲烷重新溶解，过硅胶柱纯化，获得氨基酸-紫杉醇纯品，脱去氨基酸-紫杉醇纯品中氨基酸的保护基团，然后用乙醚萃取，获得氨基酸-紫杉醇共轭物；所述氨基酸的保护基团脱去处理过程中，若选择的氨基酸的保护基团为氨基保护基团时，可直接脱去，若保护基团为羧基保护基团时，则在羧基保护基团脱去后，再将羧基部分活化成酯；
[0013](3)将叶酸溶于二甲基亚砜DMSO中，加入二环己基碳二亚胺DCC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS过夜进行反应，离心去沉淀后，用丙酮萃取，获得叶酸活性酯；
[0014](4)将步骤(2)的氨基酸-紫杉醇共轭物溶于DMSO中，加入步骤(3)的叶酸活性酯，室温反应10~30小时，冷冻干燥后，过硅胶柱纯化，获得叶酸-氨基酸-紫杉醇纯品；
[0015](5)将步骤(4)的叶酸-氨基酸-紫杉醇纯品中加入三氟乙酸TFA的DMSO溶液中，混匀后，冷冻干燥，过硅胶柱纯化，获得叶酸-氨基酸-紫杉醇前体药物；
[0016](6)避光条件下，将步骤(5)的叶酸-氨基酸-紫杉醇共轭物溶于DMSO中，加入荧光染料反应，然后再冷冻干燥，过硅胶柱纯化，获得所述叶酸-氨基酸-紫杉醇-荧光染料前体药物。
[0017]优选地，所述步骤(2)的脱去氨基酸-紫杉醇纯品中氨基酸的保护基团的方法为:用质量分数为20%的哌啶脱去保护基团，该方法能够脱去氨基酸的氨基保护碱基。
[0018]优选地，所述步骤(5)的TFA的DMSO溶液中，TFA的质量分数为20%。
[0019]一种上述小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0020]本发明相比现有技术具有以下优点:本发明提供了一种小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物及其制备方法，该方法采用多个小分子修饰紫杉醇，且每个小分子充当不同角色，包括小分子靶向、小分子 连接子和小分子染料，解决了紫杉醇的水溶性和靶向性，并降低了紫杉醇药物的毒性，提高了其治疗效果；本发明选用小分子氨基酸作为连接子，替代现有技术中用大分子蛋白或大分子脂质体作为紫杉醇药物载体，避免了大分子蛋白所引起的机体免疫原毒性，同时解决了用脂质体作为难溶性药物载体所存在的包封率差、结构不稳定等缺陷；选用荧光染料小分子修饰紫杉醇，使得紫杉醇的水溶性更大，同时还能够标记紫杉醇，实现离体检测肿瘤细胞和组织；该紫杉醇前体药物的制备方法在常温条件下完成即可，对生产环境要求低，由于小分子的结构较大分子稳定，反应过程和纯化条件较大分子修饰更易掌握；本发明的紫杉醇前提药物的每一步反应产物的产率均在85%以上，适于大规模生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0021 ] 图1为精氨酸-紫杉醇共轭物LC-MS色谱图；
[0022]图2为叶酸-精氨酸-紫杉醇在乳腺癌细胞MDA-MB-231中靶向性测定的荧光图；
[0023]图3为叶酸-精氨酸-紫杉醇在乳腺癌细胞MDA-MB-231中孵育24小时候的细胞调亡图；
[0024]图4为谷氨酸-紫杉醇共轭物LC-MS色谱图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0026]实施例1
[0027]本实施例为一种小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物的制备方法，包括以下步骤:
[0028](I)将紫杉醇(100mg,0.117mmol)溶于15ml 二氯甲烧(加转子完全溶解),再加入精氨酸(75.82mg，0.117mmol)搅拌(有浑浊)，加少量DMAP (0.117mmol)，至浑浊澄清，换冰浴搅拌，并用注射器逐滴加入溶有EDC -HCl (44.85mg,0.234mmol)的IOml 二氯甲烷，滴加20分钟后，室温搅拌22小时，每4小时用薄层色谱TLC点板跟踪一次，反应结束后，获得氨基酸-紫杉醇反应液；
[0029](2)将步骤(1)的反应液中加同体积二氯甲烷(15ml)稀释，并用同体积水(40ml)水洗二次，再用同体积饱和食盐水(40ml)洗二次，用分液漏斗分离出溶有精氨酸-紫杉醇的二氯甲烷溶液，用无水硫酸镁除水，减压抽滤，真空旋转蒸发仪旋干后用二氯甲烷重新溶解，过硅胶柱纯化，获得氨基酸-紫杉醇纯品；再用质量分数为20%的哌啶脱去精氨酸-紫杉醇纯品中精氨酸的保护碱基，获得精氨酸-紫杉醇共轭物，所述精氨酸-紫杉醇共轭物的液相色谱-串联质谱LC-MS色谱图如图1所示，精氨酸-紫杉醇最终产率为90%。
[0030](3)将叶酸溶于二甲基亚砜DMSO中，加入二环己基碳二亚胺DCC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS过夜进行反应，离心去沉淀后，用丙酮萃取，获得叶酸活性酯；
[0031](4)将步骤(2)的精氨酸-紫杉醇共轭物溶于5ml的DMS0，加入步骤(3)的叶酸活性酯，室温反应10~30小时，冷冻干燥后，用薄层色谱TLC点板跟踪，至反应完全后，过硅胶柱纯化，获得叶酸-精氨酸-紫杉醇纯品；
[0032](5)将步骤(4)的叶酸-精氨酸-紫杉醇纯品中加入到质量分数为20%的TFA的DMSO溶液中，混匀后，用薄层色谱TLC点板跟踪，至反应完全后进行冷冻干燥，然后过硅胶柱纯化，获得叶酸-精氨酸-紫杉醇前体药物；[0033](6)避光条件下，将步骤(5)的叶酸-精氨酸-紫杉醇共轭物溶于5ml的DMSO中，加入荧光染料FITC，反应24小时后，TLC点板跟踪，至反应完全后进行冷冻干燥，再过硅胶柱纯化，获得叶酸-精氨酸-紫杉醇-FITC前体药物。
[0034]叶酸-精氨酸-紫杉醇-FITC前体药物在肿瘤细胞中靶向性的测定:
[0035]将I X 104个乳腺癌细胞株MDA-MB-231的细胞放入24孔板，并在培养基中孵育过夜。用PBS小心地洗两次后，加入150 μ L的DMEM培养基，加入50 μ L溶于PBS的上述制备获得的叶酸-精氨酸-紫杉醇-FITC前体药物(lmg/mL)到每一个孔中，并设阴性对照组，在37°C，二氧化碳浓度为5%，加湿空气的条件下进行孵育12h后，每个孔用PBS洗两次，再在40倍的荧光显微镜下拍照，获得如图2所示的荧光图，图中可以看出，紫杉醇在叶酸、精氨酸和FITC三种小分子的修饰下，在PBS中的水溶性好，且在肿瘤细胞中孵育12小时后即可靶向性地进入细胞中。
[0036]叶酸-精氨酸-紫杉醇-FITC前体药物对乳腺癌细胞株MDA-MB-231诱导细胞凋亡的形态学观察
[0037]具体采用磷脂酰丝氨酸外翻分析法(Annexin V)观察细胞凋亡的情况，步骤包括:将I X 105个乳腺癌细胞株MDA-MB-231的细胞放入共聚焦孔板，在培养基中孵育过夜。用PBS小心地洗两次后，加入150 μ L的DMEM和RPMI1640培养基，加入50 μ L溶于PBS的上述制备获得的叶酸-精氨酸-紫杉醇-FITC (lmg/mL)到每一个孔中，并设阴性对照组，在370C，二氧化碳浓度为5%，并加湿空气的条件下进行孵育24h后，用PBS洗涤细胞二次，再在每孔中加入500 μ L的Binding Buffer和5 μ L的Annexin V-FITC(前药中有突光标记,但没有凋亡细胞膜的标记作 用)，混匀，再加入5 μ L的Propidium 1dide,混匀，室温下避光反应10min，40倍荧光显微镜下观察，获得如图3所示的荧光图，从图中可以看出，加入本实施例制备的紫杉醇前体药物24小时后，MDA-MB-231细胞变圆，膜皱缩，发泡，细胞核呈波纹状或呈折缝状，膜皱缩，发泡，细胞核裂解为碎块，产生了凋亡小体，细胞凋亡进入晚期，因此，本实施例制备获得的叶酸-精氨酸-紫杉醇-FITC的紫杉醇前药能够诱导MDA-MB-231细胞凋亡。
[0038]实施例2
[0039]本实施例的步骤(1)中,将紫杉醇(IOOmg, 0.117mmol)溶于15ml 二氯甲烧,再加入谷氨酸(49.78mg,0.117mmol)搅拌反应，步骤(6)中，用氨基荧光素代替FITC，其它步骤同实施例1，获得叶酸-谷氨酸-紫杉醇前体药物和叶酸-谷氨酸-紫杉醇-氨基荧光素前体药物，其中中间产物谷氨酸-紫杉醇共轭物的LC-MS色谱图如图4所示，产率为92%。
[0040]实施例1和2的叶酸-氨基酸-紫杉醇-荧光染料前体药物水溶性测定:
[0041 ] 准确称取IOOmg实施例1和2的紫杉醇前体药物，用微量注射器每次加水50 μ L，直接观察法观察溶解情况，至不容为止，统计溶解IOOmg紫杉醇前体药物所需的水量，计算溶解度。其中，叶酸-精氨酸-紫杉醇-FITC的溶解度为每ImL溶解5.55±0.18mg，叶酸-谷氨酸-紫杉醇-氨基荧光素的溶解度为每ImL溶解6.1 + 0.16mg，本发明是直接解决药物的水溶性，而大分子蛋白或脂质体作为药物载体是与药物通过物理作用形成混合物或是包埋药物，并没有从本质上解决药物的水溶性。
[0042]实施例3
[0043]本实施例中，氨基酸为蛋氨酸，荧光染料为近红外荧光染料，其它步骤同实施例1，获得叶酸-蛋氨酸-紫杉醇前体药物和叶酸-蛋氨酸-紫杉醇-近红外荧光染料前体药物。
[0044]实施例4
[0045]本实施例中,氨基酸为亮氨酸,其它步骤同实施例1,获得叶酸-亮氨酸-紫杉醇前体药物和叶酸-亮氨酸-紫杉醇-FITC前体药物。
[0046]实施例5
[0047]本实施例中,氨基酸为丝氨酸,荧光染料为氨基荧光素,其它步骤同实施例1，获得叶酸-丝氨酸-紫杉醇前体药物和叶酸-丝氨酸-紫杉醇-氨基荧光素前体药物。
[0048]实施例6
[0049] 本实施例中,氨基酸为赖氨酸,其它步骤同实施例1,获得叶酸-赖氨酸-紫杉醇前体药物和叶酸-赖氨酸-紫杉醇-FITC前体药物。
【权利要求】
1.一种小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物，其特征在于，所述前体药物的分子结构中包括叶酸、氨基酸和紫杉醇，所述氨基酸具有氨基保护基团或羧基保护基团，选自精氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、丝氨酸和赖氨酸中的一种。
2.根据权利要求1所述的一种小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物，其特征在于，所述前体药物的分子结构中还包括荧光染料，所述荧光染料选自异硫氰酸荧光素FITC、氨基荧光素或近红外荧光染料中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物，其特征在于，所述氨基酸为精氨酸或谷氨酸，所述荧光染料为异硫氰酸荧光素FITC或氨基荧光素。
4.根据权利要求2所述的一种小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物，其特征在于，所述叶酸、氨基酸、紫杉醇或荧光染料的摩尔质量比为1:1:1:1。
5.—种如权利要求1~4任一所述的小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物的制备方法，包括以下步骤: (1)将氨基酸和紫杉醇溶于二氯甲烷中，所述氨基酸和紫杉醇的摩尔质量比为1:1，滴加2，2-二羟甲基丁酸DMPA，至溶液澄清，冰浴搅拌，再滴加已溶于二氯甲烷的1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC.HCl溶液进行反应，获得氨基酸-紫杉醇反应液； (2)将步骤(1)的氨基酸-紫杉醇反应液中加入二氯甲烷稀释，获得稀释液，将稀释液先用水洗2次，再用食盐水洗2次，分离出溶有氨基酸-紫杉醇二氯甲烷溶液,用无水硫酸镁除水，抽滤，旋干后用二氯甲烷重新溶解，过硅胶柱纯化，获得氨基酸-紫杉醇纯品，脱去氨基酸-紫杉醇纯品中氨基酸的保护基团，然后用乙醚萃取，获得氨基酸-紫杉醇共轭物； (3 )将叶酸溶于二甲基亚砜DMSO中，加入二环己基碳二亚胺DCC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS过夜进行反应，离心去沉淀后，用丙酮萃取，获得叶酸活性酯； (4)将步骤(2)的氨基酸-紫杉醇共轭物溶于DMSO中，加入步骤(3)的叶酸活性酯，室温反应10~30小时，冷冻干燥后，过硅胶柱纯化，获得叶酸-氨基酸-紫杉醇纯品； (5)将步骤(4)的叶酸-氨基酸-紫杉醇纯品中加入三氟乙酸TFA的DMSO溶液中，混匀后，冷冻干燥，过硅胶柱纯化，获得叶酸-氨基酸-紫杉醇前体药物； (6)避光条件下，将步骤(5)的叶酸-氨基酸-紫杉醇共轭物溶于DMSO中，加入荧光染料反应，然后再冷冻干燥，过硅胶柱纯化，获得所述叶酸-氨基酸-紫杉醇-荧光染料前体药物。
6.根据权利要求5所述的一种小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的脱去氨基酸-紫杉醇纯品中氨基酸的保护基团的方法为:用质量分数为20%的哌啶脱去保护基团。
7.根据权利要求5所述的一种小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)的TFA的DMSO溶液中，TFA的质量分数为20%。
8.—种如权利要求1~4任一所述的小分子修饰的靶向性紫杉醇前体药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK103948936SQ201410177775
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】单玲玲, 单昕, 高贵珍, 曹稳根 申请人:宿州学院