预防水貂出血性肺炎的三价灭活疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种预防水貂出血性肺炎的三价灭活疫苗的制备，其特征在于具体步骤如下：从病貂体内分离获得血清G型绿脓杆菌SD302、血清C型绿脓杆菌SD312、血清I型绿脓杆菌SD403，上述菌种采用冻干保存；将三种血清型绿脓杆菌分别置于含2%胎牛血清的PYG培养基37℃培养后，扩大培养，对菌液进行灭活处理；按照菌体含量将灭活菌液运用生理盐水稀释至浓度为8.0×109CFU/mL；将三种稀释后的灭活菌液与40%铝胶溶液按照1:1:1:1体积比混合，加入终浓度为0.004%硫柳汞，混合得到三价灭活疫苗；其具有安全、多效价性、免疫原性好和特异性好等特点；并且价格适中，适用于基层或临床预防水貂出血性肺炎。
【专利说明】预防水貂出血性肺炎的三价灭活疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种预防水貂出血性肺炎的三价灭活疫苗的制备方法，本疫苗属于一种新的动物疫苗，主要用来预防绿脓杆菌引起水貂出血性肺炎的；应用于畜牧兽医学领域。
技术背景
[0002]水紹出血性肺炎是由绿脓单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,又称绿脓杆菌)，引起水貂的一种急性接触性传染病，以出血性肺炎和败血症为主要特征。1983年首次在中国发现该病以来，陆续在各地相继有报道，尤其在新世纪以来，水貂出血性肺炎在我国很多地方呈现地方性爆发。其与水貂细小病毒病、犬瘟热并称危害水貂养殖业发展的三个重大传染病。
[0003]绿脓单胞菌为重要的条件致病菌，在环境中广泛存在，如土壤、海水、淡水以及纯净水中；绿脓杆菌为植物、大多数非哺乳动物、哺乳动物以及人的重要病原；而水貂是唯一的可以由绿脓杆菌引起急性、传染性、致死性出血性肺炎的动物。本菌具有O抗原、H抗原、黏液抗原、R抗原、菌毛抗原等成分。O抗原分为内毒素和原内毒素蛋白质(originalendotoxin protein, ΟΡΕ)两种成分。根据LPS的O抗原可以将其分为20个不同的血清型。水貂出血性肺炎呈现地方流行性，因此对山东地区流行血清型、菌株耐药性以及分子型等流行病学资料的调查对该地区水貂出血性肺炎的防治起到了重要作用。
[0004]水貂出血性肺炎病原一绿脓杆菌为条件致病菌，其抵抗力强，容易产生耐药性，故疫苗接种是预防该病的重要途径；我国我国尚无国家认证的水貂出血性肺炎疫苗，因此亟需研制一种针对我国流行血清型的水貂出血性肺炎疫苗。
[0005]灭活疫苗制备工艺在世界各国已经得到了广泛的应用，并且免疫效果良好，作为动物疫病预防的首选策略。灭活疫苗制备主要是将病原通过甲醛等灭活后，加入佐剂，通过皮下或肌肉注射，使动物产生免疫力的生物制品。其价格低廉、易于操作，同时免疫效果好，在兽医临床上得到了广泛的应用。
[0006]
【发明内容】
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本发明的目的在于提供一种预防水貂出血性肺炎的三价灭活疫苗的其制备方法，它是从病貂体内分离出血清G型、血清C型、血清I型三株绿脓杆菌,并在一定条件下进行分别培养，再以生物反应器扩大培养，进行充分灭活制备灭活菌液；将三种灭活菌液与40%铝胶溶液等体积混合，加入终浓度为0.004%的硫柳汞，从而得到相应的三价灭活疫苗；形成外观呈均匀棕黄色悬液构象，置于2-8°C保存，静置后，上层为淡黄澄清液体，下层为灰黄色沉淀。注射时，通过肌肉注射或者皮下注射方式对水貂进行注射，从而刺激机体产生针对水貂出血性肺炎绿脓杆菌血清G型、C型、I型的中和抗体，使机体获得对血清G型、C型、I型绿脓杆菌的免疫力；具有安全、多效价性、免疫原性好和特异性好等特点；并且价格适中，适用于基层或临床预防水貂出血性肺炎。
[0007]本发明的技术方案是这样实现的:一种预防水貂出血性肺炎的三价灭活疫苗的制备，其特征在于具体步骤如下:(I)从病貂体内分离获得血清G型绿脓杆菌SD302、血清C型绿脓杆菌SD312、血清I型绿脓杆菌SD403，上述菌种采用冻干保存；(2)将三种血清型绿脓杆菌分别置于含2%胎牛血清的PYG培养基37°C培养后，再以生物反应器扩大培养，利用终浓度为0.2%的甲醛溶液对菌液进行灭活处理；(3)按照菌体含量将灭活菌液运用生理盐水稀释至浓度为8.0 X 109CFU/mL ； (4)将三种稀释后的灭活菌液与40%铝胶溶液按照1:1:1:1体积比混合，加入终浓度为0.004%硫柳汞，混合得到三价灭活疫苗；(5)对灭活疫苗进行物理性状检验、无菌检验、甲醛与硫柳汞残留量检测以及超剂量免疫安全性检验，同时进行灭活疫苗保护率实验，检测疫苗的安全性以及保护效力；疫苗要经过物理性状检测、无菌检验、超剂量免疫安全性检查、效力检查，最终2-8°C保存。使用时，充分均匀，成年水貂Iml/只肌肉注射活皮下注射，幼龄水貂0.8ml/只皮下注射。
[0008] 本发明的积极效果是其具有生物安全性，选用的疫苗株菌通过甲醛充分灭活；具有同时预防血清G型、C型、I型绿脓杆菌引起水貂出血性肺炎的功能，本疫苗所用的疫苗株均分离自我国山东地区，且通过分子分型方法确立其为流行优势菌株；具有免疫源性强，本发明是全病原灭活制备而成，因此可以产生强的免疫力；具有特异性好的特点，本疫苗选用的疫苗株均分离自水貂体内，对绿脓杆菌引起的水貂出血性肺炎具有特异性好的特点；具有成本低的特点，本疫苗使用的灭活疫苗制备简易，成本低等特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为本发明的性状形态。
【具体实施方式】
[0010]下面结合附图和具体实施对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0011]实例1、灭活疫苗制备
1.菌种复壮
将SD403、SD302、SD312菌种分别以IOLD5tl接种小鼠，待小鼠死亡后，无菌条件下，打开胸腔，在肺脏剪一小口，用接种环蘸去，在LB固体培养基上划线；37°C培养16h，挑取单菌落于5ml PYG培养基中，37°C 220 rpm培养12h，PCR鉴定，保存菌种。将Iml菌液加入1000mlPYG培养基中，37°C 220 rpm培养12h，活菌计数，制备种子。
[0012]2.灭活疫苗制备
(I)菌液制备和检验
取检验和活菌计数合格的SD403、SD302、SD312 二级种子液分别以3%比例接种于装有PYG液体培养基发酵罐中，通气、37°C培养14h ；PCR鉴定、计数。
[0013](2)菌液灭活和浓缩
向前述菌液中加入终浓度为0.2%的甲醛溶液，边加边搅拌，370C 120rpm作用48h ；将灭活后菌液沉降30d，去除上清，用生理盐水调整菌液浓度为8.0X109CFU/mL，进行无菌检验。
[0014](3)三价疫苗的制备
将调整好浓度的三种单价灭活菌液与40%的Al (OH) 3溶液按照1:1:1:1混合，加入终浓度为0.004%硫柳汞，充分混匀，即为水貂出血性肺炎三价疫苗。分别制作了 3批次疫苗，分别为 201301,201302,201303ο
[0015](4)疫苗分装
无菌检验合格后的菌液按照每瓶100mL进行分装，密封瓶口，2-8°C保存。
[0016]实例2.灭活疫苗成品检验 I安全检查
检验项目(有无菌检验，安全性检验、甲醛残留量与硫柳汞残留量检验、物理性状)均按《兽医生物制品制造及检验规程》(以下称为《规程》)方法进行。
[0017]1.1无菌检验
参照《规则》进行操作；经无菌检测，201301、201302、201303三批次疫苗无菌检验均合格。
[0018]1.2物理形状检验
分别在静置与摇匀状态下观察颜色、形态等；摇匀后为均匀棕黄色悬液；静置后，上层为淡黄澄清液体，下层 为灰黄色沉淀；
1.3甲醛残留量与硫柳汞残留量检验
参照《规则》进行操作；经检测甲醛残留量为0.10-0.13%，硫柳汞残留量为
0.002-0.003%。均在《规则》规定范围内。
[0019]1.4超剂量安全性检验
取3ml灭活疫苗免疫家兔5只，设立生理盐水对照组，30日内观察接种疫苗试验动物的采食、精神状态以及局部吸收状况。在注射疫苗30天内，家兔采食、精神状态与对照组无明显差异，局部吸收良好。结果表明:本疫苗为安全生物制品。
[0020]2效力检验
2.1水貂出血性肺炎三价灭活疫苗对小鼠免疫攻毒保护实验
将120只昆明小鼠，随机分为12组，每组10只。第1、4、7组分别免疫0.2ml 201301批次水貂出血性肺炎三价灭活疫苗；第2、5、8组分别免疫0.2ml 201302批次水貂出血性肺炎三价灭活疫苗；第3、6、9组分别免疫0.2ml 201303批次水貂出血性肺炎三价灭活疫苗；第10、11、12组分别注射0.2ml生理盐水。
[0021]免疫21d 后，第 1、2、3、10 组分别皮下注射 IOLD5tl SD302 (G)菌株；第 5、4、5、6、11组分别皮下注射IOLD50 SD312(C)菌株；第7、8、9、12组分别皮下注射IOLD50 SD403(I)菌株；观察记录小鼠死亡情况。结果显示:免疫组小鼠全部存活，对照组全部死亡，说明本疫苗对小鼠具有良好免疫保护。
【权利要求】
1.一种预防水貂出血性肺炎的三价灭活疫苗的制备，其特征在于具体步骤如下:(1)从病貂体内分离获得血清G型绿脓杆菌SD302、血清C型绿脓杆菌SD312、血清I型绿脓杆菌SD403,上述菌种采用冻干保存；(2)将三种血清型绿脓杆菌分别置于含2%胎牛血清的PYG培养基37°C培养后，再以生物反应器扩大培养，利用终浓度为0.2%的甲醛溶液对菌液进行灭活处理；(3)按照菌体含量将灭活菌液运用生理盐水稀释至浓度为8.0X 109CFU/mL ； (4)将三种稀释后的灭活菌液与40%铝胶溶液按照1:1:1:1体积比混合，加入终浓度为0.004%硫柳汞，混合得到三价灭活疫苗；(5)对灭活疫苗进行物理性状检验、无菌检验、甲醛与硫柳汞残留量检测以及超剂量免疫安全性检验，同时进行灭活疫苗保护率实验，检测疫苗的安全性以及保护效力；疫苗要经过物理性状检测、无菌检验、超剂量免疫安全性检查、效力检查，最终2-8°C保存；使用时，充分均匀，成年水貂Iml/只肌肉注射活皮下注射，幼龄水貂 .0.8ml/只皮下注射。
【文档编号】A61K39/104GK103948918SQ201410197287
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月12日 优先权日:2014年3月21日
【发明者】母连志, 韩明明, 刘慧 , 刘晓飞, 刘旭平 申请人:母连志