一种水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及生物医用材料术领域，特别是涉及一种水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉及其制备方法。水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉由罗非鱼皮酶促溶性胶原蛋白自聚集获得，其表观形态为松散的细丝状，其微观结构呈粗细均匀纵横交错的纤维状，并且在纤维丝交错之间存在均匀的细小网格。本发明制备过程简单、廉价易得，产品用途广泛。
【专利说明】一种水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医用材料术领域，特别是涉及一种水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉及其制备方法。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白是动物体内含量最丰富、分布最广泛的蛋白质。胶原蛋白具有独特的三螺旋结构、低抗原性、无毒性、良好的生物相容性和生物可降解性等特点，已被广泛应用于组织工程支架材料、止血海绵、药物控缓释系统、基因传递载体、美容外科等生物医用领域。目前，国内使用的胶原蛋白主要来自猪和牛的皮肤和跟腱，但随着疯牛病和口蹄疫等疾病的发生，使人们对它们的安全性产生了质疑；另外，由于宗教和习俗等原因，猪来源的胶原蛋白在某些地区的应用受到了限制。因此，迫切需要寻求质量和安全性更好的胶原蛋白来源。
[0003]我国每年鱼鳞，鱼皮等水产品废弃物约有40多万吨，这些水产品废弃物均含有丰富的胶原蛋白，其氨基酸组成与陆生哺乳动物胶原蛋白无明显差异，且其不存在人畜共患的传染性疾病，具有极大的开发和利用价值，但这些废弃物除小部分被用于生产饲料外，大部分却被丢弃。因此，开发鱼皮等水产品废弃物的利用新途径，不仅可提高水产品加工的附加值，而且能减少环境污染，具有良好的经济和社会效益。
[0004]然而，作为生物医 用材料，不同的形态可以有不同的用处，本发明所开发的纳吸棉产品，其特点是纤维丝状，易于根据需要撕取，用于止血和填充等，而且体内可降解，这样就可以扩大胶原蛋白医用材料的使用范围，前景可观。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供一种水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉及其制备方法。
[0006]为实现上述目的，本发明采用技术方案为:
[0007]一种水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉，水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉由罗非鱼皮酶促溶性胶原蛋白自聚集获得，这种胶原蛋白的分子量在300kDa左右，并且保持了三螺旋结构；制备得到的纳吸棉，其表观形态为松散的细丝状，其微观结构呈粗细均匀纵横交错的纤维状，并且在纤维丝交错之间存在均匀的细小网格。
[0008]水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉的制备方法:
[0009]I)将水产鱼皮胶原蛋白充分溶于浓度为0.5mol/L的醋酸溶液中，得浓度为2-6mg/mL的胶原液，而后离心收集胶原上清液，待用；
[0010]2)将磷酸盐缓冲液按体积比1:1缓慢加入到胶原上清液中，期间不断搅拌混合液体系，并加入10-15mol/L氢氧化钠溶液调节混合液体的pH至7.0-7.8 ；
[0011]3)将调节pH后的混合液置于25-35°C水浴锅中，水浴12 — 24h，使其充分自聚集；
[0012]4)用纱布过滤胶原自聚集纤维丝，然后用少量超纯水将其从纱布上洗下；洗下后将胶原自聚集纤维丝溶液装于3.5kDa透析袋中，透析24h，透析液为纯水；透析后的胶原自聚集纤维丝溶液于-80°C快速遇冷，然后-60°C冷冻干燥48h，即得水产胶原纳吸棉。
[0013]所述步骤I)将水产鱼皮胶原蛋白在温度为4°C及磁力搅拌器不断搅拌的条件下充分溶于醋酸溶液中，溶解后的胶原液于4°C、20000g的条件下离心30min，除去不溶性的杂质，用移液枪小心吸出上清液，待用。
[0014]所述磷酸盐缓冲液为用氯化钠配制40mM含氯化钠520-1040mMpH为7.4的磷酸盐缓冲液，滤纸过滤，待用；所述氢氧化钠溶液为浓度在10 — 15mol/L滤纸过滤的氢氧化钠溶液。
[0015]所述水产鱼皮胶原蛋白为罗非鱼皮酶促溶性胶原蛋白。
[0016]所述罗非鱼皮酶促溶性胶原蛋白的提取步骤为:
[0017]I)将清洗并吸干表面水分的原料罗非鱼皮在磁力搅拌下用10%正丁醇对鱼皮进行脱脂24h，期间每8h更换一次正丁醇溶液；而后清洗待用；
[0018]2)于4°C条件下，用0.lmol/L的氢氧化钠对上述处理后鱼皮进行脱杂蛋白24h，期间每8h更换一次氢氧化钠溶液,而后清洗待用；
[0019]3)将上述脱杂蛋白后的鱼皮粉碎，粉碎后鱼皮粉与0.5mol/L醋酸溶液混合，混合后再加入原料鱼皮质量0.5%-1%的胃蛋白酶(750U/mg，Sigma)，而后于4°C下搅拌提取48h ；
[0020]4)将上述提取后鱼皮提取液离心收集上清液，并在冰水浴及搅拌的条件下向上清液中缓缓加入研磨细碎的氯化钠至终浓度为0.9mol/L，而后将液体置于4°C冰箱中过夜盐析；
[0021]5)将上述盐析液离心，收集沉淀，而后将沉淀复溶于0.5mol/L的醋酸溶液中；所得复溶液装于3.5kDa透析袋中，透析24h，透析液0.02mol/L的磷酸氢二钠溶液(pH8.6)；
[0022]6)上述所得透析液再用0.lmol/L的醋酸溶液透析24h，透析后再用纯水透析48h ；透析后的胶原液于_80°C快速遇冷，然后_60°C冷冻干燥48h，即得罗非鱼皮酶促溶性胶原蛋白(PSC)。
[0023]本发明所具有的优点:
[0024]1.本发明制备过程简单、原料廉价、制得的纳吸棉未加任何化学交联剂完全依靠胶原蛋白自身自聚集的性质制备，且易于撕取使用，用途广泛，前景可观。同时本发明所得纳吸棉微观结构呈粗细均匀的纤维状，易于撕取，可用于填充和止血等，用途广泛，前景可观，是一种较好的生物医用材料。
[0025]2.本发明所用原料为水产加工的下脚料罗非鱼皮，原料来源安全，本发明充分利用罗非鱼水产加工过程中产生的鱼皮废料，变废为宝，提高经济效益。
[0026]3.本发明所用提取方法为酶促提取法，可以使鱼皮胶原蛋白提取的更加彻底，而且在提取过程中，酶可以切除胶原蛋白的末端段肽，这样可以降低人体对其的免疫抗性。同时本发明还可以应用于哺乳动物(猪和牛)以外来源的水产胶原蛋白医用材料，其安全系数更高、产量更大，而且更加廉价。
[0027]4.本发明开发的水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉，是在模拟生理条件的环境下完全依靠胶原蛋白自聚集的性质制备的，未加任何交联剂，所以其在体内的安全性、稳定性和相容性会更好。【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为本发明是实例提供的胶原蛋白(PSC)终浓度为lmg/mL，氯化钠终浓度为260mM制得样品的表观形态图；
[0029]图2为本发明是实例提供的胶原蛋白(PSC)终浓度为2mg/mL，氯化钠终浓度为520mM制得样品的表观形态图；
[0030]图3为本发明是实例提供的胶原蛋白(PSC)终浓度为lmg/mL，氯化钠终浓度为390mM制得样品的表观形态图；
[0031]图4为本发明是实例提供的胶原蛋白(PSC)终浓度为lmg/mL，氯化钠终浓度为260mM制得样品的扫描电镜图；
[0032]图5为本发明是实例提供的胶原蛋白(PSC)终浓度为2mg/mL，氯化钠终浓度为520mM制得样品的扫描电镜图；
[0033]图6为本发明是实例提供的胶原蛋白(PSC)终浓度为lmg/mL，氯化钠终浓度为390mM制得样品的扫描电镜图。
【具体实施方式】:
[0034]下面用具体实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
[0035]实施例1水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉的制备:
[0036]1.1酶促溶性罗非鱼皮胶原蛋白的提取:
[0037]1.1.1清洗鱼皮:取出一定量的保存于_20°C的罗非鱼皮，用大量自来水浸泡并冲洗，去除鱼皮表面残留的鱼肉、鱼鳞等其他组织，用超纯水浸泡清洗3次，用吸水纸吸干鱼皮表面的水分，
[0038]1.1.2脱脂:准确称取1g鱼皮，将鱼皮剪成I X 2cm大小，于4°C冰柜中，在磁力搅拌器不断搅拌的条件下，用200mL的10%正丁醇水溶液脱脂8h，重复上述脱脂过程3次，然后用自来水冲洗30min，再用超纯水清洗3次；
[0039]1.1.3脱杂蛋白:在4°C冰柜中，将上述脱脂后的鱼皮浸泡于200mL的0.lmol/L氢氧化钠溶液中脱杂蛋白8h，期间适时用玻璃棒搅拌，重复上述脱脂过程3次，然后用自来水冲洗至中性，再用超纯水清洗3次；
[0040]1.1.4酶解提取:用组织粉碎机将上述处理后的鱼皮粉碎，粉碎后鱼皮粉中加入500mL的0.5mol/L醋酸溶液，再加入0.05g(原料鱼皮质量0.5% )胃蛋白酶(750U/mgSigma)，于4°C冰柜中，用磁力搅拌器搅拌提取48h，然后于4°C，10000r/min条件下离心30min,收集上清液；
[0041]1.1.5盐析及透析:准确称取5.2596g研磨细碎的氯化钠，缓缓加入到酶提上清液中(最后浓度为0.9mol/L)，整个过程均在冰水浴和磁力搅拌器不断搅拌的条件下进行，然后将其置于4°C冰箱中过夜盐析，于4°C，10000r/min条件下离心30min，收集沉淀，将沉淀复溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，复溶液装于3.5kDa的透析袋中，依次在0.02mol/L磷酸氢二钠(pH8.6)溶液中透析24h、0.lmol/L醋酸溶液中透析24h和纯水中透析48h，整个透析过程均在4 °C冰柜中进行，
[0042]1.1.6冷冻干燥:将透析完成的胶原蛋白，在_80°C快速预冷，再在_60°C下冷冻干燥48h，即得罗非鱼皮酶促溶性胶原蛋白。
[0043]1.2罗非鱼皮酶促溶性胶原蛋白自聚集制备纳吸棉:
[0044]1.2.1不同浓度胶原蛋白自聚集制备纳吸棉:
[0045]准确称取20、40及60mg的胶原蛋白分别加入到1mL0.5mol/L醋酸溶液中，在4°C冰柜中、磁力搅拌器搅拌条件下充分溶解48h，然后于4°C、20000g条件下离心30min，用移液枪取出上清液，即得浓度分别为2、4及6mg/mL的胶原液；向各胶原液中缓慢加入10mL40mM含氯化钠790mM pH为7.4的磷酸盐缓冲液(体积比1:1即胶原的终浓度为1、2和3mg/mL，磷酸盐和氯化钠终浓度分别为20mM和390mM)，期间不断搅拌，然后用1mol/L氢氧化钠溶液，调节混合液pH至7.4，将混合液置于30°C水浴中自聚集24h，用纱布过滤胶原蛋白自聚集纤维丝，然后用少量超纯水将其从纱布上洗下；将胶原自聚集纤维丝溶液装于3.5kDa透析袋中，于室温透析24h，透析液为纯水；将透析后的胶原自聚集纤维丝溶液-80°C快速遇冷，然后-60°C冷冻干燥48h，即得罗非鱼皮水产胶原蛋白不同浓度自聚集纳吸棉。
[0046]1.2.2不同氯化钠浓度对胶原蛋白自聚集纳吸棉制备的影响:
[0047]准确称取3份20mg的胶原蛋白分别加入到3份1mL0.5mol/L醋酸溶液中，在4°C冰柜中、磁力搅拌器搅拌条件下充分溶解48h，然后于4°C、20000g条件下离心30min，用移液枪取出上清液，即得浓度分别为2mg/mL的胶原液；向各胶原液中缓慢加入10mL40mM分别含氯化钠520、790和1040mM pH为7.4的磷酸盐缓冲液(体积比1:1即胶原的终浓度为lmg/mL、磷酸盐终浓度分别为20mM、氯化钠的终浓度分别为260、390及520mM)，期间不断搅拌，然后用lOmol/L氢氧化钠溶液，调节混合液pH至7.4，将混合液置于30°C水浴中自聚集24h，用纱布过滤胶原蛋白 自聚集纤维丝，然后用少量超纯水将其从纱布上洗下；将胶原自聚集纤维丝溶液装于3.5kDa透析袋中，于室温透析24h，透析液为纯水；将透析后的胶原自聚集纤维丝溶液-80°C快速遇冷，然后-60°C冷冻干燥48h，即得不同氯化钠浓度下罗非鱼皮水产胶原蛋白自聚集纳吸棉(参见图1-6)。
[0048]用甲醛固定在玻璃片上，用叔丁醇干燥后，进行扫描电镜测定其微观结构，结果显示本发明制得的纳吸棉微观成粗细均匀的纤维丝状，性质优良，分子量在300kDa左右，并且保持了三螺旋结构。
[0049]制备得到的纳吸棉其表观形态为松散的细丝状，其微观结构呈粗细均匀纵横交错的纤维状，并且在纤维丝交错之间存在均匀的细小网格将各自聚集得到的纤维丝。
【权利要求】
1.一种水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉，其特征在于:水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉由罗非鱼皮酶促溶性胶原蛋白自聚集获得，这种胶原蛋白的分子量在300kDa左右，并保持三螺旋结构。
2.按权利要求1所述的水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉的制备方法，其特征在于: 1)将水产鱼皮胶原蛋白充分溶于浓度为0.5mol/L的醋酸溶液中，得浓度为2-6mg/mL的胶原液，而后离心收集胶原上清液，待用； 2)将磷酸盐缓冲液按体积比1:1缓缓加入到胶原上清液中，期间不断搅拌混合液体系，并加入10-15mol/L氢氧化钠溶液调节混合液体的pH至7.0-7.8 ； 3)将调节pH后的混合液置于25-35°C水浴锅中，水浴12— 24h，使其充分自聚集； 4)用纱布过滤胶原自聚集纤维丝，然后用少量超纯水将其从纱布上洗下；洗下后将胶原自聚集纤维丝溶液装于3.5k Da透析袋中，透析24h，透析液为纯水；透析后的胶原自聚集纤维丝溶液于-80°C快速遇冷，然后-60°C冷冻干燥48h，即得水产胶原纳吸棉。
3.按权利要求2所述的水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉的制备方法，其特征在于:所述步骤I)将水产鱼皮胶原蛋白在温度为4°C及磁力搅拌器不断搅拌的条件下充分溶于醋酸溶液中，溶解后的胶原液于4°C、20000g的条件下离心30min，除去不溶性的杂质，用移液枪小心吸出上清液，待用。
4.按权利要求2所述的水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉的制备方法，其特征在于:所述磷酸盐缓冲液为用氯化钠配制40mM含氯化钠520-1040mM pH为7.4的磷酸盐缓冲液，滤纸过滤，待用；所述氢氧化钠溶液为浓度在10 — 15mol/L滤纸过滤的氢氧化钠溶液。
5.按权利要求2所述的水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉的制备方法，其特征在于:所述水产鱼皮胶原蛋白为罗非鱼皮酶促溶性胶原蛋白。
6.按权利要求5所述的水产鱼皮胶原蛋白纳吸棉的制备方法，其特征在于: 所述罗非鱼皮酶促溶性胶原蛋白的提取步骤为: 1)将清洗并吸干表面水分的罗非鱼皮原料在磁力搅拌下用10%正丁醇对鱼皮进行脱脂24h，期间每8h更换一次正丁醇溶液；而后清洗待用； 2)于4°C条件下，用0.lmol/L的氢氧化钠对上述处理后鱼皮进行脱杂蛋白24h，期间每8h更换一次氢氧化钠溶液,而后清洗待用； 3)将上述脱杂蛋白后的鱼皮粉碎，粉碎后鱼皮粉与0.5mol/L醋酸溶液混合，混合后再加入原料鱼皮质量0.5% -1%的胃蛋白酶，而后于4°C下搅拌提取48h ； 4)将上述提取后鱼皮提取液离心收集上清液，并在冰水浴及搅拌的条件下向上清液中缓缓加入研磨细碎的氯化钠至终浓度为0.9mol/L，而后将液体置于4°C冰箱中过夜盐析； 5)将上述盐析液离心，收集沉淀，而后将沉淀复溶于0.5mol/L的醋酸溶液中；所得复溶液装于3.5kDa透析袋中，透析24h，透析液0.02mol/L的磷酸氢二钠溶液(pH8.6)； 6)上述所得透析液再用0.lmol/L的醋酸溶液透析24h，透析后再用纯水透析48h ;透析后的胶原液于_80°C快速遇冷，然后_60°C冷冻干燥48h，即得罗非鱼皮酶促溶性胶原蛋白(PSC)。
【文档编号】A61L15/32GK104027835SQ201410231873
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】闫鸣艳, 史文军, 秦松, 张朝晖, 崔红利 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所, 江苏省海洋水产研究所