一组抗肿瘤t淋巴细胞群及其制备方法
【专利摘要】本发明所提供的抗肿瘤T淋巴细胞群，一定程度的表达了如下五种T淋巴细胞膜分子：人白细胞分化抗原CD3、人白细胞分化抗原CD4、人白细胞分化抗原CD8、人αβT细胞受体、人γδT细胞受体，从而可以抑制乳腺癌和肝癌细胞株的增殖，诱导癌细胞凋亡，还可以抑制肝癌乳腺癌荷瘤小鼠体内肿瘤的生长；本发明抗肿瘤T淋巴细胞群配合传统的手术、化疗和放疗治疗，可达到在常规疗法清除大量肿瘤细胞后，再使用生物学治疗方式清除、杀伤少量的残留或扩散的肿瘤细胞，可提高和巩固肿瘤治疗，并减少肿瘤的复发。
【专利说明】一组抗肿瘤T淋巴细胞群及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一组抗肿瘤T淋巴细胞群及其制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来肿瘤的免疫治疗越来越受到重视。目前肿瘤的免疫疗法主要包括肿瘤疫苗、单克隆抗体技术、细胞因子治疗、过继性细胞免疫治疗等。其中过继性细胞免疫治疗是指向肿瘤患者传输具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤或激发机体抗肿瘤免疫效应，从而达到治疗肿瘤的目的。主要的过继性细胞包括淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(ant1-Q)3MeAbactivatedkiller cells)等。值得注意的是Y δ T细胞在过继免疫治疗中的潜在作用。Y S T细胞是介于获得性免疫与天然免疫之间的特殊免疫细胞类型，具有抗原特异性识别功能而无MHC限制，可在IL-2刺激下扩增，并在体外呈现出杀伤多种肿瘤的功能。以Y ST细胞为基础的免疫治疗在肺癌、肾癌、恶性黑色素瘤等I期临床研究中已显示出良好效果，尤其是转移性恶性黑色素瘤，提示其可能成为治疗肿瘤的新途径。CD8+T细胞(TC或CTL细胞)能杀伤表达抗原的靶细胞，它在抗病毒感染、急性同种异型移植物排斥以及杀伤肿瘤细胞作用中是重要的效应细胞。在正常机体中CD8+T细胞以不活化的静息T细胞的形式存在。它必须经过抗原激活并在T辅助(TH)细胞协同作用下，才能分化发育为效应杀伤T细胞(TC)。临 床病例报告CD8+T对不同类型的肿瘤具有不同的作用。目前，尚无报导具有抗肿瘤作用的混合的淋巴细胞群。
【发明内容】
[0003]本发明提供了抑制乳腺癌和肝癌细胞株的增殖、诱导癌细胞凋亡且抑制肝癌乳腺癌荷瘤小鼠体内肿瘤的生长的一组抗肿瘤T淋巴细胞群，本发明还提供了所述一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法。
[0004]本发明提供了一组抗肿瘤T淋巴细胞群，其包括表达人白细胞分化抗原⑶3的细胞占71.63 %~86.32 %，表达人白细胞分化抗原⑶4的细胞占16.43 %~27.37 %，表达人白细胞分化抗原⑶8的细胞占65.58%~76.86%，表达人α β T细胞受体的细胞占
11.90%~17.51%，表达人Y δ T细胞受体的细胞69.95%~83.74%。
[0005]本发明还提供了上述一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，包括如下步骤:
[0006]步骤一:取去白细胞滤器，过滤全血后，白细胞残留在滤器中；
[0007]步骤二:使用磷酸缓冲液冲洗去白细胞滤器，获得PBS、白细胞和部分血液的混合液；
[0008]步骤三:将磷酸缓冲液、白细胞和部分血液的混合液离心弃去血浆；
[0009]步骤四:向弃去血浆的细胞混合液中加入磷酸缓冲液，小心混匀形成混合液；
[0010]步骤五:将混合液小心叠加于细胞分离液上离心，此时离心管中由上向下分为四层:第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层；收集第二层细胞放入含磷酸缓冲液的试管中，充分混匀后，离心，弃去上清留沉淀，然后重复洗涤，最后沉淀得到所分离的外周血单个核细胞；
[0011]步骤六:将所分离的外周血单个核细胞培养于37°C，5% CO2培养箱，用抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基过夜培养后，收集悬浮的淋巴细胞；
[0012]步骤七:每2-3天在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中传代一次，使细胞浓度维持在5 X IO5~10 X IO5个细胞/mL，每次传代培养的条件均为37°C，5 % CO2，传5代以上，每代的培养条件相同，得到抗肿瘤T淋巴细胞群；
[0013]其中，所述抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基为是在无血清淋巴细胞培养基中添加异戊烯焦磷酸和人白细胞介素-2得到的培养基。
[0014]所述磷酸缓冲液为含有135mM NaCl、4.7mM KClUOmM Na2HPO4,2mM NaH2PO4 且 pH值为7.4的水溶液。
[0015]所述步骤一中去白细胞滤器的规格为2单位400ml，全血为400ml，所述步骤二中的磷酸缓冲液为40-80ml。
[0016]所述步骤三中的离心速率为1500-2500转/分，离心时间为15-20分钟。
[0017]所述步骤四中加入的磷酸缓冲液为25_40ml。
[0018]所述步骤五中的细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为LTS1077，细胞液和细 胞分离液的体积比为1.5:1-2:1，混合后离心的速率为2000-2500转/分，尚心时间为15-20分钟。
[0019]所述步骤五中收集第二层细胞是放入含20_45ml的磷酸缓冲液的试管中，与磷酸缓冲液混匀离心速率为2000-2500转/分，离心时间为10-15分钟，然后以同样转速和时间
重复洗涤两次。
[0020]所述抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基的pH为7.2-7.4，用量为30毫升，其中，异戊烯焦磷酸在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中的浓度是200 μ g/L,人白细胞介素-2在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中的浓度是100万U/L。
[0021]本发明还提供了一种抗肿瘤药物，它以上述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群为活性成分。
[0022]本发明所提供的抗肿瘤T淋巴细胞群，一定程度的表达了如下五种T淋巴细胞膜分子:人白细胞分化抗原CD3、人白细胞分化抗原CD4、人白细胞分化抗原CD8、人° eT细胞受体、人ysT细胞受体，从而可以抑制乳腺癌和肝癌细胞株的增殖，诱导癌细胞凋亡，还可以抑制肝癌乳腺癌荷瘤小鼠体内肿瘤的生长；本发明抗肿瘤T淋巴细胞群配合传统的手术、化疗和放疗治疗，可达到在常规疗法清除大量肿瘤细胞后，再使用生物学治疗方式清除、杀伤少量的残留或扩散的肿瘤细胞，可提高和巩固肿瘤治疗，并减少肿瘤的复发。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为各实施例分离出的外周血单个核细胞PBMC (刺激前)与抗肿瘤T淋巴细胞群(刺激后)通过流式细胞仪表型鉴定的对比结果。
[0024]图2 为乳腺癌细胞 MCF-7，MDA_MB_231，MDA_MB_453，MDA-MB-468 与抗肿瘤 T 淋巴细胞群通过三个不同的效靶比1:1，5:1，10:1作用后，在酶联免疫检测仪0D595nm处的检测结果，其中横坐标为T淋巴细胞与肿瘤细胞的效靶比，纵坐标为细胞存活率。[0025]图3 为乳腺癌细胞 MCF-7，MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB-468 与抗肿瘤 T 淋巴细胞群分别作用24、48、72、96小时后，在酶联免疫检测仪0D595nm处的检测结果，其中横坐标为T淋巴细胞与肿瘤细胞的作用时间，纵坐标为细胞存活率。
[0026]图4为T淋巴细胞治疗组、T淋巴细胞预处理组和对照组随着注射T淋巴细胞天数的增加，对MDA-MB-231荷瘤小鼠的肿瘤生长的影响。其中左图横坐标为注射T淋巴细胞天数，纵坐标为小鼠体内肿瘤体积大小；右图横坐标为注射T淋巴细胞天数，纵坐标为小鼠体重。
【具体实施方式】
[0027]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028]以下 I XPBS 为含有 135mM NaCl, 4.7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mMNaH2P04 且 pH 值为
7.4的水溶液。
[0029]实施例1
[0030]本实施例提供了从去白细胞滤器里分离抗肿瘤T淋巴细胞群的方法，包括如下步骤:
[0031]I)从深圳市血液中心取得一个2单位(400ml)去白细胞滤器，血站使用去白细胞滤器过滤400毫升全血( 正常人无偿献血)后，99%的白细胞残留在滤器中。
[0032]2)使用60毫升IXPBS冲洗去白细胞滤器，获得PBS、白细胞和部分血液的混合液。
[0033]3)将PBS、白细胞和部分血液的混合液以1500转/分离心20分钟弃去血浆。
[0034]4)向弃去血浆的细胞混合液中加入30毫升I XPBS，小心混匀形成混合液。
[0035]5)将混合液小心叠加于细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为LTS1077)之液面上，混合液:细胞分离液=2:1(体积比)。
[0036]6)以2000转/分离心20分钟。此时离心管中由上向下分为四层:第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。收集第二层细胞放入含20ml的IXPBS的试管中，充分混匀后，以2000转/分离心10分钟，弃去上清留沉淀，然后以20ml的IXPBS以同样转速和时间重复洗涤两次，最后沉淀得到所分离的外周血单个核细胞PBMC。
[0037]7)将所分离的PBMC培养于37°C，5% CO2培养箱，培养液为30毫升抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基。该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基是在无血清淋巴细胞培养基(天津市灏洋生物制品科技有限公司生产，产品编号为CIK2013)中添加异戊烯焦磷酸(Sigma公司，产品编号为10503)和人白细胞介素-2(IL-2)(国药准字S10970016，北京四环生物制药有限公司，规格为50万U/瓶)得到的培养基，异戊烯焦磷酸在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中的浓度是200 μ g/L，人白细胞介素-2在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中的浓度是100万U/L。该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基的pH为7.2-7.4。过夜培养后，贴壁细胞为单核细胞，悬浮的为淋巴细胞。将悬浮培养的淋巴细胞转移至新培养瓶中继续培养。
[0038]8)每2-3天在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中传代一次，使细胞浓度维持在(5~10) X IO5个细胞/mL。每次传代培养的条件均为37°C,5% CO2,传5代(每代的培养条件相同)得到抗肿瘤T淋巴细胞群，细胞离心后弃培养液上清，以I XPBS配成细胞悬液5X106/ml，取200微升进行流式细胞仪检测。分别使用抗人⑶3，⑶4，⑶8，TCRa β ,TCRy δ单克隆抗体(购买于biolegend公司，货号分别为317307，317407，301005，
306707,331207)通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原⑶3，⑶4，⑶8和人α β，gamma δΤ细胞受体的表达情况(检测方法参见 Biggs MJ, et al.2011.J.R.Soc.1nterface.8:1462.),流式细胞仪结果表明该抗肿瘤T淋巴细胞群中表达人白细胞分化抗原CD3的细胞占86.32% (即占抗肿瘤T淋巴细胞群总细胞的百分比，下同)、表达人白细胞分化抗原CD4的细胞占16.43%，表达人白细胞分化抗原⑶8的细胞占76.86%，表达人α β T细胞受体的细胞占13.68%和人Y δ T细胞受体的细胞占73.33%。同时，同样条件下检测6)中的外周血单个核细胞PBMC，其结果如图1所示 。
[0039]实施例2
[0040]本实施例提供了从去白细胞滤器里分离抗肿瘤T淋巴细胞群的方法，包括如下步骤:
[0041]I)从深圳市血液中心取得一个2单位(400ml)去白细胞滤器，血站使用去白细胞滤器过滤400毫升全血(正常人无偿献血)后，99%的白细胞残留在滤器中。
[0042]2)使用50毫升IXPBS冲洗去白细胞滤器，获得PBS、白细胞和部分血液的混合液。
[0043]3)将PBS、白细胞和部分血液的混合液以2000转/分离心15分钟弃去血浆。
[0044]4)向弃去血浆的细胞混合液中加入30毫升I XPBS，小心混匀形成混合液。
[0045]5)将混合液小心叠加于细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为LTS1077)的液面上，混合液:细胞分离液=1.5:1(体积比)。
[0046]6)以2500转/分离心15分钟。此时离心管中由上向下分为四层:第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。收集第二层细胞放入含25ml的IXPBS的试管中，充分混匀后，以2500转/分离心15分钟，弃去上清留沉淀，以20ml的IXPBS以同样转速和时间重复洗涤两次，最后沉淀得到所分离的外周血单个核细胞(PBMC)。
[0047]7)将所分离的PBMC培养于37°C，5% CO2培养箱，培养液为30毫升抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基。该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基是在无血清淋巴细胞培养基(天津市灏洋生物制品科技有限公司生产，产品编号为CIK2013)中添加异戊烯焦磷酸(Sigma公司，产品编号为10503)和人白细胞介素-2(IL-2)(国药准字S10970016，北京四环生物制药有限公司，规格为50万U/瓶)得到的培养基，异戊烯焦磷酸在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中的浓度是200 μ g/L,人白细胞介素-2在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中的浓度是100万U/L。该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基的pH为7.2-7.4。过夜培养后，贴壁细胞为单核细胞，悬浮的为淋巴细胞。将悬浮培养的淋巴细胞转移至新培养瓶中继续培养。
[0048]8)每2-3天在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中传代一次，使细胞浓度维持在(5~10) X IO5个细胞/mL。每次传代培养的条件均为37°C,5% CO2,传5代(每代的培养条件相同)得到抗肿瘤T淋巴细胞群，细胞离心后弃培养液上清，以I XPBS配成细胞悬液5X106/ml，取200微升进行流式细胞仪检测。分别使用抗人⑶3，⑶4，⑶8，TCRa β ,TCRy δ单克隆抗体(购买于biolegend公司，货号分别为317307，317407，301005，306707.331207)通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原⑶3，⑶4，⑶8和人αβ，Y δΤ细胞受体的表达情况(检测方法参见 Biggs MJ, et al.2011.J.R.Soc.1nterface.8:1462.),结果所示，表明该抗肿瘤T淋巴细胞群中表达人白细胞分化抗原CD3的细胞占71.63%、表达人白细胞分化抗原CD4的细胞占17.78%，表达人白细胞分化抗原CD8的细胞占79.39%，表达人α β T细胞受体的细胞占11.90%和人Y δ T细胞受体的细胞占83.74%。同时，同样条件下检测6)中的外周血单个核细胞PBMC，其结果如图1所示。
[0049]实施例3
[0050]本实施例提供了从去白细胞滤器里分离抗肿瘤T淋巴细胞群的方法，包括如下步骤:
[0051]I)从深圳市血液中心取得一个2单位(400ml)去白细胞滤器，血站使用去白细胞滤器过滤400毫升全血(正常人无偿献血)后，99%的白细胞残留在滤器中。
[0052]2)使用80毫升IXPBS冲洗去白细胞滤器，获得PBS、白细胞和部分血液的混合液。
[0053]3)将PBS、白细胞和部分血液的混合液以2000转/分离心20分钟弃去血浆。
[0054]4)向弃去血浆的细胞混合液中加入40毫升I XPBS，小心混匀形成混合液。
[0055]5)将混合液小心叠加于细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为LTS1077)的液面上，混合液:细胞分离液=2:1(体积比)。
[0056]6)以2000转/分离心15分钟。此时离心管中由上向下分为四层:第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。收集第二层细胞放入含40ml的IXPBS的试管中，充分混匀后，以2000转/分离心15分钟，弃去上清留沉淀，以40ml的IXPBS以同样转速和时间重复洗涤两次，最后沉淀得到所分离的外周血单个核细胞(PBMC)。
[0057]7)将所分离的PBMC培养于37°C，5% CO2培养箱，培养液为30毫升抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基。该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基是在无血清淋巴细胞培养基(天津市灏洋生物制品科技有限公司生产，产品编号为CIK2013)中添加异戊烯焦磷酸(Sigma公司，产品编号为10503)和人白细胞介素-2(IL-2)(国药准字S10970016，北京四环生物制药有限公司，规格为50万U/瓶)得到的培养基，异戊烯焦磷酸在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中的浓度是200 μ g/L,人白细胞介素-2在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中的浓度是100万U/L。该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基的pH为7.2-7.4。过夜培养后，贴壁细胞为单核细胞，悬浮的为淋巴细胞。将悬浮培养的淋巴细胞转移至新培养瓶中继续培养。
[0058] 8)每2-3天在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中传代一次，使细胞浓度维持在(5~10) X IO5个细胞/mL。每次传代培养的条件均为37°C,5% CO2,传5代(每代的培养条件相同)得到抗肿瘤T淋巴细胞群，细胞离心后弃培养液上清，以I XPBS配成细胞悬液5X106/ml，取200微升进行流式细胞仪检测。分别使用抗人⑶3，⑶4，⑶8，TCRa β ,TCRy δ单克隆抗体(购买于biolegend公司，货号分别为317307，317407，301005，
306707.331207)通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原⑶3，⑶4，⑶8和人αβ，Y δΤ细胞受体的表达情况(检测方法参见 Biggs MJ, et al.2011.J.R.Soc.1nterface.8:1462.),结果所示，表明该抗肿瘤T淋巴细胞群中表达人白细胞分化抗原CD3的细胞占80.76%,表达人白细胞分化抗原CD4的细胞占25.44%，表达人白细胞分化抗原CD8的细胞占67.71%，表达人α β T细胞受体的细胞占15.39%和人Y δ T细胞受体的细胞占69.95%。同时，同样条件下检测6)中的外周血单个核细胞PBMC，其结果如图1所示。
[0059]实施例4
[0060]本实施例提供了从去白细胞滤器里分离抗肿瘤T淋巴细胞群的方法，包括如下步骤:
[0061]I)从深圳市血液中心取得一个2单位(400ml)去白细胞滤器，血站使用去白细胞滤器过滤400毫升全血(正常人无偿献血)后，99%的白细胞残留在滤器中。
[0062]2)使用40毫升IXPBS冲洗去白细胞滤器，获得PBS、白细胞和部分血液的混合液。
[0063]3)将PBS、白细胞和部分血液的混合液以2500转/分离心15分钟弃去血浆。
[0064]4)向 去血浆的细胞混合液中加入25毫升I XPBS，小心混匀形成混合液。
[0065]5)将混合液小心叠加于细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为LTS1077)的液面上，混合液:细胞分离液=2:1(体积比)。
[0066]6)以2500转/分离心20分钟。此时离心管中由上向下分为四层:第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。收集第二层细胞放入含45ml的IXPBS的试管中，充分混匀后，以2500转/分离心10分钟，弃去上清留沉淀，以45ml的IXPBS以同样转速和时间重复洗涤两次，最后沉淀得到所分离的外周血单个核细胞(PBMC)。
[0067]7)将所分离的PBMC培养于37°C，5% CO2培养箱，培养液为30毫升抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基。该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基是在无血清淋巴细胞培养基(天津市灏洋生物制品科技有限公司生产，产品编号为CIK2013)中添加异戊烯焦磷酸(Sigma公司，产品编号为10503)和人白细胞介素-2(IL-2)(国药准字S10970016，北京四环生物制药有限公司，规格为50万U/瓶)得到的培养基，异戊烯焦磷酸在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中的浓度是200 μ g/L，人白细胞介素-2在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中的浓度是100万U/L。该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基的pH为7.2-7.4。过夜培养后，贴壁细胞为单核细胞，悬浮的为淋巴细胞。将悬浮培养的淋巴细胞转移至新培养瓶中继续培养。
[0068]8)每2-3天在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中传代一次，使细胞浓度维持在(5~10) X IO5个细胞/mL。每次传代培养的条件均为37°C,5% CO2,传5代(每代的培养条件相同)得到抗肿瘤T淋巴细胞群，细胞离心后弃培养液上清，以I XPBS配成细胞悬液5X106/ml，取200微升进行流式细胞仪检测。分别使用抗人⑶3，⑶4，⑶8，TCRa β ,TCRy δ单克隆抗体(购买于biolegend公司，货号分别为317307，317407，301005，
306707,331207)通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原⑶3，⑶4，⑶8和人α β，Y δΤ细胞受体的表达情况(检测方法参见 Biggs MJ, et al.2011.J.R.Soc.1nterface.8:1462.),结果所示，表明该抗肿瘤T淋巴细胞群中表达人白细胞分化抗原CD3的细胞占75.94%,表达人白细胞分化抗原CD4的细胞占27.37%，表达人白细胞分化抗原CD8的细胞占65.58%，表达人α β T细胞受体的细胞占17.51%和人Y δ T细胞受体的细胞占80.08%。同时，同样条件下检测6)中的外周血单个核细胞PBMC，其结果如图1所示。
[0069]实施例5、抗肿瘤T淋巴细胞群抗肿瘤活性鉴定。
[0070]1.抗肿瘤T淋巴细胞群抑制多种乳腺癌细胞增殖[0071]1.1抗肿瘤T淋巴细胞群与乳腺癌细胞效靶比
[0072]I)将接种好的乳腺癌细胞 MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-453，MDA-MB-468，(购买于中科院上海细胞库)放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，每孔200微升。分别按效靶比1:1，5:1，10:1加入实施例1的抗肿瘤T淋巴细胞群(浓度为5 X IO6/ml)，每个实验组设置五个平行复孔。
[0073]2)5% C02，37°C孵育12小时，每孔加入20ul噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4小时。
[0074]3)终止培养，弃上清，每孔加入200ul 二甲基亚砜，置振荡器上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪0D595nm处测量各孔的吸光值后计算细胞存活率，如图2所示，随着抗肿瘤T淋巴细胞群与乳腺癌细胞效靶比增高，乳腺癌细胞的存活率明显下降。
[0075]1.2抗肿瘤T淋巴细胞群与乳腺癌细胞作用时间
[0076]I)将接种好的乳腺癌细胞 MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-453，MDA-MB-468，(购买于中科院上海细胞库)放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，每孔200微升。按效靶比1:1加入实施例1的抗肿瘤T淋巴细胞群(浓度为5X106/ml)，每个实验组设置五个平行复孔。
[0077]2)5% CO2, 37。。孵育 24、48、72、96 小时，每孔加入 20ul 噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/ml，即0.5% MTT)，继续培养4小时。 [0078]3)终止培养，弃上清，每孔加入200ul 二甲基亚砜，置振荡器上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪0D595nm处测量各孔的吸光值后计算细胞存活率，如图3所示，随着抗肿瘤T淋巴细胞群与乳腺癌细胞作用时间的延长，乳腺癌细胞的存活率明显下降。
[0079]2.抗肿瘤T淋巴细胞群抑制乳腺癌合瘤小鼠体内肿瘤的生长。
[0080]取四周龄雌性Bal/c裸鼠，随机分成三组，每组10只。比较抗肿瘤T淋巴细胞群治疗组、抗肿瘤T淋巴细胞群预处理组和对照组的疗效区别。将乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞(购买于上海细胞库)用I X PBS配备成细胞浓度为2 X IO6个细胞/毫升的MDA-MB-231细胞悬液，裸鼠左侧腋窝皮下接种MDA-MB-231细胞悬液，100微升/只，其中分组为抗肿瘤T淋巴细胞群预处理组的实验组是在接种乳腺癌细胞之前先接种I X IO8个/毫升的抗肿瘤T淋巴细胞群(来自实施例1传第五代过程中对数期增殖的的抗肿瘤T淋巴细胞群)，都是待肿瘤长到IOOmm3时开始治疗。T细胞治疗组:抗肿瘤T淋巴细胞群浓度为I X IO8个/毫升(来自实施例1传第五代过程中对数期增殖的的抗肿瘤T淋巴细胞群)，裸鼠静脉注射，100微升/只。T淋巴细胞预处理组和对照组:静脉注射I XPBS，100微升/只。每周注射两次，连续注射四周后比较T淋巴细胞治疗组、T淋巴细胞预处理组和对照组的肿瘤体积的大小差异，如图4所示，T淋巴细胞预处理组与对照组相比，肿瘤体积未出现明显变小；T淋巴细胞治疗组与对照组相比，小鼠肿瘤体积出现明显变小。由此可见，T淋巴细胞预处理组并没有使小鼠免疫功能重建，持续使用抗肿瘤T淋巴细胞群对MDA-MB-231荷瘤小鼠的肿瘤生长有明显的抑制作用，抑瘤率超过70 %。
【权利要求】
1.一组抗肿瘤T淋巴细胞群，其特征在于，其包括表达人白细胞分化抗原CD3的细胞占71.63%~86.32%，表达人白细胞分化抗原⑶4的细胞占16.43%~27.37%，表达人白细胞分化抗原⑶8的细胞占65.58%~76.86%，表达人α β T细胞受体的细胞占11.90%~17.51%，表达人Y δ T细胞受体的细胞占69.95%~83.74%。
2.根据权利要求1所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一:取去白细胞滤器，过滤全血后，白细胞残留在滤器中； 步骤二:使用磷酸缓冲液冲洗去白细胞滤器，获得PBS、白细胞和部分血液的混合液； 步骤三:将磷酸缓冲液、白细胞和部分血液的混合液离心弃去血浆； 步骤四:向弃去血浆的细胞混合液中加入磷酸缓冲液，小心混匀形成混合液； 步骤五:将混合液小心叠加于细胞分离液上离心，此时离心管中由上向下分为四层:第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层；收集第二层细胞放入含磷酸缓冲液的试管中，充分混匀后，离心，弃去上清留沉淀，然后重复洗涤，最后沉淀得到所分离的外周血单个核细胞； 步骤六:将所分离的外周血单个核细胞培养于37°C，5% CO2培养箱，用抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基过夜培养后，收集悬浮的淋巴细胞； 步骤七:每2-3天在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中传代一次，使细胞浓度维持在5X IO5~IOXlO5个细胞/mL，每次传代培养的条件均为37°C，5% CO2，传5代以上，每代的培养条件相同，得到抗肿瘤T淋巴细胞群； 其中，所述抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基为是在无血清淋巴细胞培养基中添加异戊烯焦磷酸和人白细胞介素-2得到的培养基。
3.根据权利要求2所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液为含有 135mM NaCl,4.7mM KCl、IOmMNa2HPO4、2mM NaH2PO4 且 pH 值为 7.4 的水溶液。
4.根据权利要求3所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，所述步骤一中去白细胞滤器的规格为2单位400ml，全血为400ml，所述步骤二中的磷酸缓冲液为40_80ml。
5.根据权利要求4所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的离心速率为1500-2500转/分，离心时间为15-20分钟。
6.根据权利要求5所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，所述步骤四中加入的磷酸缓冲液为25-40ml。
7.根据权利要求6所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，所述步骤五中的细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为LTS1077，细胞液和细胞分离液的体积比为1.5:1-2:1，混合后离心的速率为2000-2500转/分，离心时间为15-20分钟。
8.根据权利要求7所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，所述步骤五中收集第二层细胞是放入含20-45ml的磷酸缓冲液的试管中，与磷酸缓冲液混匀离心速率为2000-2500转/分，离心时间为10-15分钟，然后以同样转速和时间重复洗涤两次。
9.根据权利要求8 所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基的pH为7.2-7.4，用量为30毫升，其中，异戊烯焦磷酸在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中的浓度是200 μ g/L，人白细胞介素-2在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中的浓度是100万U/L。
10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，它以权利要求1所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群为活性成分。
【文档编号】A61K35/14GK103981146SQ201410232783
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】蒋宇扬, 陈妍 申请人:深圳市坤健创新药物研究院, 清华大学深圳研究生院