来自丁酸梭菌的脂磷壁酸在调节水产动物免疫应答中的用途
【专利摘要】本发明公开一种来自丁酸梭菌的脂磷壁酸在调节水产动物免疫应答中的用途，该脂磷壁酸来自丁酸梭菌细胞壁，该脂磷壁酸与其他革兰氏阳性菌的细胞壁脂磷壁酸结构存在差异。本发明具有能够改善水产动物的肠道免疫功能，抑制病原菌对水产动物的感染，降低发病率的优点。
【专利说明】来自丁酸梭菌的脂磷壁酸在调节水产动物免疫应答中的用途
【技术领域】
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[0001]本发明涉及调节水产动物免疫应答的丁酸梭菌细胞壁脂磷壁酸，具体为来自丁酸梭菌的脂磷壁酸在调节水产动物免疫应答中的用途。
【背景技术】
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[0002]细菌性疾病是水产养殖业的主要传染病，严重威胁水产养殖动物的健康。目前，使用高剂量的抗菌药物仍然是防治鱼类细菌性疾病的主要方式。高剂量的抗菌药物会导致水产品产生药物残留，危害消费者健康。同时，长期使用抗菌药物还引起细菌产生耐药性，进而导致细菌性疾病更加难以防治。在这一背景下，筛选益生菌株，利用细菌的益生作用来防治病原菌就成为水产动物疾病防控新的发展方向。近年来，已有多种新型微生态制剂在生产中应用并取得了较好的效果。然而，在水产动物养殖生产中使用益生菌也存在着诸多局限:(1)益生菌对环境要求较高，养殖水体不能满足其生长增殖的需要，导致其存活率较低，效果欠佳；(2)益生菌在水产动物肠道中不能长期定植，很难持久发挥抑菌作用；(3)益生菌在水产动物肠道中的密度太低，无法充分发挥免疫调节功能，对病原菌的抑制作用较弱。因此，在充分解析益生菌免疫调节机制的基础上，分离纯化益生菌菌体有效成分，用以防治水产动物细菌性疾病就成为新的发展趋势。
[0003]脂磷壁酸是革兰氏阳性菌细胞壁的重要成分，是一类由多聚磷酸甘油酯或多聚磷酸核糖醇构成的阴离子聚合物，其链上羟基往往被丙氨酸(Ala)或N-乙酰葡萄糖胺(N-Acetylglucosamine, GlcNAc)修饰,故通常还带有一定量的正电荷,形成正负电荷交替出现的链状聚合物结构。磷壁酸对革兰氏阳性菌具有十分重要的生理功能，主要包括:(I)保护细菌免受抗生素、表面活性剂、抗菌肽、溶菌酶和热应激等的损伤；(2)维持细菌细胞壁中阳离子的浓度平衡；(3)参与细菌细胞分裂；(4)参与细菌自溶过程；(5)参与宿主细胞相关受体的识别与互作，在革兰氏阳性菌与宿主细胞的互作及免疫调节过程中发挥着十分重要的作用。
[0004]革兰氏阳性菌细胞壁脂磷壁酸的结构和性质随着细菌菌株的不同而呈现极大差异。金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的脂磷壁酸能够导致小鼠出现肺脓肿，并刺激人单核淋巴细胞 IL-6、TNF-α 等炎症因子的分泌(Weidenmaier 等，2010，PLOS One, 56: el3227)。干酪乳酸杆菌脂磷壁酸能够刺激巨噬细胞炎症因子IL-12的产生，嗜酸乳杆菌脂磷壁酸也能够诱导宿主细胞IL-12等促炎症因子的分泌(Kaji等，2010，TheJournal ofImmunology, 184:3505-3513 ；Duncker 等，2008, Neurogastroenterology&Motility, 20:843-850)。也有研究发现，植物乳杆菌磷壁酸能够刺激巨噬细胞一氧化氮(NO)的产生，从而发挥抗炎症作用(Kang 等，2011, Molecular Immunology, 48:2170-2177)。
【发明内容】
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[0005]本发明针对现有技术的上述不足，提供一种能够改善水产动物的肠道免疫功能，抑制病原菌对水产动物的感染，降低发病率的来自丁酸梭菌的脂磷壁酸在调节水产动物免疫应答中的用途。
[0006]本发明将脂磷壁酸用于调节水产动物免疫应答，该脂磷壁酸来自丁酸梭菌细胞壁。
[0007]本发明将来自丁酸梭菌的脂磷壁酸成分用于水产动物养殖中即来自丁酸梭菌的脂磷壁酸在调节水产动物免疫应答中的用途，脂磷壁酸在水产动物饲料中的添加量以丁酸梭菌的量计为106cfu/g-10ncfu/g (是“ 106cfu/g-10ncfu 丁酸梭菌菌体中的磷壁酸成分”的意思；也就是说，原来是直接添加菌体的，现在改为添加同样数量菌体中的磷壁酸成分，以下亦同)。
[0008]本发明将来自丁酸梭菌的脂磷壁酸成分在大黄鱼、鲈鱼等海水养殖鱼类饲料中的添加量以丁酸梭菌的量计为106cfu/g?109cfu/g(含义同上述脂磷壁酸在水产动物饲料中的添加量以丁酸梭菌的量计为106CfU/g-10nCfU/g表示的含义)。
[0009]本发明将来自丁酸梭菌的脂磷壁酸成分在南美白对虾饲料中的添加量以丁酸梭菌的量计为108cfu/g?101(lCfU/g(含义同上述脂磷壁酸在水产动物饲料中的添加量以丁酸梭菌的量计为106cfu/g-10ncfu/g表示的含义)。
[0010]本发明用于调节水产动物免疫应答的脂磷壁酸，该脂磷壁酸来自丁酸梭菌细胞壁；该脂磷壁酸与其他革兰氏阳性菌的细胞壁脂磷壁酸结构存在差异；能够刺激大黄鱼、鲈鱼等海水鱼血清；能够刺激南美白对虾酚氧化酶、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶等非特异性免疫因子的分泌。
[0011]本发明上述来自丁酸梭菌的脂磷壁酸的制备方法，步骤包括:
[0012](I)用 50mmol/L、ρΗ6.5Tris 缓冲液加 TX-114(TRITON X-114CAS:9036_19_5)配制成质量百分比为2%的TX-114荣誉，4°C冰箱保存，备用；
[0013](2)分别各取1ml经48h培养的菌液于若干支已知质量的塑料离心管中，常温5000r/min离心30min，去除上层培养液后再称各管质量，计算得到湿菌质量；每Ig湿菌混悬于预冷的10ml2% TX-114溶液中，磁力搅拌器搅拌裂解菌体30min，4°C过夜；4°C 5000r/min离心30min，去除细胞碎片，收集上层提取物；
[0014](3)提取物50°C水浴30min,常温5000r/min离心30min,使提取物分成两层，轻轻收集上层水相，即为脂磷壁酸的粗提取物；制备2X20cm(直径X长度)的DEAE-纤维素层析柱，用0.lmol/L、pH4.7的醋酸铵缓冲液预平衡；脂磷壁酸粗提取物中加入5倍其体积的醋酸铵缓冲液，稀释后过柱；用0.1ΜρΗ4.7的醋酸铵缓冲液洗脱，直到洗脱液275nm吸光度A275低于0.01 ;然后用lmol/L、pH4.7醋酸铵缓冲液洗脱结合于柱上的脂磷壁酸，整个过程用试管收集洗脱液，A275监测磷壁酸洗脱峰，得到纯化后的脂磷壁酸。
[0015]本发明的丁酸梭菌为日本米雅利桑株式会社的MIYAIRI II 588菌株。
[0016]本发明步骤(2)的丁酸梭菌液培养条件为:37°C厌氧培养，其培养基为MRS培养基，MRS培养基配方:酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、吐温_801g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸锰0.2g、七水硫酸锰0.05g、碳酸钙20g、蒸馏水100mL,ρΗ7.0。
[0017]本发明的优点和有益效果:
[0018]本发明从水产动物的免疫机能调节机制出发，研究了丁酸梭菌脂磷壁酸对大黄鱼溶菌酶、IgM等免疫因子水平的影响，分析了丁酸梭菌脂磷壁酸对南美白对虾酚氧化酶、超氧化物歧化酶和抗菌能力的影响，证明丁酸梭菌脂磷壁酸能够抑制致病菌诱导的大黄鱼炎症因子的表达，显著提高南美白对虾酚氧化酶、超氧化物歧化酶等非特异性体液免疫因子的水平及其抗菌能力，具有开发成为水产动物免疫调节剂的潜力，具有良好的市场前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1 丁酸梭菌脂磷壁酸的1HNMR谱图
[0020]图2植物乳杆菌脂磷壁酸的1HNMR谱图
[0021]图3金黄色葡萄球菌脂磷壁酸的1HNMR谱图
[0022]图4不同细菌来源的脂磷壁酸对大黄鱼血清溶菌酶活性的影响。
[0023]图5不同细菌来源脂磷壁酸对大黄鱼血清IgM水平的影响。
[0024]图6不同细菌来源磷壁酸对哈维氏弧菌所致大黄鱼死亡率的影响。
[0025]图7 丁酸梭菌脂磷壁酸对南美白对虾血清酚氧化酶活性的影响。
[0026]图8 丁酸梭菌脂磷壁酸对南美白对虾血清超氧化物歧化酶活性的影响。
[0027]图9 丁酸梭菌脂磷壁酸对南美白对虾血清酸性磷酸酶活性的影响。
[0028]图10 丁酸梭菌菌脂磷壁酸的红外光谱图。
【具体实施方式】
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[0029]下面通过实施例进一下详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。
[0030]1、脂磷壁酸的提取制备方法
[0031]用50mmol/L、ρΗ6.5Tris 缓冲液加 TX-114 配制成 2% TX-114，4°C冰箱保存，备用；分别各取1ml经48h培养的菌液于若干支已知质量的塑料离心管中，常温5000r/min离心30min，去除上层培养液后再称各管质量，计算得到湿菌质量；每Ig湿菌混悬于预冷的10ml2% 了乂-114溶液中，磁力搅拌器搅拌裂解菌体3011^11，41:过夜；41: 5000r/min离心30min，去除细胞碎片，收集上层提取物；提取物50°C水浴30min，常温5000r/min离心30min，使提取物分成两层，轻轻收集上层水相，即为磷壁酸的粗提取物；制备2X20cm的DEAE-纤维素层析柱，用0.1ΜρΗ4.7的醋酸铵缓冲液预平衡；细菌磷壁酸粗提取物中加入5倍体积的醋酸铵缓冲液，稀释后过柱；用同一种缓冲液洗脱，直到洗脱液275nm吸光度A275低于0.01 ;用1ΜρΗ4.7醋酸铵缓冲液洗脱结合于柱上的磷壁酸，整个过程用试管收集洗脱液，A275监测磷壁酸洗脱峰。通过红外和核磁检测，如图1和10所示，得出本发明上述方法获得了丁酸梭菌脂磷壁酸。
[0032]2、丁酸梭菌、植物乳杆菌及金黄色葡萄球菌脂磷壁酸的结构比较
[0033]600兆NMR对三种菌来源的脂磷壁酸进行结构分析，结果如图1_3所示。
[0034]本发明利用SooM1HNMR对所得三种菌脂磷壁酸进行定性，结果发现，三种脂磷壁酸的结构并不完全相同，存在着差异，这提示这三种脂磷壁酸在功能上也可能存在较大差别。
[0035]3、按照相当于细菌106cfu/g、107cfu/g、109cfu/g的量,在大黄鱼饲料中添加丁酸梭菌、植物乳杆菌和金黄色葡萄球菌脂磷壁酸，经过35天试验后，取大黄鱼血液样品，分析其溶菌酶、IgM等免疫因子的水平。结果如图4、5。
[0036]溶菌酶的测定方法:取各组鱼血清样品各0.1mL,置25°C水浴锅中预热5min，然后加入2.8mL已预热的溶壁微球菌液，立即计时，至2min时加入I滴5mol/LK0H溶液以终止反应，立即用0.5cm比色皿于640nm波长测其透光率Tl %。再取各组鱼溶菌酶样品各0.1mL,加入I滴5mol/LK0H溶液摇匀后重复以上步骤，测定其透光率T0%。AT= (Τ1%-Τ0%)为透光率的差值，即溶菌酶透光率的变化。从标准曲线上可计算血清中溶菌酶含量(活性)。
[0037]IgM的测定方法:用双抗体夹心法测定标本中鱼免疫球蛋白M(IgM)水平。用纯化的鱼免疫球蛋白M(IgM)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入免疫球蛋白M(IgM)，再与HRP标记的免疫球蛋白M(IgM)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的免疫球蛋白M(IgM)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值)，通过标准曲线计算样品中鱼免疫球蛋白M(IgM)浓度。
[0038]由图4-5可知，添加丁酸梭菌、植物乳杆菌和金黄色葡萄球菌脂磷壁酸菌能够显著刺激大黄鱼血液中溶菌酶的活性升高，而且随着磷壁酸添加量的升高，大黄鱼血清溶菌酶的活性也逐渐提高。从三种脂磷壁酸的效果比较来看，丁酸梭菌脂磷壁酸对大黄鱼血液溶菌酶活性的刺激作用最为显著。
[0039]由图5可知，添加不同革兰氏阳性菌来源的脂磷壁酸均能够刺激大黄鱼血清IgM水平升高，而且随着磷壁酸添加浓度的升高，血清IgM的水平也不断上升。
[0040]从上述二种非特异性免疫因子的变化可以看出，三种菌来源的脂磷壁酸成分均能诱导非特异性免疫因子水平升高，但其效果存在一定差异。
[0041]4、按照相当于106CfU/g到109cfu/g的菌量，在大黄鱼饲料中添加丁酸梭菌和植物乳杆菌脂磷壁酸，随机抽取10尾大黄鱼放于室内水族箱中进行攻毒试验。对每尾实验鱼腹腔注射0.4mL(浓度为6.7X107cell/mL)哈维氏弧菌进行感染，并记录攻毒后1d的死亡率，确定不同来源脂磷壁酸对大黄鱼的保护作用，结果如图6。
[0042]由图6可知，丁酸梭菌脂磷壁酸能够使哈维氏弧菌导致的大黄鱼死亡率从68.7%降低至24.3%，效果极为显著。植物乳杆菌脂磷壁酸也可使大黄鱼死亡率由70.2%降低至40.6%,这说明该脂磷壁酸也具有一定的保护作用，但其效果不及丁酸梭菌脂磷壁酸，这可能是由于丁酸梭菌是来源于肠道的益生菌而植物乳杆菌则是外源性益生菌，二者的磷壁酸结构和性质也存在差异。而金黄色葡萄球菌磷壁酸则不仅不会降低大黄鱼死亡率，还会导致其死亡率提高，这可能是由于金黄色葡萄球菌本身即为致病菌，其细胞壁脂磷壁酸是其致病因子之一。
[0043]5、按照相当于108cfu/g、109cfu/g、101Qcfu/g的菌量,在南美白对奸饲料中添加丁酸梭菌，进行为期35天的饲养试验。Tl组添加脂磷壁酸的量相当于饲料中添加108cfu/g丁酸梭菌，T2组添加脂磷壁酸的量相当于饲料中添加109cfu/g 丁酸梭菌，T3组添加脂磷壁酸的量相当于饲料中添加101(lCfU/g丁酸梭菌。饲养试验结束后，以无菌注射器抽取对虾心脏血液，用于分析酚氧化酶、超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶等非特异性免疫因子的水平。
[0044]酚氧化酶活性的测定方法:以L-多巴为底物，96孔酶标板中加入10 μ L血清，然后向各孔中加入200 μ L0.lmol/L pH6.0磷酸盐缓冲液，再各样品孔中加入10 μ L0.0lmol/L的L -多巴溶液，在酶标仪中振荡5次，每隔5min读取490nm处的OD值。酶活力以试验条件下，I分钟内A490增加0.001定义为I个酶活力单位。结果如图。
[0045]从图7中可以看出，添加脂磷壁酸的试验组南美白对虾血清中酚氧化酶的活性呈显著升高趋势。酚氧化酶原激活系统在甲壳动物的防卫机制中发挥着重要作用，酚氧化酶的高活力有助于增强对虾的非特异性免疫力，对维持对虾机体健康具有重要意义。本试验中，我们发现丁酸梭菌脂磷壁酸能够刺激南美白对虾血清酚氧化酶活性升高，这提示丁酸梭菌脂磷壁酸能够通过某种机制提高南美白对虾的非特异性免疫机能。
[0046]超氧化物歧化酶活性的测定方法:采用改进的邻苯三酚自氧化法进行测定，在25°C下于4.5mL50mmol/LPH8.3的磷酸钾盐缓冲液中加入10μ L50mmol/L邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径Icm的比色杯内，在325nm波长下每隔30s测A值一次，要求自氧化速率在0.0700D/min左右。酶活单位定义:每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为I个酶活力单位(U/mL)。
[0047]由图8可知，日粮中添加丁酸梭菌脂磷壁酸能够提高南美白对虾血清中超氧化物歧化酶的活性，随着日粮中脂磷壁酸水平的提高，对虾血清中超氧化物歧化酶活性成逐渐升高趋势。该酶可以减少自由基对正常细胞的损伤，对细胞生理代谢过程中的活性氧有清除作用，从而提高机体的解毒免疫功能和防病抗病能力。超氧化物歧化酶活性与生物的免疫水平密切相关，其活性变化可以作为反映对虾的机能健康状况及衡量对虾免疫状态的指标。
[0048]采用磷酸苯二钠法测定酸性磷酸酶(ACP)活性。ACP活力定义为:每10ml血清在37°C与底物作用60min，产生Img酚者为I个酶活力单位。结果如图9所示。
[0049]由图9可知，随着脂磷壁酸添加量的增加，南美白对虾血清酸性磷酸酶的活性逐渐升高，这说明丁酸梭菌脂磷壁酸能够刺激南美白对虾酸性磷酸酶合成，提升对虾免疫机倉泛。
【权利要求】
1.一种脂磷壁酸在调节水产动物免疫应答中的用途，该脂磷壁酸来自丁酸梭菌细胞壁。
2.根据权利要求1所述的脂磷壁酸在调节水产动物免疫应答中的用途，该脂磷壁酸与其他革兰氏阳性菌的细胞壁脂磷壁酸结构存在差异。
3.根据权利要求1所述的脂磷壁酸在调节水产动物免疫应答中的用途，该脂磷壁酸在水产动物饲料中的添加量以丁酸梭菌的量计为106cfu/g-10ncfu/g。
4.根据权利要求1所述的脂磷壁酸在调节水产动物免疫应答中的用途，所述的脂磷壁酸能够刺激大黄鱼、鲈鱼的海水鱼血清。
5.根据权利要求4所述的脂磷壁酸在调节水产动物免疫应答中的用途，所述的脂磷壁酸在大黄鱼、鲈鱼的海水养殖鱼类饲料中的添加量以丁酸梭菌的量计为106cfu/g?109cfu/g。
6.根据权利要求1所述的脂磷壁酸在调节水产动物免疫应答中的用途，所述的脂磷壁酸能够刺激南美白对虾酚氧化酶、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶的非特异性免疫因子的分泌。
7.根据权利要求6所述的脂磷壁酸在调节水产动物免疫应答中的用途，所述的脂磷壁酸成分在南美白对虾饲料中的添加量以丁酸梭菌的量计为108cfu/g?10lclcfu/g。
【文档编号】A61P37/02GK104161775SQ201410235076
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】王进波, 齐莉莉, 梅乐和, 周云晓 申请人:浙江大学宁波理工学院