B19病毒vp1独特区蛋白构建病毒性肾病模型的应用的制作方法

B19病毒vp1独特区蛋白构建病毒性肾病模型的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了B19病毒VP1独特区蛋白构建病毒性肾病模型的应用。以纯化好的B19病毒VP1独特区蛋白经尾静脉注射BALB/c小鼠。共注射3次，每次间隔10d，最后1次注射后10d，取标本进行相关检测。经肾脏组织分别行光镜、电镜和TUNEL免疫荧光分析，尿液行尿常规检查。结果表明B19病毒VP1独特区蛋白引起肾脏组织及尿液改变，说明了其能够成功的构建病毒性肾病动物模型。常见的活病毒感染建立病毒性肾病动物模型有一定的危险性，而本发明采用B19病毒VP1独特区蛋白建立病毒性肾病动物模型具有安全性好、可操作性好及成功率高的特点。
【专利说明】B19病毒VP1独特区蛋白构建病毒性肾病模型的应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒性肾病模型构建【技术领域】，涉及B19病毒VP1独特区蛋白构建病 毒性肾病模型的应用。

【背景技术】
[0002] 1、病毒性肾病的研究现状 病毒性肾病是一组因病毒感染而导致的肾脏疾病，常见的病原有乙型肝炎病毒（HBV)、 丙型肝炎病毒（HCV)、B19病毒、艾滋病病毒（HIV)等。国外报道B19病毒感染引起的病毒性 肾病包括肾小球肾炎、肾病综合征、肾功能不全等疾病。近来，B19病毒感染被认为与临床 表现重、治疗效果差、病程进展快、预后差的塌陷性肾小球病（CG)密切相关，CG患者肾脏组 织和外周血中B19病毒DNA检出率分别为78%和87%。国内郝文等报道B19病毒感染是过 敏性紫癜发病的重要原因之一，且B19病毒感染更易引起肾脏病变。余建莉等发现肾脏病 患儿B19病毒感染阳性率明显高于健康儿童，原发性肾脏病中急性肾小球肾炎B19病毒感 染阳性率最高，继发性肾脏病中狼疮性肾炎B19病毒感染阳性率最高。王薇等发现B19病 毒感染引起的肾脏疾病有自限性，其中女性患者较多。
[0003] 目前研究认为病毒感染致肾脏病变的机制包括：①病毒蛋白或组织中的致炎因子 引起肾脏细胞坏死、凋亡或功能障碍；②病毒抗原与肾小球直接结合，针对病毒抗原的免疫 反应引起肾脏损伤；③循环系统中的抗原抗体免疫复合物损伤肾脏；④病毒对肾小球的直 接破坏；⑤肾小管间质因细胞病变和肾小球产生的炎症因子而损伤；⑥血流动力学紊乱； ⑦抗病毒治疗引起肾脏损伤。病毒感染导致肾脏病变涉及的信号通路主要有TNFR信号通 路、Notch信号通路、⑶NF / Ret信号通路。Komatsuda A等认为B19病毒抗原刺激产生的 抗体所形成的抗原抗体复合物是B19病毒感染引起肾脏损伤的原因之一。
[0004] 2、B19病毒及其致病性 人细小病毒 B19 (Human Parvovirus B19, PVB19)是 1975 年 Cossart YE 用对流免疫 电泳法筛选健康献血者血液中乙型肝炎病毒时于第19号标本中偶然发现的，因此得名。它 是细小病毒科细小病毒属中目前己知的唯一致人类疾病的病毒，也是动物病毒中体积最小 结构最简单的DNA病毒。1981年，在患镰状细胞贫血和再生障碍性贫血的儿童中检测到这 种病毒，从而证实了其致病性，以后又相继在传染性红斑（又称第五病）、血小板减少性紫 癜、关节病、心肌炎、心包炎、急性肝炎患者中检测到该病毒，而且还发现该病毒能通过胎盘 感染胎儿，引起孕妇流产、早产或胎儿水肿、死胎。1987年在1例先天性免疫缺陷综合征贫 血病人中证实存在有慢性B19病毒感染。随后的研究显示在AIDS患者、器官移植的受者、 化疗的肿瘤病人等免疫抑制患者中都有慢性持续性B19病毒感染的存在。近年来，还证实 B19病毒感染与川崎病、一过性成红细胞减少、系统性红斑狼疮、皮肌炎、慢性自身免疫性血 小板/中性粒细胞减少症、某些严重的肝炎、由免疫复合物介导的肾脏损害及睾丸生殖细 胞瘤等疾病有关，甚至可引起败血症。
[0005] B19病毒颗粒由两个衣壳蛋白和一条线状的单链DNA分子组成，呈对称的二十面 立体结构，无包膜，直径22-24nm，平均23nm。在电镜和阴性染色中可见空壳和完整的病毒 颗粒，成熟的有感染力的病毒颗粒分子量为5. 6X106道尔顿，其中DNA占全重的一半。B19 病毒基因为单链小DNA，全长5596bp，两端有383bp长的重复序列形成复式发卡结构，G、C 含量高，具有强同源性，是合成整条链的引物。两端的复式发卡结构使得B19病毒基因二级 结构牢固，而不易克隆入细菌中。在B19病毒基因组内有两个大的开放读框，几乎延伸整个 基因组，左侧的开放读框（406-2501bp)编码非结构蛋白（NS)，右侧的开放读框编码两个衣 壳蛋白VP1和VP2。VP2的氨基酸编码序列（3088-5093bp)包含在VP1的氨基酸编码序列 (2416-5093bp)中，其组成比后者少226个氨基酸的氨基尾，故这两种衣壳蛋白在氨基酸组 成上具有同一'I"生。
[0006] B19病毒的细胞受体主要是红细胞糖苷脂，也被称为P抗原，它是一种中性糖脂。 P抗原主要是在红系祖细胞、成熟红细胞、巨核细胞、内皮细胞和平滑肌细胞上，这与B19病 毒感染引起的疾病相关。P抗原或抗P抗原抗体可以保护细胞不被B19病毒感染，P抗原阴 性血型的人不感染B19病毒。然而，也有体外试验发现B19病毒不与P抗原结合。α5β1 整合素复合物（ α5β 1 integrin complex)是Β19病毒进入细胞的核心受体。Ku80 DNA结 合蛋白也被认为与B19病毒进入细胞有关。有一个有趣的现象,只有极少数的B19病毒与 细胞膜上P抗原结合后进入细胞内，大多数的B19病毒从结合的细胞膜上脱落下来，将这些 脱落的B19病毒加入没有被感染过的细胞中时，这些脱落的B19病毒有极强的结合能力和 传染性，深入研究发现这与B19病毒结合P抗原后病毒蛋白构象发生变化，结合位点被暴露 出来有关。B19病毒通过内吞作用进入细胞质，网格蛋白、发动蛋白和细胞骨架都参与了这 一过程，内吞膜泡被运送到细胞核的周边。Ras超家族成员Rapl通过调节β 1整合素复合 物受体和或微管网络控制内吞膜泡在细胞质中运输。VP1独特区区域随着内吞膜泡内pH值 降低而完全暴露在病毒衣壳表面，暴露区域中包含PLA2结构域，PLA2结构域劈开膜泡，VP2 区域的NLS介导病毒衣壳与转入蛋白结合，发生构象变化的病毒核酸通过核膜孔复合物进 入细胞核。VP1独特区蛋白对于B19病毒进入宿主细胞至关重要，如果VP1独特区蛋白因核 酸突变导致构象变化，病毒核酸将无法进入细胞核。
[0007] 1983年，Mortimer PP等首次提出B19病毒对红系祖细胞有细胞毒性。Srivastava A等发现B19病毒与红系祖细胞和巨核细胞的P抗原结合后，由NS1蛋白引起细胞死亡。 Moffatt S等提出NS1蛋白引起细胞死亡是通过激活caspase 3,触发细胞凋亡所导致的。 B19病毒诱导细胞凋亡的特性并在超微结构下得以证实。深入研究发现NS1蛋白中的三磷 酸核苷结合结构域与B19病毒诱导细胞凋亡有关，这一过程包括：NS1蛋白阻止细胞膜两边 Na+与H+交换，降低胞内pH值；触发了 TNF受体信号通路，激活caspase3和caspase6 ;激 活p53,诱导Bax表达，再激活caspase 9。此后，Chen AY等认为llkDa蛋白诱导细胞凋亡 的能力比NS1蛋白强，如果抑制llkDa蛋白合成，B19病毒感染导致细胞凋亡的能力明显减 弱，并且还发现细胞浆中的llkDa蛋白浓度是细胞核中NS1蛋白浓度的100倍，llkDa蛋白 诱导细胞凋亡与激活caspase 10有关。
[0008] B19病毒感染急性期是多种自身抗体产生的重要时期，这些自身抗体包括aCL、 ai3 2GP I、dsDNA、抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA)，抗蛋白水解酶3抗体（aPR3-ANCA)和抗 髓过氧化物酶抗体（aMPO-ANCA)也短暂出现。自身抗体在分子拟态机制下具有病毒抗原表 位，引起免疫紊乱，抗独特型抗体也参与了自身抗体的产生和自身免疫反应。VP1独特区蛋 白发挥PLA2活性可促使炎症因子白三烯和前列腺素产生，炎症反应将产生一些不常见的 复合物，这些复合物含有细胞磷脂成份，依赖于分子拟态机制，刺激宿主产生相应的aPL自 身抗体，这些自身抗体会攻击宿主器官。
[0009] 3、B19病毒VP1独特区蛋白的功能 B19病毒VP1独特区蛋白分子量22kDa，VP1独特区蛋白几乎全部暴露在病毒表面。VP1 独特区蛋白的功能位点却没有暴露在病毒衣壳表面，只有当环境温度升高和pH值降低时 功能位点才暴露出来。暴露出来的功能位点与B19病毒进入细胞内有关。VP1独特区蛋白对 于病毒衣壳构建至关重要，具有良好的抗原性。VP1独特区蛋白与心磷脂（CL)和β 2糖蛋白 I (i3 2GP I )有类似的抗原决定簇。通过分析VP1独特区蛋白和几种VP1独特区蛋白突变 体的亲和常数，研究者发现尽管VP1独特区基因片段核苷酸变异较多，但是不管核苷酸如 何变异，或者是VP1独特区蛋白在何种环境中，VP1独特区蛋白构象表位都不变。Zddori Ζ 等在进行VP1独特区蛋白氨基酸序列分析时，发现VP1独特区蛋白含有磷酸酶A2(PLA2)序 列。接着，Dorsch S等采用电喷雾串联质谱（ESI-MSn)技术证实真核系统和原核系统表达 的VP1独特区蛋白都有PLA2活性，VP1独特区蛋白发挥PLA2活性时依赖于Ca 2+存在，PLA2 活性中心有赖氨酸和组氨酸，使用与赖氨酸和组氨酸结合的二倍半萜内酯（Manoalide)和 4'-二溴苯乙酮（4-bromophenacylbromide)可以阻断VP1独特区蛋白的PLA2活性。在VP1 独特区蛋白致病机理方面，Lindner J等将含有VP1独特区基因片段的质粒转染B细胞，在 把转染后的B细胞加入外周血中，可检测到大量淋巴细胞分泌干扰素 -γ (IFN- γ )，用流式 细胞仪进行淋巴细胞分类，发现大部分是CD4 + T细胞。此外，有PLA2活性的VP1独特区 蛋白会刺激滑膜细胞产生环氧合酶2 (C0X-2)，从而使前列腺素 E合成增多。在B19病毒感 染导致内皮细胞功能障碍机制研究中，发现具有PLA2活性的VP1独特区可以打开细胞膜上 的Ca 2+通道，提高内皮细胞内的Ca2+浓度，而内皮细胞功能就是由细胞内Ca2+活性所调节， 从而提示VP1独特区蛋白与内皮细胞功能障碍有关。另外，VP1独特区蛋白还被认为通过 细胞外信号调节激酶1和2 (ERK1/2)和JNK信号通路刺激产生IL-1 β、IL-6和金属蛋白酶 9 (MMP9)。在B19病毒感染急性期，VP1独特区蛋白中PLA2结构域刺激机体产生抗磷脂抗 体（aPL)，其中最主要的是抗心磷脂抗体（aCL)和抗β 2糖蛋白I抗体（a@ 2GP I )。进一 步研究发现VP1独特区蛋白刺激产生的ai3 2GP I可导致抗磷脂综合征（APS)。后续，将抗 B19病毒VP1独特区蛋白的IgG注射小鼠，小鼠会出现血小板减少、活化部分凝血酶原时间 延长、aPL和抗双股DNA(AdsDNA)抗体产生，并且通过磷脂酰肌醇3激酶（PI3K)和ERK产 生了 MMP9。


【发明内容】

[0010] 本发明解决的问题在于提供一种B19病毒VP1独特区蛋白构建病毒性肾病模型的 应用，克服了用活病毒构建病毒性肾病动物模型的缺陷。
[0011] 本发明是通过以下技术方案来实现： B19病毒VP1独特区蛋白在制备构建病毒性肾病模型的试剂中的应用。
[0012] 所述B19病毒VP1独特区蛋白被制成注射剂。
[0013] 所述的注射剂中B19病毒VP1独特区蛋白的浓度不小于1. Omg/mL。
[0014] 所述的注射剂中B19病毒VP1独特区蛋白的浓度为1. 2mg/mL。
[0015] 所述的试剂为引起肾脏组织病毒性病变及尿液改变的试剂。
[0016] 所述的肾脏组织病毒性病变表现为光显微镜、透射电镜下能够观察到的病毒性病 变。
[0017] 所述的肾脏组织病毒性病变表现为TUNEL免疫荧光能够检测到的病毒性病变。
[0018] 所述的尿液改变包括检测到尿蛋白、尿隐血的改变。
[0019] B19病毒VP1独特区蛋白在构建病毒性肾病模型中的应用。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果： 本发明提供B19病毒VP1独特区蛋白构建病毒性肾病模型的应用，以纯化好的B19病 毒VP1独特区蛋白（分子量22kDa，浓度1. 2mg/mL，纯度96. 7%)经尾静脉注射BALB/c小鼠。 共注射3次，每次间隔10d，最后1次注射后10d，取标本进行相关检测。经肾脏组织分别行 光镜、电镜和TUNEL免疫荧光分析，尿液行尿常规检查。结果表明B19病毒VP1独特区蛋白 引起肾脏组织及尿液改变，说明了其能够成功的构建病毒性肾病动物模型。
[0021] 与现有技术相比，常见的活病毒感染建立病毒性肾病动物模型有一定的危险性， 而本发明采用B19病毒VP1独特区蛋白建立病毒性肾病动物模型具有安全性好、可操作性 好及成功率高的特点。

【专利附图】

【附图说明】
[0022] 图1是光镜鉴定病毒性肾病模型结果；A图（X200)所示为B19病毒VP1独特区 蛋白干预组；B图（X200)所示为对照组。
[0023] 图2是电镜鉴定病毒性肾病模型结果；A图（X30000)所示为B19病毒VP1独特 区蛋白干预组，B图（X20000)所示为B19病毒VP1独特区蛋白干预组，C图（X70000)所 示为对照组。
[0024] 图3是TUNEL免疫荧光鉴定病毒性肾病模型结果；B19病毒VP1独特区蛋白干 预组，可见绿色荧光代表细胞凋亡；对照组无绿色荧光，蓝色信号提示DAPI衬染细胞核， Merge 为 TUNEL 和 DAPI 合并。

【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0026] 本发明采用李志宏、张国成等于2007年在《细胞与分子免疫学杂志》中公开的《人 微小病毒B19 VP1独特区蛋白的表达及纯化》过程的可行性表达纯化B19病毒VP1独特区 蛋白，后续具体方案按以下予以实现。
[0027] 1. B19病毒VP1独特区蛋白注射小鼠 ⑴选择6周龄BALB/c小鼠； ⑵使用B19病毒VP1独特区蛋白每次尾静脉注射12ygVPl独特区蛋白（浓度为 1. 2mg/mL)，对照组予以生理盐水注射； 所述的B19病毒VP1独特区蛋白分子量22kDa，纯度96. 7% ; ⑶共注射3次，每次间隔10d; ⑷最后1次注射后l〇d，取标本进行相关检测。
[0028] 2.光镜观察肾脏组织病变情况 ⑴取材。处死B19病毒VP1独特区蛋白注射后小鼠，迅速取出肾脏组织，将其切为5mm 厚组织块； ⑵固定。快速将切好的组织块放入中性福尔马林液，固定24h ; ⑶脱水。将固定好组织顺次浸泡于70%酒精2h、80%酒精2h、95%酒精（I ) 2h、95%酒 精（II )2h、无水酒精（I )2h、无水酒精（II )2h ; ⑷透明。将脱水后组织顺次浸泡于1:1二甲苯与无水酒精混合液2h、二甲苯（I )2h、 二甲苯（II )2h; (5) 浸蜡。56?58 °C将三个蜡杯中石蜡熔化，保持熔蜡在58 °C，把透明处理过组织顺次 浸泡于三个蜡杯，每个蜡杯中浸泡lh ; (6) 包埋。在包埋框中倒入熔化的石蜡，接着把已经浸蜡处理的组织放入，待石蜡凝固后 就形成石蜡包埋块； ⑴切片。切片机将组织切为4μπι厚组织片，切片置于载物片表面，放入60°C烤箱 30min ； ⑶脱蜡。把烤好的切片依次放入二甲苯（I )5min和二甲苯（II )5min ; ⑶复水。把脱蜡后切片顺次放入无水酒精5min、95%酒精5min、80%酒精5min、70%酒 精5min、蒸馈水5min ; (1〇)染色。把复水后组织切片用去离子水洗涤干净，浸泡于Harris苏木精液（5min)，在 自来水下冲洗掉多余染液，再浸泡于1%盐酸酒精5min，进行分色处理，接着放入自来水浸 泡返蓝，返蓝以后浸泡于去离子水5min,最后用0. 5%伊红酒精染色3min ; (ID脱水。将染色后切片顺次浸泡于95%酒精（I )5min、95%酒精（II ) 5min、无水酒 精（I )5min、无水酒精（II )5min ; (12) 透明。将脱水后组织切片依次放入1:1无水酒精与二甲苯混合液、二甲苯（I )5min、 二甲苯（II ) 5min ; (13) 封藏。在透明后的组织切片中央滴一滴树胶，接着加盖盖玻片； (M)显微镜观察，拍照。
[0029] 检测结果如图1所示，其中A图（X 200)所示为B19病毒VP1独特区蛋白干预组； B图（X200)所示为对照组。A图可见肾小管内大量红细胞（箭头所标示），肾小球缩小。 表明B19病毒VP1独特区蛋白干预之后出现了肾脏组织病变。
[0030] 3.电镜观察肾脏组织病变情况 ⑴取材。用乙醚麻醉小鼠，将麻醉好的小鼠固定在解剖板上，剪刀迅速剪开腹腔，将肾 脏组织取出，在冰盒上切成1mm X 1mm X 3mm组织块； ⑵固定。将4%戊二醛（20倍标本体积）加入组织块，固定24h，1%锇酸再固定2h，固定 结束后，漂洗30min ; ⑶脱水。固定好的组织块依次放入50%丙酮（10min)、70%丙酮（10min)、90%丙酮 (15min)、100% 丙酮（20min); ⑷浸透。用丙酮和1:1混合包埋液（邻苯二甲酸二丁酯与环氧树脂）浸透组织块 30min，然后取出组织块，放入混合包埋液中浸透12h ; (5)包埋。在橡胶包埋板中加入混合包埋液，放入组织块、编码条，滴满包埋液，45°C烤 12h，60°C烤48h，将包埋块取出； (6)修块。把包埋块固定于夹持器尖端，通过解剖显微镜用刀片削出肾脏组织，修整整 齐； ⑴超薄切片。将包埋块固定于超薄切片机上，安装切割刀，调节水槽中液平面与光源的 位置、切片速度，进行切片，后小心将切片捞在载网上； ⑶超薄切片染色。在蜡板表面滴上柠檬酸铅，用镊子夹在载网边缘，将组织超薄切片浮 于柠檬酸铅中，染色15min后取出，用去离子水清洗干净； ⑶观察记录数据。运行JEM22000EX透射电镜，将载网放入，观察病理改变并拍照。
[0031] 检测结果如图2所示，其中A图（X30000)所示为B19病毒VP1独特区蛋白干预 组，B图（X20000)所示为B19病毒VP1独特区蛋白干预组，C图（X70000)所示为对照组。 A图可见足细胞足突融合。B图可见肾小管空泡化。表明B19病毒VP1独特区蛋白干预之 后出现了肾脏组织病变。
[0032] 4.检测干预后鼠尿液变化情况 ⑴将最后1次注射B19病毒VP1独特区蛋白再饲养10天的BALB/c小鼠饲养在代谢笼 中，代谢笼下面罩一个塑料漏斗，收集BALB/c小鼠尿液； ⑵收集完毕后l〇〇〇rpm离心lOmin，吸取上清进行检查； ⑶将收集的尿液用Animal-2006型尿液分析仪检测。
[0033] 检测结果如表1所示： 表1 B19病毒VP1独特区蛋白注射小鼠后尿液检测数值（n=15)

【权利要求】
1. B19病毒VP1独特区蛋白在制备构建病毒性肾病模型的试剂中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，B19病毒VP1独特区蛋白被制成注射剂。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的注射剂中B19病毒VP1独特区蛋白的 浓度不小于1. Omg/mL。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的注射剂中B19病毒VP1独特区蛋白的 浓度为1. 2mg/mL。
5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂为引起肾脏组织病毒性病变及 尿液改变的试剂。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肾脏组织病毒性病变表现为光显微 镜、透射电镜下能够观察到的病毒性病变。
7. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肾脏组织病毒性病变表现为TUNEL免 疫荧光能够检测到的病毒性病变。
8. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的尿液改变包括检测到尿蛋白、尿隐血 的改变。 9. B19病毒VP1独特区蛋白在构建病毒性肾病模型中的应用。
【文档编号】A61K38/16GK104083753SQ201410241521
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】聂晓晶, 马雷, 丁晓华 申请人:中国人民解放军南京军区福州总医院