一种用于治疗肿瘤的联合用药物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于治疗肿瘤的联合用药物，所述联合用药物由砷化合物溶液与巴西苏木素类化合物的不同规格的单位制剂组成，所述的砷化物溶液通过如下方法制得：取As2O3粉末加入到无菌去离子水中得到悬浮液，所得悬浮液滴加NaOH溶液直至粉末完全溶解；所述巴西苏木素类化合物由巴西苏木素和巴西苏木红素组成。本发明将砷化合物、巴西苏木素类化合物合用，可以提高砷化合物疗效，控制砷化合物剂量和相应的毒、副作用，使它的使用变得更加安全，拓展砷化合物治疗谱，尤其在抗T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞方面表现出良好的协同作用。
【专利说明】一种用于治疗肿瘤的联合用药物
【技术领域】
[0001] 本发明属中药【技术领域】，涉及砷化合物与巴西苏木素类化合物在制备治疗肿瘤的 联合用药物中的应用，以及一种用于治疗肿瘤的联合用药物。
【背景技术】
[0002] 三氧化二砷（As203)为中药砒霜，20世纪70年代我国学者发现其治疗急性早幼粒 细胞白血病（APL)有效，引起了研究者和临床医生的广泛关注。但是不同肿瘤细胞对As 2O3 的易感性差别很大。如CN01107536. 8涉及治疗恶性淋巴瘤的药物及其配制方法，其公开了 来源于人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji细胞对As2O 3很敏感，而同样来源于人类T淋巴瘤细 胞株Jurkat细胞对As2O3就不敏感。另外，肿瘤细胞在体内外敏感性差异也大，许多肿瘤细 胞在体外能够被As 2O3有效诱导凋亡，而在临床应用中却反应不敏感。实体瘤细胞株则大多 较不敏感，竺涵光等人（口腔医学纵横杂志2000年第16卷第1期35 - 37页）报道：较多 的研究表明，三氧化二砷既有诱导肿瘤凋亡和分化作用，又有明显的抗增殖作用。不仅可 以用于治疗APL、CML等血液系统恶性肿瘤也有可能治疗食管癌、胃癌、结肠癌、口咽癌的实 体肿瘤，诸多的体外研究充分地证明了这一点。三氧化二砷治疗实体肿瘤作用在较多的理 论研究虽已得到了证实，但临床治疗实体肿瘤却未有取得明显进展的报道。究其原因，这 可能与三氧化二砷在血液中95 %?97 %的血红蛋白结合的生化特性有关。在常规的APL 临床治疗方案中，血液的砷浓度平均在1 μ mol/L，峰值在4. 8 μ mol/L，按常规的血液扩散 浓度，到达实体肿瘤的砷浓度远远低于治疗浓度。经动物体内实验表明：经动脉微量输液 泵输入100 μ mol/L的As2O3，其局部灌注区域内的组织浓度平均达7. 9 μ mol/L ;同条件下经 静脉输入，其组织浓度仅达1. 4 μ mol/L ;这可能是血液系统恶性肿瘤显效，而实体肿瘤作 用不明显的关键所在。
[0003] 研究证实三氧化二砷具有显著生理活性，有明显的抗肿瘤作用，但同时它作为一 种剧毒药物，它的毒性对人体正常组织的副作用也常被报道和研究。它的毒性作用呈现一 种剂量依赖关系，减少它的用量是一种可行安全的办法，但同时又要发挥它对肿瘤组织的 细胞毒性作用。因此，除了选择合适的给药途径外，研究如何减少As 2O3剂量和相应的毒、副 作用，同时又要提高As2O3药效，制剂的制备显得尤为重要。
[0004] 近十几年来，对三氧化二砷的研究的成果比较多，例如CN200380105498. 8公开了 三氧化二砷的口服组合物的制剂及其使用方法。又如CNO1107536. 8公开了治疗恶性淋巴 瘤的药物及其配制方法。再如CN98813016. 5公开了三氧化二砷制剂生产法及用三氧化二 砷或米拉索普治癌法。以上列举的三个专利，所配制的三氧化二砷组合物的方法基本相同， 其步骤：均采用氢氧化钠溶解，其溶液用稀盐酸中和，并调节pH为7. 0?7. 2,三氧化二砷 终浓度为lmg/ml。现有技术制备的三氧化二砷组合物由偏亚砷酸钠（NaAsO2)、三氧化二砷 和氯化钠组成。其中CNOl 107536. 8研究结果表明，采用人恶性B淋巴瘤细胞Raji细胞，细 胞密度为2. 0 X 105/ml，经As2O3浓度0. 5、I. 0、2. 0 μ mol/L作用24、48、72小时，所测活性细 胞数，反映〇. 5?2. 0 μ mol/L As2O3抑制细胞生长，并呈现剂量依赖效应；但对人T淋巴瘤 细胞株 jurkat 细胞，细胞密度为 2. OX 105/ml，As203 浓度（0· 5、1· 0、2· 0、4· O μ mol/L)不抑 制细胞生长。
[0005] 近几年来，已经有许多报道显示，三氧化二砷与其他化疗或非化疗药物联用能增 强它的效果，发生协同效应，从而减少三氧化二砷剂量和相应的毒、副作用，使它的使用变 得更加安全，更加能够拓展三氧化二砷治疗谱。如CN200310104509. 2公开了大黄有效成分 在制备增强As2O3诱导肿瘤细胞凋亡药物中的应用；如CN200810177336. X公开了一种抑制 乳腺癌细胞体外生长和治疗乳腺癌的药物；一种治疗乳腺癌的药物，它包括三氧化二砷和 粉防己碱两种组分，三氧化二砷和粉防己碱两药联合使用时可以降低三氧化二砷毒性，效 果优于单独用药；在一定浓度范围内，联合用药产生协同作用。如CN201110089819. 6公开 了三氧化二砷与南天竹子配伍的药物组合物及其制备和用途。以上列举的三个专利均未见 公开三氧化二砷的制备方法。
[0006] 苏木为豆科云实属植物，其干燥心材，味甘、咸、微辛，入心、肝、脾，是一种传统中 药材，资源丰富，用途广泛。具有舒筋通络、活血散结、镇静、祛痰等功效，收载于中华人民共 和国药典一部。
[0007] 关于苏木的化学成分研究，据日本学者永井正博等人研究报道：苏木中酚性成分 为其主要药效作用的物质基础，其包括查耳酮类、巴西苏木素类、原巴西苏木素类、高异黄 酮类衍生物，巴西苏木素类化合物是苏木中的主要活性成分，巴西苏木素类包括巴西苏木 素 （Brazilin C16H14O5)与巴西苏木红素 （Brazilein C16H12O5)。近几十年来，国内外研究发 现苏木除传统药效外还具有免疫抑制、抗氧化性、抗菌、抗补体、抗肿瘤等新的药理活性。如 CN01127907. 9公开了用于抗器官移植急性排斥反应的单味药-苏木水提物，其可延长移植 心脏的存活时间，减轻排斥反应对器官所致的免疫损伤。
[0008] 现有技术提取巴西苏木红素：
[0009] 如CN201010183648. 9公开了苏木提取物制备灌注液制备工艺及其在治疗膀胱癌 上的用途，该专利公开方法是：取苏木粉碎，三次水提，合并三次提取液，减压浓缩；静置过 夜，除去沉淀；再加入石油醚，萃取，保留水相；再加入乙酸乙酯，萃取，去掉水相；减压挥发 尽乙酸乙酯；干燥物称重,加纯化水，使干物质含量为2%，加热溶解，室温静置过夜，过滤 除去沉淀物；冻干，分装。如CN200710122084. 6公开了药物化合物巴西苏木红素制备方法 和用途，该专利公开方法是：1)将苏木心材，采用碱水溶剂进行加热提取，得到提取液；2) 将提取液在室温下加酸，使PH值为2-6,离心或静止过滤，弃去上清液，取沉淀物，然后干 燥，得干燥物；3)将干燥物用醇溶解，进行色谱分离，即制得巴西苏木红素。
[0010] 如CN201110117851. 0公开了一种巴西苏木红素的提纯方法，该专利公开方法是： 将苏木粉碎，加入提取罐中，以乙醇液为溶媒采用连续逆流法提取，提取液浓缩至浸膏，用 乙酸乙酯溶解，溶液与硅胶拌匀，低温烘干后加入石油醚中，回流提取3-5次，滤出硅胶，再 加入乙酸乙酯回流提取3-6次，提取液除溶后得到巴西苏木红素粗品，最后采用高效制备 液相色谱法纯化，收集目标洗脱液，蒸干即得产品。
[0011] 现有技术提取巴西苏木素：
[0012] 如CN200410044111. 9公开了苏木有效部位群的药物新用途，其制备方法：采用热 回流提取，将苏木粗粉，用75%乙醇浸泡，加热至85°C，连续回流提取，过滤；反复2次，将滤 液合并，减压浓缩，真空干燥，制成乙醇提取物干粉。将乙醇提取物干粉加入双蒸水混悬，用 乙酸乙酯进行萃取，静止，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层。减压回收 乙酸乙酯，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥，得到乙酸乙酯提取物干粉。
[0013] 又如赵莉莉硕士论文（2011年5月）公开了对苏木抗癌有效成分分析及其对膀胱 癌细胞抑制作用的研究。苏木提取物的制备方法：称取苏木，用蒸馏水或乙醇或甲醇，常压 回流lh，提取4次，合并提取液，减压浓缩，离心、过滤，滤液加入等体积石油醚脱脂2次，水 相加入等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯部分，减压蒸干溶剂（即得）。苏木抗癌有 效成分对体外培养的膀胱癌细胞的增生抑制及诱导凋亡作用；巴西木素是苏木中主要抗癌 有效成分之一，经鉴定该化合物为巴西木素，分子式：C16H1405,分子量：286. 28。
[0014] 综上，现有技术中以苏木心材为原料，提取、制备巴西苏木红素制剂的方法占极大 多数（是按从苏木中提取物的标题计数为多数），而制备巴西苏木素制剂的方法占极少数。 现有工艺流程繁琐，处理周期长，且收率低，不利于工业化生产。并且，现有技术对苏木中主 要两种活性组分均只提取其中一种活性组分，或巴西苏木红素，或巴西苏木素。如果没有分 别提取巴西苏木红素、巴西苏木素为主要成分的两个组分，就会在主要两种组分中丢失其 中一种活性组分，不但会影响药物的效果，而且会因提取工艺、方法等问题而影响提取物的 得率。因此，亟需开发一种新的制备苏木有效部位制剂的新方法。
【发明内容】
[0015] 本发明的第一个目的是提供砷化合物与巴西苏木素类化合物在制备治疗肿瘤的 联合用药物中的应用，其药效优于单独给药。
[0016] 本发明的第二个目的是提供一种用于治疗肿瘤的联合用药物。
[0017] 下面对本发明采用的技术方案进行具体说明。
[0018] 本发明提供了砷化合物溶液与巴西苏木素类化合物在制备治疗肿瘤的联合用药 物中的应用，所述的砷化合物溶液通过如下方法制得：取As 2O3粉末加入到无菌去离子水中 得到悬浮液，所得悬浮液滴加 NaOH溶液直至粉末完全溶解；
[0019] 所述巴西苏木素类化合物由巴西苏木素和巴西苏木红素组成，所述的巴西苏木素 类化合物的制备方法包括：
[0020] (1)以经过粉碎的苏木心材为原料，以蒸馏水或去离子水为溶剂，苏木心材与蒸馏 水或去离子水的质量比为1:2-8,在90?KKTC下提取0. 75?lh，过滤得到苏木水提液， 浓缩至苏木水提液总体积的1/6-1/20,得苏木浓缩液；将苏木浓缩液放置过夜形成结晶沉 淀，分离上层清液和沉淀A，清液中再加入用量为清液体积的3?5倍的95%乙醇，放置过 夜，离心去杂，浓缩回收乙醇，喷雾干燥，得巴西苏木红素；
[0021] (2)将沉淀A采用乙醇溶解，置于旋转蒸发器中浓缩，真空干燥，将乙醇干燥物加 入去离子水混悬，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂后，加热水溶解，过滤，取滤液，静 置，重结晶得到巴西苏木素。
[0022] 进一步，所述巴西苏木素类化合物与砷化合物的质量比以各自的制备原料（即苏 木心材与As 2O3粉末）的质量之比计大于50。本发明中，由于砷化合物具有毒性，而巴西苏 木素类化合物无毒性，因此在联合使用时，一般需尽量减少砷化合物的用量，在砷化合物用 量一定的情况下，增加巴西苏木素类化合物的用量是有利的。
[0023] 本发明在砷化合物溶液的制备中，使用的As2O3粉末的纯度为95%?99.9%。在 制备悬浮液时，一般使得每mL无菌去离子水中加入5?30mg As2O3粉末。本发明采用氢氧 化钠溶液溶解As2O3,推荐溶解As2O3的NaOH溶液的浓度为3?6mol/L，优选为3?4mol/ L，该浓度的氢氧化钠可使得As2O3完全溶解。本发明所述的砷化合物溶液，在分装制剂时， 可根据通过加入无菌去离子水和稀氢氧化钠溶液（0. 1?I. 〇mol/L，优选0. 2?0. 3mol/L) 以调节溶液浓度和pH值，例如使所得砷化合物溶液的浓度以投料的As2O3计为1?20mg/ ml以及pH值为7. 2?7. 3。本发明在砷化合物溶液的制备过程中不使用盐酸。
[0024] 本发明还提供了一种用于治疗肿瘤的联合用药物，由砷化合物溶液与巴西苏木素 类化合物的不同规格的单位制剂组成，所述的砷化物溶液通过如下方法制得：取As 2O3粉末 加入到无菌去离子水中得到悬浮液，所得悬浮液滴加 NaOH溶液直至粉末完全溶解；
[0025] 所述巴西苏木素类化合物由巴西苏木素和巴西苏木红素组成，所述的巴西苏木素 类化合物的制备方法包括：
[0026] (1)以经过粉碎的苏木心材为原料，以蒸馏水或去离子水为溶剂，苏木心材与蒸馏 水或去离子水的质量比为1:2-8,在90?KKTC下提取0. 75?lh，过滤得到苏木水提液， 浓缩至苏木水提液总体积的1/6-1/20,得苏木浓缩液；将苏木浓缩液放置过夜形成结晶沉 淀，分离上层清液和沉淀A，清液中再加入用量为清液体积的3?5倍的95%乙醇，放置过 夜，离心去杂，浓缩回收乙醇，喷雾干燥，得巴西苏木红素；
[0027] (2)将沉淀A采用乙醇溶解，置于旋转蒸发器中浓缩，真空干燥，将乙醇干燥物加 入去离子水混悬，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂后，加热水溶解，过滤，取滤液，静 置，重结晶得到巴西苏木素。
[0028] 进一步，所述巴西苏木素类化合物与砷化合物的质量比以各自的制备原料（即苏 木心材与As 2O3粉末）的质量之比计大于50。本发明中，由于砷化合物具有毒性，而巴西苏 木素类化合物无毒性，因此在联合使用时，需尽量减少砷化合物的用量，在砷化合物用量一 定的情况下，增加巴西苏木素类化合物的用量是有利的。
[0029] 所述的单位制剂为常见的剂型，如注射剂、介入剂、冲剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊 齐?、微囊剂、软胶囊剂、栓剂、膜剂、膏剂、配剂、气雾剂、各种外用制剂等，优选注射剂或介入 齐U。所述的单位制剂可根据常规的制剂工艺由砷化合物或巴西苏木素类化合物及其药学上 可接受的载体分别制成。
[0030] 所述的联合用药物可用于治疗肿瘤，如淋巴瘤（具体例如人Burkitt淋巴瘤、人T 细胞淋巴瘤等）、实体肿瘤（如呼吸系统肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤、表皮组织 肿瘤等）；也可用于治疗自身免疫病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0032] 1)、本发明在配制砷化合物溶液过程中不加入盐酸，制得的砷化合物由偏亚砷酸 钠（NaAsO 2)和三氧化二砷组成，分子结构明确，而且药物疗效显著，该溶液经与中国专利 CN1370540A对比药效的结果显示，不仅对于人B淋巴瘤细胞具有抑制作用，而且对人T淋巴 瘤细胞也具有显著的抑制作用。本发明所制备的砷化合物溶液的药效好，较现有制备的砷 化合物技术更具有优势。
[0033] 2)、本发明将砷化合物、巴西苏木素类化合物合用，可以提高砷化合物疗效，控制 砷化合物剂量和相应的毒、副作用，使它的使用变得更加安全，拓展砷化合物治疗谱，尤其 在抗T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞方面表现出良好的协同作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图I-A为苏木水提液的浓缩液放置形成结晶沉淀，将形成结晶沉淀后的苏木浓缩 液分离成二部分；该图为苏木浓缩液的上层部分；
[0035] 图I-B为放置形成结晶沉淀部分的结晶，采用乙醇溶解、乙酸乙酯萃取，取萃取液 置于旋转蒸发器中浓缩，回收溶剂后，加水溶解，静置重结晶，重结晶的溶解液。
[0036] 图2为A、B两个药物对T淋巴细胞瘤jurkat细胞的凋亡作用柱形图。
[0037] 图2中分组：
[0038] 1、不加药对照；
[0039] 2、加苏木不同剂量（以苏木原料重量计算，100、200、400、800μ g / ml);
[0040] 3、加砷化合物（以As2O3剂量计算，下面相同）As 2O3不同剂量（0· 2、0· 4、0· 8、 I. 6 μ g / ml)；
[0041] 4、As2O3O. 4 μ g / ml+苏木不同剂量（100、200、400 μ g / ml);
[0042] 5、加苏木 100 μ g / ml+As203 不同剂量（0· 2、0· 4、0· 8 μ g / ml);
[0043] 6、加苏木 200 μ g / ml+As203 不同剂量（0· 2、0· 4、0· 8 μ g / ml)
[0044] 图3-1?图3-18为流式细胞仪测定砷化合物（以As2O3剂量计算μ g/ml，以下简 称A)或/和苏木（以下简称B)A、B两个药物对T淋巴细胞瘤jurkat细胞的凋亡作用的细 胞调亡图，其中：
[0045] 图3-1 :不加药对照；
[0046] 图3-2?图3-5 :分别对应加苏木不同剂量（100、200、400、800μ g / ml);
[0047] 图3-6?图3-9 :分别对应加砷化合物（以As2O3剂量计算）As2O3不同剂量（0· 2、 0· 4、0· 8、1. 6 μ g / ml);
[0048] 图 3-10-图 3-12 :分别对应 As2O3O. 4μ g / ml+ 苏木不同剂量（100、200、 400 yg/ ml)；
[0049] 图3-13?图3-15 :分别对应加苏木100μ g / ml+As203不同剂量（0. 2、0. 4、 0. 8 μ g / ml)；
[0050] 图3-16-图3-18 :分别对应加苏木200 μ g / ml+As203不同剂量（0. 2、0. 4、 0· 8 μ g / ml)。
[0051] 图 4-卜A、4-l-B、4-l-C、4-2-A、4-2-B、4-2-C、4-3-A、4-3-B、4-3-C、4-4-A、4-4-B、 4-4-C、4-5-A、4-5-B、4-5-C为砷化合物单用及合用苏木水提取液（简称A、B两个药物）对T 淋巴细胞瘤jurkat细胞线粒体的影响。其中，图号中4-X(X = 1-5)表示五个组别：图4-1 为对照组的细胞线粒体；图4-2为As2O3 0. 4 μ g/ml ;图4-3为As2O3 0. 8 μ g/ml ;图4-4为 苏木200μ g/ml ;图4-5为苏木200μ g/ml+As203 0. 4 μ g/ml ;利用荧光显微镜同时在同一 视野下拍照片，分别为常规滤光、红色荧光、绿色荧光，利用荧光显微镜对每一个样品，分别 在同一视野下拍照片，分别为常规滤光、红色荧光、绿色荧光A、B、C图三张（照片），即图号 末尾的A、B、C分别表示该样品获得的常规滤光、红色荧光、绿色荧光照片。
【具体实施方式】
[0052] 下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但应理解本发明的范围非仅限于这 些实施例的范围。
[0053] 实施例一：砷化合物溶液的制备
[0054] 精确称质量IOOOmg纯度为99. 9%的As2O3粉末倒入装有200ml无菌去离子水的 烧瓶中，As2O 3呈悬浮液，通过加热、滴加4mol/L NaOH至粉末完全溶解后，加无菌去离子水 750ml，再用0. 3mol/L NaOH调节溶液至pH至7. 3,并用无菌去离子水补足体积至IOOOml的 砷化合物溶液，浓度以投料As2O3计为lmg/ml。制备的As 2O3溶液采用过滤法（通过0. 22 μ m 的过滤器）进行除菌并储藏在消毒小瓶中。
[0055] 实施例二：巴西苏木素类化合物的制备
[0056] 1)、巴西苏木红素的制备
[0057] 将经过粉碎的中药苏木心材为原料，以蒸馏水或去离子水为溶剂，苏木与蒸馏水 或去离子水的质量比为6倍的比例，在95°C下提取Ih ;提取3次，合并提取液，采用240目 筛或滤网过滤、用中速或快速定性滤纸过滤或置于布氏漏斗上，利用真空泵对苏木提取液 进行抽滤，得到苏木水提液；将苏木水提液置于旋转蒸发器中或电炉上浓缩，浓缩至苏木提 取液的总体积1/15,得苏木浓缩液；浓缩液放置过夜形成结晶沉淀，分离上层苏木浓缩液 和结晶沉淀A，再加入上层苏木浓缩液体积的4倍体积的95%乙醇，放置过夜，离心去杂，转 速为2500 - 3500r/min，20min，再置于旋转蒸发器中浓缩、回收乙醇，将上层苏木浓缩液置 于160-180°C下喷雾干燥，得巴西苏木红素粉末，其化学成分为以巴西苏木红素为主的巴西 苏木素类化合物，多酚含量6. 8?7. 9 %。
[0058] 2)、巴西苏木素的制备
[0059] 将结晶沉淀A采用乙醇溶解、置于旋转蒸发器中浓缩，真空干燥，将乙醇干燥物加 入去离子水混悬，乙酸乙酯萃取，取萃取液浓缩回收溶剂后，加热水溶解，置于抽滤器上过 滤除去杂质，取出滤液，静置重结晶，干燥即得巴西苏木素粉末，其化学成分以巴西苏木素 为主的巴西苏木素类化合物，多酚含量1?2%。
[0060] 实施例三：采用实施例一制备的砷化合物与实施例二步骤1)制备的苏木水提液 (由于水提液中组分即为所述的巴西苏木素类化合物，故以该苏木水提液来进行体外实 验）诱导肿瘤细胞凋亡作用进行体外实验。
[0061] 1、试验材料
[0062] 1)细胞株：从T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞、B淋巴瘤细胞株Daudi细胞、肝癌细胞 HEPG2三种细胞株中选出T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞进行实验。
[0063] 2)药物：砷化合物（配制方法为：由实施例1制得的砷化合物溶液，先用去离子水 稀释到80 μ g/ml，再用1640培养液稀释到所需浓度）；实施例二步骤1)制得的苏木水提取 液（用1640培养液稀释到所需浓度）。
[0064] 2、实验方法及步骤
[0065] 1)细胞培养
[0066] 接种处于指数生长的人T淋巴细胞瘤株jurkat细胞于24孔板培养，每孔接种为 lml，细胞密度为2 X IO5Ail置于37°C、5% CO2培养箱中培养，进行药效实验。（药效实验分 组见表2)药物作用24、48、72h，分别取细胞悬液经0. 4%台盼蓝液染色作存活细胞、死亡细 胞计数。
[0067] 实验经砷化合物、苏木水提取液的不同浓度，分别对3种肿瘤细胞（T淋巴瘤细胞 株Jurkat细胞、B淋巴瘤细胞株Daudi细胞、肝癌细胞HEPG2)进行细胞毒作用实验。在实 验选定的砷化合物、苏木水提取液的不同剂量下单用与合用在3种细胞中分别有效，同时， 比较了 3种肿瘤细胞对砷化合物、苏木水提取液的敏感性，从中选择了对砷化合物、苏木水 提取液的药效相对不敏感的T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞作为主要药效学实验。进行了砷 化合物（简称A)、苏木水提取液（简称B)A、B两个药物对T淋巴细胞Jurkat细胞毒作用 体外实验；
[0068] 2)药效分组
[0069] 1、不加药对照；2、加苏木不同剂量（以苏木原料重量计算100、200、400、 800 yg/ ml)；
[0070] 3、加砷化合物（以As2O3剂量计算，下面相同）As 2O3不同剂量（0· 2、0· 4、0· 8、 I. 6 μ g / ml)；
[0071] 4、As2O3O. 4 μ g / ml+苏木不同剂量（100、200、400 μ g / ml);
[0072] 5、加苏木 100 μ g / ml+As203 不同剂量（0· 2、0· 4、0· 8 μ g / ml);
[0073] 6、加苏木 200 μ g / ml+As203 不同剂量（0· 2、0· 4、0· 8 μ g / ml)
[0074] 3)实验指标测定
[0075] ① AnnexinV/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡
[0076] 取处于对数生长期的人T淋巴细胞瘤株jurkat细胞接种于6孔板，每孔接种为 3ml，细胞密度为2x 105/ml，置于37°C、5% CO2培养箱中培养，（药效分组同前）培养44h 后，分别取jurkat细胞I X IO6个/ml的实验组与对照组的细胞，用PBS洗2次，1000r/min， 5min，弃上清液，在每100 μ 1细胞悬液中加入AnnexinV/PI试剂双染色（操作按试剂盒方 法）制备完实验样品，进行流式细胞仪对AnnexinV/PI双染色细胞检测。
[0077] 3、实验结果
[0078] 表1、流式细胞仪测定两个药物对T淋巴细胞瘤jurkat的抑制作用
[0079]
【权利要求】
1. 一种砷化合物溶液与巴西苏木素类化合物在制备治疗肿瘤的联合用药物中的应用， 其特征在于：所述的砷化合物溶液通过如下方法制得：取As 203粉末加入到无菌去离子水中 得到悬浮液，所得悬浮液滴加 NaOH溶液直至粉末完全溶解； 所述巴西苏木素类化合物由巴西苏木素和巴西苏木红素组成，所述的巴西苏木素类化 合物的制备方法包括： (1) 以经过粉碎的苏木心材为原料，以蒸馏水或去离子水为溶剂，苏木心材与蒸馏水或 去离子水的质量比为1:2?8,在90?100°C下提取0. 75?lh，过滤得到苏木水提液，浓缩 至苏木水提液总体积的1/6?1/20,得苏木浓缩液；将苏木浓缩液放置过夜形成结晶沉淀， 分离上层清液和沉淀A，清液中再加入用量为清液体积的3?5倍的95 %乙醇，放置过夜， 离心去杂，浓缩回收乙醇，喷雾干燥，得巴西苏木红素； (2) 将沉淀A采用乙醇溶解，置于旋转蒸发器中浓缩，真空干燥，将乙醇干燥物加入去 离子水混悬，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂后，加热水溶解，过滤，取滤液，静置，重 结晶得到巴西苏木素。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述巴西苏木素类化合物与砷化合物的质 量比以各自的制备原料苏木心材与As20 3粉末的质量之比计为大于50。
3. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述砷化合物溶液的制备过程中不使 用盐酸。
4. 一种用于治疗肿瘤的联合用药物，其特征在于：所述联合用药物由砷化合物溶液与 巴西苏木素类化合物的不同规格的单位制剂组成，所述的砷化物溶液通过如下方法制得： 取As 203粉末加入到无菌去离子水中得到悬浮液，所得悬浮液滴加 NaOH溶液直至粉末完全 溶解； 所述巴西苏木素类化合物由巴西苏木素和巴西苏木红素组成，所述的巴西苏木素类化 合物的制备方法包括： (1) 以经过粉碎的苏木心材为原料，以蒸馏水或去离子水为溶剂，苏木心材与蒸馏水或 去离子水的质量比为1:2-8,在90?100°C下提取0. 75?lh，过滤得到苏木水提液，浓缩至 苏木水提液总体积的1/6-1/20,得苏木浓缩液；将苏木浓缩液放置过夜形成结晶沉淀，分 离上层清液和沉淀A，清液中再加入用量为清液体积的3?5倍的95%乙醇，放置过夜，离 心去杂，浓缩回收乙醇，喷雾干燥，得巴西苏木红素； (2) 将沉淀A采用乙醇溶解，置于旋转蒸发器中浓缩，真空干燥，将乙醇干燥物加入去 离子水混悬，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂后，加热水溶解，过滤，取滤液，静置，重 结晶得到巴西苏木素。
5. 如权利要求4所述的联合用药物，其特征在于：所述巴西苏木素类化合物与砷化合 物的质量比以各自的制备原料苏木心材与As20 3粉末的质量之比计为大于50。
6. 如权利要求4或5所述的联合用药物，其特征在于：所述砷化合物溶液的制备过程 中不使用盐酸。
【文档编号】A61K31/352GK104274489SQ201410246755
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2013年6月5日
【发明者】楼兰花 申请人:楼兰花