5-羟色胺2受体拮抗剂用于改善胰岛素抵抗的用途
【专利摘要】本发明涉及医药领域，具体涉及5-羟色胺2受体拮抗剂用于改善胰岛素抵抗的用途，它可以通过改善胰岛素抵抗，从而用于治疗2型糖尿病或代谢综合征。
【专利说明】5-羟色胺2受体拮抗剂用于改善胰岛素抵抗的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药领域，具体涉及5-羟色胺2受体拮抗剂，通过改善胰岛素抵抗，从而治疗2型糖尿病或代谢综合征的用途。
【背景技术】
[0002]胰岛素抵抗(Insulin resistance, IR)是指“各种原因使胰岛素促进细胞摄取和利用葡萄糖的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定”这种现象。一个具有正常代谢的人，胰岛素是在进食后由胰腺内的胰岛β细胞分泌的，它传递信号给体内的胰岛素感应组织，使细胞膜表面产生葡萄糖转运体(Glucosetransporter, GLUT)吸收葡萄糖从而降低血糖浓度。IR的主要发生组织为肝脏、脂肪组织和骨骼肌。细胞发生IR时，正常水平的胰岛素无法诱导这些细胞产生足够的GLUT，从而完成正常的葡萄糖吸收功能。为了对此进行补偿，胰岛需释放更多的胰岛素，以使足够的细胞GLUT被激发来吸收葡萄糖。因此IR的主要原因是“细胞对胰岛素的敏感性降低，胰岛素诱导细胞内GLUT转运到细胞膜上从而增加葡萄糖吸收的能力下降”。其病变的本质是细胞内的，某种原因使细胞GLUT表达能力下降，GLUT基因或蛋白表达下降，从而降低了细胞在胰岛素刺激下吸收利用葡萄糖的能力，从而出现IR。
[0003]多种原因可导致IR，如肥胖、长期高血糖、高游离脂肪酸血症、高糖皮质素血症、妊娠和体内胰岛素拮抗激素增多等。但公认的，肥胖是导致IR最主要的原因，尤其是向中性肥胖；而高糖皮质素血症、高游离脂肪酸血症可能是肥胖导致IR的直接原因。与IR直接相关的疾病主要有两种:2型糖尿病(Diabetes mellitus type2, DM-1I)和代谢综合征(metabolic syndrome, MS) ?DM-1I占糖尿病患者90%以上,病人的主要表现就是肥胖和IR,机体胰岛素相对缺乏，只有病情恶化、后期的DM-1I病人才因为胰岛被破坏出现胰岛素的绝对缺乏。MS为多种代谢成分异常聚集的病理状态，是一组复杂的代谢紊乱症候群，是导致糖尿病、心脑血管疾病(动脉粥样硬化、中风、冠心病)的危险因素，目前认为其集簇发生的核心是IR。临床上，诊断MS的主要标准有:腹型肥胖(即向中性肥胖)、IR、高脂血症(高甘油三酯血症、高低密度脂蛋白及低高密度脂蛋白血症)。因此，改善机体对胰岛素的敏感性，降低IR成为治疗DM-11、MS的首选。双胍类(如二甲双胍)和噻唑烷二酮类(如罗格列酮和吡格列酮)是临床常用的增加胰岛素敏感性、改善IR的药物。
[0004]实验室及临床检测IR的主要方法有以下几种:
[0005]1.HOMA-1R指数HOMA-1R指数全称为“稳态模型胰岛素抵抗指数”，这是衡量机体IR最常用的方法，方法简单、结论可靠。测量空腹血糖和空腹胰岛素浓度，计算HOMA-1R指数(H0MA-1R =空腹血糖X空腹胰岛素+22.5)，实验时通过与正常对照组比较来确定IR ；
[0006]I1.尿糖量测定如果血糖浓度足够高(超过肾糖阈)，可在尿液中检测到葡萄糖(这是糖尿病名称的来由)。单位时间内人或动物排出的尿液中葡萄糖含量的多少，可反映IR及糖尿病的严重程度，尿糖量越高表明IR及糖尿病越严重。
[0007]II1.糖耐量试验给空腹(禁食12小时以上)病人或动物口服葡萄糖，或动物腹腔注射葡萄糖，测量给葡萄糖后一段时间内(2小时左右)血糖浓度的变化，来检测机体对葡萄糖的利用效率。IR衡量指标:血糖浓度变化曲线，血糖浓度曲线下面积(AUC)。IR时，给葡萄糖后一段时间内血糖浓度比正常值偏高，AUC明显增大，表明出现明显糖耐量异常；
[0008]IV.胰岛素敏感性试验实验室常用。动物禁食后腹腔注射胰岛素，测量给胰岛素后一段时间内(2小时左右)血糖浓度的变化，来检测机体对胰岛素的敏感性。IR衡量指标:血糖浓度变化曲线，血糖浓度曲线下面积(AUC)。IR时，给胰岛素后血糖浓度的降低程度减小，AUC明显增大，表明机体对胰岛素的敏感性明显降低。
[0009]IR实际上是细胞代谢紊乱的一种表现。IR时，机体细胞的糖代谢、脂代谢都出现紊乱，尤其在脂肪细胞、肝细胞和骨骼肌细胞，这种能量代谢的紊乱特别明显，导致脂肪细胞分泌一些激素样因子紊乱(如瘦素、抵抗素分泌增加，脂联素分泌减少)，肝细胞脂质沉积、炎症因子产生增加等，骨骼肌细胞对葡萄糖的利用效率降低等。但导致IR的本质原因目前是不清楚的，虽然发现糖皮质素、游离脂肪酸、一些炎症因子(如肿瘤坏死因子α)可直接导致细胞产生IR、抑制GLUT的细胞内表达，但它们是通过什么途径、怎样改变细胞内的代谢通路及信号通路从而导致IR的？是否存在一种共同的作用特点？目前并未弄清。我们的研究发现，糖皮质素、游离脂肪酸导致IR时存在共同的作用特点:引起肝细胞、脂肪细胞及骨骼肌细胞5-羟色胺合成或受体表达发生改变；通过逆转细胞的5-HT系统改变能够阻断这些因素导致的IR。
[0010]5-HT受体(5-HT receptor, 5-HTR)存在于细胞膜上，属于膜受体，5-HT受体亚型复杂，现已发现有7大类受体存在，即5-肌1_71?，5-!11'1，4，51?主要分布在中枢，5-!11'2，3，6，71?主要分布在外周。这7类受体又被进一步分为若干个亚型。5-肌21?可被分为5-HT2AR、5-HT2BR和5-HT2CR0外周和中 枢均有分布的是5-HT2A，2BR，5-HT2eR主要存在于中枢神经系统，肝脏、骨骼肌、内脏脂肪组织分布有5-HT2A，2BR。具有选择性阻断5-HT2R的药物不多，已知沙格雷酯(Sarpogrelate, SAR)、酮舍林(ketanserin, KET)属于选择性5_HT2R拮抗剂。临床应用中，SAR可抑制由5-HT增强的血小板凝集及抑制血管收缩作用等，临床用于改善慢性动脉闭塞症所引起的溃疡、疼痛以及冷感等缺血性诸症状。虽然临床有SAR治疗糖尿病性并发症下肢动脉硬化闭塞症的报导，但没有可以改善IR的研究报导；KET对5-HT2AR的敏感性高于5-HT2BR，可拮抗5-HT2AR引起的血管收缩、支气管和血小板聚集，临床应用于轻、中度或严重高血压，亦能用于控制急性高血压发作，如手术前、后以及产妇的子痫前期，亦可用于充血性心力衰竭、雷诺病等。总的来看，目前5-HT2受体拮抗剂的临床应用面较窄，且5-HT2R拮抗剂没有用于改善IR、治疗MD-1I或MS的研究报导。
【发明内容】
[0011]本发明公开了 5-羟色胺2受体拮抗剂用于改善胰岛素抵抗的用途，进而其可用于治疗2型糖尿病或代谢综合征。
[0012]我们在研究中发现:
[0013]1、体外培养肝细胞用地塞米松(DEX)或油酸(OA)刺激建立胰岛素抵抗(IR)细胞模型，或动物实验用DEX刺激建立IR动物模型时，肝细胞、脂肪细胞及骨骼肌细胞的5-HT2A；2B受体表达均被明显上调，并同步地出现IR症状。
[0014]2、体外细胞培养实验时，用DEX或OA刺激建立肝细胞IR模型，5_HT2R阻断剂(SAR、KET)均可明显抑制DEX或OA导致的GLUT基因表达被下调，提示DEX或OA刺激导致的细胞对胰岛素敏感性的下降可被5-HT2R阻断剂逆转。
[0015]3、动物实验研究时，用DEX建立IR动物模型，SAR或KET进行治疗，结果表明，DEX导致的IR(高血糖、高血胰岛素浓度，糖耐量异常，机体对胰岛素敏感性降低，肝脏、内脏脂肪和骨骼肌GLUT基因表达明显下调)被明显逆转，表现为:血糖、血胰岛素浓度降低，糖耐量异常改善，机体对胰岛素的敏感性升高，肝脏、内脏脂肪和骨骼肌GLUT基因表达明显上调，机体IR状态明显改善。
[0016]综上所述，5-羟色胺2受体拮抗剂具有改善胰岛素抵抗的功效，可用于因胰岛素抵抗引起的2型糖尿病或代谢综合征。
[0017]所述的5-羟色胺2受体拮抗剂优选沙格雷酯或酮舍林。
[0018]下面是本发明的部分药效学实验及结果:
[0019]1.肝细胞体外细胞培养研究
[0020]“肝细胞5-HT2A，2B受体基因表达、GLUT基因表达，在DEX或OA刺激时的改变；及阻断5-HT2A，2B受体(5-HT2A，2BR)时对DEX或OA导致的IR的改善作用”研究结果。
[0021]1.1实验方法
[0022](I)细胞培养
[0023]大鼠BRL-3A肝细胞株体外培养，实验在细胞传代之10_20代时完成。细胞培养在37°C、含5% C02的培养箱中，用含10%胎牛血清的PRM1-1640培养基培养，并用青霉素/莲霉素联合抗菌。细胞接种浓度5 X 105个/瓶，培养24小时后待细胞增殖达到70-80%瓶底面积时可进行给药。分别用地塞米松(DEX)或油酸(OA)刺激建立IR细胞模型。DEX刺激IR模型给药分组:对照组一正常培养基培养，DEX刺激模型组一培养基中加入30 μ M/LDEX, SAR治疗组一培养基中加入30 μ M/L DEX及25 μ M/L SAR, KET治疗组一培养基中加Λ 30 μ M/L DEX及25 μ M/L KET ；0A刺激IR模型给药分组:对照组一正常培养基培养，OA刺激模型组一培养基中加入200 μ M/L 0A, SAR治疗组一培养基中加入200 μ M/L OA及25 μ M/L SAR, KET治疗组一培养基中加入200 μ M/L OA及25 μ M/L KET0所有实验组培养48小时后用裂解液裂解细胞，所得溶液可进行进一步实验，用于细胞内物质含量检测及PCR试验。
[0024](2)给药剂量
[0025]地塞米松(DEX)—30 μ M/L
[0026]沙格雷酯(SAR)—25 μ M/L
[0027]酮舍林(KET)—25 μ M/L
[0028]油酸(OA)—200 μ M/L
[0029]1.2实验指标检测方法
[0030]肝细胞相关因子基因表达:逆转录PCR技术检测5-HT2A，2B受体(5-HT2AR，5-HT2BR)、GLUT2基因(mRNA)表达。其中，肝细胞GLUT为GLUT2。引物:
[0031 ] 5-HT2AR 上游引物 5’ GGATTTACCTGGATGTGC3’
[0032]下游引物5’ TGGATGGACCGTTGGAAG3’
[0033]5-HT2BR 上游引物 5’ CAGCAGCAGAGGAAATGA3’
[0034]下游引物5’ ATCCAGGGAAATGGCACA3’
[0035]GLUT2 上游引物 5’GGTGTTGCTGGATAAGTTCA3’[0036]下游引物5’ AGGATTCGAGTTAAGAGGGA3’
[0037]内参 GAPDH 上游引物 5’ TATCGGACGCCTGGTTAC3’
[0038]下游引物5，TGCTGACAATCTTGAGGGA3，；
[0039]1.3实验结果
[0040]所有数据统计学检测用组间Student-t检测，p〈0.05表示有明显统计学差异，p〈0.01表示有非常明显统计学差异。下列所有图表中数据用均值土标准差士 80>表
示，N = 3 ;*ρ〈0.05，**ρ〈0.01与对照组比较；$ρ<0.05，$$ρ〈0.01与模型组比较。
[0041](I)DEX刺激或OA刺激导致肝细胞IR时5-ΗΤ2Α，2BR基因表达也明显上调
[0042]结果见图1。可见，正常肝细胞存在5-ΗΤ2Α，2BR基因表达；DEX刺激或OA刺激后，肝细胞5-HT2A，2BR基因表达被上调。
[0043](2)阻断5-HT2A，2BR可明显改善DEX或OA导致的肝细胞IR
[0044]结果见图2、图3。用SAR或KET阻断5-HT2A，2BR,以达到抑制5-HT2A，2BR功能的目的，结果可见，阻断5-HT2A，2BR，可明显逆转DEX或OA刺激导致的肝细胞GLUT2基因表达下调。提示，肝细胞5-HT2A，2BR表达上调是DEX或OA导致肝细胞GLUT2基因表达下调(即导致IR)时的共同特点，通过阻断5-HT2A，2B受体，可改善DEX或OA导致的肝细胞IR。
[0045]2.动物实验研究
[0046]“用SAR、或KET阻断5-HT2A，2BR,对DEX导致的大鼠糖尿病模型IR的改善作用及明显的降血糖、增加机体胰岛素敏感性效应”研究结果。
[0047]2.1实验方法
[0048](I)动物处理
[0049]24只雄性Wistar大鼠随机分为7组(每组6只):对照组(control group)一皮下注射(s.c.)生理盐水(NS)0.50ml/kg/次，并经口给药(p.ο.)0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液 5ml/kg/ 次；IR模型组一s.c.DEX0.75mg/kg/ 次，并同时 p.0.CMC_Na5ml/kg/次；IR 模型 SAR 治疗组—s.c.DEX0.75mg/kg/ 次，同时 p.0.SAR30mg/kg/ 次；IR 模型 KET 治疗组一s.c.DEX0.75mg/kg/ 次，同时 p.0.KET4mg/kg/ 次。s.c.药物用 NS 溶解，p.ο.药物用0.5% CMC-Na混悬；各给药组s.c.给药容积为0.5ml/kg/次，p.ο.给药容积为5ml/kg/次，每天上下午各给药一次。动物笼养于普通鼠笼，保持室温24±2°C、光照控制保证12h明、暗条件，普通水喂养，连续给药20天。
[0050](2)给药剂量
[0051]地塞米松(DEX)—0.75mg/kg/次，一天两次
[0052]沙格雷酯(SAR)—30mg/kg/次,一天两次
[0053]酮舍林(KET)—4mg/kg/次,一天两次
[0054](3) HOMA-1R 指数计算
[0055]连续给药第20天，各组动物首先禁食(不禁水)12小时，然后取血，测血清空腹血糖、空腹胰岛素浓度，计算HOMA-1R指数(H0MA-1R =空腹血糖X空腹胰岛素+22.5)。
[0056](4)糖耐量试验
[0057]连 续给药15天后，动物禁食12小时，经尾尖端处血血糖试纸法检测血糖，腹腔注射(1.P.)葡萄糖(2.0g/kg)行糖耐量试验，检测1.p.葡萄糖前及后30min, 60min, 90min, 150min的血糖浓度。结果作图并计算曲线下面积(AUC),以衡量动物的糖耐量。
[0058](5)胰岛素敏感性试验
[0059]连续给药18天后，动物禁食12小时，经尾尖端处血血糖试纸法检测血糖，1.P.胰岛素(0.5U/kg)行胰岛素敏感性试验,检测1.p.胰岛素前及后30min, 60min, 90min, 150min的血糖浓度。结果作图并计算曲线下面积(AUC)，以衡量动物胰岛素敏感。
[0060](6)尿糖含量检测
[0061]连续给药第20天，最后一次给药前禁食约7小时，然后各组按要求分别给以DEX及相应药物，给药后迅速将动物放入代谢笼中，自由饮水，收集给药后5小时内尿量，测量尿液中葡萄糖浓度，计算5小时尿液中葡萄糖含量。
[0062]连续给药20天后动物禁食12小时，麻醉，取血、取肝脏、取内脏脂肪组织及取大腿部骨骼肌，以检测血清及组织相关生化指标。
[0063]2.2实验指标检测方法
[0064](I)血清及组织生化指标检测
[0065]ELISA法检测血清 、肝脏、脂肪组织5-HT水平，ELISA法检测血清胰岛素浓度，分光光度法检测血糖浓度、尿糖含量。
[0066](2) GLUT2、GLUT4、5-HT2A, 2B 受体基因表达检测
[0067]肝脏、脂肪组织及骨骼肌相关因子基因表达:逆转录PCR技术检测GLUT2、GLUT4基因(mRNA)表达。其中，GLUT2存在于肝细胞，GLUT4存在于脂肪细胞及骨骼肌。5-HT2AR、5-HT2BR、GLUT2、内参GAPDH引物同细胞实验，GLUT4引物如下:
[0068]GLUT4 上游引物 5’ TCCAGGATGAAGGAAACAGC3’
[0069]下游引物5’ GCGAGGCAAGGCTAGAITTT3’。
[0070]2.3实验结果
[0071]所有数据统计学检测用组间Student-t检测，p〈0.05表示有明显统计学差异，p〈0.01表示有非常明显统计学差异。下列所有图表中数据用均值土标准差SD)表
示，N = 6 ;*ρ〈0.05，**ρ〈0.01与对照组比较；$ρ<0.05，$$ρ〈0.01与模型组比较。
[0072](I) DEX致大鼠IR模型中，肝脏、内脏脂肪及骨骼肌5-ΗΤ2Α，2BR基因表达的改变
[0073]结果见图4。正常大鼠肝脏、内脏脂肪及骨骼肌存在5-ΗΤ2Α，2BR基因表达；在DEX导致大鼠糖尿病时，三种组织5-ΗΤ2Α，2BR基因表达明显上调。
[0074](3)抑制5-ΗΤ合成或阻断5-ΗΤ2Α，2BR，对DEX致大鼠糖尿病模型肝脏、内脏脂肪及骨骼肌GLUT基因表达的影响
[0075]结果见图5。在DEX致大鼠IR模型中，肝脏GLUT2，内脏脂肪及骨骼肌GLUT4基因表达明显下调；用5-HT2A，2BR阻断剂SAR或KET进行治疗，可明显抑制DEX导致的GLUT2、GLUT4基因表达下调，提示三种组织对胰岛素的敏感性明显提高。
[0076](4)糖耐试验，胰岛素敏感性试验，血糖、血胰岛素浓度及HOMA-1R指数检测结果
[0077]结果见图6、图7、图8。糖耐量试验及胰岛素敏感性试验结果均表明DEX可导致动物出现明显的IR。糖耐量试验中，腹腔注射葡萄糖后150min内，DEX导致的IR模型组血糖浓度明显高于对照组，血糖浓度曲线下面积(AUC)明显大于对照组，提示出现糖耐量异常；胰岛素敏感性试验中，腹腔注射胰岛素150min内，IR模型组血糖浓度的下降明显小于对照组，AUC明显大于对照组，提示胰岛素敏感性明显降低，阻断5-HT2A，2BR—用SAR或KET，可明显改善DEX导致的糖耐量异常，及提高胰岛素敏感性。
[0078]空腹血糖、血胰岛素浓度检测结果及HOMA-1R指数计算结果，与糖耐量试验及胰岛素敏感性试验结果完全一致。表明DEX导致IR、升高血糖及胰岛素浓度，而阻断5-HT2A, 2BR可明显改善IR、降低血糖及胰岛素浓度。
[0079](5)尿糖含量检测结果
[0080]各试验组最后一次给以DEX，及用5-HT2R阻断剂SAR、KET治疗后，5小时内尿糖含量检测结果见图9。可见，DEX处理IR模型组出现明显的尿糖，而各药物治疗组尿糖含量明显降低。结果提示，用5-HT2R阻断剂进行治疗，均可明显降低糖尿病大鼠的尿糖量，表明可治疗糖尿病。
[0081]结果表明，阻断5-HT2A，2BR，可明显改善IR，从而治疗以出现IR为主要特征的2型糖尿病、代谢综合征等疾病。阻断5-HT2A，2BR的改善IR作用，与抑制5-HT2A，2BR功能相关，其直接的作用可能也是与上调肝细胞GLUT2表达及上调内脏脂肪、骨骼肌GLUT4表达相关。
【专利附图】
【附图说明】
[0082]图1是DEX或OA对体外培养肝细胞5-HT2AR、5_HT2BR基因表达的影响
[0083]图2是DEX处理对体外培养肝细胞GLUT2基因表达的抑制作用，及同时用SAR、KET处理时DEX对GLUT2基因表达的抑制作用
[0084]图3是OA处理对体外培养肝细胞GLUT2基因表达的抑制作用，及同时用SAR、KET处理时OA对GLUT2基因表达的抑制作用
[0085]图4是大鼠连续给DEX20天后肝脏、脂肪组织、骨骼肌5-HT2AR、5_HT2BR基因表达
[0086]图5是大鼠连续给DEX20天后肝脏GLUT2、脂肪组织及骨骼肌GLUT4基因表达，以及用5-HT2受体阻断剂治疗后GLUT基因表达
[0087]图6是大鼠连续给DEX15天后，以及用5_HT2受体阻断剂治疗后糖耐量试验
[0088]图7是大鼠连续给DEX18天后，以及用5_肌2受体阻断剂治疗后胰岛素敏感性试验
[0089]图8是大鼠连续给DEX20天后，以及用5_HT2受体阻断剂治疗后空腹血糖浓度(A)、空腹胰岛素浓度⑶及HOMA-1R指数(C)
[0090] 图9是大鼠连续给DEX20天及用5_HT2受体阻断剂治疗后，最后一次给以DEX及药物后5小时内尿糖含量。
【权利要求】
1.5-羟色胺2受体拮抗剂用于制备预防或治疗胰岛素抵抗引起的疾病的药物的用途。
2.权利要求1的用途，其中5-羟色胺2受体拮抗剂是沙格雷酯或酮舍林。
3.权利要求1的用 途，其中胰岛素抵抗引起的疾病是2型糖尿病或代谢综合征。
【文档编号】A61K31/517GK104000810SQ201410270769
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】傅继华, 林闽, 王珊珊, 韩颖, 郭可可, 李涛, 曲伟 申请人:中国药科大学