一种肿瘤血管阻断剂多肽、基因、表达载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种肿瘤血管阻断剂多肽，编码其的基因，表达其的表达载体以及其在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。本发明的肿瘤血管阻断剂多肽从N端到C端依次包含：截断的组织因子tTF的氨基酸序列、连接子和肿瘤靶向分子pHLIP的氨基酸序列。本发明的肿瘤血管阻断剂多肽能够通过pHLIP定位到肿瘤血管内皮细胞表面，从而特异的在肿瘤血管产生血栓，阻断肿瘤部位血液供应，达到治疗肿瘤的目的；并且，由于其活性域(tTF)具有接近其天然的结构，因此与现有技术的肿瘤靶向肽介导组织因子相比具有更好的凝血活性。
【专利说明】一种肿瘤血管阻断剂多肽、基因、表达载体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤治疗的药物【技术领域】，尤其涉及一种肿瘤血管阻断剂多肽、基因、 表达载体及其应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤血管是肿瘤细胞获取营养物质及排除代谢产物的通道，也是肿瘤细胞逃逸、 转移的重要途径之一，其形态学和功能都有别于机体的正常血管系统，因而是肿瘤靶向治 疗的关键靶点之一。肿瘤血管靶向治疗主要包括两种模式：抑制新生血管生成和阻断已有 肿瘤血管。其中阻断肿瘤已有血管疗法主要是通过选择性的破坏肿瘤已有的血管，切断肿 瘤血供，诱发肿瘤细胞发生缺血性坏死，从而达到治疗肿瘤的目的。因此，如何实现特异的 阻断肿瘤部位的血管，而对机体正常组织血管没有影响，成为研究的热点。
[0003] 组织因子（TF)是一个分子量约为47kDa的跨膜糖蛋白，在血栓形成过程中起重要 的作用。正常情况下，组织因子位于血管壁外膜细胞，不存在于循环中或不与循环血液接 触。当血管壁的完整性遭到破坏时，组织因子就会暴露于循环血液，通过激活凝固级联反应 发挥止血作用。组织因子由263个氨基酸残基组成，其中氨基端的219个氨基酸残基位于 细胞膜外，是组织因子的活性部位。研究表明，当该区域处于游离状态时，并没有凝血活性； 但当它被锚定在细胞膜上，并暴漏于血液中时，则会产生类似于全长因子的凝血活性，因此 该段序列被称之为截断的组织因子（tTF)。
[0004] 肿瘤靶向分子pHLIP是一种由35个氨基酸构成的多肽。当其在体内（pH = 7. 35-7. 45)循环时，处于自由伸展状态，并不能锚定于特定组织；但当其到达肿瘤（pH < 7)部位时，则会产生酸响应的构象变化，形成α-螺旋结构，并与细胞膜发生相互作用， 插入细胞膜中从而锚定于内皮细胞表面。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提出一种肿瘤血管阻断剂多肽，编码其的基因，表达其的表达 载体以及其在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用；本发明的肿瘤血管阻断剂多肽的活性 域--截断的组织因子tTF具有更接近天然的结构，因此具有更好的凝血活性，可以更有效 地发挥肿瘤血管阻断作用。
[0006] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 第一方面，本发明提供了一种肿瘤血管阻断剂多肽，该肿瘤血管阻断剂多肽从N 端到C端依次包含：截断的组织因子tTF的氨基酸序列、连接子和肿瘤靶向分子pHLIP的氨 基酸序列。
[0008] 作为优选，所述截断的组织因子tTF的氨基酸序列如SEQ ID N0 :2所示；SEQ ID N0 : 2所示的氨基酸序列（从N端到C端）如下：
[0009] SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQ TYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDV FGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE。
[0010] SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列即为组织因子位于细胞膜外的氨基酸残基序列，当 其处于游离状态时，没有凝血活性；当其通过靶向肽定位于肿瘤血管内皮细胞膜上时，则会 发挥组织因子的功能，激活凝血途径，诱发血栓形成。
[0011] 优选地，所述肿瘤靶向分子pHLIP的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示；SEQ ID N0 : 4所示的氨基酸序列（从N端到C端）如下：
[0012] AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTo
[0013] 所述肿瘤靶向分子pHLIP在肿瘤部位的微酸性环境中能够产生构象变化，形成 α -螺旋结构，并穿过细胞膜，从而定位于肿瘤血管内皮细胞膜。
[0014] 作为优选，所述连接子由4-8个、优选4-6个、更优选5个氨基酸构成；
[0015] 进一步优选地，所述连接子具有如SEQ ID Ν0:3所示的氨基酸序列。SEQ ID Ν0 :3 所示的氨基酸序列（从N端到C端）如下：GGGGS。
[0016] 所述连接子能够使表达得到的融合蛋白活性域（即截断的组织因子tTF)和靶向 域（即肿瘤靶向分子pHLIP)的功能保持完整。
[0017] 更进一步优选地，所述肿瘤血管阻断剂多肽具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序 列；SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列（从N端到C端）如下：
[0018] SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQ TYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDV FGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREGGGG SAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTo
[0019] 本发明所述肿瘤血管阻断剂多肽，能够响应肿瘤微酸性的特点，产生构象变化，形 成α -螺旋结构，从而定位于肿瘤血管内皮细胞，并激活活性域一tTF的凝血活性，从而 能够特异地在肿瘤血管形成血栓，达到抑制肿瘤生长的治疗目的；而在正常生理pH环境 中，其靶向域不能形成α -螺旋结构，不具有穿膜功能，因此不能将活性域定位于细胞上， 使得活性域不能发挥凝血活性，从而保证该药物分子在体内循环时，不会在正常部位血管 形成血栓，避免副作用的产生。
[0020] 第二方面，本发明提供了一种肿瘤血管阻断剂基因，其编码如第一方面任一项所 述的肿瘤血管阻断剂多肽。
[0021] 本领域的技术人员应理解，由于密码子的简并性，本发明编码所述肿瘤血管阻断 剂多肽的核苷酸序列并不唯一，任何能够编码并表达所述肿瘤血管阻断剂多肽的核苷酸序 列都应当理解为本发明的肿瘤血管阻断剂基因。
[0022] 虽然如此，本发明仍然提供了一种肿瘤血管阻断剂基因，所述肿瘤血管阻断剂基 因具有如SEQ ID Ν0:5所示的核苷酸序列；SEQ ID Ν0 :5所示的核苷酸序列（从5'端到3' 端）如下：
[0023] TCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATTTAACTTGGAAATCAACTAATTTCAAGACAATTTTG GAGTGGGAACCCAAACCCGTCAATCAAGTCTACACTGTTCAAATAAGCACTAAGTCAGGAGATTGGAAAAGCAAATG CTTTTACACAACAGACACAGAGTGTGACCTCACCGACGAGATTGTGAAGGATGTGAAGCAGACGTACTTGGCACGGG TCTTCTCCTACCCGGCAGGGAATGTGGAGAGCACCGGTTCTGCTGGGGAGCCTCTGTATGAGAACTCCCCAGAGTTC ACACCTTACCTGGAGACAAACCTCGGACAGCCAACAATTCAGAGTTTTGAACAGGTGGGAACAAAAGTGAATGTGAC CGTAGAAGATGAACGGACTTTAGTCAGAAGGAACAACACTTTCCTAAGCCTCCGGGATGTTTTTGGCAAGGACTTAA TTTATACACTTTATTATTGGAAATCTTCAAGTTCAGGAAAGAAAACAGCCAAAACAAACACTAATGAGTTTTTGATT GATGTGGATAAAGGAGAAAACTACTGTTTCAGTGTTCAAGCAGTGATTCCCTCCCGAACAGTTAACCGGAAGAGTAC AGACAGCCCGGTAGAGTGTATGGGCCAGGAGAAAGGGGAATTCAGAGAAGGTGGTGGTGGTTCTGCTGAACAGAACC CGATCTACTGGGCTC GTTACGCTGACTGGCTGTTCACCACCCCGCTGCTGCTGCTGGACCTGGCTCTGCTGGTTGAC GCTGACGAAGGTACC。
[0024] 第三方面，本发明提供了一种肿瘤血管阻断剂表达载体，其包含如第二方面所述 的肿瘤血管阻断剂基因。
[0025] 本领域的技术人员应理解，本发明对表达载体所采用的载体质粒并没有特别限 制，因为本领域的技术人员在得知本发明的基因序列的基础上，结合本领域技术人员的公 知常识能够选择合适的载体质粒用于本发明的基因表达。
[0026] 虽然如此，本发明特别提供一种载体质粒，其为常用的pET30a载体质粒。因此，本 发明的表达载体优选为采用pET30a载体质粒构建的表达载体。
[0027] 第四方面，本发明提供了一种肿瘤血管阻断剂组合物，其包含如第一方面任一项 所述的肿瘤血管阻断剂多肽、如第二方面任一项所述的肿瘤血管阻断剂基因或如第三方面 任一项所述的肿瘤血管阻断剂表达载体。
[0028] 第五方面，本发明提供了如第一方面任一项所述的肿瘤血管阻断剂多肽、如第二 方面任一项所述的肿瘤血管阻断剂基因或如第三方面任一项所述的肿瘤血管阻断剂表达 载体在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
[0029] 本发明所述肿瘤血管阻断剂多肽具体可以通过设计相应的基因序列，构建融合蛋 白表达质粒，并将其转入如BL21大肠杆菌中，IPTG诱导表达并纯化，得到具有肿瘤靶向性 及凝血活性的肿瘤血管阻断剂。
[0030] 本发明所述肿瘤血管阻断剂多肽，能够响应肿瘤微酸性的特点,产生构象变化，形 成α -螺旋结构，从而定位于肿瘤血管内皮细胞，并激活活性域一tTF的凝血活性，从而 能够特异地在肿瘤血管形成血栓，达到抑制肿瘤生长的治疗目的；而在正常生理pH环境 中，其靶向域不能形成α -螺旋结构，不具有穿膜功能，因此不能将活性域定位于细胞上， 使得活性域不能发挥凝血活性，从而保证该药物分子在体内循环时，不会在正常部位血管 形成血栓，避免副作用的产生。
[0031] 本发明所述肿瘤血管阻断剂多肽无需渗透到肿瘤组织中，在肿瘤血管处即可直接 发挥作用，因此所用药量减少，且不易产生耐药性；多肽的主体部分来源于自身的组织因子 胞外区，因此免疫原性小，能够很好的躲避免疫系统，减少药物在体内循环时被免疫清除。
[0032] 此外，本发明所述肿瘤血管阻断剂多肽与已经报道的其他肿瘤靶向肽介导组织因 子相比，更接近组织因子天然的构象，其凝血活性更好。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1是本发明肿瘤血管阻断剂多肽（融合蛋白）的结构示意图（Α)和融合蛋白 SDS-PAGE电泳鉴定结果（Β);图（Α)显示，所述肿瘤血管阻断剂多肽包括活性域、连接域和 靶向域三部分；图（Β)中，Μ表示蛋白质标准分子量，1表示融合蛋白的泳道，箭头指示处即 为融合蛋白。
[0034] 图2是本发明肿瘤血管阻断剂通过尾静脉注入裸鼠乳腺癌肿瘤模型12小时后的 治疗效果；其中，（A)为注射生理盐水（对照）后荷瘤小鼠体外形貌，（B)为对照肿瘤，（C) 为对照肿瘤病理切片（箭头代表肿瘤血管，没有血栓形成），（D)为注射肿瘤血管阻断剂后 荷瘤小鼠体外形貌，（E)为注射肿瘤血管阻断剂后肿瘤、（F)为注射肿瘤血管阻断剂后肿瘤 病理切片（箭头代表肿瘤血管，有明显血栓形成）。
【具体实施方式】
[0035] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理 解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定 本发明的范围。
[0036] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无 特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0037] 实施例1 :融合蛋白质粒的构建
[0038] 用全基因合成的方式，合成该融合蛋白的基因序列SEQ ID N0 :5,并在该融合蛋白 基因序列的两端分别设计Nde I和Xho I酶切位点。然后，将融合蛋白基因通过上述酶切位 点，连接入pET30a载体中，从而得到融合蛋白表达载体。
[0039] 实施例2 :融合蛋白的表达和纯化
[0040] (1)融合蛋白的表达
[0041] 将上述融合蛋白表达载体转化入BL21大肠杆菌中，先接5 μ L菌液到5mLLB液体 培养基中，37°C，200Xrpm，摇床培养16h。将培养的菌液转接到500mLLB液体培养基中， 37°C，200Xrpm，培养至 0D = 0· 6 ?0· 8,用 IPTG(0. 5mM)诱导表达 4h。
[0042] (2)融合蛋白的纯化
[0043] 将上述IPTG诱导表达的菌液离心（6000Xrpm，5min)，弃上清，收菌。沉淀用 25mL10mM Tris-HCl (pH = 8. 0)溶液吹散，超声破菌，12000Xrpm，离心lOmin，上清去除干 净，用25mL10mM Tris-HCl (pH = 8. 0)溶液重悬超声离心得到的沉淀，静置lOmin。重复上 述操作一次，得到沉淀。加入少量的10mM Tris-HCl (pH = 8. 0)溶液重悬沉淀，再加8mL含 8M尿素的10mM Tris-HCl (pH = 8. 0)溶液溶解蛋白，12000 Xrpm，离心10min，收集上清。
[0044] 通过SDS-PAGE电泳鉴定融合蛋白，结果如图1 (B)所示，可见形成清晰、纯净的条 带，大小在30KDa以上，与预期相符。
[0045] 实施例3 :肿瘤血管阻断剂效果实验
[0046] 将实施例2提供的肿瘤血管阻断剂多肽尾静脉注入裸鼠乳腺癌肿瘤模型（模型 的构建参考文献：Tian Y, Li S, Song J, Zhu M, Ji T, Nie G, Wei J and Zhao Y. A doxorubition delivery platform using engineered natural membrane vesicles exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials (2013).)，12小时后观察治疗效果，以注射生理盐水作为对 照组。结果如图2所示。
[0047] 由图2可见，与注射生理盐水荷瘤小鼠（A)相比，本发明的肿瘤血管阻断剂能够引 起肿瘤部位出现肉眼可见的深红色（D);解剖后，可见对照组肿瘤（B)为正常的肉红色，而 注射肿瘤血管阻断剂（E)的肿瘤则出现明显的血栓引起的暗红色；肿瘤病理切片则可以看 出与对照组（C)相比，注射肿瘤血管阻断剂组（F)在肿瘤血管中形成了明显的血栓（箭头 所示）。
[0048] 上述结果表明，本发明的肿瘤血管阻断剂能够在肿瘤血管中形成血栓，切断肿瘤 血供，诱发肿瘤细胞发生缺血性坏死，从而达到治疗肿瘤的目的。
[0049] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但 本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征 以及详细方法才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发 明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围 和公开范围之内。
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【权利要求】
1. 一种肿瘤血管阻断剂多肽，其特征在于，从N端到C端依次包含：截断的组织因子 tTF的氨基酸序列、连接子和肿瘤靶向分子pHLIP的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的肿瘤血管阻断剂多肽，其特征在于，所述截断的组织因子tTF 的氨基酸序列如SEQ ID NO : 2所示； 优选地，所述肿瘤靶向分子pHLIP的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3. 根据权利要求1或2所述的肿瘤血管阻断剂多肽，其特征在于，所述连接子由4-8 个、优选4-6个、更优选5个氨基酸构成； 优选地，所述连接子具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的肿瘤血管阻断剂多肽，其特征在于，所述肿瘤血管 阻断剂多肽具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
5. -种肿瘤血管阻断剂基因，其编码如权利要求1-4任一项所述的肿瘤血管阻断剂多 肽。
6. 如权利要求5所述的肿瘤血管阻断剂基因，其特征在于，具有如SEQID NO:5所示的 核苷酸序列。
7. -种肿瘤血管阻断剂表达载体，其包含如权利要求5或6所述的肿瘤血管阻断剂基 因。
8. 如权利要求7所述的肿瘤血管阻断剂表达载体，其特征在于，所述表达载体的基础 载体为pET30a质粒载体。
9. 一种肿瘤血管阻断剂组合物，其包含如权利要求1-4任一项所述的肿瘤血管阻断剂 多肽、如权利要求5-6任一项所述的肿瘤血管阻断剂基因或如权利要求7-8任一项所述的 肿瘤血管阻断剂表达载体。
10. 如权利要求1-4任一项所述的肿瘤血管阻断剂多肽、如权利要求5-6任一项所述的 肿瘤血管阻断剂基因或如权利要求7-8任一项所述的肿瘤血管阻断剂表达载体在制备用 于治疗肿瘤的药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK104045717SQ201410323457
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】聂广军, 李素萍, 田艳华, 赵颖 申请人:国家纳米科学中心