一种用于个性化的骨修复材料和其制备方法

一种用于个性化的骨修复材料和其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于个性化的骨修复材料及其制备方法，骨修复材料包括质量比为0.1-0.6∶1的有机材料和无机材料，以及包裹了蛋白质的脂质微球粉末。该骨修复材料可用于个性化的骨修复，其具有生物相容性且可降解，具有生物骨材料所需要的安全、立体网状结构、平衡降解的特点。
【专利说明】一种用于个性化的骨修复材料和其制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种生物修复材料。
[0002] 本发明还涉及所述生物修复材料的制备方法。

【背景技术】
[0003] 骨组织损伤是人类健康面临的一大难题。随着医学科学的发展，人工骨移植技术 已经较为广泛地应用于临床，但至今人工骨移植仍存在一些问题，其中最严重的是骨组织 短缺，供体不足，同时，人工骨移植治疗方案最终仍难以修复受到损伤的骨组织或使之功能 得到长期恢复。生物制造工程是一种重要的潜在替代治疗措施，有望最终解决这个问题。当 个体骨组织损伤或缺失时，生物制造技术采用植入器官代用品的方式进行个性化治疗，这 种方式可以在植入初期已经具有组织或器官的全部功能，并在体内生长的过程中逐步具有 需要的组织或器官的功能。另外骨组织在人体内是一个立体组织，内部有血管、神经、骨细 胞、骨髓等多种复杂的生物组成，设计三维的立体和制造其内部的通道也是需要必须解决 的问题。
[0004] 组织工程支架材料的目的是为构建组织的细胞提供一个三维支架，有利于细胞的 黏附、增殖乃至分化，为细胞生长提供合适的外环境。生物可降解材料在组织工程研究中起 着非常重要的作用，它是组织工程实现产业化的关键。
[0005] 除了符合一般生物医学材料的要求外，组织工程学所需的理想生物材料还需满足 如下要求：具备良好的生物相容性，不会因邻近组织的排异反应而影响新组织的功能；具 有可降解性及适宜的降解速率，当移植的细胞或组织在受体内存活时，支架材料可自行降 解；具有符合细胞、组织器官要求的生物力学强度；具有良好的细胞界面关系，能相互作用 以保存和促进细胞功能；易于塑型，便于加工成理想的二维或三维结构，而且移植到体内后 能保持原有形状；可以和其他活性分子复合，促进种子细胞的增殖与分化；易消毒性。
[0006] 目前计算机辅助技术的加入，医学影像技术及材料制作加工技术的进步又为组织 工程的个性化治疗创造了新的契机。如用非侵入计算机断层扫描（CT)和核磁共振成像 (MRI)进行三维重建，指导组织分类或创伤鉴别。目前计算机辅助设计和制作（CAD/CAM)以 及快速成型技术（RP)制作硬组织模型、组织支架和定制型假体，3D打印技术的应用将近一 步推动了 CAD技术，可以用医疗影像数据建立个性化损伤或替代部位的数据库，得到精准 的体积和尺寸以及内部空隙等骨组织个体化模块。
[0007] 组织工程的最终目的是让细胞在体外生长、分化为功能组织和器官。细胞的来源 可大致分为成熟的细胞和干细胞，成熟的细胞又可分为自体和异体两个不同的来源。自体 细胞来源应该是最理想的细胞来源。所要通过的步骤基本上包括收取少量的自体细胞然后 在体外培养增殖。之后这些组织可以用于组织工程或直接用于自体的治疗。现在已经知 道，不仅骨髓组织中存在的间质干细胞（MSCs)在一定条件下，可向成骨细胞、软骨细胞、成 肌细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等分化，而且在其他组织如皮肤、肝、神经等也存在干细胞， 这些干细胞还存在相互转化的现象。研究表明，组织特异干细胞有可能作为组织工程的种 子细胞来源，其中自体MSCs与支架材料复合构建的组织工程骨已有临床应用的个案报道， 显示了临床应用的良好前景。MSCs还易于实现外源基因的导入和表达，为基因治疗开创了 应用前景。人骨髓间充质干细胞（human marrow mesenchymal stem cells, hMSCs)由于获 取途径较为方便，扩增表型稳定，同时避免了医学伦理争议，因而成为理想的组织工程骨 种子细胞，用于向成软骨细胞方向诱导以构建组织工程骨.Tali等研究采用hMSCs构建软 骨，体外接种生物活性材料并植入裸鼠体内，其成软骨效果理想。
[0008] 成熟细胞体外培养仍然是个值得研究的课题，因为如何有效地提高细胞在体外的 增殖能力将对组织工程有直接影响，特别是病人急需这种细胞或自体细胞形成的组织或器 官。生物反应器是安装了将营养物、气体（如氧气和二氧化碳）和废物控制在适当数量水 平的搅拌器和传感器的培养室。随着组织在生物反应器中的生长，使其机械特性达到最佳 将是极为关键的问题，因为许多组织在受到扩展、拉动或压缩作用时会做出反应，进行重构 或改变它们的总体结构。


【发明内容】

[0009] 本发明的一个目的在于提供一种骨修复材料，该骨修复材料可用于个性化的骨修 复，其具有生物相容性且可降解，具有生物骨材料所需要的安全、立体网状结构、平衡降解 的特点。
[0010] 本发明的再一个目的是提供所述骨修复材料的制备方法，通过将生物相容可降解 有机材料，经过适当的溶剂溶解后，与无机磷酸钙盐混合后，加入包裹有蛋白质的脂质微球 粉末混匀，根据CT扫描获得的数据设计的3D模型数据程序，打印出适合特异个体治疗的骨 修复3D材料，材料经过真空干燥除去残余的溶剂，接种骨髓间质干细胞，在自动化控制的 生物反应器中进行立体培养，获得个性化的骨修复材料，最后植入到人体内病变待修复部 位。
[0011] 根据本发明的一个方面，一种用于个性化的骨修复材料，包括
[0012] 质量比为0. l-o. 6:1的有机材料和无机材料，以及
[0013] 包裹了蛋白质的脂质微球粉末；其中：
[0014] 所述有机材料选自 PLGA，PLA 和 PGA，所述 PLGA 中 PLA :PGA = 5 % -95 % : 95%-5%，分子量范围为8000-250000 ;所述PLA分子量范围为8000-250000，；所述PGA分 子量范围为8000-250000 ;
[0015] 所述无机材料为选自磷酸三钙，α-磷酸三钙，羟基磷灰石和磷酸四钙中的一 种或多种的磷酸类钙盐；
[0016] 所述包裹于脂质微球中的蛋白质选自神经细胞生长因子，类胰岛素生长因子，重 组人β干扰素，红细胞生成素，转化生长因子_β3,骨形态发生蛋白的一种或者几种，每 份脂质微球粉末中蛋白质的含量为；神经细胞生长因子50?200ng/份，类胰岛素生长因 子50?200ng/份，红细胞生成素5?20IU/份，重组人干扰素50?200ng/份，转化生长 因子-0 35〇-12〇ng/份，骨形态发生蛋白BMP-250-100ng/份，骨形态发生蛋白BMP-7为 50-100ng/ 份；
[0017] 优选的蛋白质为重组人干扰素 IFN-β，IFN-β的含量为100ng/ml ;更优选的蛋白 质为IFN-β与TGF-β 3的组合。
[0018] 根据本发明的另一方面，制备个性化的骨修复材料的方法，包括下述步骤：
[0019] 1)按照预定的比例以有机溶剂混匀所述有机材料和无机材料，加入包裹了蛋白质 的冻干脂质微球粉末，制备骨修复材料；
[0020] 2)将步骤1)的骨修复材料转入3D打印机，用非侵入计算机断层扫描和核磁共 振成像进行个体化骨损伤部位三维数据采集，将采集到的断层图像切片转化为三维打印模 型，利用快速成型技术制作骨组织模型和组织支架；
[0021] 3)将步骤2) 3D打印制备的骨组织支架置于细胞瓶中接种成骨细胞，细胞接种浓 度至1 X 105/mL，培养至细胞附着或形成单层细胞后转移到细胞生物反应器中进行立体培 养；
[0022] 4)获得可植入骨损伤部位的个性化的骨修复材料。
[0023] 本发明所述的制备方法，其中在打印过程中材料要处于低温状态，温度范围 为-30°C?-10°C，并且打印的材料要持续给予冷风使其固定成型；打印完的骨组织支架要 进行真空冷冻干燥。
[0024] 所述骨组织支架在接种细胞前需要进行无菌处理，可以以Y射线照射，或者环氧 乙烷熏蒸。并且将所述支架经培养液浸泡。
[0025] 接种细胞到生物支架，在培养瓶中培养2天待生物骨支架上的细胞附着或形成单 层后转移骨组织支架到生物反应器中，立体培养，其中流加培养基的速度为5ml/min-15ml/ min，培养基的成分根据培养时间和生长情况调整。成骨细胞（hMSC)完全培养基包括如下 成分：低糖DMEM88% (v/v),胎牛血清10% (v/v)，L-谷氨酸1% (v/v),青/链霉素1% (v/v)。hMSC成软骨分化培养基包括如下成分：高糖DMEM96. 3% (v/v)，L-谷氨酸1% (v/ '〇，青/链霉素1%卜八)，10_31凡抗坏血酸0.5(%〇八)，1_31/1^地塞米松0.01 (%〇/ v)，40 μ g/L L-脯氨酸 0· 1 % (v/v)，1000 μ g/L 丙酮酸钠 0· 1 % (v/v)，ITS+Premixl % (v/ v),10ng/ml TGF-^3〇
[0026] 本发明的骨组织材料在个性化修复中，可以保持生物材料的降解速度和新生骨组 织的生长速度的平衡，本发明采用了细胞因子和骨蛋白介入技术，尤其是脂质微球的包裹 技术，使个性化骨组织的体外生长和体内生长期内，更好的多元化刺激周围组织和骨组织 本身的各种相关联的组织系统的生长。
[0027] 本发明发现了 IFN-β可能作为具有促进hMSCs成软骨分化的能力，且IFN-β可 以代替TGF-β 3作用，二者联合使用可以更加促进成软骨分化。
[0028] 本发明使用有机生物材料，应用先进制造技术和3D打印技术，结合现代个体影像 学技术，使个性化骨的治疗更加符合立体尺寸，保证骨组织内部的细胞通道，植入后更快和 自体组织融合，减少异体排斥反应。
[0029] 本发明提供的个性化的骨修复材料和其制备方法得到的骨组织，具有生物骨材料 所需要的安全、立体网状结构、平衡降解的特点。

【专利附图】

【附图说明】
[0030] 图1为添加不同蛋白质（细胞因子）的阿尔新蓝染色结果；
[0031] 图2为添加各蛋白质（细胞因子）的GAG检测结果；
[0032] 图3为添加 IFN- β促进hMSCs成软骨分化的GAG检测结果；
[0033] 图4为添加 IFN- β促进hMSCs成软骨分化的qRT-PCR结果，显示成软骨分化第14 天各组Collagenll表达水平；
[0034] 图5为添加 IFN- β促进hMSCs成软骨分化的qRT-PCR结果，显示成软骨分化第14 天各组S0X9表达水平；
[0035] 图6为添加 IFN- β促进hMSCs成软骨分化的WESTERN BLOT结果；
[0036] 图7为不同浓度IFN- β诱导成软骨分化后细胞GAG总含量变化趋势；
[0037] 图8为hMSCs在PLGA/TCP材料上的成骨分化的扫描电镜检验结果；
[0038] 图9为在PLGA/TCP材料上成骨分化的hMSC细胞的ALP酶活性比较；
[0039] 图10为用于立体培养的生物反应器结构示意图。

【具体实施方式】
[0040] 材料来源：
[0041] 除特别注明外，所有材料为市售购买；
[0042] hMSC细胞来源：第5代的hMSC细胞株购自广州赛业公司
[0043] 包裹蛋白质的脂质微球制备：
[0044] 薄膜蒸发法制备脂质微球步骤如下：①成膜：膜材配料：将注射用卵磷脂、胆固醇 和十八胺（或维生素 E)按配料比3?7:1?3:1称量，然后溶解在终浓度为0. 5?1. 5% 的二氯甲烷或三氯甲烷中，将该液体置于旋转蒸发仪的茄型瓶中，60°C水浴作为蒸发温度， 旋转使溶剂蒸发，最后阶段用氮气吹干溶剂，使脂质体在茄型瓶中成膜。②水化：加入含细 胞因子（例如：重组人IFNi3 la (终浓度为100ng/ml)和骨形态发生蛋白BMP-2(终浓度为 80ng/ml))的水相溶液约50ml (膜材在溶液的浓度为1 % )，加入几粒小玻璃珠，剧烈震荡， 待薄膜从瓶壁上完全脱落后，水浴超声约30min，瓶中液体呈淡云雾状。③高压匀浆：将粗 制脂微球用高压匀浆机在压力为15Kpa?30Kpa压力范围内，通过冷凝水，将匀浆机出口的 温度控制在30°C?37°C，均质到200?400nm的粒径。
[0045] 冷冻干燥法（FDM)相结合制备脂质微球，则在上述基础上增加以下步骤：④冷冻 干燥：将匀浆后的脂质体混合物，震荡，加入适量的海藻糖使其中终浓度为1.5%，将液体 在压力下通过孔径为〇. 45um的板式过滤器，进行无菌处理，同时也可将脂质体的孔径控制 在450nm以下，还可以进一步的使脂质体的粒径更为均一，取过滤后的样品在无菌条件下 分装，2ml/瓶，分装在西林瓶中；⑤冷冻，干燥。脂质微球蛋白冻干样在应用时，可加入一定 体积的PBS或生理盐水（2ml)，震荡至淡云雾状即可。
[0046] 仪器设备：
[0047] 3D打印设备、CT和MRI为通用设备；
[0048] 用于立体培养的生物反应器：结构参见图10,生物反应器100,包括罐体1，分别位 于罐体两端的第一罐盖2A和第二罐盖2B，第一罐盖设置有伸向罐体内部的第一夹持部件 3A和用于物质进出的至少一个第一导管4A，第二罐盖设置有伸向罐体内部的第二夹持部 件3B和用于物质进出的至少一个第二导管4B，第一罐盖2A和第二罐盖2B与罐体1之间形 成密封。通过商品化生物反应器，将培养液从本生物反应器下端的导管注入，培养液充满罐 体1，从罐体顶端的导管流出，返回至商品化生物反应器。通过所述商品化生物反应器自动 控制气体、液体的溶氧、pH、压力、温度以及额外物质的添加，在培养不同时期向立体培养的 生物反应器补充不同的营养成分，实现罐体1内组织块和生物材料的立体、连续、接近体液 的培养。
[0049] 以下结合具体实施例对本发明进行详细说明：
[0050] 实施例1.个性化骨组织材料配比
[0051] 称取lg羟基磷灰石或α-磷酸三钙或β-磷酸三钙或磷酸四钙置于一端密闭的 容器中，加入2ml丙酮后将领一端密闭，振荡使丙酮浸润羟基磷灰石。
[0052] 称取0· 2g，平均分子量为10万的PLGA (聚（D, L-乳酸-co-乙醇酸），PLA:PGA = 75:25)或PGA(聚乙交酯）或PLA(聚（L-乳酸）），置于一端密闭的容器中，加入体积为 〇. 2ml的丙酮后将另一端密闭，使PLGA完全溶解。
[0053] 将溶解后的有机材料完全加入到无机材料中，振荡搅拌均匀，密闭。
[0054] 取一份量的包裹有冻干脂质微球粉末，该粉末中同时含有神经细胞生长因子 (NGF)为100ng/份，重组人干扰素（IFN-β)为120ng/份，骨蛋白（BMP-2)为100ng/份。 将其加入上述制备好的材料液体中，迅速混匀。
[0055] 实施例2个性化骨组织材料制备
[0056] 用非侵入计算机断层扫描（CT)和核磁共振成像（MRI)进行个体化骨损伤部位三 维数据采集，采集到的断层图像切片采用mimic或3dMed软件处理，转化为三维的空间矢量 数据，再通过三维设计软件Aut 〇deSk3ds Max，转化为三维打印模型，编译为3D打印机识别 文件格式如STL文件。
[0057] 设置立体材料支架的打印参数，层与层之间材料垂直交叉式堆叠，每层内采用平 行式放置，每条之间的间隙为1mm，Z轴方向每次的步进高度为0· 1mm，X轴和Y轴方向的移 动速度为2mm/s，出料口的孔径控制在0· 5mm-〇. 1mm之间，出料的压力控制在20psi_60psi 之间。
[0058] 称取lga -磷酸三钙置于一端密闭的容器中，加入2ml丙酮后将领一端密闭，振荡 使丙酮浸润羟基磷灰石。
[0059] 称取0. 3g，平均分子量为10万的PLA，置于一端密闭的容器中，加入体积为0. 2ml 的丙酮后将另一端密闭，使PLA完全溶解。
[0060] 将溶解后的有机材料完全加入到无机材料中，振荡搅拌均匀，密闭。
[0061] 取一份量的包裹有冻干脂质微球粉末，该份粉末中包括类胰岛素生长因子 (IGF-I)为100ng/份，红细胞生成素（ΕΡ0)为20IU/份，重组人干扰素（IFN-β)为80ng/ 份，骨蛋白（BMP-7)为100ng/份。将其加入上述制备好的材料液体中，迅速混匀。
[0062] 将混合好的材料加入到3D打印机的原料储存室中，运行程序，按照设定好的程序 打印出所设计的立体材料支架。打印过程维持支架平台及周围温度为_2〇°C，并且持续给予 冷风使固液相分离成型。
[0063] 支架打印后，需将支架进行真空冷冻干燥处理，第一段温度设为-50°C，真空度设 为20pa，运行4h ;第二段温度控制在28?32°C，持续时间42小时。
[0064] 实施例3个性化骨组织材料（添加细胞因子IFN- β )诱导hMSC细胞成软骨分化
[0065] 用非侵入计算机断层扫描（CT)和核磁共振成像（MRI)进行个体化骨损伤部位三 维数据采集，采集到的断层图像切片采用mimic或3dMed软件处理，转化为三维的空间矢量 数据，再通过三维设计软件Aut〇deSk3ds Max，转化为三维打印模型，编译为3D打印机识别 文件格式如STL文件。
[0066] 设置立体材料支架的打印参数，层与层之间材料垂直交叉式堆叠，每层内采用平 行式放置，每条之间的间隙为1mm，Z轴方向每次的步进高度为0· 1mm，X轴和Y轴方向的移 动速度为2mm/s，出料口的孔径控制在0· 5mm-〇. 1mm之间，出料的压力控制在20psi_60psi 之间。
[0067] 称取lgi3 -磷酸三钙置于一端密闭的容器中，加入2ml丙酮后将领一端密闭，振荡 使丙酮浸润羟基磷灰石。
[0068] 称取0. 3g，平均分子量为12万的PGA，置于一端密闭的容器中，加入体积为0. 2ml 的丙酮后将另一端密闭，使PGA完全溶解。
[0069] 将溶解后的有机材料完全加入到无机材料中，振荡搅拌均匀，密闭。
[0070] 取一份量的包裹有冻干脂质微球粉末，其中含重组人干扰素（IFN-β )为120ng/ 份。将其加入上述制备好的材料液体中，迅速混匀。
[0071] 将混合好的材料加入到3D打印机的原料储存室中，运行程序，按照设定好的程序 打印出所设计的立体材料支架。打印过程维持支架平台及周围温度为_2〇°C，并且持续给予 冷风使固液相分离成型。
[0072] 支架打印后，需将支架进行真空冷冻干燥处理，第一段温度设为-50°C，真空度设 为20pa，运行4h ;第二段温度控制在28?32°C，持续时间42小时。
[0073] 将三维支架用射线做无菌处理，在无菌条件下，将处于对数分裂期的hMSC细胞， 浓度为5X 105cell/ml，分别取0. 5ml接种于三维支架和6孔细胞板（阴性对照）中，静置 培养20天，其中每4天更换一次细胞完全培养基。hMSC完全培养基包括如下成分：低糖 DMEM88% (v/v),胎牛血清 10% (v/v)，L-谷氨酸 1% (v/v),青 / 链霉素 1% (v/v)。hMSC 成软骨分化培养基包括如下成分：高糖DMEM96. 3% (v/v)，L-谷氨酸1% (v/v)，青/链 霉素1%(丫八），10臟〇1凡抗坏血酸0.5(%(￥八），11111]1〇1凡地塞米松0.01 (%(￥八），40 4区/ L L-脯氨酸 0.1% (v/v)，1000yg/L 丙酮酸钠 0.1% (v/vhlTS+Premixl% (v/v)，10ng/ml TGF- β 3.
[0074] 于第20天收集实验组细胞和对照组细胞，进行生化分析检测。
[0075] 糖胺多糖（GAG)总含量是细胞成软骨分化水平的重要标志，GAG含量检测结果显 示成软骨实验组在培养4d后已与空白组有显著性差异，GAG总含量随着时间不断增高.在 整个实验周期内，实验组的细胞GAG总含量与对照组细胞相比有显著性差异。表明该方法 制备的三维支架有可能促进细胞的成软骨分化。
[0076] 实施例4.添加不同细胞因子的骨组织材料促进hMSCs成软骨分化
[0077] 实验方法：
[0078] 添加不同细胞因子IGF-1，NGF，ΕΡ0和IFN- β的分组方法：
[0079] 取对数生长期的第8代hMSCs，以完全培养基重悬，调整细胞浓度至1 X 105/mL. 6 孔板每孔接种200 μ L细胞悬液，补充培养基至2mL.细胞分为空白对照组，成软骨对照 组，IFN-β组，IGF-1组，NGF组和ΕΡ0组，4d时用完全培养基，成软骨分化培养基，含 100ng/ml IFN-β的完全培养基，含100ng/ml IGF-1的完全培养基，含100ng/ml NGF的 完全培养基和含l〇IU/ml EP0的完全培养基对应换液，之后每4d换液。
[0080] 阿尔新蓝染色检测方法：
[0081] 分组换液后14d取出6孔板，小心抽去孔里的培养基，加入清理液清洗，酸性液 孵育3min后清洗2次，染色液处理30min，避免光照，清洗2次，核固红复染后倒置显微 镜下观察拍照，每组3个复孔。
[0082] 实验结果
[0083] (1)添加不同细胞因子的阿尔新蓝染色结果
[0084] 阿尔新蓝染色结果显示（图1)空白对照组，IGF-1组，NGF组和ΕΡ0组染色后梭型 的细胞形态仍清晰可见，细胞周围并未见蓝色的糖蛋白出现，而成软骨对照组有明显的细 胞形态变化，细胞周围有大量糖蛋白聚集，IFN-β组细胞形态有向软骨细胞分化的趋势， 但只有少量糖蛋白可见。
[0085] (2)添加各细胞因子的GAG检测结果
[0086] 糖胺多糖总含量是细胞成软骨分化水平的重要标志，GAG总含量检测结果显 示（图2)，成软骨对照组在换用成软骨分化培养基后4d已与其他组有显著性差异 (p〈0. 01)，GAG总含量随着时间不断增高.IFN-β组细胞GAG总含量在4d，8d和空白对照组 有显著性差异（P〈〇. 05)，但后期两者接近，没有显著性差异，其余各组GAG总含量和空白 对照组没有显著性差异（P>〇.〇5)，实验表明IFN-β可能促进hMSCs成软骨分化。
[0087] 实施例5.添加 IFN- β促进hMSCs成软骨分化
[0088] 实验方法：
[0089] 检验IFN-β促成软骨分化效果的分组方法：
[0090] 取对数生长期的第8代hMSCs，以完全培养基重悬，调整细胞浓度至1 X 105/mL. 6 孔板每孔接种200 μ L细胞悬液，补充培养基至2mL.细胞分为空白对照组，成软骨对照 组，正^0组和正^0+了6?-0 3(转化生长因子-0 3)组，4(1时用完全培养基、成软骨分化 培养基、含l〇〇ng/ml IFN-β的成软骨分化培养基（不含TGF-0 3)和含100ng/ml IFN-β 的成软骨分化培养基对应换液，之后每4d换液。
[0091] 实验结果：
[0092] (1)添加 IFN- β促进hMSCs成软骨分化的GAG检测结果
[0093] GAG总含量检测结果显示（图3)，成软骨对照组，IFN- β组和IFN- β +TGF- β 3组 与空白对照组都有显著性差异（Ρ〈〇. 01)，且GAG总含量随着时间不断增高.。IFN-β组细 胞GAG总含量略高于成软骨对照组，4d和lid有显著性差异（p〈0. 01)，但7d和14d没有 显著性差异（P>〇. 05)，IFN- β +TGF- β 3组细胞GAG总含量远远高于成软骨对照组和IFN- β 组，和成软骨对照组有显著性差异（P〈〇.〇l)，实验表明IFN-β可以代替TGF-0 3作用， 二者联合使用可以更加促进成软骨分化。
[0094] (2)添加 IFN- β促进hMSCs成软骨分化的qRT-PCR结果
[0095] qRT-PCR结果显示（图4,5)，14d时IFN-β组细胞Collagen II和S0X9基因相对 表达率要远远高于空白对照组（P〈〇.〇l)，和成软骨对照组较为接近，而IFN-i3+TGF-i3 3 组细胞Collagen II和S0X9基因相对表达率则明显高于其他各组（p〈0. 01)。
[0096] (3)添加 IFN- β促进hMSCs成软骨分化的WESTERN BLOT结果
[0097] WESTERN BLOT结果显示（图6)，14d各组均有Collagen II和S0X9条带出现，其 中IFN- β +TGF- β 3组条带最为明亮.
[0098] 灰度分析值（表1)证明IFN- β +TGF- β 3组Collagen II和S0X9相对表达量较其 他各组都有明显差异（p〈〇. 01).
[0099] 表1 WESTERN BLOT半定量灰度分析
[0100]

【权利要求】
1. 一种用于个性化的骨修复材料，包括 质量比为0. l-o. 6:1的有机材料和无机材料，以及 包裹了蛋白质的脂质微球粉末；其中： 所述有机材料选自 PLGA，PLA 和 PGA，所述 PLGA 中 PLA :PGA = 5% -95% :95% -5%， 分子量范围为8000-250000 ;所述PLA分子量范围为8000-250000,；所述PGA分子量范围为 8000-250000 ； 所述无机材料为选自磷酸三钙，磷酸三钙，羟基磷灰石和磷酸四钙中的一种或 多种的磷酸类钙盐； 所述包裹于脂质微球中的蛋白质选自神经细胞生长因子，类胰岛素生长因子，重组人 β干扰素，红细胞生成素，转化生长因子，骨形态发生蛋白的一种或者几种，每份脂质微 球粉末中蛋白质的含量为；神经细胞生长因子50?200ng/份，类胰岛素生长因子50? 200ng/份，红细胞生成素5?20IU/份，重组人干扰素50?200ng/份，转化生长因子 50-120ng/份，骨形态发生蛋白BMP-2为50-100ng/份，骨形态发生蛋白BMP-7为50-100ng/ 份。
2. 权利要求1所述的个性化的骨修复材料，其中包裹于脂质微球中的蛋白质为重组人 干扰素 IFN-β，IFN-β的含量为100ng/ml。
3. 权利要求1或2所述的个性化的骨修复材料，其中包裹于脂质微球中的蛋白质为重 组人干扰素-β与转化生长因子-β 3的组合。
4. 制备权利要求1所述的个性化的骨修复材料的方法，包括下述步骤： 1) 按照预定的比例以有机溶剂混匀所述有机材料和无机材料，加入包裹了蛋白质的冻 干脂质微球粉末，制备骨修复材料； 2) 将步骤1)的骨修复材料转入3D打印机，用非侵入计算机断层扫描和核磁共振成像 进行个体化骨损伤部位三维数据采集，将采集到的断层图像切片转化为三维打印模型，利 用快速成型技术制作骨组织模型和组织支架； 3) 将步骤2) 3D打印制备的骨组织支架置于细胞瓶中接种成骨细胞，培养至细胞附着 或形成单层细胞后转移到生物反应器中进行立体培养； 4) 获得可植入骨损伤部位的个性化的骨修复材料。
5. 权利要求4所述的制备方法，其中步骤2)所述打印过程中材料温度范围 为-30°C?-10°C，并且打印的材料持续给予冷风使其固定成型；打印完的骨组织支架进行 真空冷冻干燥。
6. 权利要求4所述的制备方法，其中所述骨组织支架在接种细胞前进行γ射线照射或 环氧乙烷熏蒸的无菌处理，并且将所述支架经培养液浸泡。
7. 权利要求4所述的制备方法，其中步骤3)中，接种细胞到骨组织支架，在培养瓶中培 养2天待骨组织支架上的细胞附着或形成单层后转移骨组织支架到生物反应器中，立体培 养，其中流加培养基的速度为5ml/min-15ml/min，成骨细胞完全培养基包括如下成分： 低糖DMEM88 % (v/v),胎牛血清10 % (v/v), L-谷氨酸1 % (v/v),青/链霉素1 % (v/v)。hMSC成软骨分化培养基包括如下成分：高糖DMEM96. 3% (v/v)，L-谷氨酸1% (v/ '〇，青/链霉素1%卜八)，10_31凡抗坏血酸0.5(%〇八)，1_31/1^地塞米松0.01 (%〇/ v)，40 μ g/L L-脯氨酸 0· 1 % (v/v)，1000 μ g/L 丙酮酸钠 0· 1 % (v/v)，ITS+Premixl % (v/
【文档编号】A61L27/22GK104147641SQ201410330587
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】张丽君, 张英, 张登央, 王飞, 王妍 申请人:深圳职业技术学院