一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用，氨基化锂皂石为(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷APMES修饰的锂皂石；聚乙二醇与叶酸的摩尔比为1∶0.4-1∶0.8；聚乙二醇-叶酸的质量分数在45-55％。制备：将叶酸溶解在溶剂中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，搅拌得到混合溶液，逐滴加入聚乙二醇溶液中，搅拌2-3d，透析，冷冻干燥，得到聚乙二醇-叶酸PEG-FA；向PEG-FA溶液中加入EDC，搅拌2-4h，再逐滴加入氨基化锂皂石纳米颗粒的水溶液中，磁力搅拌2-3d，透析，即得。应用于药物负载。本发明制备方法简单，条件温和，应用范围广泛，具有良好的市场前景。
【专利说明】一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制 备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于纳米载药材料及其制备和应用领域，特别涉及一种聚乙二醇-叶酸修 饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用。
【背景技术】
[0002] 癌症被认为是21世纪人类面临的重大挑战之一。在使用化学药物治疗肿瘤的过 程中，抗癌药物存在水溶性差、在病灶部位保留时间短以及不能特异性识别肿瘤细胞等问 题，这将对人体产生强烈的毒副作用，而无法有效实现药物对肿瘤的杀伤效果。因此，发展 一种具有肿瘤靶向作用的载体材料实现药物的负载、可控释放与靶向治疗是目前纳米医学 的研究热点。粘土类纳米颗粒，如锂阜石（Laponite, LAP),不仅具有良好的生物相容性，还 能够高效负载药物并实现药物的控制释放，在药物输送领域展现了独特的优势。但是负载 药物之后，锂皂石纳米颗粒在水中的胶体稳定性下降，而且无法主动识别并富集到肿瘤细 胞，因此，将靶向分子连接到其表面得到具有主动靶向效果的多功能锂皂石纳米颗粒，是改 善抗肿瘤药物载体性能的有效途径。
[0003] 聚乙二醇（PEG)是一种具有良好生物相容性的链状聚合物，修饰到纳米材料表面 能够显著提高其在水中的稳定性。叶酸（Folic Acid，FA)是一种小分子水溶性维生素，对 维持肿瘤细胞过度活跃的新陈代谢作用有重要。叶酸受体在大部分肿瘤细胞表面均存在 过量表达，而在正常细胞表面表达量很少。因此，如果将靶向分子FA链接到PEG末端得到 PEG-FA，然后再修饰到锂皂石表面，不仅可以利用PEG分子链的修饰提高材料的稳定性，降 低毒性，延长纳米颗粒在体内的循环时间，减少药物在到达肿瘤部位之前的代谢消耗，还能 够通过FA分子与肿瘤细胞表面FA受体的特异性结合实现载体对肿瘤细胞的特异性识别与 主动富集，实现肿瘤的靶向治疗。
[0004] 查阅相关文献可以发现，合成聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒作为 药物载体用于抗肿瘤药物输送与肿瘤靶向治疗的研究尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳 米颗粒及其制备和应用。所涉及的制备过程简单，条件温和。本发明的LM-PEG-FA/D0X能 够有效控制D0X的释放，对高叶酸受体表达的肿瘤细胞具有明显的靶向性和抑制效果，在 肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。
[0006] 本发明的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒，氨基化锂皂石 为（3-氨基丙基）二甲基乙氧基硅烷APMES修饰的锂皂石；聚乙二醇与叶酸的摩尔比为 1 : 0.4-1 : 0.8;聚乙二醇-叶酸的质量分数在45-55%。本发明的一种聚乙二醇-叶酸 修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒用于抗肿瘤药物D0X的负载，聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化 锂皂石纳米颗粒LM-PEG-FA和阿霉素盐酸盐D0X的质量比为2 : 1-4 : 1，在此条件下D0X 的负载效率为85-91% ·
[0007] -种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，包括下述步骤：
[0008] (1)将叶酸溶解在溶剂中，加入1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅 拌4-6h，得到混合溶液，然后逐滴加入聚乙二醇的溶液中，搅拌反应2-4d，透析，冷冻干燥， 得到聚乙二醇-叶酸；其中碳二亚胺盐酸盐与叶酸的摩尔比为13 : 1-16 : 1，投入的叶酸 与聚乙二醇的摩尔比为1 : 1-1 : 2;
[0009] (2)向聚乙二醇-叶酸PEG-FA的溶液加入1-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺 盐酸盐EDC，搅拌2-4h，得到混合溶液，然后逐滴加入氨基化锂皂石纳米颗粒LM-NH 2的水溶 液中，搅拌反应2-4d，透析，得到聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-PEG-FA ; 其中投入的碳二亚胺盐酸盐与叶酸的摩尔比为10 : 1-12 : 1，投入的聚乙二醇-叶酸与氨 基化锂皂石纳米颗粒的质量比为0.5 : 1-0. 6 : 1。
[0010] 所述步骤（1)中的溶剂为二甲基亚砜DMS0,步骤（1)中所述的聚乙二醇PEG的溶 液溶剂和步骤（2)中聚乙二醇-叶酸的溶液溶剂为二甲基亚砜DMS0。
[0011] 所述步骤（1)中的聚乙二醇PEG为NH2-PEG-C00H，分子量大小为2000。
[0012] 所述步骤⑴中的FA溶液浓度为5-8mg/mL。
[0013] 所述步骤⑴中得到的PEG-FA中PEG和FA的摩尔比为1 : 0.4-1 : 0.8。
[0014] 所述步骤（2)中的氨基化锂皂石纳米颗粒LM_NH2为（3-氨基丙基）二甲基乙氧 基硅烷APMES修饰的锂皂石LAP。
[0015] 所述步骤（2)中的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-NH2的水溶液浓度为6-8mg/mL。
[0016] 所述步骤（2)中所得到的LM-PEG-FA中，PEG-FA的质量分数在45-55 %。
[0017] 所述步骤（1)和步骤（2)中的搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为100-150r/min。
[0018] 所述步骤⑴和步骤（2)中的透析为纯水透析，透析袋截留分子量大小为 8000-14000,透析时间为 2-4d。
[0019] 所述步骤⑴和步骤⑵中的反应条件为避光反应。
[0020] 本发明的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应用，将聚乙二 醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-PEG-FA水溶液加入阿霉素盐酸盐水溶液，搅拌 12-24h，离心，洗涤并分散，得到负载阿霉素盐酸盐的聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂 石纳米颗粒LM-PEG-FA/D0X，其中LM-PEG-FA和D0X的质量比为2 : 1-4 : 1。
[0021] 所述聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-PEG-FA水溶液的浓度为 2-6mg/mL，阿霉素盐酸盐的水溶液浓度为l-2mg/mL。
[0022] 所述搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为100_150r/min ;离心的速率为8000-10000r/ min,离心的时间为5min。
[0023] 所得到的LM-PEG-FA/D0X中，LM-PEG-FA纳米颗粒对D0X的负载效率为85-91 %。
[0024] 锂阜石（Laponite，LAP)属于粘土类纳米颗粒，具有良好的生物相容性，并且被证 实可以高效负载药物，是一种具有广泛应用前景的药物载体。LAP经过修饰可以得到表面 氨基化的锂皂石纳米颗粒LM-NH 2，它继承了 LAP作为药物载体的全部优良性质，并且便于进 一步修饰。然而，LM-NH2本身没有对肿瘤的主动靶向效果，因此，将靶向分子连接到lm-nh 2 表面，得到具有主动靶向效果的多功能锂皂石纳米颗粒用于药物负载，是改善抗肿瘤药物 载体LM-NH2的有效途径。本发明将PEG-FA连接到LM-NH 2表面，得到的LM-PEG-FA不仅可 以通过叶酸的靶向作用被肿瘤细胞主动摄取，同时引入的长链聚合物PEG可以延长载体在 体内循环时间，降低材料毒性，提高材料稳定性，改善药物释放特性，并且还可以有效减少 FA与FA受体结合时的空间位阻，提高LM-PEG-FA/DOX与高叶酸受体表达的肿瘤细胞的亲和 力。本发明的LM-PEG-FA载体用于抗肿瘤药物负载，对高叶酸受体表达的肿瘤细胞具有良 好的靶向效果，可作为理想的靶向纳米载体，实现药物、基因或诊断分子探针的负载与靶向 输送。
[0025] 本发明使用紫外-可见光分光光度计、1Η核磁分析、热重分析、Zeta电势测量、紫 外-可见光谱测试等方法表征本发明制备的靶向修饰的锂皂石纳米颗粒，同时用刃天青还 原法、流式细胞术分析和激光共聚焦显微镜来检验载药的锂皂石纳米颗粒对表面叶酸受体 高表达的人卵巢癌细胞（SK-0V-3细胞）的毒性与靶向性。具体测试结果如下：
[0026] (1)表面电势和水合粒径测量
[0027] 修饰前后粒子的粒径以及表面电势均通过动态光散射进行测定，结果如表1所 示。经硅烷偶联剂修饰后，锂皂石的表面电势从-37. 9mV变到-2. 4mV，这是由于APMES带 正电荷，修饰到LAP表面后可以屏蔽LAP表面的部分负电荷，导致了材料表面电势的变化。 在表面进一步修饰了 mPEG之后，所得到的LM-mPEG表面电势降低到-5. 34±2. 20mV。在 修饰了 PEG-FA之后，表面电势进一步降低到-7. 74±0. 73mV。因此，通过修饰前后的电势 变化也可以证明氨基化锂皂石表面已成功修饰了 mPEG和PEG-FA。另一方面，由于所修饰 的mPEG和PEG-FA具有较大的空间位阻，得到的LM-mPEG和LM-PEG-FA的颗粒粒径分别为 153. 8±4. 6nm 和 242. 8±10. 2nm，较 LM-NH2(76. 6±4. 5nm)有了较大幅度的增长。颗粒粒 径的变化也证明了 mPEG和PEG-FA可以成功的修饰到氨基化锂皂石表面。另外，表面修饰 后锂皂石的较小且具有较好的分散性，因此，仍是一种良好的载体材料。
[0028] 表 1 LAP、LM-NH2、LM-mPEG、LM-PEG-FA 的水合直径和表面电势
[0029]
【权利要求】
1. 一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒，其特征在于：所述的氨基化锂 皂石纳米颗粒为（3-氨基丙基）二甲基乙氧基硅烷修饰的锂皂石；聚乙二醇-叶酸的质量 分数在45-55%，聚乙二醇与叶酸的摩尔比为1 : 0.4-1 : 0.8。
2. -种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，包括下述步骤： (1) 将叶酸溶解在溶剂中，加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌 4_6h，得到混合溶液，然后逐滴加入聚乙二醇的溶液中，搅拌反应2-4d，透析，冷冻干燥，得 到聚乙二醇-叶酸；其中碳二亚胺盐酸盐与叶酸的摩尔比为13 : 1-16 : 1，投入的叶酸与 聚乙二醇的摩尔比为1 : 1-1 : 2; (2) 向聚乙二醇-叶酸PEG-FA的溶液加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐 酸盐EDC，搅拌2-4h，得到混合溶液，然后逐滴加入氨基化锂皂石纳米颗粒LM-NH2的水溶液 中，搅拌反应2-4d，透析，得到聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-PEG-FA ;其 中投入的碳二亚胺盐酸盐与叶酸的摩尔比为10 : 1-12 : 1，投入的聚乙二醇-叶酸与氨基 化锂皂石纳米颗粒的质量比为0.5 : 1-0.6 : 1。
3. 根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方 法，其特征在于：步骤（1)中所述的溶剂为二甲基亚砜DMSO,步骤（1)中所述的聚乙二醇的 溶液和步骤（2)中聚乙二醇-叶酸的溶液溶剂为二甲基亚砜DMSO。
4. 根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方 法，其特征在于：步骤（1)中叶酸溶液浓度为5-8mg/mL。
5. 根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方 法，其特征在于：步骤（2)中氨基化锂阜石纳米颗粒的水溶液浓度为6-8mg/mL。
6. 根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备 方法，其特征在于：步骤（1)和步骤（2)中所述的搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为100-1501·/ min〇
7. 根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备 方法，其特征在于：步骤（1)和步骤（2)中所述的透析为纯水透析，透析袋截留分子量为 8000-14000,透析时间为 2-4d。
8. 根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方 法，其特征在于：步骤（1)和步骤（2)中所述的反应条件为避光反应。
9. 根据权利要求1所述的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应用， 其特征在于：将聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒水溶液加入阿霉素盐酸盐水 溶液，搅拌12-24h，离心，洗涤并分散，得到负载阿霉素盐酸盐的聚乙二醇-叶酸修饰的氨 基化锂皂石纳米颗粒，其中聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒和阿霉素盐酸盐 的质量比为2 : 1-4 : 1。
10. 根据权利要求9所示的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应用， 其特征在于：所述聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒水溶液的浓度为2-6mg/ mL，阿霉素盐酸盐的水溶液浓度为l-2mg/mL。
11. 根据权利要求9所示的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒 的应用，其特征在于：所述搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为100_150r/min ;离心的速率为 8000-10000r/min，离心的时间为 5min。
【文档编号】A61K9/14GK104147608SQ201410337210
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】史向阳, 吴一伦, 郭睿 申请人:东华大学