蝇蛆活性蛋白肽的制备方法与所制备的蝇蛆活性蛋白肽及其用途
【专利摘要】本发明提供了一种蝇蛆活性蛋白肽的制备方法，所述方法包括新鲜蝇蛆冷冻、解冻、磨浆、调节pH、抽提、离心分离、超滤、纳滤脱盐、浓缩、过滤除菌、冷冻干燥、分装制品获得蝇蛆活性蛋白肽等步骤。本发明方法操作简单，生产成本低廉，适用于大规模工业化生产，实现了从蝇蛆中高效制备蛋白肽的目的。本发明还涉及到通过本发明方法制备获得的蝇蛆活性蛋白肽，其具备对烧伤后的患者具有显著的皮肤再生修复功能的活性。本发明还涉及通过本发明方法制备的蝇蛆活性蛋白肽的用途，所述用途包括将所述蝇蛆活性蛋白肽在制备预防和/或治疗人类创伤性皮肤疾病的药物、食品、保健品或化妆品中的应用。
【专利说明】蝇蛆活性蛋白肽的制备方法与所制备的蝇蛆活性蛋白肽及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及从蝇蛆中制备高活性蛋白肽的方法与所制备的产品及其用途，属于蛋白质生物化学、医学和制药领域。
【背景技术】
[0002]家蚬(Musca demestica)是家蚬属(Musca)动物,是完全变态昆虫,其生活史包括卵、幼虫(蝇蛆)、蛹、成虫(苍蝇，Fly maggot)四个阶。蝇蛆在自然界中无所不在，具备完备的抗菌、生殖和损伤修复机制，有极强的环境适应能力。这种环境适应机制是家蝇在长期的进化过程中获得的。研究表明，蝇蛆体内含有强大的防卫机制，如抗菌肽、抗氧化能力的过氧化物酶和金属硫蛋白等、自我修复能力的表皮生长因子等。蝇蛆的这些功能性成分为疾病医疗应用提供了贵重的药物资源。蝇蛆疗法在清理伤口的医疗功效，主要起源于I860年初人类对蝇蛆活动在伤口产生正面效应的了解，其中的美国内战和1910年代的第一次世界大战期间，对受伤士兵的治疗。近年来医学界对蛆疗法的重新重视，主要是对于部分慢性伤口感染及一些对抗生素产生抗性的超级病菌的处理。虽然并不是所有的伤口感染都适合使用蝇蛆疗法，但国外已有许多医院开始使用这类方法，治疗一些如糖尿病患者的慢性溃疡伤口、褥疮、烧烫伤，或是如福耳尼坏疽等难缠的发炎，有的治疗也已获得了很好的效果。蝇蛆在伤口上的医疗机制，一般认为至少具有清除坏死组织、抗菌和加速愈合等功效。在使用蝇蛆疗法时，最大的挑战除了病患的心理障碍外，应该就是如何取得安全卫生的医用无菌蛆。到目前为止，虽然还无法了解蝇蛆在治疗伤口时的完整机制，但最近的研究显示蛆虫的分泌物质有高度抗菌效果，且有极佳的稳定性，可能有开发成为新一代抗超级病菌药剂的希望。
[0003]在制备方法方面，CN103555798公开了一种制备蝇姐蛋白肽的方法，该方法采用了，新鲜蝇蛆活性蛋白肽肽经过清洗、破碎、热处理、酶解、灭酶等步骤后，用陶瓷膜分离技术对酶解液进行分离和纯化，然后经浓缩以及喷雾干燥等步骤。但方法的缺点是所制备的高温干燥粉碎法和灭酶来纯化蝇蛆活性蛋白肽肽，所制备的蛋白在制备过程中彻底变性。相类似的方法的还有很多。利用变性的蝇蛆活性蛋白肽肽所制备药物必然治疗的效果差，治疗周期差，给患者带来更多的痛苦和药费的损失。在生产上带来更多的成本消耗。因此现有技术中，急需提供一种能够保持蛋白活性的新型制备方法。以满足国际对蝇姐蛋白的食用、医用和美容化妆品的需求。基于现有技术存在的实质性缺欠，本发明在生产过程中，淘汰了使用高温干燥粉碎法，在低温(0-18°C)条件下，经去除杂蛋白以及多糖、胆固醇、月旨类物质等，制备蝇蛆活性蛋白肽肽。利用所制备的的蝇蛆活性蛋白肽，对皮肤损伤具有明显的修复功能的活性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种高品质(活性高见效快)的蝇蛆活性蛋白肽的制备方法所述方法所述方法包括新鲜蝇蛆冷冻、解冻、磨浆、调节pH、抽提、离心分离、超滤、纳滤、脱盐、浓缩、过滤除菌、冷冻干燥、分装制品步骤。
[0005]其中所述离心为离心力大于3000g的离心，优选为大于1000g的离心，更优选为大于20000g的离心。
[0006]在本发明的一个优选方面，磨浆后进行抽提，抽提前对磨浆液进行PH调整，pH可以调节为 6.0-8.0,例如 pH 为 6.2-7.8,6.4-7.8，合适的 pH 为 6.5-7.5，优选为 6.8-7.5。调PH值是因为蝇蛆的活性多肽绝大多数溶解在液体中，便于与水不溶物分开。调节pH可以用常用的酸或碱溶液。
[0007]在本发明的一个具体方面，本发明所述的方法包括如下步骤:
[0008]I)饲育的鲜活蝇蛆，尽量用适当孔径的萝筛去除杂质，装入编织袋，于_20°C进行冷冻保藏；
[0009]2)按每公斤冷冻蝇蛆加3-5升去离子水或缓冲液溶解冻块，再用胶体磨磨浆，保持温度在2-8°C，且磨浆后，调节pH至6.8-7.5，静止保持0.5-4小时，进行抽提；
[0010]3)用14000转/分(=12000g)高速离心机离心30-60分钟，收集上清液体；
[0011]4)调pH值至6.8-7.5，用6万道尔顿分子量截流的滤膜超滤，收集透过液；
[0012]5)用400-500道尔顿之间的纳滤膜浓缩，并反复洗涤蛋白肽3_5次；
[0013]6)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
[0014]在本发明的进一步具体方面，所述方法的具体步骤为:
[0015]I)饲育的鲜活蝇蛆，尽量用适当孔径的萝筛去除杂质，装入编织袋，于_20°C进行冷冻保藏；
[0016]2)按每公斤冷冻蝇蛆加3-5升去离子水或缓冲液溶解冻块，再用胶体磨磨浆，保持温度在约4°C，且磨浆后，调节pH至7.2，静止保持2个半小时，进行抽提；
[0017]3)用14000转/分高速离心机离心40分钟，收集上清液体；
[0018]4)用6万道尔顿分子量截流的滤膜超滤，收集透过液；
[0019]5)用400-500道尔顿之间的纳滤膜浓缩，并反复洗涤脱盐蛋白肽4次；
[0020]6)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
[0021]在本发明的另一个方面，通过本发明的方法提供了一种蝇蛆活性蛋白肽，其具有对创伤皮肤的修复功能的活性。
[0022]在本发明的一个方面，提供一种通过本发明方法制备的蝇蛆活性蛋白肽的用途，所述用途包括制备预防和/或治疗人类创伤性皮肤疾病的含有所述蝇蛆活性蛋白肽的药物、食品、保健品或化妆品中的应用。
[0023]在本发明的又一个方面，所述的用途还包括将所述药物、食品、保健品或化妆品制备成口服制剂、外用制剂、吸入制剂、经鼻制剂、经直肠制剂、经皮制剂或注射制剂，优选为外用剂型。
[0024]在本发明的又一个方面，所述的用途还包括每天对人施用预防和/或治疗有效量的约lug/kg至约10000mg/kg体重的蝇蛆活性蛋白肽。
[0025]本发明中的冷冻干燥目的是完全保留蛋白肽生物活性，因为高温能破坏蛋白肽的结构甚至变性失活。
[0026]本发明的方法操作简单，生产成本低廉，适用于大规模工业化生产，实现了从蝇蛆中高效制备活性蛋白肽工艺。离心和过滤所得到的滤液由于不含有任何有害物质，不会污染环境。本工艺产生固形废弃物，可加热干燥制备高蛋白营养饲料。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1、蝇蛆活性蛋白肽肽生产工艺线路图。
[0028]图2、小鼠创伤愈合治疗试验。
[0029]图3、小鼠创伤愈合期内的组织切片观察。
[0030]图4、本发明制备蝇蛆活性蛋白肽对2个烧伤病例的治疗效果。
【具体实施方式】
[0031]为了提供对本发明的实质性理解，在下文中以不同的详细程度描述了本发明的某些方面、模式、实施方式、变型和特征。
[0032]在实施本发明的过程中，使用了生物化学、蛋白质生物化学、医学、病理学、动物实验学的很多传统技术。这些技术是熟知的。
[0033]在本发明的一个实施方式中，提供了一种蝇蛆活性蛋白肽的制备方法，所述方法包括新鲜蝇蛆冷冻、解冻、磨浆、调节pH、抽提、离心分离、超滤、纳滤、脱盐、浓缩、过滤除菌、冷冻干燥、分装制品步骤，其具体工艺流程如图1所示。
[0034]术语“一”，“一种”和“该”:除非内容清楚指明，否则本说明和所附的权利要求中使用的单数形式“一”，“一种”和“该”包括复数的引用对象。例如，本文所提及的“一种蝇蛆活性蛋白肽”包括同一批次繁殖的，不同批次繁殖后制备的蝇蛆活性蛋白肽的组合等。
[0035]本发明可以直接使用新鲜的蝇蛆体。术语“一种蝇蛆体”或“蝇蛆体”是指家蝇在其繁殖生活史中的任何阶段的某一个体，或者同一批繁殖，或者不同批繁殖的所有个体的的集合。可以是一个家蝇，也可以是无数个家蝇的的集合体。
[0036]术语“低温”是指将温度控制在标准的室温以下，即约摄氏25°C以下。因此，如果以温度值来表示低温通常是指在摄氏0°c -25°C之间的任何温度，例如，摄氏0°C -20°c，或摄氏0°C -18°C之间，适合地低于约摄氏10°C，例如例如在0°C以上至约9°C之间，适合地在约1°C至约8°C，适合地在约2°C至约8°C之间，优选在约2°C至约6°C之间，更优选在2°C至约4°C之间。
[0037]在本发明的又一实施方式中，提供了蝇蛆体的低温冷冻的保持方法。家蝇低温冷冻保可以预防腐败。将所述蝇蛆体在低于约0°c (比如液态氮)的温度下冷冻保藏，例如在(TC以下至约-180°c之间，适合地在约-10°c至约-180°c，更适合地在约-15°C至约-180°C之间，优选在低于约_20°C至低于约-25°C之间冷冻保藏。时间可以是任何时间，同时与冷冻保藏的温度、蝇蛆体的冻结状态和生产需要有关，温度越低需要冷冻保藏时间短。例如在低于约_20°C保持过夜(8-12小时)或者I至5天，5至7天甚至I个月或2个月以上。
[0038]保存时可以添加冻存保护剂以防止冷冻变性。常用防止蝇蛆体的防护剂本文仅为举例但不限于例如糖类和/或糖醇类。
[0039]所述糖类可以是白砂糖、木糖、葡萄糖、聚葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、异麦芽酮糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、低聚果糖、木糖、异麦芽糖、低聚麦芽糖、低聚异麦芽糖、异麦芽酮糖、低聚半乳糖(半乳寡糖)、甘露低聚糖(甘露寡糖)、低聚木糖(木寡糖)、淀粉、纤维素、肝糖原、肌糖原、蛋白多糖、蜂蜜等，这些甜味剂可以单独使用或者由上述甜味剂组成的组的一种或两种以上混合使用；优选为使用白砂糖、海藻糖、木糖、果糖、半乳糖、异麦芽糖、低聚麦芽糖、低聚异麦芽糖、异麦芽酮糖、聚葡萄糖，更优选为海藻糖、异麦芽糖、低聚麦芽糖、低聚异麦芽糖、异麦芽酮糖、和/或聚葡萄糖。用于本发明的糖醇类可以是赤藓糖醇(赤藻糖醇)、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖醇、葡萄糖醇、异麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇和异麦芽酮糖醇，优选为赤藓糖醇、山梨糖醇、异麦芽糖醇，更优选为赤藓糖醇和/或异麦芽糖醇。如果胎盘组织为1000重量份来计算，糖类和/或糖醇类可以为20-80重量份，合适为20-70重量份，优选为20-65重量份，更优选为20-50重量份，最优选为25-50重量份。
[0040]在本发明的又一个实施方式中，蝇蛆体进行解冻，解冻通常加入去离子水或者缓冲液。为了减少后续工序，通常加入1-20倍的水或者缓冲液，适合地1-10倍，优选为5-10倍水进行解冻。然后，对解冻后蝇蛆体进行磨浆，磨浆是为了虫体活性蛋白肽成分充分释放进入液体中。磨浆是在胶体磨中进行，转数通常低于5000转，例如50-4500转，合适为100-3500转，优选为500-3000转。但有时候为了快速磨浆，也会大于5000转。磨浆温度一般为低于18°C的低温中进行。因此掌握合适的解冻时间和保持水温特别重要。磨浆时间可以为4个小时以内.所述缓冲液为磷酸缓冲液、碳酸缓冲液、硼酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液坐寸ο
[0041]在本发明的一个优选实施方式中，磨浆后进行抽提，抽提前对磨浆液进行pH调整，pH可以调节为6.0-8.0,例如pH为6.2-7.8、6.4-7.8，合适的pH为6.5-7.5，优选为
6.8-7.5。调pH值是因为蝇蛆的活性多肽绝大多数溶解在液体中，便于与水不溶物分开。调节pH可以用常用的酸或碱溶液。
[0042]抽提的温度可以选择在室温中进行，也可以在低于室温下进行，低于20°C，优选低于10°C，更优选低于6°C，最优选低于4°C。
[0043]抽提时间依据抽提温度、抽提效果和蝇蛆活性蛋白肽性质来决定，例如0.5-24个小时,例如,0.5-20个小时，0.5-10个小时，0.5-4个小时；即使抽提超过24个小时也是可能的。
[0044]整个实验室的环境温度条件可以控制在1_18°C，例如1-16°C，1-14°C，1-10°C，优选低于8°C，更优选低于6°C，最优选低于4°C。
[0045]本发明的另一【具体实施方式】是对抽提后样品采用了离心操作，用高速离心机离心目的是除去不溶于水的多糖、杂蛋白等杂质。离心可以采用实验室常用的各种离心设备，例如真空离心机，或非真空离心机。也可采用冷冻离心机或者常温离心机。工业化生产的离心机。例如:高速连续离心机,此外离心机离心力的计算为本领域已知的技术。例如,离心机的转速和相对离心力计算公式为:RCF(g) = 11.18X (rpm/1000)2XR
[0046]其中:RCF是英文Relative Centrifugal Forece (相对离心力)的简称，通常以克(g)为单位。RPM为revolut1ns per minute的简称，即每分钟离心机的转了多少转。
[0047]2为开平方
[0048]R为离心机半径，例如水平离心机半径为离心机轴至试管底部的距离，；或垂直式离心机为离心机轴至试管口中央的距离，以厘米(cm)为单位来表示。
[0049] 例如水平离心机半径R = 10cm, rpm = 10000时，其RCF = 11180g
[0050]例如垂直式离心机半径R = 15cm, rpm = 10000时,其RCF = 16770g
[0051]通常离心力大小以g为单位进行计算转速的设定，离心力可以在10000g以上，例如，150000g以上，200000g以上，再例如350000g以上，也可在3000g至10000g之间，例如5000g至10000g之间，优选为10000g-100000g之间，更优选为20000g-100000g，例如在80000g 或 100000g。
[0052]离心温度可以可以选择在室温中进行，也可以在低于室温下进行，例如低于20°C，或低于15°C，优选为低于10°C，更优选为6°C，或低于4°C。
[0053]离心时间可以为任何时间，基于不能使离心时间过长导致过多的杂质沉淀而导致收量降低，同时过长时间也容易导致蝇蛆活性蛋白肽变性。通常选择I个小时以内，例如40分钟，30分钟，或20分钟。
[0054]离心后可以有效去除含有杂质的上清液，保留含有蝇蛆活性蛋白肽的沉淀粗品。
[0055]在本发明的又一个实施方式中，提供了对离心后蝇蛆活性蛋白肽的沉淀粗品的过滤浓缩方法，过滤采用了利用板筐压滤机和纳滤机过滤。常用的板筐压滤机有手动板框压滤机、机械板框压滤机和液压板框压滤机，同时采用纳滤机进行浓缩，常用的纳滤机有空心纤维柱式纳滤机和反渗透纳滤机。
[0056]本发明的再一个实施方式中，用6万道尔顿以上分子量截流的滤膜超滤，目的是进一步纯化蝇蛆活性蛋白肽，因为大于6万道尔顿的蛋白几乎在医疗、保健和化妆品应用没有实际意义，而且大分子量的蛋白会增加在水中的粘稠度，会降低后续产品的质量。
[0057]本发明的再一个实施方式中，对上述超滤液体进行纳滤浓缩。所述的纳滤浓缩包括浓缩和脱除低于500道尔顿的盐类、有机小分子杂质，步骤如下:先进行纳滤膜浓缩；然后不断加水稀释同时纳滤膜浓缩脱杂质；上述的纳滤膜为截留分子量在400-500道尔顿之间的纳滤膜，如此过程被重复3-5次，达到脱盐的目的。
[0058]本发明中的冷冻干燥目的是完全保留蛋白肽生物活性，因为高温能破坏蛋白肽的结构甚至变性失活。
[0059]在本发明的一个制造蝇蛆活性蛋白肽的【具体实施方式】中，其包括如下步骤:
[0060]I)饲育的鲜活蝇蛆，尽量用适当孔径的萝筛去除杂质，装入编织袋，于_20°C进行冷冻保藏；
[0061]2)按每公斤冷冻蝇蛆加3-5升去离子水或缓冲液溶解冻块，再用胶体磨磨浆，保持温度在2-8°C，且磨浆后，调节pH至6.8-7.5，静止保持0.5-4小时，进行抽提；
[0062]3)用14000转/分(=12000g)高速离心机离心30-60分钟，收集上清液体；
[0063]4)调pH值至6.8-7.5，用6万道尔顿分子量截流的滤膜超滤，收集透过液；
[0064]5)用400-500道尔顿之间的纳滤膜浓缩，并反复洗涤蛋白肽3_5次；
[0065]6)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
[0066]在本发明的制造蝇蛆活性蛋白肽的进一步【具体实施方式】中，所述方法的具体步骤为:
[0067]I)饲育的鲜活蝇蛆，尽量用适当孔径的萝筛去除杂质，装入编织袋，于_20°C进行冷冻保藏；
[0068]2)按每公斤冷冻蝇蛆加3-5升去离子水或缓冲液溶解冻块，再用胶体磨磨浆，保持温度在约4°C，且磨浆后，调节pH至7.2，静止保持2个半小时，进行抽提；
[0069]3)用14000转/分高速离心机离心40分钟，收集上清液体；
[0070]4)用6万道尔顿分子量截流的滤膜超滤，收集透过液；
[0071]5)用400-500道尔顿之间的纳滤膜浓缩，并反复洗涤脱盐蛋白肽4次；
[0072]6)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
[0073]在本发明的另一个实施方式中，提供了一种蝇蛆活性蛋白肽，所述蛋白通过通过本发明方法制备，且该蛋白具备对创伤性皮肤修复功能。
[0074]在对人类受试者进行测试之前，可以在合适的动物模型系统中测试治疗中所用的蝇蛆活性蛋白肽，所述动物受试者模型系统包括但不局限于非人灵长类(例如狒狒、猩猩、猴)；诸如猫、狗、蛇等的宠物动物；猪、马、牛、山羊等的农场动物；诸如大鼠、小鼠、猴、兔等的实验室动物的任何动物。在一个实施方式中，将蝇蛆活性蛋白肽给药至患有、或处于上述创伤性皮肤疾病的危险中(易得该症状的状态)的受试者，来试图改善造成该病理症状或疾病的一个或多个因素。
[0075]在本发明的另一个实施方式中，提供了通过本发明方法制备的蝇蛆活性蛋白肽的用途，所述的用途包括制备治疗受试者创伤性皮肤疾病的含有所述蝇蛆活性蛋白肽的药物、食品、保健品或化妆品中的应用。
[0076]术语“皮肤病”是指皮肤(包括毛发和甲)受到内外因素的影响后，其形态、结构和功能均发生变化，产生病理过程，并相应的表现出各种临床症状。皮肤病的发病率很高，但不注意，会严重影响健康和生活质量，少数较重甚至可以危及生命。
[0077]术语“受试者创伤性皮肤疾病”包括皮肤受到非正常外界因素影响，例如烧、烧、烫、冻、晒、刀刺割扎或手术后在皮肤上留下的损伤。
[0078]在本发明的另一个实施方式中，本发明所制备的蝇蛆活性蛋白肽可用于包括烧伤、烫伤、冻伤、晒伤、刀伤和/或手术创口伤口愈合治疗。
[0079]在本发明的另一个实施方式中，本发明所制备的蝇蛆活性蛋白肽作为保健品和化妆品原料，所述的保健品和化妆品用于治疗粉刺、面部炎症、青春豆、祛皱、美白、皮肤保湿、生发、乌发等。
[0080]在本发明的又一个实施方式中，将所述药物、食品、保健品或化妆品制备成口服制剂、外用制剂、吸入制剂、经鼻制剂、经直肠制剂、经皮制剂或注射制剂，优选为外用制剂。
[0081]所述外用制剂可以为涂抹剂型药物、霜剂、外敷、软膏、外用药水、液体喷雾剂和气喷雾剂等；或者用于局部给药的酊剂、创布、化妆品等剂型。
[0082]在本发明的再一个实施方式中，每天对人施用预防和/或治疗有效量的含有本发明所制备的蝇蛆活性蛋白肽，上述有效量可以为任何有效量，例如0.5ug/kg、lug/kg或10ug/kg人体重,合适地的有效量包括对人每天施用约lug/kg至约10000mg/kg体重的蝇蛆活性蛋白肽。
[0083] 本文中使用的术语“有效量”指的是足以获得所需的治疗和/或预防效果，例如引起预防或减轻与病理症状或疾病的症状的量。给药至受试者的组合物的量将取决于疾病的类型和严重性以及个体的性质，比如平时的健康情况、年龄、性别、体重和对药物的耐受力。所述量还取决于患病程度、严重性和类型。本领域技术人员将能够根据这些因素和其他因素来确定合适的剂量。所述组合物还可结合一种或多种其他的治疗化合物来给药。在本文描述的方法中，本发明的化合物可以给药至具有病理症状的一种或多种迹象或病理症状的受试者。例如，“治疗有效量”是指最小程度地减轻症状的生理作用的平均水平。优选地，上述受试者为人类。
[0084]实施例
[0085]实施例1
[0086]饲育的鲜活蝇蛆，尽量用适当孔径的萝筛去除杂质，装入编织袋，于-20°C进行冷冻保藏。
[0087]制备时候，取新鲜冷冻的蝇蛆1kg，加5升去离子水，搅拌解冻，用胶体磨磨浆，调PH7.2，14000转/分(=12000g)离心，取澄清液，用6万道尔顿分子量截流的滤膜超滤，穿过液用400-500道尔顿之间的纳滤膜浓缩到I升，再加入去离子水到5升，用400-500道尔顿之间的纳滤膜浓缩，并反复洗涤脱盐蛋白肽4次，最后浓缩到0.3升，用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，得蝇蛆活性蛋白肽0.05公斤成品。
[0088]实施例2
[0089]与实施例2的方法类似，饲育的鲜活蝇蛆，尽量用适当孔径的萝筛去除杂质，装入编织袋，于-20°C进行冷冻保藏；
[0090]取新鲜冷冻的蝇蛆5kg，加25升去离子水，搅拌解冻，用胶体磨磨浆，调pH7.2，14000转/分离心，取澄清液，用6万道尔顿分子量截流的滤膜超滤，穿过液用400-500道尔顿之间的纳滤膜浓缩到5升，再加入去离子水到25升，搅拌后纳滤浓缩，反复4次，最后浓缩到1.5升，冷冻干燥，得蝇蛆活性蛋白肽0.25公斤。
[0091]实施例3
[0092]与实施例2的方法类似，饲育的鲜活蝇蛆，尽量用适当孔径的萝筛去除杂质，装入编织袋，于-20°C进行冷冻保藏；
[0093]取新鲜冷冻的蝇蛆10kg，加50升去离子水，搅拌解冻，用胶体磨磨浆，调pH7.2，14000转/分离心，取澄清液，用6万道尔顿分子量截流的滤膜超滤，穿过液用纳滤机浓缩到10升，再加入去离子水到50升，搅拌后纳滤浓缩，反复4次，最后浓缩到2.5升，用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，得蝇蛆活性蛋白肽0.5公斤。
[0094]实施例5
[0095]实验为使用本工艺制备的蝇蛆活性蛋白肽肽进行初步的烧伤和创口愈合试验，以此检验我们制备的蝇蛆活性蛋白肽肽的应用效果。1.分为以下几个步骤:
[0096]分别各取5只2周龄雌雄BALB/c小鼠，在消毒和无菌的条件下，去皮制备平均为平方厘米大小人工创口，然后用2%浓度用量(含0.1 %尼伯金乙酯钠盐作防腐剂)的自制蝇蛆活性蛋白肽肽涂抹创伤处，每天一次，共30天，其中每两天测量伤口大小一次。对照组为只用0.1%尼伯金乙酯钠盐去离子水，在相同的条件下饲养。结果如图2显示的那样，试验组的伤口愈合明显好于对照组，在12天，试验组已经完全愈合，而对照组却留有约0.5平方厘米的疤痕伤口。经病理切片检测发现，试验组皮下组织上皮细胞增生，而对照组没有象试验组那样明显(见图3)，说明我们自制的蝇蛆活性蛋白肽肽能够很好地促进伤口愈合。
[0097]2、临床试验效果观察
[0098]本试验在吉林省通化东昌区江东医院进行的试验。因火灾I名患者腹部大面积烧伤(性别男，43岁，农民)，用2%浓度蝇蛆活性蛋白肽(含0.1%尼伯金乙酯钠盐作防腐剂，由实施例1制备)涂布烧伤处，用量？每天3次，连续实施I个月。另一例为也是因火灾使手臂烧伤(性别男，39岁，农民)，2%浓度蝇蛆活性蛋白肽(含0.1%尼伯金乙酯钠盐作防腐剂)涂布烧伤处，每天3次，连续实施I个月。上述2例烧伤均获得了理想的治疗，预后没有留下任何伤疤(见图4)。
[0099]本发明方法操作简单，生产成本低廉，适用于大规模工业化生产，实现了从蝇蛆中高效制备活蛋白肽的目的。本发明所制备的蝇蛆活性蛋白肽可用于伤口(包括烧伤、烫伤、开放性创伤、刀伤以及手术创口)愈合治疗、保健品和与预防和/或治疗粉刺、面部炎症、青春豆、祛皱、美白、皮肤保湿、生发、乌发等相关的化妆品产品的原材料。
[0100]本发明不局限在本申请中描述的特定实施方式，用作本发明的单独的方面的单一说明。本领域技术人员将理解，可以不脱离本申请的精神和范围的情况下进行各种修改和改动。根据以上描述，除了本文中列举的以外，本公开的范围内的功能上等同的用途对于本领域的本领域技术人员而言是明显的。这样的改动和修改意欲落在所附权利要求的范围内。本公开仅受所附权利要求以及与这样的权利要求的的范围所等同的全部范围限制。应当理解，本公开不局限于特定的方法、试剂、组合物和生物系统，当然，所述方法、试剂、组合物和生物系统可以变化。还可理解，本文中使用的术语仅用于描述特定的实施方式，不用来是限制性的。
[0101]本文所参考的或引用的所有专利、专利申请、在先申请和出版物通过引用而全文并入本文，包括所有的附图和表格，使得它们不与本说明书的明确教导相矛盾。在权利要求范围内提出其他的实施方式。
【权利要求】
1.一种蝇蛆活性蛋白肽的制备方法，所述方法包括新鲜蝇蛆冷冻、解冻、磨浆、调节pH、抽提、离心分离、超滤、纳滤、脱盐、浓缩、过滤除菌、冷冻干燥、分装制品步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述调节PH步骤是将磨浆液调节至pH6.8-7.5的步骤。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述离心为离心力大于1000g的离心。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述离心为离心力大于20000g的离心。
5.如权利要求1所述的方法，其中，其包括如下步骤: 1)饲育的鲜活蝇蛆，尽量用适当孔径的萝筛去除杂质，装入编织袋，于_20°C进行冷冻保藏； 2)按每公斤冷冻蝇蛆加3-5升去离子水或缓冲液溶解冻块，再用胶体磨磨浆，保持温度在2-8°C，且磨浆后，调节pH至6.8-7.5，静止保持0.5-4小时，进行抽提； 3)用14000转/分高速离心机离心30-60分钟，收集上清液体； 4)用6万道尔顿分子量截流的滤膜超滤，收集透过液； 5)用400-500道尔顿之间的纳滤膜浓缩，并反复洗涤蛋白肽3-5次； 6)用除菌过滤机除菌 ，冷冻干燥，分装制品。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法的具体步骤为: 1)饲育的鲜活蝇蛆，尽量用适当孔径的萝筛去除杂质，装入编织袋，于_20°C进行冷冻保藏； 2)按每公斤冷冻蝇蛆加3-5升去离子水或缓冲液溶解冻块，再用胶体磨磨浆，保持温度在约4°C，且磨浆后，调节pH至7.2，静止保持2个半小时，进行抽提； 3)用14000转/分高速离心机离心40分钟，收集上清液体； 4)用6万道尔顿分子量截流的滤膜超滤，收集透过液； 5)用400-500道尔顿之间的纳滤膜浓缩，并反复洗涤蛋白肽4次； 6)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装制品。
7.如权利要求1-6所述方法制备的蝇蛆活性蛋白肽，其中，所述蝇蛆活性蛋白肽具有对创伤皮肤的修复功能的活性。
8.如权利要求1-6所述方法制备的蝇蛆活性蛋白肽在制备预防和/或治疗人类创伤性皮肤疾病的药物、食品、保健品或化妆品中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，所述的用途还包括将所述药物、食品、保健品或化妆品制备成口服制剂、外用制剂、吸入制剂、经鼻制剂、经直肠制剂、经皮制剂或注射制剂，优选为外用剂型。
10.如权利要求8所述的用途，所述的用途还包括每天对人施用约lug/kg至约10000mg/kg体重的治疗有效量的蝇蛆活性蛋白肽。
【文档编号】A61K8/64GK104163847SQ201410342427
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年5月3日
【发明者】刘爽, 庞海, 庞玉, 邓小霞 申请人:吉林省金梓源生物科技有限公司