一种特异性针对Neutrokine-α蛋白的核酸适配体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种特异性针对Neutrokine-α蛋白的核酸适配体，其具有较好的结合Neutrokine-α蛋白的活性，可以用于制备成为试剂盒从而特异性的筛选以及去除Neutrokine-α蛋白。
【专利说明】—种特异性针对Neutroki ne- α蛋白的核酸适配体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体地说，本发明涉及用于治疗系统性红斑狼疮的多肽。
【背景技术】
[0002]系统性红斑狼疮(SLE)据认为是自体免疫疾病，其中B淋巴细胞的异常机能亢进和免疫球蛋白Y(IgG)自体抗体的大量异常产生起着关键作用。该病理学过程导致Ig包覆的细胞的隐没和破坏、补体蛋白的固定和切割以及化学吸引素(chemotaxin)、血管活性肽和破坏性酶在组织中的释放。
[0003]系统性红斑狼疮(SLE)并发动脉粥样硬化(AS)是SLE主要致死原因之一。早在1976年，人们已经注意到了 SLE死亡率曲线呈"双峰"模式，一个是在活动性狼疮早期阶段败血症的高发生率，另一个是非活动性狼疮晚期阶段心肌梗死的高发生率。尽管各种疾病控制措施大大提高了系统性红斑狼疮患者的生存率，然而AS仍然是导致SLE患者死亡的主要原因。红斑狼疮的病例对照(年龄，种族，和性别相匹配)研究表明:在年龄小于50岁的红斑狼疮的患者中，31-37%患者表现出AS病变的代表性标志物，而对照组中仅有9-15%的人群表现出这种代表标志物；在年龄大于或等于50岁的患者中，70-80%的狼疮患者表现出动脉粥样硬化病变的代表性标志物，而对照人群中只有21-45%的人具有这种代表性标志物。
[0004]SLE的特征在于多样性表现形式。在疾病进程中，总共95%的患者诉有肌肉骨骼疾病，80 %表现出皮肤损伤，85 %有血液疾病，60 %有神经紊乱，60 %有心肺疾病，30 %~50%有肾脏疾病，40%有胃肠道疾病，15%有血栓且15%有眼部疾病。大多数的患者(95% )还经受在大多数时候均存在的系统性症状，如疲倦、不适、发烧、厌食和体重减轻。多数患者经历突发与缓解交替的疾病期。永久性缓解(不治疗时没有症状)极为罕见。超过50年之前，多数诊断为SLE的患者存活少于5年。现在，10年存活超过90%，这主要是基于早诊断、对症抗炎和免疫抑制治疗。常见死因为免疫抑制造成的感染。
[0005]研究结果显示:包括高血压、肥胖、糖尿病、吸烟、高胆固醇血症、绝经后状态等在内传统危险因素均不能完全解释红斑狼疮患者中冠心病加重的原因，而系统性红斑狼疮本身(非长期使用糖皮质激素的情况下)依然是一个独立危险因素。尽管疾病病程与系统性红斑狼疮损伤指数都是促进动脉粥样硬化(颈动脉斑块)的独立预测因素，但狼疮如何增加动脉粥样硬化的发生风险尚未完全明了。
[0006]在SLE治疗中常规使用抗疟疾药、抗炎药和免疫抑制药物。当症状难以控制时，对非甾体抗炎剂补充以皮质激素。此外，主要器官受累的活跃的SLE需要采用环磷酰胺的激进性疗法。
[0007]迄今为止，还没有可用于治愈SLE和/或在长期基础上改善患者的生活品质的病因性治疗。然而，近来在抗体技术中的发展和对引起该自体免疫疾病的因素的进一步鉴定已经开启了使用单克隆抗体作为治疗选择的可能性。特别地，治疗SLE的有利方法将是与导致多克隆自体抗体的大量过度产生的病理性免疫响应相互作用或将其纠正的特异性治疗。由于SLE的发病机理主要涉及失调的B细胞，特别受关注的是能够靶向B细胞的单克隆抗体。潜在的B细胞表面抗原靶标是⑶19、⑶20、⑶21和⑶22。此外，IL-10、IL-1ra,IL-12是调节免疫响应的重要细胞因子，且尤其在SLE患者的突发期间升高。IL-10和抗双链DNA(dsDNA)的自体抗体的血浆水平往往反映患SLE的患者的疾病活跃性。升高的IL-10水平与SLE患者的疾病活跃性相关(Park等，Clin.Exp.Rheumatol.1998年5月-6月；16(3):283-8)。然而，IL-10是对免疫系统具有多效性的细胞因子，且已知其还参与降低促炎性响应。
[0008]已对SLE患者进行了采用单克隆抗体的临床试验。特别地，几种试验涉及抗体利妥昔单抗(Rituximab)，一种用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的嵌合小鼠抗CD20单克隆抗体。Robak和Robak(2009)注意到，这些试验的结果显示出该抗体在SLE患者中较高的活性，且已开发了数种新的靶向⑶20的抗体(Ofatumumab、IMMU-106和GA-101)。其它报道了单克隆抗体在SLE中的活性的临床试验采用抗CD22抗体、依帕珠单抗(Epratuzumab)、抗TNF α 抗体、英夫利昔单抗(Infliximab)、抗 IL-10 抗体、Β-Ν10 (Llorente 等,ArthritisRheum.2000 年 8 月；43(8):1790-800)、抗 CD40L 抗体、IDEC 131 和 BG 9588、BLYS 抑制剂、贝利单抗(Belimumab)、抗IL6受体抗体、妥克利母单抗(Toclimumab)和抗C5抗体依库珠单抗(Eculizumab)完成。
[0009]Neutrokine-α蛋白(SEQ ID NO:1)是TNF配体家族的一个成员，其与APRIL (28.7% ),TNFa (16.2% )、和淋巴毒素-a (LTa) (14.1% )享有氨基酸序列相同性(Moore, et al., (19 99) Science 285:260-263)。Neutrokine- α 的正式名称是肿瘤坏死因子(配体)超家族成员13B(TNFSF13b)。全长Neutrokine-α基因编码285个氨基酸的多肽，其第47位到73位氨基酸之间为跨膜区，跨膜区前面为II型膜结合蛋白特征性的非疏水性序列。和TNF家族的其他成员一样,Neutrokine-α以三聚体蛋白的形式发挥作用。当Neutrokine-α在细胞表面表达之后，在第134位氨基酸处裂解细胞外区，以便释放出有生物学活性的三聚体。
[0010]已知Neutrokine-α与来自肿瘤坏死因子受体超家族的三种不同受体结合。它们是跨膜活化物和CAM互作用体、B细胞活化因子受体、B细胞成熟抗原。受体的表达主要限定于B淋巴细胞。相信Neutrokine-α的大部分作用都是由BAFF-R介导的，因为在Neutrokine-α表达缺陷或BAFF-R表达缺陷小鼠的B细胞组分中的主要缺陷在TACI或BCMA缺陷小鼠中并不明显。
[0011]当在体外和体内检测Neutrokine-α蛋白时,Neutrokine-α显示出能促进B细胞的增殖、分化和生存。另外,Neutrokine-α也显示出一些对T细胞的作用。被遗传工程化成过度表达Neut1kine-α的小鼠具有增加数目的外周B细胞和增高的免疫球蛋白浓度。另外，Neutrokine-α转基因小鼠表现出自身免疫表型，其与人系统性红斑狼疮中看到的类似，包括发生自身抗体和肾小球肾炎相关症状。后来的研究显示在自身免疫病例如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎和干燥综合征患者的血清和/或滑膜液中的Neutrokine-α水平也是被上调的。因此，在科学界普遍的看法是Neut1kine-α拮抗剂在治疗自身免疫病方面具有治疗作用。
[0012]发明详述
[0013]本发明的目的在于提供能够特异性结合Neutrokine-α蛋白的适配子,从而实现将人体中Neutrokine- α被结合、分离或者功能被抑制，从而达到治疗系统性红斑狼疮、类风湿关节炎的效果。
[0014]所述能识别Neutrokine-α蛋白的寡核苷酸序列,包括SEQ ID N0.2_15，且采用其中的一条寡核苷酸序列就能完成对Neutrokine-α蛋白的识别检测；
[0015]所述一组能识别Neutrokine-α蛋白的寡核苷酸序列的制备方法包括以下步骤:
[0016]1、合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTC——
[0017]N35——GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中 N35 为 35 个随机寡核苷酸；
[0018]2、将寡核苷酸文库分别与Neutrokine- α蛋白混合后进行SELEX筛选，获得适配子富集文库；
[0019]3、SELEX筛选完成后，对获得的适配子富集文库进行克隆测序；
[0020]4、选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证，筛选获得能识别Neutrokine-α蛋白的寡核苷酸序列。
【具体实施方式】
[0021]实施例:
[0022]1、Neutrokine-α 蛋白的制备
[0023]采用本领域技术人员熟知的酵母重组表达的方式获得具有与Neutrokine-α蛋白相同生物活性的Neutrokine-α蛋白，该蛋白序列如SEQ ID NO:1所示；蛋白溶液的浓度为 10mg/mlo
[0024]2、文库和引物的合成
[0025]2.1、合成用于筛选的 ssDNA寡核苷酸文库(5' -AATTCACTTACTTAACCAATCCGG——N35——ACACAAGAGTGAGAATTAGAGCG-3')，其中 N35 为 35 个随机寡核苷酸；
[0026]引物Pl:AATTCACTTACTTAACCAATCCGG ；
[0027]引物P2: CGCTCTAATTCTCACTCTTGTGT。
[0028]2.2、适配子的SELEX筛选，具体方法如下:
[0029]2.2.1ssDNA与Neutrokine-α蛋白的结合、分离，具体方法如下:
[0030]取100μΜ的ssDNA寡核苷酸文库4μ L，用2Χ结合缓冲液稀释至100 μ 1，95 °C变性5min,冰浴1min后加入100 μ I Neutrokine- α蛋白，摇床结合50min,再6000rpm离心7min,弃上清,然后用IX结合缓冲液洗沉淀,弃上清；在沉淀中再加入IX结合缓冲液100 μ L,96°C加热5min,然后15000rpm离心1min,取上清液,对沉淀再次加热并离心,合并上清液，则可分离得到与Neutrokine-α蛋白有亲和力的ssDNA次级文库；所述2X结合缓冲液为20 X结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述IX结合缓冲液为20 X结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20X结合缓冲液配方为IM NaCl、50mM KCl、500mMTris-HClUOmM MgCl2, pH 7.4。
[0031]2.2.2 ssDNA与Neutrokine-α蛋白的结合、分离，具体方法如下:
[0032]将步骤2.2.I分离得到的能与Neutrokine-α蛋白结合的ssDNA,再与100 μ INeutrokine-α蛋白摇床结合30min,后续步骤同步骤2.2.1,可分离到与Neutrokine-α蛋白有亲和力的ssDNA次级文库。
[0033]2.2.3不对称PCR扩增ssDNA，具体方法如下:
[0034]对步骤2.2.2分离获得的ssDNA次级文库进行不对称PCR扩增，总体积为25 μ I的不对称 PCR 扩增体系为:10XPCR 缓冲液:2μ I ；Ρ1(10μΜ):1μ I ；Ρ2(0.2μΜ):1μ I ；dNTP (各 2.5mM):0.4μ I ；MgCl2(25mM):1.2μ I ;ssDNA 模板(0.2 μ g/ μ I):2μ I ；Taq DNA聚合酶(5ιι/μ I):0.2μ I ；ddH20:17.2μ I ;PCR 反应参数:94°C预变性 4min，然后进行 40个循环94°C变性30s，58。。退火30s，72。。延伸20s，最后72°C延伸7min ；
[0035]2.2.4亲和力的测定，具体方法如下:
[0036]2.2.4.1扩增:用带有地高辛标记的引物Pl不对称PCR扩增筛选出来的ssDNA次级文库，扩增条件和参数与步骤2.2.3的不对称PCR扩增体系和参数相同；
[0037]2.2.4.2与蛋白结合:取步骤2.2.4.1扩增所得的PCR产物100μ L，95°C变性5min,冰浴1min后加入100 μ L蛋白中，充分混合,在室温下结合30min,然后6000rpm离心，分离蛋白与上清液，蛋白中包含有与蛋白中结合的带地高辛标记的ssDNA，上清液中是未结合的ssDNA，同时做一不加ssDNA的空白，即用2 X结合缓冲液代替PCR产物，同样进行上述操作；
[0038]2.2.4.3洗涤:将蛋白用IX结合缓冲液500 μ L洗涤I次，6000rpm离心，弃上清，
取蛋白；
[0039]2.2.4.4与酶标兔抗地高辛抗体结合:在蛋白中加入100 μ L1:900TBS稀释的过量的酶标兔抗地高辛抗体，充分混合后，反应lOmin，使之与蛋白中的地高辛标记的ssDNA结合；
[0040]所述TBS为0.5M Tris-NaCl溶液，配制方法为:先水溶8.5~9g NaCl,再加Tris-HCK0.5M, ρΗ7.6)溶液 100ml，最后加水定容至 IL ；0.5M Tris-HCl (ρΗ7.6，100ml)溶液配制方法:称取Tris 6.06g,加入双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至7.6，定容至10mlo
[0041]2.2.4.5洗涤:6000rpm离心，去上清，再用IX结合缓冲液500 μ L洗涤3次，得蛋白；
[0042]2.2.4.6ΤΜΒ (四甲基联苯胺)显色:加入400 μ L双蒸水重悬蛋白，再加入200 μ LTMB显色液，避光显色1min后，以2mol/L H2S04200 μ L终止反应，测定450nm处的吸光值0D450，该值即反映与菌结合的ssDNA的亲和力，即OD结合，空白同样进行上述步骤
2.2.4.3,2.2.4.4,2.2.4.5和2.2.4.6，得到空白相应的吸光度OD空白；
[0043]所述TMB显色液使用常规的配制方法配制。
[0044]2.2.4.7测定PCR产物中DNA的摩尔浓度:取步骤2.2.4.1扩增所得的PCR产物，以已知浓度梯度的初始ssDNA文库为标准品，用Bandscan软件作为图像分析软件，采用溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳法定量测定PCR产物中的DNA含量，获得相应DNA的摩尔浓度，进而可以计算出10yL PCR产物中的DNA摩尔数。
[0045]2.2.4.8计算相应文库的亲和力:
[0046]
【权利要求】
1.一种用于适配子筛选的Neutrokine-α蛋白，其序列为SEQ ID Ν0:1所示。
2.—种识别Neutrokine-α蛋白的寡核苷酸序列,其特征在于为SEQ ID N0.2_15任一条序列所示。
3.权利要求2所示的寡核苷酸序列用于筛选Neutrokine-α蛋白的应用。
4.权利要求2所示的寡核苷酸序列制备得到的药物组合物、试剂或试剂盒。
5.权利要求4所示的寡核苷酸序列在制备用于治疗红斑狼疮的药物组合物、试剂或试剂盒中的应用。
【文档编号】A61K31/7088GK104177488SQ201410342519
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月13日 优先权日:2014年7月13日
【发明者】马海龙 申请人:马海龙