一种复合羊膜粉的制备方法及制备得到的复合羊膜粉的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种复合羊膜粉的制备方法，包括以下步骤：1)羊膜取材与清洗；2)保护活性因子；3)低温粉碎；4)冷冻干燥；解决了羊膜片粉碎过程细胞因子活性保护的问题，该复合羊膜粉材料羊膜活性因子得到保留，可在常温下保存，并可与多种粉状、液状、水性、油性药物或药用材料等进行复配，适用于微创介入或特殊创面修复的需求。
【专利说明】-种复合羊膜粉的制备方法及制备得到的复合羊膜粉
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学材料领域，尤其是涉及一种复合羊膜粉的制备方法及制备得 到的复合羊膜粉。
【背景技术】
[0002] 羊膜是胎盘的最内层，厚约0. 02?0. 5mm，在光镜和电镜下，可分为上皮层和基质 层，根据纤维排列结构及所含细胞不同，基质层又可分为基底膜、致密层、纤维母细胞层和 海绵层4层，基质层含有大量的胶原，主要为i、iii、iv、V、Vii型胶原和纤维粘连蛋白、层 粘连蛋白等成份，可为组织修复提供营养支持。
[0003] 羊膜上皮及基质含有一些生长因子如；碱性成纤维细胞生长因子化fgf)、肝细胞 生长因子化奸）和转化生长因子-目（tgf-目）等，该些因子能促进上皮化发生，有利于上皮 细胞的分化、移行和增强上皮细胞的粘附性，细胞因子是一类具有生物活性的蛋白质分子。
[0004] 研究显示；羊膜基质层含有独特的间质成份，能抑制转化生长因子目信号增生和 抑制正常人类角膜、角膜缘纤维母细胞的肌纤维母细胞的增殖及其向纤维细胞分化，因而 羊膜还具有抑制纤维化，减轻疲痕形成的功能。
[0005] 人羊膜上皮细胞表面不表达hla - a、b、C、化抗原或目2微球蛋白。表达ib抗 原、限制ia抗原，该些免疫学上的特点使羊膜无免疫原性。
[0006] 羊膜是可降解的天然高分子材料，其优良的生物学性状，使其作为一种宝贵的自 然资源具有开发应用的广阔前景。羊膜片移植不仅可W用于眼表重建，还可W用于促进肌 膊损伤修复，促进周围神经再生修复，促进骨膜生长及骨愈合，烧伤外科、整形外科、妇科、 泌尿外科等重建黏膜和皮肤组织，在干细胞研究及组织工程研究领域的应用也取得了可喜 成果。
[0007] 国内外羊膜的临床应用范围在不断拓展，由于羊膜移植片在一些微创手术中应用 受到限制，本发明采用人羊膜在保护剂中被低温加工成粉状，保留羊膜主要生物活性，使羊 膜粉能用于微创手术及介入材料，发挥羊膜在特殊部位的预防炎症，加速组织修复等应有 的功能。
[0008] 申请公布号为CN101316602A(申请号为200680044389. 3)的进入中国国家阶段的 PCT发明专利申请公开了羊膜制品和纯化的组合物及其使用方法，该专利具体公开的是胎 盘组织经匀浆、离也、冻干后制得一种含透明质酸（HA)、肿瘤坏死因子剌激基因6 (TSG-6)、 五聚环蛋白（PTX-3)和血小板反应蛋白（TSP-I)的纯化组合物及其应用，没有提及制备过 程活性蛋白的保护问题，该种方式存在的缺陷在于：
[0009] (1)胎盘、羊膜在粉碎过程中，局部高温和氧化会使羊膜本身的活性因子变性失 活。
[0010] (2)羊膜组织主要W胶原蛋白为主，是水不溶性的结构蛋白；羊膜上皮层及基质 中含有丰富的活性因子，即功能性蛋白，常用的活性蛋白保护剂种类很多，包括糖、氨基酸、 高分子材料、表面活性剂等，多数保护剂在加工过程中的耐酸、碱、盐、热等特性W及其控制 液体流变性质的能力都不能达到对羊膜粉的保护要求。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于提供一种复合羊膜粉的制备方法，解决羊膜片粉碎过程细胞因 子活性保护的问题，该复合羊膜粉材料羊膜活性因子得到保留，可在常温下保存，并可与多 种粉状、液状、水性、油性药物或药用材料等进行复配，适用于微创介入或特殊创面修复的 需求。
[0012] 本发明的另一个目的在于提供该方法制备得到的复合羊膜粉。
[0013] 本发明采用如下技术方案实现；一种复合羊膜粉的制备方法，包括W下步骤：
[0014] 1)羊膜取材与清洗；按标准（YZB/国1340-2013)进行羊膜取材，在洁净无菌环境 下，将新鲜羊膜用无菌生理盐水冲洗除去血溃，控干盐水；
[00巧]。保护活性因子；将黄原胶溶解在0. IM?1M、PH = 6. 8?7. 5的缓冲溶液中配 置质量浓度为0. Ol%?0. 5%的黄原胶溶液，将经过步骤1处理的羊膜置入该黄原胶溶液 中，羊膜与黄原胶溶液的质量比为1 ;1?100,旋转混合20min?30min，旋转混合的转速为 lOr/min ?lOOr/min ;
[0016] 3)低温粉碎：在-19(TC?-4C的低温环境下，将经过步骤2处理的羊膜和黄原胶 溶液的混合物进行磨碎处理，再在4C?IOC下过100目?200目筛，滤过液在4C?IOC 下离也脱水5min?IOmin,离也脱水的转速为8000r/min?1500化/min,得离也沉淀物；
[0017] 4)冷冻干燥；将步骤3中制得的离也沉淀物冷冻干燥至含水量为3%?10%，即 制得复合羊膜粉。
[0018] 进一步的，步骤2中所述缓冲溶液为磯酸二氨轴/磯酸氨二轴、巧樣酸/巧樣酸轴 中的一种。
[0019] 进一步的，步骤3中所述低温环境是通过液氮或干冰制造。
[0020] 进一步的，步骤3中所述磨碎处理是通过球磨机或匀浆机进行研磨处理。
[0021] 本发明所述的复合羊膜粉的制备方法制备得到的复合羊膜粉。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0023] (1)本发明采用黄原胶与羊膜组合，使羊膜在低温粉碎过程中，活性蛋白的琉基 受到黄原胶的物理屏障的保护，减少了活性基团的氧化，与新鲜羊膜相比活性因子保留了 30%?60%，而常规方法制备的羊膜粉与新鲜羊膜相比活性因子只保留了不到10%，显 然，本发明方法制备的复合羊膜粉保留的活性因子远远高于常规方法制备的羊膜粉，制成 的复合羊膜粉用于临床仍具有预防、减轻炎症，加速组织修复等功能；
[0024] (2)黄原胶还赋予复合羊膜粉假塑性，该特性是由于黄原胶在低温、高剪切力的粉 碎过程中表现出高流变性，黄原胶的流变性能使不可溶的羊膜胶原成分较长期地息浮，粉 碎时新产生的微小羊膜颗粒迅速被黄原胶包裹，使保护性能达到最佳；粉碎完成后，混合物 迅速成为高黏、稳定的凝胶，该是其他保护剂不具备的特质，有利于羊膜低温粉碎、常温保 存；
[0025] (3)由于黄原胶、羊膜组合，使复合羊膜粉应用方便，可根据不同需要与其他药物 或药用材料进行复配，只要将本发明产品与加入的物质一起在旋祸混合仪上高速旋转，黄 原胶黏度下降，加入的物质可均匀稳定的分散到复合羊膜粉中，该一特性在临床应用中非 常方便，可随时将复合羊膜粉与多种粉状、液状、水性、油性药物或药用材料等进行复配，用 于微创介入或特殊需求的创面修复。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明一种复合羊膜粉的制备方法及制备得到的复合羊 膜粉作进一步的详细说明。
[0027] 实施例1
[0028] 按标准（YZB/国1340-2013)进行人羊膜取材，在洁净无菌环境下，将新鲜人羊膜 用无菌生理盐水冲洗除去血溃，控干盐水；将黄原胶溶解在0. 1M、PH = 6. 8的巧樣酸/巧樣 酸轴缓冲溶液中，配置质量浓度为0. Ol %的黄原胶溶液，将上述羊膜置入该黄原胶溶液中， 羊膜与黄原胶溶液的质量比为1 ;1，旋转混合20min，旋转混合的转速为l(K)r/min ;然后在 利用液氮制造的-19CTC的低温环境下，通过球磨机进行磨碎处理，再在4C下过200目筛， 滤过液在4°C下离也脱水5min，离也脱水的转速为150(K)r/min，得离也沉淀物；再将离也沉 淀物冷冻干燥至含水量为3%，即制得复合羊膜粉。本实施例中所用的人羊膜可W用其他动 物来源的羊膜替换。
[0029] 复合羊膜粉中细胞因子含量分析实验：
[0030] -、标准液配置与标准曲线制作
[0031] 精密称取细胞因子标准品（均购自美国Merck公司），所述细胞因子标准品包括： a、重组人表皮生长因子；b、重组人成纤维细胞生长因子；C、重组人肝细胞生长因子；d、重 组人转化生长因子目；e、重组人膜岛素样生长因子；f、重组人血小板源性生长因子；g、重 组人血管内皮生长因子；K重组人神经生长因子；i、重组人睫状神经营养因子；j、重组人 脑源性神经营养因子；将不同量的细胞因子标准品加入到PH = 7. 4的PBS缓冲液中，配制 细胞因子的浓度分别为l、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ng/mL的标准液；采用放射免疫 分析法测定各标准液放射强度，制作标准曲线。
[00础二、样品处理
[0033] 复合羊膜粉及新鲜羊膜中加入PH = 7. 4的PBS缓冲液，制成相应的样品溶液，4°C 存放备用。
[0034] H、免疫放射分析实验
[00对 1)固相抗体制备
[0036] 用包被缓冲液（0. ImoVUPH = 9. 5的碳酸盐缓冲液）将细胞因子单克隆抗体（鼠 抗人表皮生长因子单克隆抗体，均购自美国Immulomedics公司）稀释成500mg/L，加入聚苯 己帰六角试管中，加量200 y L/管，置4°C冰箱过夜。次日，倾去包被液，W SOOy L/管加封 闭液（含1% BSA的0. 05mol/L、PH = 7. 4的磯酸盐缓冲液）37C封闭Ih ;弃去封闭液，自 然瞭干后备用。
[0037] 其中，单克隆抗体包括；a、鼠抗人表皮生长因子单克隆抗体，1251-鼠抗人表皮生 长因子单克隆抗体；b、鼠抗人成纤维细胞生长因子单克隆抗体，1251-鼠抗人成纤维细胞 生长因子单克隆抗体；C、鼠抗人肝细胞生长因子单克隆抗体，1251-鼠抗人肝细胞生长因 子单克隆抗体；t鼠抗人转化生长因子目单克隆抗体，1251-鼠抗人转化生长因子目单克 隆抗体；e、鼠抗人膜岛素样生长因子单克隆抗体，1251-鼠抗人膜岛素样生长因子单克隆 抗体；f、鼠抗人血小板源性生长因子单克隆抗体，1251-鼠抗人血小板源性生长因子单克 隆抗体；g、鼠抗人血管内皮生长因子单克隆抗体，1251-鼠抗人血管内皮生长因子单克隆 抗体；K鼠抗人神经生长因子单克隆抗体，1251-鼠抗人神经生长因子单克隆抗体；i、鼠抗 人睫状神经营养因子单克隆抗体，1251-鼠抗人睫状神经营养因子单克隆抗体；j、鼠抗人 脑源性神经营养因子单克隆抗体，1251-鼠抗人脑源性神经营养因子单克隆抗体。
[0038] 2)免疫放射分析程序
[0039] 在已包被相应抗体的包被管中加入100 y L相应细胞因子标准液或待测样品和 IOOy L 1251-鼠抗人表皮生长因子单克隆抗体，混匀，37C恒温反应化；弃反应液，用洗涂 液化02mol/L、PH = 7. 4的磯酸盐缓冲液）洗3次（每次500 y L)，吸水纸吸干管口残液， 用放射免疫分析仪测量包被管的放射性计数；W细胞因子浓度（ng/mL)为横坐标，各标准 点的结合率炬/T)为纵坐标，在双对数坐标纸上绘制标准曲线；根据样品的B/T，从标准曲 线上查出相应的细胞因子浓度，或使用仪器附带分析软件的计算程序直接获得待测样品中 相应细胞因子浓度。
[0040] 如试验结果
[0041] 复合羊膜粉和新鲜羊膜的各种细胞因子含量下表所示：
[0042]
【权利要求】
1. 一种复合羊膜粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 羊膜取材与清洗：按标准进行羊膜取材，在洁净无菌环境下，将新鲜羊膜用无菌生 理盐水冲洗除去血渍，控干盐水； 2) 保护活性因子：将黄原胶溶解在0. 1M?1M、PH = 6. 8?7. 5的缓冲溶液中配置质 量浓度为〇. 01 %?〇. 5 %的黄原胶溶液，将经过步骤1处理的羊膜置入该黄原胶溶液中，羊 膜与黄原胶溶液的质量比为1 :1?100,旋转混合20min?30min，旋转混合的转速为10r/ min ?100r/min ; 3) 低温粉碎：在_190°C?_4°C的低温环境下，将经过步骤2处理的羊膜和黄原胶溶液 的混合物进行磨碎处理，再在4°C?10°C下过100目?200目筛，滤过液在4°C?10°C下离 心脱水5min?lOmin，离心脱水的转速为8000r/min?15000r/min，得离心沉淀物； 4) 冷冻干燥：将步骤3中制得的离心沉淀物冷冻干燥至含水量为3%?10%，即制得 复合羊膜粉。
2. 根据权利要求1所述的复合羊膜粉的制备方法，其特征在于，步骤2中所述缓冲溶液 为磷酸二氢钠/磷酸氢二钠、柠檬酸/柠檬酸钠中的一种。
3. 根据权利要求1所述的复合羊膜粉的制备方法，其特征在于，步骤3中所述低温环境 是通过液氮或干冰制造。
4. 根据权利要求1所述的复合羊膜粉的制备方法，其特征在于，步骤3中所述磨碎处理 是通过球磨机或匀浆机进行研磨处理。
5. 根据权利要求1至4任一所述的复合羊膜粉的制备方法制备得到的复合羊膜粉。
【文档编号】A61K9/19GK104224842SQ201410445608
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】苗春云, 傅筱冲, 滕志强, 熊贞燕, 贺雅琳 申请人:苗九昌