在奶牛不同乳区构建两种菌型临床型乳腺炎模型的方法
【专利摘要】本发明提供了一种在奶牛不同乳区构建两种菌型临床型乳腺炎模型的方法，选取健康、无患病史、体况正常、乳房发育良好、处于第一胎次泌乳中期，SCC〈10万/mL，所有乳区乳汁细菌培养均为阴性的中国荷斯坦奶牛作为实验动物，对上述奶牛的4个乳区分别作如下处理：利用通乳针分别将1X107CFU/mL的金黄色葡萄球菌的细菌悬液和1X106CFU/mL链球菌悬液经乳头管注射入奶牛乳房内，对照组注射等量的灭菌ros，空白组不作处理；大拇指和食指相连成圆形，自乳头基部自下而上反向按压，使菌液均匀扩散至乳腺管，不在乳池蓄留，攻菌24h后，确定奶牛乳房炎模型构建成功。本发明完全排除了个体差异对试验的影响。
【专利说明】在奶牛不同乳区构建两种菌型临床型乳腺炎模型的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物科学领域，特别涉及一种利用同一奶牛不同乳区构建两种菌型临 床型乳房炎模型的方法。
【背景技术】
[0002] 奶牛乳腺炎又称乳房炎，是由多种病因引起的一种炎性反应，是奶牛最常见的疾 病之一，受奶牛自身遗传背景、环境条件、饲养管理条件等因素的影响。
[0003] 乳腺炎严重影响了原料奶质量、奶牛的利用年限、奶牛养殖效益、牛奶制品的营养 价值和消费者的健康。奶牛乳腺炎是牛业生产效率低，成本高的主要原因之一。大多数国家 奶牛乳腺炎的发病率在是40%左右(包括隐性乳腺炎)，奶产量会减少15%，我国由于技术不 成熟，设施不配套等原因。每年因奶牛患乳腺炎造成的损失高达数十亿元。奶牛感染乳腺 炎，其乳中含有大量病原微生物及其释放的毒素和残留的抗生素，饮用这类牛奶会引起人 类腹泻、呕吐、发烧等现象，继而严重影响人类的健康。乳腺炎的病因有多种，其中微生物感 染是引起奶牛乳腺炎发生的最主要的原因，已发现的病原体达150多种，金黄色葡萄球菌、 链球菌和大肠杆菌引起的病例高达90%。金葡菌和链球菌都是兼性厌氧的革兰氏阳性菌。 金葡菌主要引起哺乳动物乳房内的感染，在奶牛中，25%-30%乳房内的感染都是由金葡菌引 起的。链球菌属中能够引起乳腺炎的有无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、化脓链球菌 和兽疫链球菌。
[0004] 临床型乳腺炎症状明显，乳房及乳汁均有不同程度的异常症状。轻者乳汁稀薄， 并伴有絮片、凝块，乳房轻度发热或疼痛；重者乳汁变淡黄色，有时出现脓汁，乳房红肿、质 硬、发热、疼痛，泌乳减少且分泌不畅，同时出现不同程度的全身反应，如食欲丧失、体温升 高、精神抑郁等，发病率约为21-23%。根据炎症炎性过程的不同分为急性乳腺炎、浆液性乳 腺炎、卡他性乳腺炎、纤维蛋白性乳腺炎、脓性乳腺炎、出血性乳腺炎、蜂窝织炎性乳腺炎。 但临床型乳房炎动物模型的建立一直以来都是一个重点难点问题，受到很多外界因素的影 响。
[0005] 目前，直接应用奶牛建立乳房炎模型的研究较少，一般用泌乳小鼠、泌乳兔取而代 之，以降低成本，增加试验的灵活性。但乳房炎的发生、发展和防治和动物自身的遗传背景 有着密不可分的关系。直接运用奶牛作为实验动物无疑可以消除自身遗传背景对试验的影 响。
[0006] 现有的建立乳房炎模型方法如下： 1.小鼠乳腺炎模型。主要通过细菌培养，而后取100微升注入细菌感染组小鼠乳腺组 织中，功菌24h之后，观察乳房组织外部结构变化，颈椎脱白法处死小鼠，迅速取出乳腺组 织做石蜡切片，一部分进行HE染色做病理学分析。
[0007] 2.家兔乳腺炎模型。运用从乳腺炎病牛奶样中分离到的金黄色葡萄球菌，人工诱 发家兔乳腺炎，建立家兔乳腺炎模型。并设立l〇4CFU、106CFU和108CFU 3个不同剂量组以 及健康对照组和生理盐水组。家兔乳腺攻菌24h耳缘静脉采血测定血常规。观察攻菌家兔 的临床表现、体温变化、采食、饮水情况，同时结合血常规检测报告进行诊断，筛选成功的家 兔乳腺炎模型。
[0008] 本发明从实验动物的选择入手，通过一系列的指标选择合适的实验动物。然后通 过定点攻菌、无菌取样等技术建立同一奶牛不同乳区两种菌型临床型乳房炎模型。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种在奶牛不同乳区构建两种菌型临床型乳腺炎模型的方 法，直接应用奶牛建立乳房炎模型，以消除其它方法存在的自身遗传背景对试验的影响的 问题。
[0010] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种在奶牛不同乳区构建两种菌型临床型乳腺炎模型的方法，其特征在于：包括以下 步骤： (1) 选择标准：选取健康、无患病史、体况正常、乳房发育良好、处于第一胎次泌乳中期， SCC〈10万/mL，所有乳区乳汁细菌培养均为阴性的中国荷斯坦奶牛作为实验动物，连续隔 离观察7天后进行试验； (2) 分区攻菌方式：对上述奶牛的4个乳区分别作如下处理：利用通乳针分别将IX 107 CFU/mL的金黄色葡萄球菌的细菌悬液和1 X 106 CFU/mL链球菌悬液经乳头管注射入奶牛乳 房内，注射剂量为5mL，对照组注射等量的灭菌PBS，空白组不作处理； (3) 乳区按压方式：大拇指和食指相连成圆形，自乳头基部自下而上反向按压，使菌液 均匀扩散至乳腺管，不在乳池蓄留，攻菌24h后，确定奶牛乳房炎模型构建成功。
[0011] 后续研究可立即无菌操作采集奶牛的乳腺组织，放入液氮中带回实验室，转 入-70°C冰箱备用，全程无菌操作。
[0012] 攻菌前后定时采集各头奶牛各乳区的牛奶样品，进行乳汁外观检查，BMT试验，体 细胞数（SCC)测定，乳腺组织切片理学检测；乳汁细菌学检测，判断单一乳区是否只感染接 种菌型，而无交叉感染，从而判断奶牛两种菌型临床型乳房炎模型构建成功与否。
[0013] 以下技术方法为行业通用或国标方法，与本专利独有技术一起构成本专利技术体 系。
[0014] 1)细菌悬液制作及计数方法 金黄色葡萄球菌（ATCC29213)，链球菌（C55912)来自于扬州大学兽医学院。
[0015] 金黄色葡萄球菌（ATCC29213)，接种于肉汤培养基中，在37°C电热恒温箱中培 养24 h复苏。将复苏后的金葡菌培养并传代，调整细菌浓度并进行菌计数。试验用金 葡球菌的分离、培养、鉴定及细菌计数等操作方法与步骤均参考卫生部于2010年颁布的 《中华人民共和国国家标准食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》 (GB4789. 10-2010)进行。
[0016] 将链球菌（C55912)接种于100毫升Todd-Hewitt肉汤中，置37°C生化培养箱中6h 复苏。将肉汤培养物稀释于无菌哺乳动物林格氏溶液中，得到约1X106 CFU/mL链球菌悬 液。奶样中链球菌的检测方法参照《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验溶 血性链球菌检验》（GB/T 4789. 11-2003)。
[0017] 2)北京乳腺炎试验法（BMT法） BMT法是一种间接检测乳汁中体细胞数的方法，最早由Scalm和Noorlander提出加州 乳腺炎试验法（CMT)，该方法操作简单，灵敏度高，价格便宜，且可进行现场操作，是目前各 国普遍采用的诊断方法，诊断标准见表1。我国根据CMT的原理研制出了北京乳腺炎试验法 (BMT)、上海乳腺炎试验法（SMT)、兰州乳腺炎试验法（Lanzhou Mastitis Test, LMT)、杭州 乳腺炎试验法（Hangzhou Mastitis Test, HMT)等。
[0018] 表1北京奶牛乳腺炎测定（BMT)标准
【权利要求】
1. 一种在奶牛不同乳区构建两种菌型临床型乳腺炎模型的方法，其特征在于：包括以 下步骤： (1) 选择标准：选取健康、无患病史、体况正常、乳房发育良好、处于第一胎次泌乳中期， SCC〈10万/mL，所有乳区乳汁细菌培养均为阴性的中国荷斯坦奶牛作为实验动物； (2) 分区攻菌方式：对上述奶牛的4个乳区分别作如下处理：利用通乳针分别将1 X 107 CFU/mL的金黄色葡萄球菌的细菌悬液和1 X 106 CFU/mL链球菌悬液经乳头管注射入奶牛乳 房内，对照组注射等量的灭菌PBS，空白组不作处理； (3) 乳区按压方式：大拇指和食指相连成圆形，自乳头基部自下而上反向按压，使菌液 均匀扩散至乳腺管，不在乳池蓄留，攻菌24h后，确定奶牛乳房炎模型构建成功。
2. 如权利要求1所述的在奶牛不同乳区构建两种菌型临床型乳腺炎模型的方法，其特 征在于：步骤（1)中，选取的中国荷斯坦奶牛在连续隔离观察7天后进行试验。
3. 如权利要求1所述的在奶牛不同乳区构建两种菌型临床型乳腺炎模型的方法，其特 征在于：步骤（2)中，注射剂量为5mL。
4. 如权利要求1所述的在奶牛不同乳区构建两种菌型临床型乳腺炎模型的方法， 其特征在于：后续研究可立即无菌操作采集奶牛的乳腺组织，放入液氮中带回实验室，转 入-70°C冰箱备用，全程无菌操作。
5. 如权利要求1所述的在奶牛不同乳区构建两种菌型临床型乳腺炎模型的方法，其特 征在于：攻菌前后定时采集各头奶牛各乳区的牛奶样品，进行乳汁外观检查，BMT试验，体 细胞数（SCC)测定，乳腺组织切片理学检测；乳汁细菌学检测，判断单一乳区是否只感染接 种菌型，而无交叉感染，从而判断奶牛两种菌型临床型乳房炎模型构建成功与否。
【文档编号】A61K35/74GK104208104SQ201410476668
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月18日 优先权日:2014年9月18日
【发明者】杨奕李, 锐杨, 章平 申请人:扬州大学