一种抗菌仿生硅化胶原支架材料的构建方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗菌仿生硅化胶原支架材料构建方法及应用。该方法包括将胶原海绵支架在正硅酸和抗菌剂的混合液中进行处理，得到抗菌仿生硅化胶原支架材料。优选的，所述胶原海绵支架是经聚阳离子表面处理后的胶原海绵支架。所述抗菌溶液为葡萄糖酸氯己定溶液或氯烃基二甲基苯甲胺。本发明将抗菌剂氯己定或氯烃基二甲基苯甲胺整合入纤维内仿生硅化胶原材料内部，使抗菌成分缓释与植骨材料降解同步化，构建了具有良好机械性能、成骨特性和抗菌性能的新型仿生硅化胶原支架材料。同时所引入的氯己定或氯烃基二甲基苯甲胺抗菌成分可以随着材料中硅酸的释放而缓慢释放，从而实现了抗菌作用的发挥与植骨材料降解的同步化。
【专利说明】一种抗菌仿生硅化胶原支架材料的构建方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于组织工程支架材料领域，涉及一种抗菌仿生硅化胶原支架材料的构建 方法及应用。
【背景技术】
[0002] 随着外伤，肿瘤，先天畸形等原因造成的骨组织缺损不断增加，人们对植骨材料的 需求也日益增多，资料显示，目前全球每年的植骨手术达到近220万例，植骨手术的费用则 达到了将近25亿美元。感染性骨缺损及植骨部位术中术后感染的发生已成为导致植骨失 败的主要原因之一，例如在下颌骨缺损的骨移植修复中，约有10% -20%的病例会因感染 而导致植骨失败。所以长期以来，研制具有抗菌功能的生物材料替代自体骨修复骨缺损一 直是医学和材料学领域的重要课题，如何克服植骨部位的感染已成为骨缺损修复领域内 的研究热点，而人体口腔的多细菌环境则对颌面部植骨材料的抗菌性能提出了更高的要 求。
[0003] 最理想的再生修复材料应该具有和缺损组织完全一致的结构和功能，因此，如何 模拟天然骨、牙组织的分级结构，构建纤维内仿生矿化胶原材料被认为是目前骨、牙硬组织 再生材料研究领域的关键问题之一。以聚合物稳定磷酸钙无定形液相前体为基础，初步实 现纤维内矿化恢复自然矿化胶原的仿生结构，并具有良好机械强度，而受到广泛关注。但是 目前的仿生钙化方法仍存在周期较长、钙化深度受限、钙化不均匀、胶原部分降解及不具有 抗菌性能等问题，从而制约了该方法的广泛应用。如何使用仿生合成的方法，实现胶原纤维 内的快速有效矿化，同时赋予矿化胶原支架材料以优异的抗菌性能，成为该领域下一步研 究的热点和难点。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的在于提供一种抗菌仿生硅化胶原支架 材料构建方法。
[0005] 为此，本发明提供的抗菌仿生硅化胶原支架材料构建方法包括：
[0006] 将胶原海绵支架在if硅酸和抗菌剂的混合液中讲行处理,得到抗菌仿生硅化胶原 支架材料。
[0007] 优选的，所述胶原海绵支架是经聚阳离子表面处理后的胶原海绵支架。
[0008] 优选的，所述聚阳离子的供体为聚丙烯氯化铵或聚乙烯亚胺。
[0009] 优选的，所述抗菌溶液为葡萄糖酸氯己定溶液或氯烃基二甲基苯甲胺。
[0010] 优选的，所述正硅酸和抗菌剂的混合液的PH值为5-6。
[0011] 优选的，所述抗菌仿生硅化胶原支架材料构建方法包括：
[0012] (1)将胶原海绵支架聚丙烯氯化铵溶液或聚乙烯亚胺溶液中孵育制得经聚阳离子 表面处理后的胶原海绵支架；
[0013] (2)将抗菌剂溶液加入正硅酸溶液中，利用抗菌剂对正硅酸溶液的稳定作用制得 稳定的正娃酸和抗菌剂混合液，
[0014] (3)将经表面处理的胶原支架置于正硅酸和抗菌剂的混合液中进行矿化处理2-6 天，每天更换新鲜的正硅酸和抗菌剂的混合液，最终制得抗菌仿生硅化胶原支架材料。
[0015] 优选的，所述胶原海绵支架的制备方法包括：
[0016] 取新鲜牛腱，去除筋膜、脂肪后切成薄片；
[0017] 将切好的腱片加入蛋白酶消化液中进行消化处理后；
[0018] 将消化处理后的腱片放入醋酸溶液进行溶胀处理，搅拌均匀并离心除去杂质；
[0019] 接着采用磷酸盐溶液对溶胀处理后的牛腱组织进行盐析，提高胶原溶液纯度；接 着使用聚乙二醇对牛腱组织进行浓缩，得胶原溶液；
[0020] 胶原溶液冷冻干燥后得多孔胶原海绵；
[0021] 使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）_碳化二亚胺溶液或N-羟基琥珀酰亚胺溶 液对多孔胶原海绵进行交联固定，接着经冲洗后，再次冷冻干燥，制得胶原海绵支架。
[0022] 所述胶原海绵支架的孔径为50-200 μ m，正硅酸和抗菌剂的混合液是由正硅酸溶 液和抗菌剂溶液配置而成，且所述正硅酸溶液的质量百分比浓度为2% -8%，所述抗菌溶 液的质量百分比浓度为1% -10%，所述正硅酸溶液与抗菌溶液的用量关系为：体积比1:1。
[0023] 所述胶原海绵支架在正硅酸溶液和抗菌溶液的混合液中处理时间为2-6天。
[0024] 针对现有技术的缺陷或不足，本发明的另一目的在于提供将上述方法制备的材料 作为骨缺损修复材料的应用。
[0025] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0026] (1)本发明将抗菌剂氯己定或氯烃基二甲基苯甲胺整合入纤维内仿生硅化胶原材 料内部，使抗菌成分缓释与植骨材料降解同步化，构建了具有良好机械性能、成骨特性和抗 菌性能的新型仿生硅化胶原支架材料。
[0027] (2)本发明在纤维内仿生硅化胶原材料所引入的氯己定或氯烃基二甲基苯甲胺抗 菌成分可以随着材料中硅酸的释放而缓慢释放，从而实现了抗菌作用的发挥与植骨材料降 解的同步化，为抗菌仿生硅化胶原应用于感染性骨缺损的修复提供了可能。
[0028] (3)在本发明中采用聚阳离子聚丙烯氯化铵或聚乙烯亚胺对胶原支架进行前期处 理，与胶原纤维表面的阴性电荷位点结合，从而形成富含多聚阳离子的胶原纤维内环境，以 促进后期带负电荷的硅酸前体对胶原纤维的粘附、渗透。此外带正电荷的聚丙烯氯化铵或 聚乙烯亚胺有可能与胶原纤维表面的阴性电荷位点结合并发生相分离，模拟了硅藻蛋白兼 性分子的特点，为渗透入胶原纤维内部的液相硅酸前体向固相高聚合度的二氧化硅转化提 供催化位点，最终形成二氧化硅在胶原内部的有序沉积，反映出胶原自然矿化状态时的周 期性横纹结构，并显著提高了胶原支架的机械性能。
[0029] (4)由于葡萄糖酸氯己定及氯烃基二甲基苯甲胺具有抗菌作用强、抗菌谱广及不 易产生耐药性等优点，因此本发明中采用葡萄糖酸氯己定或氯烃基二甲基苯甲胺来稳定硅 酸前体溶液，从而为硅酸前体对胶原纤维内部间隙的渗透提供足够的时间，同时将抗菌剂 氯己定整合入纤维内仿生硅化胶原材料内部。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1为实施例1构建的材料的娃化胶原的透射电镜图；其中，图I (a)表不低倍 观察下，整个胶原纤维束呈现高电子密度的状态，胶原纤维周围空间内的二氧化硅颗粒沉 积很少，可见胶原纤维内部二氧化硅有序沉积所反映出的胶原纤维的规律性横纹结构；图 1(b)显示高倍观察下，纤维内矿物质即二氧化硅充实了胶原纤维内部空隙。
[0031] 图2为实施例1的胶原支架仿生硅化处理前后的对比图，其中，图2 (a)硅化前胶 原支架图2(b)表示硅化后胶原支架
[0032] 图3为实施例1的胶原支架仿生硅化处理前后的官能团变化示意图；
[0033] 图4为实施例1的抗菌仿生硅化胶原支架的动态硅酸释放特点示意图；
[0034] 图5为实施例1的抗菌仿生硅化胶原支架的氯已定释放特点示意图；图
[0035] 图6为实施例1步骤⑴制得的胶原海绵支架的电镜扫描图。
【具体实施方式】
[0036] 在仿生硅化领域中，硅藻、海绵等生物具有在常温常压下可快速合成硅质细胞壁 的特点。从硅藻细胞壁中提取的长链聚胺可以在体外快速催化硅酸前体溶液凝集形成二氧 化硅。使用合成迅速的二氧化硅替代传统的羟基磷灰石，实现胶原纤维的快速硅化，为构建 新型的硬组织缺损修复材料提供了新的思路。同时为进一步改善纤维内硅化胶原材料的性 能，将抗菌剂氯己定或氯烃基二甲基苯甲胺整合入纤维内仿生硅化胶原材料内部，使抗菌 成分缓释与植骨材料降
[0037] 解同步化，实现纤维内仿生硅化胶原材料的抗菌功能化转变，为感染性骨缺损的 修复提供更好的解决途径。
[0038] 本发明采用胶原溶胀液冷冻干燥法制备疏松多孔的胶原支架，并进行交联固定； 采用聚丙烯氯化铵或聚乙烯亚胺溶液对上述制备的胶原支架进行表面处理；通过水解正硅 酸四乙酯获得正硅酸溶液，与不同浓度的葡萄糖酸氯己定溶液或氯烃基二甲基苯甲胺溶液 混合后，制备稳定的硅酸前体溶液；将所得的经表面处理的胶原支架置于所得的硅酸前体 溶液中进行矿化处理，完成仿生矿化胶原材料的抗菌功能化修饰，使氯已定或氯烃基二甲 基苯甲胺与纤维内硅化胶原相复合，从而成功地构建了新型抗菌仿生硅化胶原支架。所得 抗菌仿生硅化胶原支架形成以胶原纤维内二氧化硅矿物质有序沉积为特征的纤维内矿化 并具有同步释放硅酸及抗菌剂的作用。
[0039] 以下是发明人提供的具体实施例，以对本发明的技术方案作进一步解释说明。
[0040] 实施例1
[0041] 该实施例的抗菌仿生硅化胶原支架材料构建方法，按照如下步骤：
[0042] (1)制备胶原海绵支架：取新鲜牛腱500g，去除筋膜、脂肪等杂质后切成薄片；将 切好的腱片加入250mL0. 5%的蛋白酶消化液中，在37°C恒温下进行消化处理3小时后， 使用IOOmLO. 3g/L H2O2溶液终止酶消化反应，蒸馏水反复冲洗后晾干；将IOOg晾干的腱 片加入IOOmLO. 1 %的醋酸溶液进行溶胀，搅拌均匀并离心除去杂质；采用磷酸盐溶液进 行反复盐析，以提高胶原溶液纯度；使用聚乙二醇进行浓缩，制备终浓度为20mg/mL的胶 原溶液；_20°C预冷2小时后，置于正空冷冻干燥机冻干24小时，制得多孔胶原海绵；使用 0. 3M1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）-碳化二亚胺/0. 06M N-羟基琥珀酰亚胺溶液室温下 对胶原海绵进行交联固定5小时，以稳定支架结构；蒸馏水反复冲洗后，再次冷冻干燥，制 得孔径50-200 μ m，孔隙率约为90%的胶原海绵支架（图6)。
[0043] (2)将步骤⑴所得的胶原海绵支架置于lOmg/ml的聚丙烯氯化铵溶液中，37°C恒 温下孵育4小时；蒸馏水反复冲洗后，冷冻干燥备用，制得经聚阳离子表面处理后的胶原海 绵支架。
[0044] (3)室温以正硅酸四乙酯为原料采用稀酸水解法制备浓度为3%的正硅酸；将所 得正硅酸与2%的葡萄糖酸氯己定按照1:1的体积比均匀混合，并将终溶液pH值调至5. 5 ; 3000转/分钟离心3分钟，取上清制得1 %葡萄糖酸氯己定稳定的1. 5%的正硅酸前体溶 液。
[0045] (4)将步骤（2)所得的经表面处理的胶原支架置于步骤（3)所得的稳定硅酸前 体溶液中进行矿化处理，每天更换新鲜的硅酸前体溶液，孵育4天后，使用蒸馏水反复冲洗 后，冷冻干燥备用，制得抗菌仿生硅化胶原支架材料。
[0046] 按照实施例1所述，本发明所构建新型抗菌仿生硅化胶原支架材料具有以下特 占 ·
[0047] 通过TEM观察发现，如图1所示，实施例1构建的抗菌仿生硅化胶原支架材料实现 了二氧化硅颗粒在胶原纤维内部有序沉积及胶原纤维内部的完全矿化。
[0048] 如图2所示，将仿生硅化处理后的胶原支架材料，硬度及弹性明显增加，润湿后进 行干燥处理，未见明显塌陷收缩，且表现出较好的可压缩性。
[0049] 如图3所示，傅里叶红外光谱观察胶原硅化前后官能团的变化，确定纤维内矿物 质主要含有Si-O-Si基团，主要成分为水合二氧化硅；
[0050] 如表1所示，单轴压缩应力-应变测试结果表明，抗菌仿生硅化胶原支架的 O到5 %的切线模量为637. 56 ± 109. 32KPa，是未经硅化处理的胶原支架的37500倍 (0. 017±0. 002KPa);抗菌仿生硅化胶原支架的韧性模量为178. 83±6. 70KPa，是未经硅化 处理的胶原支架的1375倍（0. 13±0. 003KPa)。
[0051] 表1胶原支架仿生硅化处理前后的单轴压缩应力-应变测试结果
[0052]
【权利要求】
1. 一种抗菌仿生娃化胶原支架材料构建方法，其特征在于，该方法包括： 将胶原海绵支架在正硅酸和抗菌剂的混合液中进行处理，得到抗菌仿生硅化胶原支架 材料。
2. 如权利要求1所述的抗菌仿生硅化胶原支架材料构建方法，其特征在于，所述胶原 海绵支架是经聚阳离子表面处理后的胶原海绵支架。
3. 如权利要求2所述的抗菌仿生硅化胶原支架材料构建方法，其特征在于，所述聚阳 离子的供体为聚丙烯氯化铵或聚乙烯亚胺。
4. 如权利要求1所述的抗菌仿生硅化胶原支架材料构建方法，其特征在于，所述抗菌 溶液为葡萄糖酸氯己定溶液或氯烃基二甲基甲胺。
5. 如权利要求1所述的抗菌仿生娃化胶原支架材料构建方法，其特征在于，所述正娃 酸和抗菌剂的混合液的PH值为5-6。
6. 如权利要求1所述的抗菌仿生硅化胶原支架材料构建方法，其特征在于，所述抗菌 仿生硅化胶原支架材料构建方法包括： (1) 将胶原海绵支架聚丙烯氯化铵溶液或聚乙烯亚胺溶液中孵育制得经聚阳离子表面 处理后的胶原海绵支架； (2) 将抗菌剂溶液加入正硅酸溶液中，利用抗菌剂对正硅酸溶液的稳定作用制得稳定 的正硅酸和抗菌剂混合液； (3) 将经表面处理的胶原支架置于正硅酸和抗菌剂的混合液中进行矿化处理2-6天， 每天更换新鲜的正硅酸和抗菌剂的混合液，最终制得抗菌仿生硅化胶原支架材料。
7. 如权利要求1所述的抗菌仿生硅化胶原支架材料构建方法，其特征在于，所述胶原 海绵支架的制备方法包括： 取新鲜牛腱，去除筋膜、脂肪后切成薄片； 将切好的腱片加入蛋白酶消化液中进行消化处理后； 将消化处理后的腱片放入醋酸溶液进行溶胀处理，搅拌均匀并离心除去杂质； 接着采用磷酸盐溶液对溶胀处理后的牛腱组织进行盐析，提高胶原溶液纯度；接着使 用聚乙二醇对牛腱组织进行浓缩，得胶原溶液； 胶原溶液冷冻干燥后得多孔胶原海绵； 使用1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基）-碳化二亚胺溶液或N-羟基琥珀酰亚胺溶液对 多孔胶原海绵进行交联固定，接着经冲洗后，再次冷冻干燥，制得胶原海绵支架。
8. 如权利要求1-7任一权利要求所述的抗菌仿生娃化胶原支架材料构建方法，其特征 在于，所述胶原海绵支架的孔径为50-200 ii m，正硅酸和抗菌剂的混合液是由正硅酸溶液和 抗菌剂溶液配置而成，且所述正硅酸溶液的质量百分比浓度为2% -8%，所述抗菌溶液的 质量百分比浓度为1% -10%，所述正硅酸溶液与抗菌溶液的用量关系为：体积比1:1。
9. 如权利要求8所述的抗菌仿生硅化胶原支架材料构建方法，其特征在于，所述胶原 海绵支架在正硅酸溶液和抗菌溶液的混合液中处理时间为2-6天。
10. 权利要求1中任一方法制备的抗菌仿生硅化胶原支架材料作为骨缺损修复材料的 应用。
【文档编号】A61L27/14GK104307042SQ201410488167
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月22日 优先权日:2014年9月22日
【发明者】焦凯, 牛丽娜, 陈吉华, 郑智明, 李齐宏, 柴治国 申请人:焦凯