治疗和预防金黄色葡萄球菌感染及相关病状的方法
【专利摘要】本发明涉及预防和治疗受试者的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的方法和组合物。本发明的治疗性组合物包含杀白细胞素E和/或D蛋白或多肽和抗杀白细胞素E和/或D抗体。本发明进一步涉及鉴定LukE/D细胞毒性的抑制剂和LukE/D-白细胞结合的抑制剂的方法。
【专利说明】治疗和预防金黄色葡萄球菌感染及相关病状的方法
[0001] 本申请是申请号为201280039370. 5、申请日为2012年6月19日、发明名称为"治 疗和预防金黄色葡萄球菌感染及相关病状的方法"的中国发明专利申请的分案申请，原申 请为国际申请号为PCT/US2012/043179的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2011年 6月19日，申请号为61/498, 596的美国临时申请的优先权。
[0002] 本申请要求2011年6月19日提交的美国临时专利申请序列号61/498, 596的权 益，其据此通过引用整体并入。
【技术领域】
[0003] 本发明涉及筛选、治疗和预防金黄色葡萄球菌感染和金黄色葡萄球菌相关病状的 方法。
[0004] 发明背景
[0005] 金黄色葡萄球菌（"S. aureus"）是超过25%的人口共生定植的细菌。重要的是， 这种生物能够突破其初始定植部位，导致细菌传播和疾病。金黄色葡萄球菌是医院感染的 主要原因，是感染性心内膜炎以及皮肤和软组织感染最常见的病原，并且是食物传染疾病 的四大主要原因之一。总体来说，在美国医院金黄色葡萄球菌每年感染超过120万患者。耐 抗生素菌株（即，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA)菌株），包括耐受被视为对金黄色葡萄 球菌感染的最后防线的抗生素，万古霉素（vancomycin)的菌株的出现进一步突显了金黄 色葡萄球菌对人类健康的威胁。这些事实突显了研发对这种重要病原体的新型疗法的重要 性。
[0006] 金黄色葡萄球菌产生很多不同的毒力因子和毒素，使这种细菌能够中和并经受 住不同种类的免疫细胞，特别是组成身体一级防御系统的白血细胞亚群的攻击。这些毒 力因子和毒素的产生使金黄色葡萄球菌维持感染状态（见Nizet, "Understanding How Leading Bacterial Pathogens Subvert Innate Immunity to Reveal Novel Therapeutic Targets, "J. Allergy Clin. Immunol. 120(1) :13-22(2007))。在这些毒力因子中，金黄 色葡萄球菌产生几种双组分白细胞毒素，其通过两种非相关蛋白或亚基的协同作用损坏 宿主防御细胞和红细胞的膜（见Menestrina等人，"Mode of Action of Beta-Barrel Pore-Forming Toxins of the Staphylococcal Alpha-Hemolysin Family,，'Toxic ol. 39(11) :1661-1672(2001))。在这些组分白细胞毒素中，Y-溶血素（HlgAB和HlgCB)和 Pantone-Valentine杀白细胞素（PVL)最有特征。
[0007] 杀白细胞素对哺乳动物细胞的毒性涉及两个组分或亚基的作用。第一亚基命 名为S类亚基（即，"慢洗脱型"），而第二亚基命名为F类亚基（即，"快洗脱型"）。S 和F亚基协同作用以在白血细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和中性粒细胞（总 称为吞噬细胞）上形成孔隙（见Menestrina等人，"ModeofActionofBeta-Barrel Pore-FormingToxinsoftheStaphylococcalAlpha-HemolysinFamily,，'Toxic ol. 39(11) :1661-1672(2001))。双组分毒素在靶细胞膜上形成孔隙的机制未完全了解。提 出的这些毒素的作用机制涉及S亚基很可能通过受体与靶细胞膜的结合，接着是F亚基 与S亚基的结合，从而形成寡聚体，寡聚体依次形成插入祀细胞膜内的前孔隙（pre-pore) (Jayasinghe 等人，"The Leucocidin Pore:Evidence for an Octamer With Four LukF Subunits and Four LukS Subunits Alternating Around a Central Axis, ''Protein. Sci. 14(10) :2550-2561 (2005))。双组分白细胞毒素形成的孔隙通常为阳离子选择型。孔 隙形成经由溶解导致细胞死亡，已经报道在靶白血细胞的情况下，这由归因于阳离子流入 的渗透不平衡引起（Miles 等人，"The Staphylococcal Leucocidin Bicomponent Toxin Forms Large Ionic Channels,''Biochemistry 40(29) :8514-8522(2001))。
[0008] 除PVL (也称为杀白细胞素S/F-PV或LukSF-PV)和Y -溶血素（HlgAB和HlgCB) 夕卜，已知金黄色葡萄球菌产生的双组分白细胞毒素的清单包括杀白细胞素E/D("LukE/D")、 杀白细胞素A/B( "LukAB"）和杀白细胞素M/F( "LukMF"）。因此，这些双组分杀白细胞 素的 S 类亚基包括 HlgA、HlgC、LukE、LukS-PV、LukA 和 LukM，而 F 类亚基包括 HlgB、LukD、 LukF-PV、LukB和LukF'-PV。金黄色葡萄球菌S和F亚基并非杀白细胞素特异性。即，它们 可互换，以致其它双组分组合可在白血细胞中产生功能性孔隙，大大增多了白细胞毒素清 单（Meyer 等人，"Analysis of the Specificity of Panton-Valentine Leucocidin and Gamma-Hemolysin F Component Binding,，'Infect. Immun. 77 (I) : 266-273 (2009)) 〇
[0009] 设计治疗MRSA感染的有效疗法特别具有挑战性。除对甲氧西林和相关抗生素 的抗性外，还已发现MRSA具有显著水平的对大环内酯（例如，红霉素（erythromycin))、 ￠-内酰胺酶抑制剂组合（例如，Unasyn、Augmentin)和氟喹诺酮（fluoroquinolone) (例如，环丙沙星（ciprofloxacin))以及对氯洁霉素（clindamycin)、三甲氧节二氨啼陡 (trimethoprim)/横胺甲卩惡唑（sulfamethoxisol) (Bactrim)和利福平（rifampin)的抗性。 在严重的金黄色葡萄球菌感染情况下，临床医师已经采取静脉注射万古霉素。然而，已经有 金黄色葡萄球菌对万古霉素抗性的报道。因此，需要研发有效抗击金黄色葡萄球菌感染的 新疗法。
[0010] 本发明涉及克服本领域的这些和其它限制。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明的第一方面涉及包含治疗有效量的分离杀白细胞素E(LukE)蛋白或其多 肽、分离杀白细胞素D(LukD)蛋白或其多肽，或其组合，和药学上可接受的载体的组合物。 [0013] 本发明的另一方面涉及在受试者中对金黄色葡萄球菌感染产生免疫的方法。这种 方法涉及按在受试者中对金黄色葡萄球菌感染产生免疫有效的量施用本发明的组合物。
[0014] 本发明的另一方面涉及包含治疗有效量的选自由LukE抗体、LukD抗体或其组合 组成的组的抗体和药学上可接受的载体的组合物。
[0015] 本发明的另一方面涉及预防受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌 相关病状的方法。这种方法涉及按预防受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌 相关病状有效的量施用包含选自由LukE抗体、LukD抗体或其组合组成的组的抗体的组合 物。
[0016] 本发明的再一方面涉及治疗受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌 相关病状的方法。这种方法涉及按治疗受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌 相关病状有效的量施用包含LukE/D介导的细胞毒性的一种或多种抑制剂的组合物。
[0017] 本发明的再一方面涉及预测金黄色葡萄球菌感染的严重程度的方法。这种方法涉 及培养经由来自受试者的液体或组织样品从感染受试者获得的金黄色葡萄球菌并且量化 培养的金黄色葡萄球菌中的LukE和/或LukD表达。将来自所述受试者的样品中LukE和 /或LukD的量化量与生成少量或不可检测量的LukE和/或LukD的对照样品中LukE和/ 或LukD的量做比较，并且基于所述比较预测金黄色葡萄球菌感染的严重程度。
[0018] 本发明的另一方面涉及治疗患有金黄色葡萄球菌感染的受试者的方法。这种方法 涉及培养经由来自受试者的液体或组织样品从感染受试者获得的金黄色葡萄球菌并且量 化培养的金黄色葡萄球菌中的LukE和/或LukD表达。将来自所述受试者的样品中LukE 和/或LukD的量化量与生成少量或不可检测量的LukE和/或LukD的对照样品中LukE和 /或LukD的量做比较，并且基于这种比较确定对受试者的适合疗法。所述方法进一步涉及 向受试者施用确定的适合疗法以治疗金黄色葡萄球菌感染。
[0019] 本发明的另一方面涉及鉴定LukE/D细胞毒性的抑制剂的方法。这种方法涉及提 供细胞群、含有LukE/D的制剂和候选LukE/D抑制剂。在所述候选抑制剂存在和缺乏时使所 述细胞群暴露于含有LukE/D的所述制剂，并且在所述候选抑制剂存在和缺乏时测量LukE/ D介导的细胞毒性。比较在所述候选抑制剂存在和缺乏时细胞毒性的测得量并且基于这种 比较鉴定LukE/D细胞毒性的抑制剂。
[0020] 本发明的另一方面涉及鉴定LukE/D介导的孔隙形成的抑制剂的方法。这种方法 涉及提供一群白细胞、含有LukE和LukD的制剂和候选抑制剂。在所述候选抑制剂存在和 缺乏时使所述白细胞群暴露于含有LukE和LukD的所述制剂，并且在所述候选抑制剂存在 和缺乏时测量白细胞群上的孔隙形成。比较在所述候选抑制剂存在和缺乏时孔隙形成的测 得量，并且基于这种比较鉴定LukE/D介导的孔隙形成的抑制剂。
[0021] 本发明的另一方面涉及鉴定LukE和/或LukD白细胞结合的抑制剂的方法。这种 方法涉及提供一群白细胞、含有经可检测标记的LukE和LukD的制剂和候选抑制剂。在所 述候选抑制剂存在和缺乏时使所述细胞群暴露于含有经可检测标记的LukE和LukD的所述 制剂，并且在所述候选抑制剂存在和缺乏时测量经标记LukE和/或LukD与白细胞群的结 合。比较在所述候选抑制剂存在和缺乏时LukE和/或LukD白细胞结合的测得量，并且基 于这种比较鉴定LukE和/或LukD白细胞结合的抑制剂。
[0022] 金黄色葡萄球菌作为病原体的巨大成功部分是由于其表达大量损害宿主的因子 的能力。在这些因子中有许多分泌到细胞外环境的细菌蛋白毒素，在那里它们通过杀伤宿 主细胞起作用。杀白细胞素E/D(LukE/D)是金黄色葡萄球菌产生的缺乏特征性的毒素。如 本文所证明，这种毒素靶向并杀伤是涉及于保护宿主免受金黄色葡萄球菌感染的关键免疫 细胞的宿主白细胞。LukE/D对体内发病机制至关重要的发现突显了这种毒素在疾病过程中 的重要性。如本文所述,免疫接种LukE和/或LukD对金黄色葡萄球菌产生中和抗体。因 此，主动和/或被动疫苗策略提供了预防金黄色葡萄球菌感染的新型治疗策略。另外，对 LukE/D介导的细胞毒性的直接抑制提供了治疗患有金黄色葡萄球菌感染的个体的新方式。
[0023] 附图简述
[0024] 图1A-1B显不，缺乏agr基因座（Aagr Arot)的金黄色葡萄球菌中rot基因的缺 失使在小鼠中的毒力恢复到野生型（"WT"）水平并且导致LukE/D的过量生成。图IA为存 活曲线，显示Aagr A rot双突变体在小鼠中表现出WT毒力特征。在静脉注射约IX IO7CFU 的金黄色葡萄球菌WT、A agr或A agr A rot双突变体后监测小鼠的存活率。每组小鼠的总 数为N = 6。使用对数秩（Mantel-Cox)检验测定曲线之间的统计显著性。***，p < 0. 0005。 图IB中，在AagrArot双突变体中，白细胞毒素的生成恢复。示出了来自下列菌株的 TCA沉淀细菌培养上清液（于RPMI+CAS中生长5h)的蛋白质样品的免疫印迹：WT、Aagr 和AagrArot。阴性对照条带含有来自各白细胞毒素缺失突变体（AlukE/D、AlukA/B、 Ahla、AhlgC)的TCA沉淀上清液。还探测了所有LukE免疫印迹中AlukE/DAhlgACB双 突变体胞外蛋白作为LukE抗体交叉反应性的对照。
[0025] 图2A-2C说明，rot单独缺失导致动物体内的超高毒力，去阻遏引起的表现型和作 为结果发生的LukE/D过量生成。图2A的存活曲线示出了与亲本WT菌株相比，A r〇t突变体 的超高毒力。在静脉注射约I X IO7CFU的金黄色葡萄球菌WT和A r〇t菌株后监测小鼠的存 活率。每组小鼠的总数：WT，N= 17 ; A r〇t，N= 12。在转录阻遏因子Rot缺乏时LukE/D的生 成增加，而其它白细胞毒素的生成很大程度上未受影响。图2B的免疫印迹中示出了来自下 列菌株的扣4沉淀细菌培养上清液（于1?^1+045中生长511)的蛋白质样品 ：11'和八1"的。阴 性对照条带含有来自各毒素-rot双突变体（Arot A lukE/D、A rot A lukA/B、ArotAhla 和ArotAhlgACB)的TCA沉淀上清液。还探测了所有LukE免疫印迹中ArotAlukE/ D A hlgACB三突变体胞外蛋白作为LukE抗体交叉反应性的对照。如图2C的存活曲线所示， Arot突变体的超高毒力是由于LukE/D的生成增加。静脉注射约IX IO7CFU的金黄色葡萄 球菌WT、A rot和A rot A lukE/D后监测小鼠的存活率。使用对数秩（Mantel-Cox)检验测 定存活曲线之间的统计显著性。#，P彡〇? 005 ;*#，p彡0? 0005。
[0026] 图3A-3B显示，Rot与lukE/D启动子结合并且阻遏基因表达。如图3A所示，最 佳lukE/D基因表达依赖于Rot的去阻遏。lukE/D启动子区与GFP的转录融合用于测量在 下列菌株背景（WT、Aagr、Arot和AagrArot)下的肉汤培养中启动子的活化。随时间推 移测量GFP荧光并且在标准化为600nm下的细菌光密度后将值表示为相对荧光单位（RFU)。 所示值为一式三份进行的3次实验的结果。图3B中，Rot与lukE/D启动子结合。图3B是 与M280链霉亲和素（streptavidin)磁珠结合并用金黄色葡萄球菌全细胞溶解产物培育的 生物素化基因内DNA(非特异性）或lukE/D启动子DNA的启动子拉下的免疫印迹。经由免 疫印迹使用抗Rot抗体检测Rot。
[0027] 图4A-4F说明，在系统感染的小鼠模型中AlukE/D单突变体的毒力显著减弱。 图4A和4B示出了对金黄色葡萄球菌Newman中lukE/D缺失的验证。图4A中，示出了具 有IukE特异性引物的金黄色葡萄球菌基因组DNA的PCR。图4B中示出了来自下列菌株的 TCA沉淀细菌培养上清液（于RPMI+CAS中生长5h)的蛋白质样品的免疫印迹：WT、A IukE/ D、A lukE/D ::plukE/D、A hlgACB 和 A hlgACB。还探测了 A lukE/D 突变体胞外蛋白作为 LukE抗体交叉反应性的对照。图4C-4F显示，在小鼠中A lukE/D突变体的毒力严重受损。 图4C和4D中，静脉注射约IX IO7CFU (图4C)或约IX IO8CFU (图4D)的金黄色葡萄球菌 WT、A lukE/D和A lukE/D: :plukE/D菌株后监测小鼠的存活率。每组小鼠的总数为N = 6。使用对数秩（Mantel-Cox)检验测定存活曲线之间的统计显著性。**，p < 0. 005 ;***， p彡0. 0005。图4E和4F描绘了对感染约I X IO7CFU对图4C和4D描述的相同菌株96h后， 来自肾脏的细菌CFU(图4E)和宏观病理学（图4F)的列举。箭头指出肾脓肿的位置。使 用单因素（I-Way)ANOVA与Tukey的多重比较后续检验测定统计显著性。**，p < 0. 005 ; #木，P < 0. 0005。
[0028] 图5A-5E显示，LukE/D对人免疫细胞有毒并且在人免疫细胞中形成孔隙。图5A为 细胞活力曲线，显示纯化重组LukE/D对人单核细胞样细胞系THP-I有毒。用重组LukE、LukD 或LukE+LukD (LukE/D)的混合物使THP-I细胞系中毒。在中毒Ih后使用CellTiter监测 细胞活力，其中经培养基处理的细胞设为100 %能活。结果表示三份样品的平均数土 S. D.。 如图5B的细胞活力曲线所示，纯化重组LukE/D对人HL60细胞系无毒。如以上使HL60细 胞系中毒并且在中毒Ih后使用CellTiter监测细胞活力，其中经培养基处理的细胞设为 100%能活。相反，图5C的细胞活力曲线显示,纯化重组LukE/D对原代人（左图）和原代 鼠（右图）中性粒细胞（也称为多形核中性粒细胞或PMN)有毒。如以上使PMN中毒并且 在中毒Ih后使用CellTiter监测细胞活力，其中经培养基处理的细胞设为100%能活。如 图所示，LukE/D通过在细胞膜上形成孔隙介导对宿主细胞THP-I细胞的细胞毒性。用 纯化LukE/D培育THP-I和HL60细胞，并且用溴化乙锭并入测定测量孔隙形成。示出了对 于THP-I和HL60而言，三次实验的平均荧光。图5E示出了经LukE/D处理（30 ii g/ml)的 和对照（无毒性）THP-I细胞的溴化乙锭摄取的荧光显微镜图像。
[0029] 图6A-6B说明，LukE/D细胞毒性经亲和力纯化a -LukE多克隆抗体中和。在用 0. I ii g a -LukE多克隆抗体或免疫前血清培育后，用I. 5 ii g的重组LukE/D使THP-I细胞 中毒。分别使用CellTiter和溴化乙锭监测细胞活力（图6A)和孔隙形成（图6B)。对于 CellTiter测定而言，经培养基处理的细胞设为100%活力。结果表示两份样品的平均数土 标准偏差（S. D.)。
[0030] 发明详述
[0031] 本发明的第一方面涉及包含治疗有效量的分离LukE蛋白或其多肽、分离LukD蛋 白或其多肽或其组合，和药学上可接受的载体的组合物。
[0032] 在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含分离LukE蛋白或多肽。在本发明的 另一实施方案中，所述组合物包含分离LukD蛋白或多肽。在本发明的再一实施方案中，所 述组合物包含LukE和LukD蛋白或多肽。
[0033] 根据本发明的这个方面，适合的分离LukE蛋白包括源自任何金黄色葡萄球菌菌 株的LukE蛋白。来自适合本发明组合物的不同金黄色葡萄球菌菌株的LukE蛋白的氨基酸 序列示于以下表1中（即，SEQ ID No: 1-10)。表1的SEQ ID NO: 11是不同金黄色葡萄球 菌菌株的LukE蛋白上展示出高水平的序列同一性的LukE共有序列。相应地，在本发明的 一个实施方案中，分离LukE蛋白包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。在本发明的另一实施 方案中，分离LukE蛋白包含与SEQ ID NO: 11具有约70-80%序列相似性，更优选与SEQ ID NO: 11具有约80-90%序列相似性，并且更优选与SEQ ID NO: 11具有约90-95%序列相似 性，并且最优选与SEQ ID NO: 11具有约95-99%序列相似性的氨基酸序列。
[0034] 在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含LukE的分离免疫原性多肽。适合的 LukE多肽长度为约50至约100个氨基酸。更优选地，LukE多肽长度介于约100-200个氨 基酸之间，更优选长度介于约200-250个氨基酸之间，并且最优选长度介于约250-300个氨 基酸之间。全长LukE的N端氨基酸残基表示天然分泌/信号序列。因此，SEQ ID NO: 1-10 的每一个和SEQ ID NO: 11中的氨基酸残基29-311表示LukE的"成熟"分泌形式。相应 地，SEQ ID NO: 1-10的每一个和SEQ ID NO: 11中的氨基酸残基1-311称为LukE的"未成 熟"形式。相应地，在本发明的一个实施方案中，LukE多肽包含SEQ ID N0:11的氨基酸残 基29-311。可选地，本发明的LukE多肽包含SEQ ID N0:11的氨基酸残基48-291、氨基酸 29-301或氨基酸48-301。这些LukE多肽缺乏LukE活性，但是保持了抗原性。在任何一种 情况下，适合的LukE多肽还包括包含与SEQ ID NO:ll的氨基酸残基29-311、SEQ ID NO:ll 的氨基酸残基48-291、SEQ ID NO: 11的氨基酸残基29-301或SEQ ID NO: 11的氨基酸残基 48-301具有约70-80%序列相似性，优选80-90%序列相似性，更优选90-95%序列相似性 且最优选95-99 %序列相似性的氨基酸序列的那些多肽。
[0035] 根据本发明的这个方面，适合的分离LukD蛋白包括源自任何金黄色葡萄球菌菌 株的那些蛋白。来自适合本发明组合物的不同金黄色葡萄球菌菌株的LukD蛋白的氨基酸 序列示于以下表2中（即，SEQ ID No:12-21)。表2的SEQ ID N0:22是不同金黄色葡萄球 菌菌株的LukD蛋白上展示出高水平的序列同一性的LukD共有序列。相应地，在本发明的 一个实施方案中，分离LukD蛋白包含SEQ ID N0:22的氨基酸序列。在本发明的另一实施 方案中，分离LukD蛋白包含与SEQ ID NO: 22具有约70-80%序列相似性，更优选与SEQ ID NO: 22具有约80-90%序列相似性，并且更优选与SEQ ID NO: 22具有约90-95%序列相似 性，并且最优选与SEQ ID N0:22具有约95-99%序列相似性的氨基酸序列。
[0036] 在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含LukD的分离免疫原性多肽。适合的 LukD多肽长度为约50至约100个氨基酸。更优选地，LukD多肽长度介于约100-200个氨基 酸之间，更优选长度介于约200-250个氨基酸之间，并且最优选长度介于约250-300个氨基 酸之间。全长LukD的N端氨基酸残基表示天然分泌/信号序列。因此，SEQ ID NO: 12-21 的每一个和SEQ ID NO:22中的氨基酸残基27-327表示LukD的成熟分泌形式。相应地， SEQ ID NO: 12-21的每一个和SEQ ID NO:22中的氨基酸残基1-327称为LukD的"未成熟" 形式。相应地，在本发明的一个实施方案中，LukE多肽包含SEQ ID N0:22的氨基酸残基 27-327。可选地，本发明的LukE多肽包含SEQ ID N0:22的氨基酸残基46-307、27-312和 46-312。这些LukD多肽缺乏LukD活性，但是保持了抗原性。在任何一种情况下，适合多肽 还包括包含与SEQ ID NO: 22的氨基酸残基27-327、SEQ ID NO: 22的氨基酸残基46-307、 SEQ ID N0:22的氨基酸残基27-312或SEQ ID N0:22的氨基酸残基46-312具有约70-80% 序列相似性，优选80-90 %序列相似性，更优选90-95 %序列相似性且最优选95-99%序列 相似性的氨基酸序列的那些多肽。
[0037] 表1-金黄色葡萄球菌LukE序列比对
[0038] 金黄色葡萄球菌菌株
【权利要求】
1. 一种组合物，包含 治疗有效量的分离LukE蛋白或其多肽、分离LukD蛋白或其多肽，或其组合，和 药学上可接受的载体。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述分离LukE蛋白包含SEQ ID NO: 11的氨基 酸序列。
3. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述分离LukE多肽包含SEQ ID NO: 11的氨基 酸残基48-291。
4. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述分离LukD蛋白包含SEQ ID NO:22的氨基 酸序列。
5. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述分离LukD多肽包含SEQ ID NO:22的氨基 酸残基46-307。
6. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的分离蛋白或其多肽与免疫原性载 体分子连接。
7. 根据权利要求6所述的组合物，其中所述免疫原性载体分子与免疫原性蛋白或肽共 价或非共价结合。
8. 根据权利要求6所述的组合物，其中所述免疫原性载体分子选自由牛血清白蛋白、 鸡蛋卵白蛋白、钥孔隙戚血蓝蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素、甲状腺球蛋白、肺炎球菌荚 膜多糖、CRM 197和脑膜炎球菌外膜蛋白组成的组。
9. 根据权利要求1所述的组合物，进一步包含一种或多种另外的选自由以下组成的组 的金黄色葡萄球菌抗原：a溶血素抗原、蛋白A、336血清型多糖抗原、凝固酶、凝集因子A、 凝集因子B、纤连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、胶原结合蛋白、弹性蛋白结合蛋白、 MHC类似蛋白、多糖细胞内粘连蛋白、0溶血素、S溶血素、y溶血素、Panton-Valentine 杀白细胞素、杀白细胞素 A、杀白细胞素 B、杀白细胞素 M、剥脱性毒素 A、剥脱性毒素 B、V8蛋 白酶、透明质酸裂解酶、脂酶、葡萄球菌激酶、肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1、聚-N-琥 珀酰0-1 - 6葡萄糖胺、过氧化氢酶、0 -内酰胺酶、磷壁酸、肽聚糖、青霉素结合蛋白、趋 化性抑制蛋白、补体抑制剂、Sbi、5型抗原、8型抗原、脂磷壁酸和识别宿主分子的微生物表 面组分。
10. 根据权利要求1所述的组合物，进一步包含佐剂。
11. 根据权利要求10所述的组合物，其中所述佐剂选自由鞭毛蛋白、弗氏完全或 不完全佐剂、氢氧化铝、溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基苯酚、 iscomatrix和脂质体聚阳离子DNA颗粒组成的组。
12. -种在受试者中对金黄色葡萄球菌感染产生免疫的方法，包括： 按在受试者中对金黄色葡萄球菌感染产生免疫有效的量施用根据权利要求1所述的 组合物。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述组合物进一步包含一种或多种另外的选 自由以下组成的组的金黄色葡萄球菌抗原：a溶血素抗原、蛋白A、336血清型多糖抗原、凝 固酶、凝集因子A、凝集因子B、纤连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、胶原结合蛋白、弹 性蛋白结合蛋白、MHC类似蛋白、多糖细胞内粘连蛋白、0溶血素、S溶血素、Y溶血素、 Panton-Valentine杀白细胞素、杀白细胞素 A、杀白细胞素 B、杀白细胞素 M、剥脱性毒素 A、 剥脱性毒素 B、V8蛋白酶、透明质酸裂解酶、脂酶、葡萄球菌激酶、肠毒素、中毒性休克综合 征毒素-1、聚-N-琥珀酰0-1 -6葡萄糖胺、过氧化氢酶、￠-内酰胺酶、磷壁酸、肽聚糖、 青霉素结合蛋白、趋化性抑制蛋白、补体抑制剂、Sbi、5型抗原、8型抗原、脂磷壁酸和识别 宿主分子的微生物表面组分。
14. 根据权利要求12所述的方法，其中所述组合物进一步包含佐剂。
15. 根据权利要求12所述的方法，进一步包括： 在施用包含分离LukE蛋白、分离免疫原性LukE片段、分离LukD蛋白、分离免疫原性 LukD片段或其组合的组合物之前、之后或同时向受试者施用佐剂。
16. 根据权利要求12所述的方法，其中所述施用在受试者中诱导对金黄色葡萄球菌的 中和免疫反应。
17. 根据权利要求12所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌感染为耐甲氧西林金黄色 葡萄球菌（MRSA)感染或甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA)感染。
18. 根据权利要求12所述的方法，其中所述施用经口服、通过吸入、通过鼻内滴注、局 部、经皮、肠胃夕卜、皮下、静脉注射、动脉内注射、肌肉注射、胸膜内、腹膜内或通过敷用到粘 膜上进行。
19. 根据权利要求12所述的方法，进一步包括重复所述施用。
20. 根据权利要求12所述的方法，其中所述受试者为婴儿、青少年、成人或老人。
21. 根据权利要求12所述的方法，其中所述受试者为免疫力低下的青少年、成人或老 人。
22. -种治疗或预防受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状的方 法，包括： 按预防受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状有效的量施用组 合物，所述组合物包含杀白细胞素 E(LukE)抗体、杀白细胞素 D(LukD)抗体或其组合和药学 上可接受的载体。
23. 根据权利要求22所述的方法，进一步包括 施用选自由抗感染剂、抗生素试剂、抗菌剂组成的组的试剂。
24. 根据权利要求22所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌感染为MRSA感染或MSSA 感染。
25. 根据权利要求22所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌相关病状选自由皮肤损伤 和感染、组织脓肿、毛囊炎、骨髓炎、肺炎、烫伤样皮肤综合征、败血病、脓毒性关节炎、心肌 炎、心内膜炎和中毒性休克综合征组成的组。
26. 根据权利要求22所述的方法，其中所述施用经口服、通过吸入、通过鼻内滴注、局 部、经皮、肠胃夕卜、皮下、静脉注射、动脉内注射、肌肉注射、胸膜内、腹膜内或通过敷用到粘 膜上进行。
27. 根据权利要求22所述的方法，进一步包括重复所述施用。
28. 根据权利要求22所述的方法，其中所述受试者为婴儿、青少年、成人或老人。
29. 根据权利要求22所述的方法，其中所述受试者为免疫力低下的青少年、成人或老 人。
30. -种治疗受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状的方法，包 括： 按治疗受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状有效的量施用包 含LukE/D介导的细胞毒性的一种或多种抑制剂的组合物。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中所述抑制剂为蛋白质或肽抑制剂、核酸抑制剂 或小分子抑制剂。
32. 根据权利要求30所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂为LukE 抑制剂。
33. 根据权利要求32所述的方法，其中所述LukE抑制剂是识别SEQ ID NO: 11的氨基 酸序列中的表位的抗体。
34. 根据权利要求30所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂为LukD 抑制剂。
35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述LukD抑制剂是识别SEQ ID NO: 22的氨基 酸序列中的表位的抗体。
36. 根据权利要求30所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂包含 LukE/D受体拮抗剂。
37. 根据权利要求30所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂抑制 LukE和LukD的相互作用。
38. 根据权利要求30所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂抑制 LukE、LukD或LukE/D与白细胞的质膜结合。
39. 根据权利要求30所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂防止 LukE/D寡聚体复合物形成。
40. 根据权利要求30所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂抑制 LukE/D介导的细胞孔隙。
41. 根据权利要求40所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂包含环糊 精化合物。
42. 根据权利要求30所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂是诱导毒 素阻遏因子（Rot)的试剂。
43. 根据权利要求30所述的方法，进一步包括 施用选自由抗感染剂、抗生素试剂、抗菌剂组成的组的试剂。
44. 根据权利要求30所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌感染为MRSA感染或MSSA 感染。
45. 根据权利要求30所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌相关病状选自由皮肤损伤 和感染、组织脓肿、毛囊炎、骨髓炎、肺炎、烫伤样皮肤综合征、败血病、脓毒性关节炎、心肌 炎、心内膜炎和中毒性休克综合征组成的组。
46. 根据权利要求30所述的方法，其中所述施用经口服、通过吸入、通过鼻内滴注、局 部、经皮、肠胃夕卜、皮下、静脉注射、动脉内注射、肌肉注射、胸膜内、腹膜内或通过敷用到粘 膜上进行。
47. 根据权利要求30所述的方法，进一步包括重复所述施用。
48. 根据权利要求30所述的方法，其中所述受试者为婴儿、青少年、成人或老人。
49. 根据权利要求30所述的方法，其中所述受试者为免疫力低下的青少年、成人或老 人。
50. -种预测受试者金黄色葡萄球菌感染的严重程度的方法，包括： 培养来自于从感染受试者获得的液体或组织样品的金黄色葡萄球菌； 量化培养的金黄色葡萄球菌中的LukE和/或LukD表达或生成； 比较来自所述受试者的样品中LukE和/或LukD的量化量与生成少量或不可检测量的 LukE和/或LukD的对照样品中LukE和/或LukD的量；并且 基于所述比较预测金黄色葡萄球菌感染的严重程度。
51. 根据权利要求50所述的方法，其中所述量化包括： 测量培养的金黄色葡萄球菌中LukE和/或LukD蛋白生成的水平。
52. 根据权利要求50所述的方法，其中所述量化包括： 测量培养的金黄色葡萄球菌中lukE和/或lukD mRNA表达的水平。
53. -种治疗患有金黄色葡萄球菌感染的受试者的方法： 培养来自于从感染受试者获得的液体或组织样品的金黄色葡萄球菌； 量化培养的金黄色葡萄球菌中的LukE和/或LukD表达或生成； 比较来自所述受试者的样品中LukE和/或LukD的量化量与生成少量或不可检测量的 LukE和/或LukD的对照样品中LukE和/或LukD的量； 基于所述比较确定对所述受试者的适合疗法；并且 向所述受试者施用所述确定疗法以治疗金黄色葡萄球菌感染。
54. 根据权利要求53所述的方法，其中所述量化包括： 测量培养的金黄色葡萄球菌中LukE和/或LukD蛋白生成的水平。
55. 根据权利要求53所述的方法，其中所述量化包括： 测量培养的金黄色葡萄球菌中lukE和/或lukD mRNA表达的水平。
56. -种鉴定LukE/D细胞毒性的抑制剂的方法，包括： 提供细胞群； 提供含有LukE和LukD的制剂； 提供候选抑制剂； 在所述候选抑制剂存在和缺乏时使所述细胞群暴露于含有LukE和LukD的所述制剂； 测量暴露细胞群中LukE/D介导的细胞毒性水平； 比较在所述候选抑制剂存在和缺乏时LukE/D细胞毒性的测量水平；并且 基于所述比较鉴定LukE/D细胞毒性的抑制剂。
57. 根据权利要求56所述的方法，其中在所述候选抑制剂存在下，与其缺乏时相比， LukE/D介导的细胞毒性水平降低鉴定LukE/D细胞毒性的抑制剂。
58. 根据权利要求56所述的方法，进一步包括： 提供细胞毒性的经标记标志物； 在所述暴露之前、同时或之后，使所述细胞群与细胞毒性的经标记标志物接触； 检测细胞毒性的经标记标志物；并且 基于所述检测测量所述细胞群中LukE/D介导的细胞毒性水平。
59. 根据权利要求58所述的方法，其中所述细胞毒性的经标记标志物为细胞活力染 料、不能透过细胞的染料和/或细胞溶解的标志物。
60. 根据权利要求56所述的方法，其中所述细胞群包括白细胞群。
61. -种鉴定LukE/D介导的孔隙形成的抑制剂的方法，包括： 提供一群白细胞； 提供含有LukE和LukD的制剂； 提供候选抑制剂； 在所述候选抑制剂存在和缺乏时使所述白细胞群暴露于含有LukE和LukD的所述制 剂； 测量在所述候选抑制剂存在和缺乏时所述白细胞群中的孔隙形成； 比较在所述候选抑制剂存在和缺乏时孔隙形成的测得量；并且 基于所述比较鉴定LukE/D介导的孔隙形成的抑制剂。
62. 根据权利要求61所述的方法，其中在所述候选抑制剂存在下，与其缺乏时相比，孔 隙形成减少鉴定LukE/D介导的孔隙形成的抑制剂。
63. -种鉴定LukE和/或LukD-白细胞结合的抑制剂的方法，包括： 提供一群白细胞； 提供含有经可检测标记的LukE和LukD的制剂； 提供候选抑制剂； 在所述候选抑制剂存在和缺乏时使所述细胞群暴露于含有经可检测标记的LukE和 LukD的所述制剂； 测量在所述候选抑制剂存在和缺乏时经标记LukE和/或LukD与所述白细胞的结合； 比较在所述候选抑制剂存在和缺乏时LukE和/或LukD-白细胞结合的测得量；并且 基于所述比较鉴定LukE和/或LukD-白细胞结合的抑制剂。
64. 根据权利要求63所述的方法，其中在所述候选抑制剂存在下，与其缺乏时相比， LukE和/或LukD-白细胞结合减少鉴定LukE和/或LukD-白细胞结合的抑制剂。
【文档编号】A61P31/04GK104474531SQ201410532443
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2012年6月19日 优先权日:2011年6月19日
【发明者】V·J·托雷斯, F·阿朗佐 申请人:纽约大学