一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，通过制备无免疫源性骨膜生物支架和种子骨膜细胞，将无免疫源性骨膜生物支架低温干燥后密封，使用γ射线消毒后，将种子骨膜细胞以浓度为1×106/ml，滴于消毒的支架表面，待骨膜细胞逐渐随着悬液渗入无免疫源性骨膜生物支架内部后添加培养基，每2～3天换液，培养1周，进行体外复合培养。该方法所获取的骨膜生物支架中具有免疫源性的细胞去除彻底，细胞外基质的结构及主要成分保留完好，异体骨膜细胞可以与生物支架有效复合，为骨缺损、骨不愈的组织工程研究提供生物复合支架材料。
【专利说明】一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法。
【背景技术】
[0002]骨膜具有较强的成骨能力，在骨折愈合修复方面扮演着重要角色，骨膜也被认为是促进骨移植材料在移植区域发挥修复作用的始动因素。然而自体骨膜移植存在供体不足、供区结构功能损害等问题，而异体骨膜移植则存在严重的免疫排斥反应等问题。因此解决异体骨膜中的免疫排斥问题将是实现骨膜移植的重要环节。组织中具有主要免疫源性的成份为细胞，在去除细胞的同时也意味着免疫源性的去除。目前去除细胞的方法主要包括物理方法、化学方法和酶法。
[0003]骨膜组织通过物理、化学及相关酶的作用后虽然可以有效去除具有免疫源性的细胞成份，然而处理过程中势必会对细胞外基质的成份和结构造成不可避免的破坏，进而影响该支架的生物相容性，令细胞难以与其复合。因此，通过优化脱免疫源性的处理所获取的理想的无免疫源性骨膜生物支架应是在去除细胞成份的同时又尽可能完整地保留支架细胞外基质的主要生物活性成份及结构，为异体种子细胞地长入提供一个合适的、天然的生长空间。另一方面，支架材料和种子细胞是骨组织工程中必不可少的两个核心环节，支架材料在体外复合种子细胞可以保证其植入靶位置后具有更强的修复重建能力。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，目的在于制备复合骨膜细胞的组织工程支架，为骨缺损、骨不愈的组织工程研宄提供生物复合支架材料。
[0005]本发明具体通过以下技术方案实现:
[0006]一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，该方法包括以下步骤:
[0007]I)无免疫源性骨膜生物支架的制备和鉴定；
[0008]2)将保存的无免疫源性骨膜生物支架低温干燥后密封，使用Y射线消毒；
[0009]3)取异体骨膜组织剪成碎块，用胶原酶消化4h，取上清液离心后收集细胞，放于培养瓶中培养，获得种子骨膜细胞；
[0010]4)将种子骨膜细胞以浓度为lX106/ml，滴于消毒的支架表面，待骨膜细胞逐渐随着悬液渗入无免疫源性骨膜生物支架内部后添加培养基，每2?3天换液，培养I周。
[0011]进一步:
[0012]步骤(I)具体为包括以下步骤:
[0013]a.将骨膜组织冲洗，在_80°C条件下冷冻24?48h，取出后37°C条件下融化，重复3?5次；
[0014]b.在 3% 曲拉通-X100 (Triton-XlOO)和 3.5X l(T5mol/L 苯甲基黄酰氟(PMSF)的脱细胞液震荡12h，PBS反复冲洗并放入I %十二烷基硫酸钠(SDS)中继续震荡6h ；
[0015]c.冲洗后将骨膜组织放于混有0.001U/L RNA酶和0.1U/L DNA酶的混合消化酶液中 30 ?40min ；
[0016]d.在体积分数1%的过氧乙酸溶液浸泡消毒4h，既得无免疫源性骨膜生物支架，置于含0.1U/L的青链霉素的PBS液中4°C环境下保存备用。
[0017]步骤(2)中使用γ射线消毒，照射总剂量为15KGray。
[0018]步骤(3)所述的胶原酶为2g/L的I型胶原酶，所述的培养瓶内含10%胎牛血清和I %青链霉素的DMEM/F12培养基。
[0019]步骤⑷所述的培养基为含10%胎牛血清和I %青链霉素的DMEM/F12培养基。
[0020]本发明的有益效果为运用物理冻融、去污剂洗脱和酶消化等方法所获取的骨膜生物支架中含免疫源性的细胞结构去除彻底，细胞外基质的主要结构及成分保留完好，所用的异体骨膜细胞可以与该骨膜生物支架有效复合。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是正常骨膜组织学染色观察图；a为DAPI染色；b为HE染色；c为Masson染色；
[0022]图2是无免疫源性骨膜组织学染色观察图；a为DAPI染色；b为HE染色；c为Masson 染色；
[0023]图3是骨膜扫描电镜观察图；a为正常骨膜扫描电镜观察图；b为无免疫源性骨膜扫描电镜观察图；
[0024]图4是复合支架组织学检查图；&为HE染色观察细胞与支架复合培养情况；b为荧光下观察细胞在支架上的复合情况。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0026]实施例1兔胫骨无免疫源性骨膜生物支架与种子细胞复合的培养方法
[0027]1、材料
[0028]实验动物:为健康新西兰大白兔，由温州医科大学动物实验中心提供，3?4月龄，体质量约为2.0?2.5kg，雌雄不限，常规饮食饮水，分笼饲养。
[0029]主要试剂及仪器设备:曲拉通-X100 (Triton-XlOO，Sigma公司)，十二烷基硫酸钠(SDS，美国Sigma公司)，苯甲基黄酰氟(PMSF，美国Sigma公司)，RNA酶、DNA酶(美国Sigma公司)，I型胶原酶(美国GIBCO公司)，DNA提取试剂盒(大连TAKARA公司)，羟脯氨酸(Hyp)测试盒(南京凯基生物)，DAPI染液(美国Sigma公司)，CCK-8 (日本同仁)，胎牛血清(美国GIBCO公司)，青霉素、链霉素(上海博蕴生物有限公司)，DMEM/F-12培养基(美国GIBCO公司)，恒温震荡机(德国Heidolph公司)、微量紫外分光光度仪(美国NanoDrop公司)、CX31_32RFL荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)、S_3000N型扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)、MRX-HD全自动酶标分析仪(美国B1tek公司)、C02培养箱(德国 Hera-cell 公司)。
[0030]2、无免疫源性骨膜生物支架材料的制备
[0031]2.1兔胫骨骨膜的分离取材
[0032]予体积分数为3%的戊巴比妥钠lml/kg耳缘静脉麻醉后，于双侧胫骨近端内侧分离骨膜。术中仔细剔除骨膜表面肌肉等软组织，用无菌手术刀片切取1.5cmXl.5cm范围的骨膜全层后使用骨膜剥离器紧贴骨皮质表面缓慢剥下骨膜。整个分离取材过程尽量保持术野清洁，骨膜组织保持形态完整。
[0033]2.2骨膜免疫源性成份去除过程
[0034]将取出的游离骨膜用PBS反复冲洗3-4次，去除组织上残留的血液及其他杂质，放入-80°C冰箱内冷冻24-48小时后取出后37°C条件下融化(反复5个循环)后，放入含3%Triton-XlOO和3.5 X 10_5mol/LPMSF的脱细胞液中置于37°C恒温震荡机上震荡12小时，后予PBS反复冲洗并放入1% SDS中继续震荡6小时。冲洗后将骨膜放于混有0.001U/L RNA酶和0.1U/L DNA酶的混合消化酶液中30?40分钟后，予体积分数I %过氧乙酸溶液浸泡消毒4小时，PBS充分冲洗3遍后置于含0.1U/L的青链霉素的PBS液中4°C环境下保存备用。
[0035]3、无免疫源性骨膜生物支架的鉴定
[0036]3.1大体观察
[0037]观察新鲜骨膜组织及经物理冻融，Triton-XlOO, SDS震荡作用及RNA酶、DNA酶等混合消化酶液处理后，骨膜组织呈现白色疏松海绵状结构。
[0038]3.2组织学检查
[0039]正常组及脱免疫源性处理后的骨膜，经4%多聚甲醛固定，酒精梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡、包埋、切片，常规行组织学HE染色、DAPI染色和Masson染色后观察，如图1和图2所示，经处理后骨膜组织中具有免疫源性的细胞已完全去除，而细胞外基质中的主要成份(胶原)则有效保留。
[0040]3.3胶原定量检测
[0041]采用羟脯氨酸测量法，根据羟脯氨酸在胶原蛋白中含量占13.4%以推算脱免疫源性处理前后胶原含量的变化。具体采用羟脯氨酸测试盒(凯基生物)里说明书所提供的步骤操作:精确称取正常骨膜组织(η = 6)和处理后骨膜组织(η = 6)湿重30?10mg放入试管中并加入水解液，沸水浴20分钟后，调节PH值至6.0?6.8左右，经反复离心、纯化后和标准液一同予550nm的酶标仪检测吸光度并计算每毫克组织Hyp含量以进一步得出骨膜组织的胶原含量。结果显示无免疫源性骨膜生物支架(34.72±1.29yg/mg)与正常骨膜组织(35.95 ± 1.65 μ g/mg)胶原含量差别无统计学意义(P > 0.05)。
[0042]3.4DNA定性定量分析
[0043]去正常骨膜及脱免疫源性处理后的骨膜质量约为2?25mg，在56°C水浴中经蛋白酶K和RNA酶水解后，提取基因组DNA (按照TakaraDNA试剂盒说明操作)，微量紫外分光光度仪测定其浓度，并计算每毫克组织DNA含量。结果显示无免疫源性骨膜生物支架DNA含量(32.4±8.5ng/mg)较正常骨膜组织(1281.6±631.6ng/mg)明显减低。
[0044]3.5扫描电镜观察
[0045]正常组及脱免疫源性处理后的骨膜组织用3%戊二醛固定24小时后，PBS冲洗，乙醇梯度(体积分数为50%、70%、80%、90%、95%、100%)脱水，每个脱水15min以上，真空干燥，表面喷金处理后在扫描电子显微镜下观察，如图3所示，见无免疫源性骨膜生物支架表面呈疏松多孔结构，更有利于细胞复合。
[0046]4、骨膜细胞的分离和培养
[0047]无菌条件下取出游离骨膜，反复予PBS冲洗后在超净台上用眼科剪将骨膜剪成Imm3左右碎块，用2g/L的胶原酶放于37°C、含5% C02的培养箱中消化4h，取上清液，1200r/min离心5min离心收集细胞，放于含10%胎牛血清和1%的DMEM/F12培养瓶中培养，当细胞铺满瓶底时进行传代，收集第二代骨膜细胞进行后续复合。
[0048]5、骨膜细胞与支架复合
[0049]取无免疫源性骨膜生物支架低温干燥后密封包装，使用γ射线(15KGray)消毒。消毒后置于干燥培养皿中，将分离的第二代骨膜细胞以浓度为I X 106/ml，滴于支架表面，待骨膜细胞逐渐随着悬液渗入无免疫源性骨膜生物支架内部(3小时)后添加培养基，每2-3天换液，培养I周。
[0050]6、复合支架的组织学检查
[0051]取培养7天后的复合支架予PBS清洗后添加Live-dead染液，荧光下观察细胞在支架上的复合情况；经4%多聚甲醛固定，酒精梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡、包埋、切片，常规行组织学HE染色观察细胞与支架复合培养情况，如图4所示，结果均显示异体骨膜细胞可在该支架上有效复合并增殖。
【权利要求】
1.一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，其特征在于包括以下步骤: 1)无免疫源性骨膜生物支架的制备和鉴定； 2)将保存的无免疫源性骨膜生物支架低温干燥后密封，使用γ射线消毒； 3)取异体骨膜组织剪成碎块，用胶原酶消化4h，取上清液离心后收集细胞，放于培养瓶中培养，获得种子骨膜细胞； 4)将种子骨膜细胞以浓度为lX106/ml，滴于消毒的支架表面，待骨膜细胞逐渐随着悬液渗入无免疫源性骨膜生物支架内部后添加培养基，每2?3天换液，培养I周。
2.根据权利要求1所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，其特征在于:步骤(I)具体为包括以下步骤: a.将骨膜组织冲洗，在_80°C条件下冷冻24?48h，取出后37°C条件下融化，重复3?5次； b.在3%Triton-XlOO和3.5X10-5mol/L PMSF的脱细胞液震荡12h，PBS反复冲洗并放入1% SDS中继续震荡6h; c.冲洗后将骨膜组织放于混有0.001U/L RNA酶和0.1U/L DNA酶的混合消化酶液中30 ?40min ； d.在体积分数I%的过氧乙酸溶液浸泡消毒4h，制得无免疫源性骨膜生物支架，置于含0.1U/L的青链霉素的PBS液中4°C环境下保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，其特征在于:步骤⑵中使用γ射线消毒，照射总剂量为15KGray。
4.根据权利要求1所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，其特征在于:步骤(3)所述的胶原酶为2g/L的I型胶原酶，所述的培养瓶内含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM/F12培养基。
5.根据权利要求1所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，其特征在于:步骤(4)所述的培养基为含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM/F12培养基。
【文档编号】A61L27/36GK104511052SQ201410781495
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年12月16日 优先权日:2014年12月16日
【发明者】陈雷, 陈凯, 林贤丰 申请人:温州医科大学附属第一医院