本发明与分离胎盘中活性成分的技术有关，更详而言之是指一种以超临界流体技术分离与纯化胎盘中机能成分的方法。
背景技术：
胎盘是胎儿与母体组织之间的结合结构，提供胚胎所有营养物质和保护，科学研究发现，胎盘中含有丰富的生长因子、激素、蛋白质、胜肽、核酸、抗体和其他浓缩营养成分，可以促进身体组织的健康。它含有丰富的生长因子如肝细胞生长因子、神经生长因子、表皮纤维细胞因子、胰岛素生长因子、血小板衍生生长因子、造血细胞生长因子、血管内皮细胞因子等促进干细胞的生长因子，这些生长因子具有调节自主神经系统，改善心血管循环，伤口组织愈合，增强神经再生，平衡多种荷尔蒙，免疫增强功能(抗过敏)，镇痛作用和肠道健康的改善。
已知从胎盘中萃取生物活性胜肽成分的方法甚多，如美国专利US3409605以离子交换树脂吸附、浓缩和纯化胎盘中生长因子，美国专利US4169139则以丙酮、稀醋酸铅和稀硫酸铵分离沉淀组织中的蛋白质成分，中国CN1298736C与CN102488713B专利采用新鲜胎盘以无菌水清洗，加入10-100倍食盐水，高速组织均质化，先经透析脱盐与超过滤膜澄清处理，得到一种无色或微带黄色透明液体，再经阴离子交换层析、凝胶排阻层析、逆相高效液相层析多重步骤分离纯化，透析冻干得到萃取纯化的成品。也有如中国CN101658534A专利，其采用液态氮冷冻解冻法，高速研磨后，再经过透析脱盐与超过滤膜澄清处理，以离子交换树脂吸附和洗脱条件下，得到活性胜肽成分。
现有萃取与纯化胎盘相关机能成分的方法繁杂，分离与纯化胎盘中的胜肽、蛋白质与活化因子等机能成分较为耗时，且需使用大量的有机溶剂，在制作过程中有机溶剂可能会与机能成分产生化学反应的情形，不仅制作完成后溶剂去除与浓缩过程中，加热蒸发溶剂易造成机能成分部分破坏，且溶剂易残留于分离物或纯化物中，造成机能成分纯度不足的情形，显有改进之处。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种以超临界流体技术分离与纯化胎盘中机能成分的方法，其可分离与纯化胎盘中的活性成分，不但成本低，制作简单、操作性强、适合于规模化生产，且能保持胎盘中生物活性成分的活性，不需再经繁复的溶剂去除与浓缩、分离程序，且超临界流体可回收再利用，不需再经浓缩过程去除溶剂的步骤，无溶剂残留等安全疑虑，甚为环保、安全，具实用价值。
为达成前述的目的，本发明提供一种以超临界流体技术分离与纯化胎盘中机能成分的方法，其至少包含以下步骤：萃取：在预定温度与压力的操作条件下，以预定的流速持续将胎盘萃取液与超临界状态溶剂通入一分馏槽内，用以自胎盘萃取液萃取出胜肽与蛋白质等机能成分；纯化：持续在预定温度与低于前述压力的操作条件下分离超临界状态溶剂，将该分馏槽内萃取出的机能成分依序输送至若干分离槽进行纯化，以获得胎盘萃取液中的胜肽、蛋白质与活化因子等机能成分。
所述纯化的步骤中，将所述分馏槽内萃取出的机能成分依序输送经过连接的三个分离槽并逐步降压，以进行选择性分离、区分与纯化，从而提升胎盘胜肽与蛋白质的含量与纯度。
所述萃取的步骤中，胎盘萃取液以1:10(W/V)的比例将胎盘粉末与乙醇混合离心而成。
胎盘粉末为干燥的人体或羊、猪、鹿的胎盘粉末。
所述萃取的步骤中，在压力2000-4000Psi、温度40℃或60℃的操作条件下，将胎盘萃取液放置于所述分馏槽，超临界状态溶剂为超临界二氧化碳/乙醇，以超临界流体流速3-9L/hr、胎盘萃取液流速1-3L/hr流入所述分馏槽。
所述纯化的步骤中，在温度40℃或60℃下，依序分别以3000、2000、1000psi的压力在三个分离槽快速降压分离超临界状态溶剂。
所述萃取的步骤中，最适的操作条件为：压力为4000Psi、温度为40℃。
所述纯化的步骤中，最适的操作条件为：温度为60℃、压力为3000psi时，最适于将胎盘胜肽与蛋白质纯化区分于三个所述分离槽中。
本发明的有益效果在于：
本发明所提供以超临界流体技术分离与纯化胎盘中机能成分的方法，其采用安全无毒的超临界状态溶剂，配合物理方式的萃取与纯化的步骤，可将胎盘萃取液分离出活性成分-胜肽与蛋白质，且无溶剂残留等安全疑虑，环保、安全，超临界状态溶剂更可回收再利用，相较于已知萃取与分离胎盘胜肽与蛋白质的方法，本发明更可量产、连续式运作，具实用价值。
附图说明
图1为本发明一较佳实施例的流程图。
图2为本发明一较佳实施例的压力-胎盘胜肽分离效率分析图。
图3为本发明一较佳实施例的压力-胎盘蛋白质分离效率分析图。
图4为本发明一较佳实施例的压力-选择性值分析图。
图5与图6为本发明一较佳实施例的胎盘胜肽与蛋白质成分在胎盘萃取液(Feed)、分馏槽底部残余物(R)与三分离槽F1、F2、F3的浓度分布图。
图7为本发明一较佳实施例的压力-ADSC活化能力分析图。
图8为本发明一较佳实施例的ADSC生长因子在胎盘萃取液(Feed)、分馏槽底部残余物(R)与三分离槽F1、F2、F3的浓度分布图。
具体实施方式
以下，举本发明一较佳实施例，并配合附图做进一步的详细说明如后：
请参阅图1所示，本发明一较佳实施例以超临界流体技术分离与纯化胎盘中机能成分的方法100，可分离与纯化胜肽、蛋白质与活化因子等机能成分，其第一步骤为萃取110：备取1-2Kg的胎盘粉末(可为干燥的人体或羊、猪、鹿等动物的胎盘粉末)，以1:10(W/V)的比例用乙醇混合离心而制备胎盘萃取液(Feed)，接着在压力2000-4000Psi、温度40与60℃、超临界流体(二氧化碳SC-CO2/乙醇溶剂)流速3-9L/hr与胎盘萃取液流速1-3L/hr的操作条件下，连续通入一分馏槽内进行萃取，用以在该分馏槽中的顶端与底端分别萃取出胜肽与蛋白质等机能成分。该分馏槽为内径36mm、高度1000mm的不锈钢槽体，其内充填有不锈钢单体片。
本发明的第二步骤为纯化120：在温度40℃或60℃下，将该分馏槽内萃取出的胜肽与蛋白质等机能成分，连续地依序输送经过连接的三个分离槽，分别以3000、2000、1000psi的压力逐步降压，也即，第一分离槽为3000psi的压力，第二分离槽为2000psi的压力，而最后的第三分离槽为1000psi的压力，用以分离超临界状态溶剂，获得胎盘萃取液中的胜肽、蛋白质与活化因子等机能成分。三个分离槽皆为内径36mm、高度500mm的不锈钢槽体。
以下，利用不同的操作条件(改变压力与温度)实施前述方法，取胎盘萃取液(Feed)、分馏槽顶部萃取物(Extract)、分馏槽底部残余物(Raffinate，R)，及三个分离槽分别得到的胜肽、蛋白质与活化因子等机能成分(后称区分物F1、F2与F3)，分析以下生化性质：(1)脂肪组织来源的干细胞(adiposederivedstemcells；ADSC)的活化能力、(2)蛋白质浓度、(3)蛋白质电泳、(4)胜肽浓度。
ADSC活化能力的测量，以流式细胞仪分析，单位以％表示。蛋白质浓度的测量，以Bradford蛋白浓度测定试剂定量分析，单位以mg/gdw表示。蛋白质电泳分析，以SDS-PAGE蛋白质电泳胶体分析，单位以mg/gdw表示。胜肽浓度的测量，以C18管柱的HPLC定量分析，单位以mg/gdw表示。
实验结果分为两部分：(1)胎盘中的机能成分最适分离与纯化条件，(2)蛋白质成分、胜肽浓度与ADSC活性的量产制程，数据分析如图2至图8所示。
首先，在该连续式纯化反应系统将胎盘萃取液分离后，收集该分馏槽顶部与底部的样品，分析二者含量并计算出胎盘胜肽的分离效率(K-valueofpeptide；Kpeptides)、胎盘蛋白质的分离效率(K-valueofprotein；Kproteins)与二者含量的选择性值(selectivity)。定义如下：
Kpeptides＝分馏槽顶部胎盘胜肽含量÷分馏槽底部胎盘胜肽含量。Kproteins＝分馏槽顶部胎盘蛋白质含量÷分馏槽底部胎盘蛋白质含量。选择性定义＝Kpeptides÷Kproteins。
当Kpeptides＝1时，表示该分馏槽顶部胎盘胜肽含量等于分馏槽底部胎盘胜肽含量。Kpeptides>>1时，表示胎盘胜肽含量容易被分离于分馏槽的顶部；Kproteins<<1时，表示胎盘蛋白质含量容易被分离于该分馏槽底部。
操作压力与温度会改变胎盘胜肽与蛋白质的分离效率。分馏后的数值结果显示：如图2所示，温度在40℃范围下，压力越高时(即压力达3000psi时)，胎盘胜肽的分离效率达3.0以上。如图3所示，温度在40℃范围下，压力越高时(即压力达4000psi时)，胎盘蛋白质的分离效率达2.5。因此，采用温度40℃与压力4000psi时，最适于将胎盘胜肽与蛋白质分离于分馏槽的顶部。如图4所示，当温度在60℃范围下与压力达3000psi时，选择性值达4.0，显示在此操作条件下，最适于将胎盘胜肽与蛋白质纯化区分于三个分离槽中(F1、F2、F3)。
举例而言，选择温度40℃与压力4000psi的操作条件下，将胎盘胜肽与蛋白质成分，分离于分馏槽的顶端，再利用降压(即降低压力至3000、2000、1000psi于F1、F2、F3)，与提高温度至60℃范围下，可以选择性分离、区分与纯化胎盘胜肽与蛋白质的含量与纯度，如图5与图6所示：胎盘胜肽与蛋白质成分在胎盘萃取液(Feed)、分馏槽底部得到残余物(R)，三个分离槽F1、F2、F3的浓度分布，因此，在温度40℃与压力4000psi的操作条件下，得到胎盘蛋白质成分于分馏槽的底部；同时地，在温度60℃与压力3000、2000psi的操作条件下，得到胎盘胜肽成分于分离槽F1与F2中。
图7的实验结果显示，分析收集分馏槽的样品的ADSC活化能力表现，显示超临界状态溶剂，在操作压力4000Psi与温度40℃下，最适合萃取出活化ADSC生长因子的机能成分，进而促进脂肪组织来源的干细胞活化与再生的能力。
图8的实验结果显示：在温度40℃与压力2000、1000psi条件下，最适合分离与纯化活化ADSC生长因子的纯化物在第二分离槽-区分物2(F2)与第三分离槽-区分物3(F3)中。
此外，为验证本发明的纯化技术应用于机能性食品与化妆品产业的功效，进行下列工业量产测试实验：
应用超临界流体在温度40℃与压力4000psi条件下与胎盘萃取液在分馏槽内进行萃取处理后，同时地，再将胎盘中最适合促进脂肪组织来源的干细胞的活化与再生能力的生长因子，在温度40℃与压力2000psi条件下，分离活化ADSC生长因子的纯化物在第二分离槽-区分物2(F2)。实验配方与实验结果的数据分析如表一所示。这些使用本发明技术从胎盘中所分离与纯化的胜肽、蛋白质与活化因子等机能成分，添加在机能性饮品、食品(果冻)或精华液的化妆品中，可有效地促进ADSC活化与再生能力的生长因子，有效促进ADSC活性能力15-21％。
表一：
由上可知，本发明所提供以超临界流体技术分离与纯化胎盘中机能成分的方法，其采用安全无毒的超临界状态溶剂，配合物理方式的萃取与纯化的步骤，可将胎盘萃取液分离出活性成分-胜肽与蛋白质，且无溶剂残留等安全疑虑，环保、安全，超临界状态溶剂更可回收再利用，相较于已知萃取与分离胎盘胜肽与蛋白质的方法，本发明更可量产、连续式运作，显然甚具实用价值。