具有增强的促凋亡特性的基因修饰的传染性麻疹病毒(MV-DELTAC病毒)在癌症治疗中的用途的制作方法

本发明涉及一种来源于减毒活麻疹病毒株的基因修饰的传染性麻疹病毒，所述基因修饰的传染性麻疹病毒中编码病毒辅助c蛋白的基因已经被敲除(mv-deltac)。本发明具体涉及所述基因修饰的传染性mv-deltac在治疗恶性肿瘤或癌症病症的用途，以及制备用于这类治疗的药剂或组合物的用途。

背景技术：

恶性间皮瘤是一种罕见的和高度侵袭性的癌症，对常规的治疗方法具有抗性。恶性胸膜间皮瘤的发展主要与长时间接触石棉纤维和粉尘有关(kazan-allenetal,lungcancer,2005,49s1:s3-s8；robinsonetal,lancet,2005,366:397-408)。黑色素瘤是在黑素细胞中发展出的一种恶性肿瘤，当未被治疗时，它可以扩展到整个身体。尽管它只代表频率最低的一类皮肤癌，但它造成大部分皮肤癌相关的死亡(chin,l.etal.,genesdev.200620:2149-2182)。肺腺癌在吸烟者和非吸烟者中是最常见的肺癌类型，并且是癌症死亡最常见的原因之一(travis,w.d.etal,jthoraconcol.,2011,6(2),244-285)。

对于数种侵袭性癌症诸如恶性间皮瘤、黑色素瘤和肺腺癌来说，当前没有提供显著治愈可能性的策略。

它们的预后是非常差的，对于所有常规的治疗方式，诸如化疗、放疗和/或外科手术来说它们是相对难治的。因此迫切需要开发新的临床方法。

癌症病毒疗法被广泛认为是用于治疗耐受常规抗癌疗法的癌症的新的替代方法(boisgeraultnetal.,immunotherapy,2010,march2(2),185-199)。溶瘤病毒疗法已经在临床前和数个i期临床抗癌治疗中(lech,pjandrussell,sj；expertreviewofvaccines,2010,9(11):1275-1302；galanisetal,cancerresearch,2010,70(3):875-882)以及体外研究中(gauvrit,aetal.,cancer research,2008,68(12),4882-4892)显示多重抗肿瘤机制。与细胞转移免疫疗法相比，病毒疫苗具有以下优点：提供同时发生细胞减少的个性化抗癌免疫，无需个性化的制备。此外，病毒疫苗可以被改造以去除免疫抑制性病毒组分并插入增强抗肿瘤细胞毒性和免疫的转基因(a.gauvritetal.,cancerresearch,2008,68(12),4882-4892)。

麻疹病毒(mv)是一种非片段化的单链、负链包膜的属于副粘液病毒科(paramyxoviridae)家族麻疹病毒(morbilivirus)属的rna病毒。mv的非片段化基因组具有反信使(antimessage)极性，这导致基因组rna在体内或体外既不翻译并且纯化时也不具传染性。这种病毒在1954年被分离(enders,j.f.andpeebles,t.c,1954,procsocexpbiolmed,86(2):277-286)，从那时起活的减毒疫苗来源自该病毒以提供疫苗株，特别是来源自schwarz/moraten株。

已经研究和报道了非片段化(-)链rna病毒的转录和复制以及它们组装为病毒颗粒，尤其在病毒学领域(第3版,vol1,1996,lippincott-ravenpublishers-fieldsbnetal.)。mv的转录和复制不涉及被感染细胞的细胞核，而是发生在所述被感染细胞的细胞质中。mv基因组包括编码来自6个基因(称为n、p、m、f、h和l)的6个主要结构蛋白和其他两种来自p基因的非结构蛋白(c和v蛋白)的基因。基因顺序如下所示：3'，n、p(包括c和v)、m、f、h，以及5'端的l大聚合酶蛋白(图1a)。基因组还包括基因间区域m/f中的非编码区；该非编码区包含未翻译rna的大约1000个核苷酸。所述基因分别编码前导肽(i基因)、病毒核衣壳的蛋白即核蛋白(n)、磷蛋白(p)和大蛋白(l)，所述蛋白围绕基因组rna组装以提供核衣壳。其他基因编码病毒包膜蛋白，包括血凝素(h)、融合蛋白(f)和基质蛋白(m)。mv的c蛋白由多顺反子p基因编码，它是小的(186个氨基酸)碱性蛋白，定位于细胞质和细胞核(bellini,w.j.etal,j.virol,1985,53:908-919)。该病毒蛋白描述为mv毒性因子，其作用还未被透彻了解。为了确定mv的c蛋白的作用，使用缺乏c蛋白表达的重组野生型mv株，其基于高致病性的ic-b株并使用反向遗传系统产生。据推测mv的c蛋白可能参与病毒颗粒的组装、病毒蛋白表达以及延迟感染细胞的凋亡，以便建立长期的mv感染(takeuchi,k.etal,j.virol,june2005,7838-7844)。尽管已经报道了mv的c蛋白抑制干扰素抗病毒应答(shaffer,j.a.etal,virology,2003,315:389-397)，但是另一研究得出相反结论(takeuchi,k.etal,j.virol,june2005,7838- 7844)，从而证明mv的c蛋白的功能还没有被明确确定。

在作为溶瘤剂被检测的人病毒中，减毒活mv疫苗表现出许多优点。在30年间已给亿万儿童施用，它是最安全和最广泛使用的人儿科疫苗。mv减毒株感染大量细胞类型，优选感染转化的癌细胞。这归因于mv使用在癌细胞中经常过表达的cd46作为受体以抵抗天然杀伤细胞的补体依赖的杀死(naniche,d.etal,jvirol,1993,67(10):6025-6032；dhiman,n.etal,revmedvirol,2004,14(4):217-229)，而野生型mv优选使用slam(cd150)(tatsuo,h.etal.nature,2000,406(6798):893-897；anderson,b.d.etal,cancerres.,2004,64:4919-4926；schneider,u.etal,jvirol,2002,76:7460-7467)。有趣地是，通过特异性靶向癌细胞而不感染健康细胞，mv显示天然的抗肿瘤特性。因此，对于用于未来的治疗方案来说，mv的安全特性不存在问题。

野生型mv的溶瘤(oncolytic)特性是本领域技术人员公知的(mayofoundationformedicaleducationandresearch,us07854928)。最近，已经启动临床试验来研究edmonstonmv株治疗卵巢、恶性胶质瘤、非小肺癌和多发性骨髓瘤的能力(参见http://clinicaltrials.gov，麻疹和癌症关键词)。还描述了重组或嵌合mv疫苗作为接种载体的用途(wo2004/000876、wo2004/076619、wo2006/136697和wo2008/078198)。

这种技术还被认为可用于间皮瘤的免疫-溶瘤治疗(gauvrit,a.etal,cancerresearch,2008,68(12),4882-4892)。相应地，国际专利申请wo2009/047331描述了mv疫苗的减毒活schwarz株对一组上皮样间皮瘤肿瘤细胞的溶瘤和免疫佐剂特性。使用从传染性cdna克隆产生的mv疫苗的拯救schwarz株，显示mv感染的间皮瘤细胞诱导自发性单核细胞来源的树突细胞(mo-dc)成熟和肿瘤抗原特异性应答。

癌症病毒疗法相对于常规疗法的潜在优点包括以下特性：诱导免疫应答时包括不仅针对癌症抗原(肿瘤相关抗原)更高的靶标特异性，从而具有更好的安全边界，而且具有归因于免疫记忆的延长效果，从而可以预防复发和转移。实际上，已经证明在抗原呈递细胞存在的条件下，癌细胞部位施用mv后发展出免疫特异性应答和记忆(masse,d.etal,int.j.cancer,2004,111(4),575-580)；liuetal,moleculartherapy:thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy,2010,18(6):1155-1162)。已证明schwarzmv株的 抗肿瘤活性通过多种机制起作用，包括肿瘤细胞溶解、诱导肿瘤免疫原性凋亡(与细胞死亡有关的危险信号表达)和病毒介导的合胞体形成(gauvrit,a.etal,cancerres,2008,68(12),4882-4892)。此外，释放的肿瘤相关抗原和源于病毒复制的炎症还表明破坏了对肿瘤的免疫耐受性并诱导抗癌免疫。

尽管能有效感染，但一些mv感染的恶性肿瘤或癌细胞对细胞死亡诱导具有抗性。因此需要开发出有助于克服这类抗性，从而提高并延长恶性肿瘤或癌细胞的特异性细胞死亡诱导的病毒。

树突细胞(dc)前体被分为单核细胞来源的树突细胞(mo-dc)和浆细胞样树突细胞(pdc)，它们显示不同的功能特性。pdc是参与抗病毒免疫应答的dc亚组，因为它们表达toll样受体(tlr)，专门用于识别病毒核酸(tlr7，tlr9)(gilliet,m.etal,natrevimmunol,2008,8:594-606)。就活化和成熟而言，它们通过产生大量的i型干扰素(ifn-α，β，ω)，对各种各样的病毒(尤其是甲型流感病毒，单纯疱疹病毒，hiv)产生应答。当它们被病毒感染时，它们还能将病毒抗原呈递给cd8⁺和cd4⁺t细胞(fonteneau,j.f.etal,blood,2003,101:3520-3526)，并将来自病毒感染细胞的病毒抗原交叉呈递给cd8⁺t淋巴细胞(dipucchio,t.etal,natimmunol,2008,9:551-557；lui,g.etal,plosone,2009,4:e7111)。还显示pdc可能在抗肿瘤的免疫应答中起到有益作用(drobits,b.etal,jclininvest.,2012,122:575-585；liu,c.etal,jclininvest.,2008,118:1165-1175)。举例来说，在小鼠黑色素瘤模型中，在利用tlr7配体(咪喹莫特)进行局部治疗后在肿瘤内部观察到pdc活化和抗肿瘤免疫应答(drobits,b.etal,jclininvest.,2012,122:575-585)。因为mv是单链rna(ssrna)，本发明人假设pdc能够检测肿瘤细胞的mv感染，因为它们液泡内的tlr7表达，其识别单链rna。

发明概述

本发明人意外的发现，一种来源于减毒活mv株的基因修饰的传染性麻疹病毒(所述基因修饰的传染性麻疹病毒中编码病毒辅助c蛋白的基因已被敲除)(mv-deltac)，引发增强的抗恶性肿瘤或癌细胞的应答，特别是与未修饰的mv相比，具有增强的促凋亡特性。因此本发明提供mv-deltac，并显示它可以有效地感染并杀死恶性肿瘤或癌细胞，诸如恶性间皮瘤、黑色素瘤和肺腺癌细胞。本发明人还证明，与来自mv感染的恶性间皮瘤、黑 色素瘤和肺腺癌细胞的裂解物接触的浆细胞样树突细胞可以活化抗间皮瘤、抗黑色素瘤和抗肺腺癌cd8t细胞。因此本发明人认为，当使用mv-deltac作为抗恶性肿瘤或癌细胞的活性化合物时，因为mv-deltac活化pdc，mv-deltac的观察到的特性可能是令人感兴趣的。

本发明涉及一种来源于减毒活麻疹病毒株的传染性麻疹病毒，当给诊断患有侵袭性恶性肿瘤或侵袭性癌症病症的个体施用时，通过活化浆细胞样树突细胞(pdc)，用于治疗所述侵袭性肿瘤或侵袭性癌症。

本发明还涉及一种来源于减毒活麻疹病毒株的基因修饰的传染性麻疹病毒，所述基因修饰的传染性麻疹病毒中编码辅助c蛋白的基因已被敲除(mv-deltac)，当给诊断患有侵袭性恶性肿瘤或侵袭性癌症病症的个体施用时，通过活化浆细胞样树突细胞(pdc)，用于治疗所述传染性肿瘤或传染性癌症。

术语“麻疹病毒”简写为mv，表述“来源于减毒活麻疹病毒株的麻疹病毒，所述基因修饰的传染性麻疹病毒中编码病毒辅助c蛋白的基因已被敲除”简写为mv-deltac。

本申请使用的术语“编码”定义核酸分子在指定细胞或细胞系中被转录，并在合适情况下翻译表达产物的能力。

在本发明中，个体优选的是哺乳动物，更优选的是人。

如本文所定义的，表述“基因修饰的”包括以下事实：在制备的，尤其是拯救(rescue)的基因修饰的传染性mv-deltac中去除了麻疹病毒c蛋白合成。

如本文所定义的，表述“编码病毒辅助c蛋白的基因已被敲除”表示，编码c蛋白的基因的表达被沉默。

c蛋白合成的抑制具体来说通过沉默p基因中包含的并编码c蛋白的c蛋白开放阅读框(orf)的表达来实现。c蛋白orf与porf的一部分在+1框架中重叠。c蛋白orf的沉默具体来说通过以下方式实现：所述orf序列的适当突变，通过突变p基因n末端区域的第二个“atg”起始密码子。除了这种第一个突变之外，可以引入第二个突变，通过取代c开放阅读框中下游的一个核苷酸以添加一个终止密码子(图1b)(patterson,j.b.etal,virology,2000,267(1):80-89)。

根据用于副粘液病毒科的习惯，术语“基因”可用于表示编码mrna 的基因组rna核酸。在本发明的上下文中，它还可以表示所述mrna中包含的orf。

沉默c蛋白表达的所述突变必须维持p基因的表达，以确保其表达p蛋白的能力。

在一个优选的实施方案中，mv的突变rna核酸进一步满足所谓的“六位规则(ruleofsix)”。“六位规则”表述以下事实：编码全长mv(+)链rna基因组的核酸中存在的核苷酸总数是6的倍数。在一个具体实施方案中，包括相同的或包括突变mv-deltac基因组或由所述突变mv-deltac基因组和可能额外的尤其是编码序列组成的核酸构建体是6的倍数。“六位规则”在本领域已经公认为是对mv基因组中核苷酸总数的要求，其确保mv基因组rna的有效或优化复制，这归因于与使基因组上6个核糖核苷酸壳体化的每个mv蛋白亚基相互作用以形成核衣壳。

公布在不同的mv株，诸如高致病性ic-b株(takeuchi,k.etal,j.virol,june2005,7838-7844)或edmonstonb疫苗株(radecke,f.etal,virology,1996,217:418-421；patterson,j.b.etal,virology,2000,267(1):80-89)中已被敲除的c蛋白表达的方法在现有技术中已被公开，其通过使用反向遗传学系统，并且可用于本发明的情况下。

如本文所定义的，表述“来源于减毒活麻疹病毒株的传染性麻疹病毒”表示一种麻疹病毒，其来源于与相同宿主，尤其是人中指定的亲株相比无毒性或毒性更低的株，并在给宿主，尤其是人施用时保持传染特性和免疫原性和可能的佐剂性，即保持对mv的免疫显性t和b细胞应答和可能的佐剂性诸如诱导t细胞共刺激蛋白或细胞因子il-12。致病性的原株强烈破坏血细胞生成(arneborn,p.etal,clinexpimmunol,1983,51:165-172；kim,e.a.etal,radiographics,2002,22specno:si37-149；okada,h.etal,archvirol,2000,145:905-920)，从而产生瞬时免疫抑制，在发展中国家造成由麻疹感染引起的大部分死亡。与原株相反，减毒活株不诱导免疫抑制(okada,h.etal,archvirol,2001,146:859-874)。

因此减毒活mv株指以下菌株：已经在选定细胞上进行系列传代并且优选的，适应其他细胞，诸如具有ifnα/β应答的原代细胞，即cef细胞，以产生适于制备疫苗株的种子株，其载有既不允许回复致病性也不整合入宿主染色体，尤其是人宿主染色体的稳定基因组。在本发明的一个具体实 施方案中，减毒活mv是在原代细胞诸如cef细胞上挑选的mv。

作为一种具体的“减毒活株”，当被批准用于人的疫苗株满足fda(美国食品与药物管理局)确定的标准，即在对实验和临床资料进行严格评估后，它满足安全性、有效性、质量和重复性标准(www.fda.gov/cber/vaccine/vacappr.htm)时，它是适合于本发明的减毒活株。

在本发明中，提供mv病毒的具体减毒活mv株是schwarz株或moraten株，尤其来自疫苗(aventis)。已经证明，schwarz株与moraten株具有高度的序列相同性(parks,c.l.etal,2001,jvirol,75(2):910-920；schwarz,a.j.,1962,amjdischild,103,386-389)。schwarz/moraten株在当前被广泛使用，因为它们诱导长期的细胞和体液免疫应答，并呈现重要的遗传稳定性，因为从未观察到回复到致病形式(hilleman,m.,2002,vaccine,20:651-665)。

更优选的，使用克隆入质粒ptm-mvschw的mvschwarz株的cdna产生本发明基因修饰的传染性mv，所述质粒ptm-mvschw由巴斯德研究院于2002年6月12日保藏于cncm(法国，巴黎)，编号i-2889，其序列由combredet描述(combredet,c.etal,2003,jvirol,77(21):11546-11554)，并公开于wo2004/000876和本发明的实施例1。质粒ptm-mvschw获自bluescript质粒，包括编码schwarz株全长mv(+)rna链的多核苷酸，置于t7rna聚合酶启动子的控制下，并且具有18967个核苷酸。从减毒活mv的病毒颗粒纯化的核酸开始，可以类似地获得来自其他mv株的cdna。为了制备编码mv-deltac基因组的合适cdna，通过取代p基因中第二个“atg”起始密码子对质粒ptm-mvschw进行修饰，以得到质粒ptm-mvschw-deltac-atul(egfp)(seqidno:1)。具体来说，通过将t核苷酸突变为c核苷酸，用“acg密码子”取代“atg”密码子。

在一个具体实施方案中，seqidno:1的ptm-mvschw-deltac-atul(egfp)质粒被进一步突变，通过用a核苷酸取代第2803位的g核苷酸以提供终止密码子。ptm-mvschw-deltac-atul(egfp)的这种变体具有seqidno:2的核苷酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，通过拯救获得基因修饰的传染性mv-deltac。在wo2004/000876中已经详细描述了schwarzmv株的未修饰mv的拯救，相同方法可用于制备基因修饰的传染性mv-deltac。

在本发明一个具体的实施方案中，基因修饰的传染性mv-deltac表达gm-csf(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)(guse,k.etal,2011,oncolyticvacciniavirusforthetreatmentofcancer,vol.11,no.5,pages595-608)，因此是mv-deltac-gm-csf。

如本文所定义的，表述“用于治疗”表示基因修饰的传染性mv-deltac可用于以下方法：给个体施用以完全清除个体，尤其是人中确诊的恶性肿瘤或癌症病症，或减少肿瘤大小，或减轻所述恶性肿瘤或癌症病症的症状。在一个具体实施方案中，涉及本发明mv-deltac的病毒疗法可以与其他疗法，尤其是化疗联用。因此，涉及mv-deltac的病毒疗法可用于组合或附加治疗方式。

如本文所定义的，表述“侵袭性恶性肿瘤或侵袭性癌症”是指对于当前已知的常规治疗方式，诸如化疗、放疗和/或外科手术具有抗性，因此在所述常规治疗下仍然发展的恶性肿瘤或癌症。

如本文所定义的，表述“通过活化浆细胞样树突细胞(pdc)”表示mv或mv-deltac感染的肿瘤细胞在抗肿瘤免疫应答中通过活化pdc产生大量ifn-α，和/或将来自被感染肿瘤细胞的taa交叉呈递给肿瘤特异性cd8+t淋巴细胞的能力，以利用pdc。

如本文所定义的，术语“浆细胞样树突细胞(pdc)”包括抗原呈递细胞，其响应病毒和细菌刺激产生大量α/β干扰素(ifn-α/β)，以及在本发明中被识别以能够吞噬肿瘤感染细胞。

在一个具体实施方案中，所述mv-deltac可用于治疗恶性间皮瘤，尤其是恶性胸膜间皮瘤。

在另一个具体实施方案中，本发明涉及一种来源于减毒活麻疹病毒株的基因修饰的传染性麻疹病毒，所述基因修饰的传染性麻疹病毒中编码病毒辅助c蛋白的基因已被敲除(mv-deltac)，当给诊断患有黑色素瘤或肺腺癌病症的个体施用时，用于治疗黑色素瘤或肺腺癌。

本发明的一个具体实施方案提供一种基因修饰的传染性mv-deltac，当给诊断患有恶性肿瘤或癌症病症的个体施用时，其可用于治疗对未修饰mv具有抗性的恶性肿瘤或癌细胞。

表述“未修饰的mv”是指没有被基因修饰的mv传染性减毒活株，诸如schwarz或moraten株的病毒。

如本文所定义的，表述“对未修饰mv具有抗性的恶性肿瘤或癌细胞”是指已知抵抗细胞死亡诱导(尽管未修饰mv有效感染)，或已知未修饰mv比mv-deltac产生的针对细胞死亡诱导的应答要弱的恶性肿瘤或癌细胞。

本发明人已经证明，与施用未修饰mv获得的应答相比，给各种恶性肿瘤或癌细胞施用mv-deltac提供或引发提高的应答，尤其在较低浓度水平引发提高的凋亡活性，具有更短的响应时间和提高的免疫原性(kroemer,g.etal,annu.rev.immunol,2012,31:51-72)。

根据本发明一个具体的实施方案，所述基因修饰的传染性mv-deltac在mv-deltac感染的恶性肿瘤或癌细胞中显示凋亡活性。

如本文所定义的，表述“凋亡活性”是指在细胞中诱导或引发凋亡的能力，其可以通过恶性肿瘤或癌细胞，尤其是实施例的恶性间皮瘤、黑色素瘤和肺腺癌细胞中的体外凋亡来证明。

通过免疫应答或在细胞应激或细胞死亡中分子的产生可以表征本发明mv-deltac病毒显示的活性。这些分子包括hmgb-1(高迁移率族蛋白-1)、钙网蛋白(calreticulin)和热休克蛋白(hsp70)，其被称为参与免疫应答活化的危险信号(zitvogel,letalcell,2012,140:798-804)。

胱天蛋白酶-3(caspase-3)已知参与凋亡程序的晚期事件(duprez,l.etal,microbesinfect,2009,11(13):1050-1062)。

根据本发明一个具体的实施方案，所述基因修饰的传染性mv-deltac在mv-deltac感染的恶性肿瘤或癌细胞中诱导胱天蛋白酶-3的活化。

hsp70蛋白在感染细胞质膜外层上的存在参与免疫应答，尤其是参与抗原呈递细胞和先天细胞免疫效应物的识别(oglesbeeetal,viralimmunol,2002,15(3):399-416)。

根据本发明一个具体的实施方案，所述基因修饰的传染性mv-deltac在mv-deltac感染的恶性肿瘤或癌细胞中诱导hsp70蛋白暴露于质膜外层。

钙网蛋白是一种重要的内质网蛋白，在细胞应激期间其可以重新定位于质膜外层(healetal,biochemj1998,329(2),389-394)。具体来说，这种暴露于细胞表面允许通过抗原呈递细胞的凋亡细胞吞噬(ogdenetal,jexpmed,2001,194(6):781-795)。最近，一些研究假设暴露在细胞表面的钙网蛋白决定了它们死亡的免疫原性(obeidetal,natmed,2007,13(1):54-61)。

根据本发明一个具体的实施方案，所述基因修饰的传染性mv-deltac 诱导钙网蛋白移位到mv-deltac感染的恶性肿瘤或癌细胞表面。

在免疫原性细胞死亡期间释放到环境中的hmgb-1通过结合不同的受体，诸如tlr4(apetohetal,natmed,2007,13(9):1050-1059)和tlr9(tianetal,natimmunol,2007,8(5):487-496)，对树突细胞的成熟起作用。

根据本发明一个具体的实施方案，所述基因修饰的传染性mv-deltac诱导hmgb-1在mv-deltac感染的恶性肿瘤或癌细胞的胞外介质(extracellularmedium)中的释放。

本发明人在人癌细胞系(a549人肺腺癌细胞和hela颈癌细胞)和非癌细胞(hek293人胚肾细胞和vero非洲绿猴肾细胞)中比较了细胞死亡诱导。他们证明与未修饰的mv相比，mv-deltac甚至在低moi也诱导对a549和hela人癌细胞的更高和更早的细胞死亡(图23a)。本发明人还观察到，对于未修饰mv和mv-deltac来说，vero细胞的细胞死亡诱导是类似的，而在感染68小时后没有观察到hek293细胞的细胞死亡(图23b)。因此本发明人证实，mv-deltac对人癌细胞是特异的：实际上，当其接触人癌细胞时，mv-deltac显示比未修饰mv更高的凋亡活性，但当其接触实验细胞系即vero细胞时，显示与未修饰mv类似的凋亡活性。

本发明还涉及一种用于制备疫苗性(vaccinal)浆细胞样树突细胞(pdc)的方法，所述浆细胞样树突细胞用于在诊断患有恶性肿瘤或癌症病症的个体中治疗所述恶性肿瘤或癌症，所述方法包括下列步骤：

-用来源于减毒活麻疹病毒株的传染性麻疹病毒体外感染先前从所述个体收集的恶性肿瘤或癌细胞，以产生细胞裂解物；

-将pdc与细胞裂解物接触以产生疫苗pdc；

-回收负载(load)的pdc。

本发明还涉及一种用于制备疫苗性浆细胞样树突细胞(pdc)的方法，所述浆细胞样树突细胞用于在诊断患有恶性肿瘤或癌症病症的个体中治疗所述恶性肿瘤或癌症，所述方法包括下列步骤：

-用来源于减毒活麻疹病毒株的基因修饰的传染性麻疹病毒体外感染先前从所述个体收集的恶性肿瘤或癌细胞，以产生细胞裂解物，所述基因修饰的传染性麻疹病毒中编码病毒辅助c蛋白的基因已被敲除(mv-deltac)；

-将pdc与细胞裂解物接触以产生疫苗pdc；

-回收负载的pdc。

在本发明中，上文定义方法的所述恶性肿瘤或癌症是侵袭性恶性肿瘤或侵袭性癌症，尤其是恶性间皮瘤、黑色素瘤或肺腺癌。

在本发明中，上文定义方法的所述减毒活麻疹病毒株是schwarz株或moraten株。

当给个体施用mv-deltac时，可以通过胸膜内腔或通过鼻内、肌内、静脉内或皮下途径进行施用。当通过胸膜内腔施用mv-deltac时，优选的在邻近待治疗的恶性肿瘤或癌细胞处施用或直接将其施用入待治疗的恶性肿瘤或癌细胞中。

待施用的mv-deltac的治疗有效量优选的范围是10³到10⁹50％组织培养感染剂量(tcid50)。tcid50测定法是本领域技术人员公知的，尤其由描述(arch.exp.path.pharmak,1931,162:840-483)。

制备疫苗pdc的方法优选的不包括从个体获取恶性肿瘤或癌细胞以便体外制备疫苗pdc的步骤。该步骤可以根据本领域技术人员已知用于获取或提取细胞样品，诸如活检和渗出(即胸膜积液)的任意技术进行。在取出后，例如可以根据传统技术在培养基中维持恶性肿瘤或癌细胞，或冷冻(即在-80℃)用于保存。当恶性肿瘤或癌细胞不是来源于接受疫苗pdc治疗的个体时，它们尤其可以来自异体恶性间皮瘤、黑色素瘤和肺腺癌细胞系。

在上文定义的体外制备方法中，可以通过使细胞和病毒直接接触进行mv-deltac对恶性肿瘤或癌细胞的感染，例如感染复数(mutliplicityofinfection,moi)为1，37℃温育2小时。感染后，由于病毒的作用，感染细胞的死亡自发进行。通常首先形成合胞体(syncitia)，然后是细胞裂解，从而提供适于疫苗制备的细胞裂解物。通过感染细胞的直接显微镜观察可以证实这种现象。

如本文所定义的，术语“细胞裂解物”包括如本文公开所获的全部(或总)细胞裂解物，或细胞裂解物的组分，诸如膜组分(即细胞质内含体或apobodies)。

可以根据本领域技术人员公知的许多方法获取pdc。在本发明一个的具体实施方案中，pdc优选的来源于待治疗的个体。当前优选的是pdc来源于白细胞采集物(leukapheresis)。获取pdc尤其是本领域技术人员公知的。优选的，可以按照coulais描述的通用方法获取pdc(coulais,detal., cytotherapy,2012,14(7):887-896)。当pdc来源于待治疗的个体时，pdc可以获自所述个体的白细胞采集物。

对本领域技术人员显而易见的是，pdc与细胞裂解物的接触应当维持足够时间以便pdc被细胞裂解物中存在的抗原有效负载。一旦被负载(或被脉冲处理(pulse))，就获得本发明的疫苗pdc。可以根据gauvrit描述的通用方法(gauvrit,aetal,cancerres,2008,68(12),4882-4892)进行负载。一种足以使得pdc有效负载的pdc和细胞的示例性的接触时间是大约24小时。通常在pdc已经负载后达到pdc的活化状态。可以通过本领域技术人员公知的多种标记物，诸如膜或细胞因子标记物证明pdc的活化状态(或成熟状态)。barchet已经特别列出了活化树突细胞的这类标记物(barchet,wetal.,seminarsinimmunology,2005,17(4):253-261)和marafioti(marafioti,tetal,blood,2008,lll(7):3778-3792)。

因此，根据本发明的制备方法获得的疫苗pdc是特别有益的，因为它们是抗癌cd8t细胞的有效刺激剂。同样有益的，根据本发明的制备方法允许制备活化状态的疫苗pdc。

本发明尤其涉及可以通过上述定义的制备方法获得的疫苗树突细胞。根据本发明一个具体的实施方案，当给诊断患有侵袭性恶性肿瘤或侵袭性癌症的个体施用时，所述疫苗pdc可用于治疗所述侵袭性恶性肿瘤或侵袭性癌症。

更具体的，当给诊断患有恶性间皮瘤、黑色素瘤或肺腺癌病症的个体施用时，它可用于治疗恶性间皮瘤、黑色素瘤或肺腺癌。本文公开的涉及mv-deltac应用的实施方案与本文公开的pdc的用途密切相关。

本发明人在体外证明mvschwarz感染肿瘤细胞对人pdc活化情况的影响，以及它们将肿瘤抗原交叉呈递给特异性cd8+t细胞克隆的能力。本发明人证明，尽管cd46表达，但pdc对mv感染是不敏感的。但是，pdc通过产生ifn-α能够对mv产生体外应答，当向培养物中添加il-3时灵敏度更高。本发明人还证明，mv感染的肿瘤细胞触发pdc活化，尤其是ifn-α产生，而uv-照射过的肿瘤细胞不触发pdc活化。pdc活化可能是由mv的单链rna引起的，其在pdc内吞小室中触发tlr7，随后是mv感染肿瘤细胞的吞噬。有趣的是，本发明人第一次阐述证明，与mv感染的肿瘤细胞共培养的人pdc能够将nyeso-1肿瘤抗原交叉呈递给特异性cd8+t 细胞克隆。这些结果表明，除了直接的肿瘤裂解效果之外，基于mv的抗肿瘤病毒疗法可以通过活化pdc来触发抗肿瘤免疫应答。使用mv-deltac预期类似的结果，因为突变病毒的肿瘤细胞感染正巧是类似的。甚至预期更高的应答，因为在感染肿瘤细胞后mv-deltac引起更高的危险信号(钙网蛋白和hsp70)表达，并且感染的细胞还表达mv-deltac的单链rna。

本发明还涉及一种药物组合物，包括作为活性成分的基因修饰的传染性mv-deltac或可以通过上文定义方法获得的疫苗pdc，以及药学上可接受的载体，当给诊断患有侵袭性恶性肿瘤或侵袭性癌症病症的个体施用时，通过活化pdc用于治疗所述侵袭性恶性肿瘤或侵袭性癌症。

如本文所定义的，药学上可接受的载体包括能够将mv-deltac配制在组合物中的任意物质。载体是生理上可接受的任意物质或物质的组合，即适合其用于接触宿主，尤其是人的组合物，并且是无毒的。这类载体的实例是磷酸缓冲盐溶液、蒸馏水、乳液诸如油/水乳液，各种类型的湿润剂、无菌溶液等等。

本发明还涉及一种药物组合物或活性成分的组合体，包括基因修饰的传染性mv-deltac或可以通过上文定义方法获得的疫苗pdc，并且还包括化疗剂和药学上可接受的载体，当给诊断患有侵袭性恶性肿瘤或癌症病症的个体施用时，用于治疗所述侵袭性恶性肿瘤或侵袭性癌症。

如本文所定义的，化疗剂是可用于治疗恶性肿瘤或癌症的分子。化疗剂的性质将取决于恶性肿瘤或癌症的类型。化疗剂的实例是本领域技术人员公知的。

本发明还涉及一种活性成分的组合体，包括(i)减毒活mv或基因修饰的传染性mv-deltac，以及(ii)可以通过上述定义的方法获得的疫苗pdc，当给诊断患有恶性肿瘤或癌症病症的个体施用时，用于同时或分开施用以治疗所述侵袭性恶性肿瘤或侵袭性癌症。

附图简述

图1.mv和mv-deltac。(a)mv基因组和基因顺序的示意图，显示编码p、v和c蛋白的p基因(显示p、v和corf)。b)质粒ptm-mvschw(seqidno:3)和ptm-mvschw-deltac-atul(egfp)的核苷酸序列部分，其中天然mvschw基因组cdna第2788位的t核苷酸被c核苷酸取代(seq idno:4)；除了这个第一个突变之外，通过在c开放阅读框的下游添加终止密码子，即“tag”终止密码子，引入第二个突变，所述“tag”终止密码子通过用a核苷酸取代天然mvschw基因组cdna第2803位的g核苷酸来获得(seqidno:5)(下划线表示引入的核苷酸突变)。

图2.mv、mv-deltav、mv-deltac和mv-pg954表达p、v和c蛋白。在sds-page凝胶上分离用不同病毒感染的vero细胞的裂解物，并利用特异性单克隆抗体通过蛋白印迹检测p、v、c蛋白。

图3.mv、mv-pg954、mv-deltav和mv-deltac的复制动力学。vero(a)、hela(b)、jurkat(c)和u937(d)细胞用moi为1的不同病毒进行感染。测定细胞相关病毒滴度作为tcid50值。

图4.mv和mv-deltac在vero和hela细胞上的细胞病变效应。上栏：用mv或mv-deltac(moi为0.1)感染后24小时，在vero细胞上诱导的细胞病变效应。下栏：用mv或mv-deltac感染后24小时，hela细胞的免疫荧光。将细胞固定，并用抗mv的血球凝集素(h)的单克隆抗体进行染色。

图5.在感染mv或mv-deltac的vero细胞中病毒蛋白表达的动力学。按照moi为1感染细胞，然后在不同的时间点进行裂解。通过蛋白印迹分析细胞裂解物，并使用特异性单克隆抗体鉴定病毒蛋白n和v(抗-n克隆120,naniche,d.etal.,jgenvirol,1992,73(10):2617-2624；抗-v,takeuchi,k.etal,febsletters,2003,545(2),177-182)。

图6.在用mv-pg954、mv-deltav或mv-deltac免疫的cd46/ifnar小鼠中诱导的抗mv体液免疫。在单次接种后2个月收集的血清中通过elisa测定抗体滴度。(a)来自不同组小鼠的混合血清的有限稀释法。(b)每只小鼠的个体滴度。(c)每组的平均滴度。抗体滴度定义为，经计算得到的吸光度值为未免疫小鼠血清的吸光度值两倍的被测血清的有限稀释度。

图7.mv-deltac感染和细胞死亡诱导。a)用mv或mv-deltac(moi＝1，2小时)感染肿瘤细胞，并在感染后72小时，用fitc-annexin-v和碘化丙啶双重染色后通过流式细胞术进行分析。数据代表annexin-v细胞的百分比。b)在感染后72小时，用抗活性胱天蛋白酶-3抗体(bdbiosciences)染色后通过流式细胞术分析病毒感染(mv或mv-deltac)和未感染的肿瘤细胞。百分比表示mv-deltac感染后“活化的胱天蛋白酶-3-阳性”细胞的百分比。

图8.hsp70蛋白暴露于细胞表面。通过胞外染色和流式细胞术，对于meso13和meso56上皮样间皮瘤细胞在感染后48小时，或对于a549肺腺癌和m17黑色素瘤细胞在感染后72小时确定膜hsp70蛋白表达。数据代表hsp70细胞的百分比。

图9.mv-deltac感染后钙网蛋白的膜移位。对于meso13和meso56上皮样细胞在感染后48小时，或对于a549肺腺癌细胞和m17黑色素瘤细胞在感染后72小时，利用抗钙网蛋白抗体和cy5偶联的抗小鼠二抗对未感染和感染的(mv或mv-deltac，moi＝1)肿瘤细胞进行染色。然后通过流式细胞术分析细胞。数据代表钙网蛋白细胞的百分比。

图10.hmgb-1在胞外环境中的释放。在感染后24、48或72小时收集未感染或感染的(mv或mv-deltac，moi＝1)肿瘤细胞的上清液，并储存于-20℃。然后通过elisa确定这些上清液中hmgb-1的数量。

图11.肿瘤细胞和pdc的mv受体表达、mv感染灵敏度和存活。(a)cd46和cd150/slam在肿瘤细胞系(m18、meso13和a549)和pdc表面的表达(mab染色：灰色直方图；同种型对照：白色直方图；直方图上的值是r-mfi，相对平均荧光强度，定义为mab染色的mfi除以同种型对照mfi)。(b)mv-egfp(moi＝1)感染肿瘤细胞系(m18、meso13和a549)和pdc。(c)在存在或不存在il-3的条件下，mv-egfp(moi＝1)对pdc的感染。(d)在存在或不存在il-3的情况下，随着moi增加的mv-egfp对pdc的感染。(e)在mv感染或uv照射后肿瘤细胞系的存活。感染或uv照射后3天，将细胞与染色死细胞的进行温育。通过流式细胞术分析荧光。图1a、1c和1e的结果代表3个独立实验。图1b和1e的结果反映3个独立实验的平均值。误差线代表标准差。

图12.mv-egfp或uv-照射的mv-egfp对pdc的感染。在存在il-3的条件下的pdc或meso13细胞单独培养(ni)，或与moi＝50的mv-egfp(mv)或uv-照射(312nm-100kj/m²)的mv-egfp(mv*)培养72小时(上栏)，或培养2小时然后培养70小时(下栏)。通过流式细胞术分析荧光。

图13.mv感染的肿瘤细胞诱导pdc成熟。将pdc与il-3、mv(moi＝1)、mv和il-3、r848、uv-照射的或mv-感染的肿瘤细胞培养18小时。(a)通过对cd123⁺/bdca-4⁺细胞进行门控(gate)的流式细胞术测量pdc的cd83、cd86和cd40表达。(b)直方图获自3个独立实验。使用 非参数曼-惠特尼比较检验来确定p值，其通过将样品结果与il-3pdc结果进行比较获得(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

图14.响应mv感染肿瘤细胞的pdc活化不依赖于pdc中的mv复制和cd46感染。(a)将pdc与il-3单独、r848、il-3/mv-egfp(mv)、il-3/mv-egfp以及10mg/ml的抗cd46或il-3/uv-照射的mv-egfp(mv*)(moi＝1)培养18小时。通过流式细胞术测定pdc的cd83、cd80和cd86表达。(b)将pdc与il-3、uv-照射的m18、存在或不存在10mg/ml抗cd46(hycultbiotech)条件下的mv感染的m18(m18mv)，或在暴露于pdc前用uv照射的mv感染的m18(m18mv*)一起培养。通过流式细胞术测定pdc的cd83、cd80和cd86的表达(对bdca-4+/hla-dr+细胞进行门控)。(c)通过elisa测量pdc的ifn-α产生。(d)以10mg/ml抗cd46单克隆抗体培养72小时后，对m18的mv-egfp感染抑制。

图15.pdc对mv感染或uv-照射的肿瘤细胞的吞噬。(a)mv感染和uv-照射的肿瘤细胞用pkh-67染色，并与pdc在4℃或37℃共培养18小时(1dc：1个肿瘤细胞)。细胞用hla-dr-特异性mab进行染色。通过流式细胞术分析荧光。该实验代表4个实验。(b)4个吞噬实验的散布图呈现。误差线代表标准差。(c)mv感染的肿瘤细胞用pkh-67染色(绿色)，并与pdc共培养18小时。细胞用hla-dr-特异性mab染色(红色)。通过共聚焦显微术分析荧光。

图16.pdc响应mv产生ifn-α是tlr7依赖性的。(a)将pdc与il-3、mv(moi＝1)、mv和il-3、r848、uv-照射的或mv-感染的m18或a549肿瘤细胞培养18小时。通过elisa测量培养上清液中的ifn-α产生。(b)在含或不含il-3以及增量mv的条件下培养pdc18小时。通过elisa测量培养上清液中的ifn-α产生。(c)在存在或不存在不同浓度irs661(tlr7抑制剂)的条件下，将pdc与il-3和mv(moi＝10)、cpg-a或mv-感染的m18培养18小时。通过elisa测量培养上清液中的ifn-α产生。结果获自3个独立实验。

图17.在与mv感染的nyeso-1+/hla-a*0201-m18肿瘤细胞共培养后，hla-a*0201+pdc对nyeso-1的交叉呈递。(a)通过实时pcr确定m18和a549肿瘤细胞系的nyeso-1表达(n＝3)。(b)将pdc与il-3、r848或uv-照射或mv-感染的m18肿瘤细胞培养18小时。将与r848一 起培养的一些pdc用nyeso-1(157-165)肽脉冲处理1小时并洗涤。然后在存在布雷菲德菌素(brefeldin)a的条件下，将pdc与对hla-a*0201/nyeso-1(157-165)(称为lt)特异的m117.167cd8+t细胞克隆共培养6小时。用cd8和ifn-γ-特异性mab染色后，通过流式细胞术分析m117.167t细胞克隆的ifn-γ产生。(c)将pdc与r848、或uv-照射或mv-感染的m18(nyeso-1⁺/hla-a*0201^-)或a549(nyeso-17hla-a*020r)肿瘤细胞培养18小时。将与r848一起培养的一些pdc用nyeso-1(157-165)肽脉冲处理1小时并洗涤。然后在存在布雷菲德菌素a的条件下，将pdc与对hla-a*0201/nyeso-1(157-165)特异的m117.167cd8+t细胞克隆共培养6小时。在用cd8和ifn-γ特异性mab染色后，通过流式细胞术分析m117.167t细胞克隆的ifn-γ产生。(d)交叉呈递实验的散布图呈现，“n”代表进行实验的次数，“n”在不同条件下是不同的，这是因为可用pdc的数量有限，本发明人无法在每次实验中都进行对照。

图18.用于交叉呈递实验的培养条件的图示。

图19.(a)和(b)未修饰mv或mv-deltac对黑色素瘤细胞的感染和细胞死亡。用moi为1的未修饰mv或mv-deltac感染后24h、48h和72h，通过流式细胞术对感染水平和诱导的细胞死亡进行样品分析。mv-deltac疫苗株有效地感染对未修饰mv疫苗株的感染具有抗性的肿瘤细胞。用不同moi的未修饰mv-egfp或mv-deltacegfp感染黑色素瘤肿瘤细胞2小时。

图20.未修饰mv或mv-deltac造成的黑色素瘤细胞的细胞死亡。用不同moi的未修饰mv-egfp或mv-deltacegfp感染黑色素瘤肿瘤细胞2小时。通过流式细胞术在感染后24h、48h和72h测定每个细胞系中诱导的细胞死亡率(未感染细胞中topro+细胞的百分比-感染细胞中topro+细胞的百分比)。

图21.在用未修饰mv或mv-deltac感染黑色素瘤细胞后，“危险信号”的表达。(a)用未修饰mv或mv-deltac感染后24h、48h和72h，hsp70和钙网蛋白(crt)表达的流式细胞分析的实例。(b)感染后72h通过胞外标记和流式细胞术确定未感染肿瘤细胞以及用未修饰mv和mv-deltac(moi＝0.5)感染的细胞中hsp70蛋白和crt的膜表达。

图22.肿瘤内注射mv-deltac后的体内黑色素瘤肿瘤生长。植入肿瘤 注射pbs以显示正常肿瘤生长，作为对照。在这些对照小鼠中，肿瘤体积在13天内从45mm³增加到150mm³。在用mv-deltac治疗的组中，在注射后10天观察到肿瘤体积的更大降低，其达到25mm³，并且在注射后14天肿瘤被清除。

图23.用mv-deltac或未修饰mv感染后，癌症细胞和非癌细胞的存活。用不同moi的mv-deltac(图示中为黑色柱图)或未修饰mv(图示中为白色柱图)感染人a549和hela癌细胞(a)以及hek293和vero非癌细胞(b)(重复三次)。在培养24、46和68小时后，利用celltiter-glo试剂，基于荧光素酶的测定法(其通过atp定量对培养孔中代谢活性细胞数目进行评估)来测定活细胞的数目。

图24.未修饰mv和mv-deltac对癌细胞和非癌细胞的复制动力学。用mv-deltac或未修饰mv(moi＝1)感染人a549和hela癌细胞以及hek293和vero非癌细胞(重复三次)。测定病毒滴度为tcid50。

实施例

实施例1

未修饰mv与mv-deltac之间的比较研究

未修饰mv的体外感染。减毒活mvschwarz株获自f.tangy(巴斯德研究院，法国)。通过利用radecke描述(radeckeetal.,emboj.,1995,14:5773-5784)和parks改进(parksetal,j.virol,1999,73:3560-3566)的基于辅助细胞的拯救系统，从ptm-mvschw(由巴斯德研究院于2002年6月12日保藏在cncm(法国，巴黎)，保藏号为i-2889)cdna拯救schwarzmv。简而言之，用5μg的ptm-mvschw和0.02μg的表达schwarzmv-l基因的pemc-lschw转染293-3-46辅助细胞(combredetetal,j.virol.,2003,77:11546-11554)。在37℃过夜温育后，在43℃进行热休克2h，并将转染细胞转移到vero细胞单层上。将15天共培养出现的合胞体转移到35-mm孔，然后在含5％fcsdmem的vero细胞培养物的75-cm²和150-cm²培养瓶中进行扩增。当合胞体达到80-90％融合时，将细胞刮入小体积的optimem中，并冻融一次。在低速离心以沉淀细胞碎片后，将包含病毒的上清液储存于-80℃。通过对vero细胞的终点有限稀释法来确定重组mv储液的滴度。利用方法(arch.exp.path.pharmak.,1931,162:480-483)计算 tcid50。

mv-deltac的体外感染。还通过对hek293-t7-mv辅助细胞的反向遗传学拯救mv-deltac，并在vero细胞上扩增，按照wo2004/000876描述的用于未修饰mv的类似步骤。相应地按照所述申请的公开从纯化mv病毒颗粒，或从质粒ptm-mvschw(通过将p基因n末端区域的(+1)orf中存在的第二个“atg”起始密码子突变以得到质粒ptm-mvschw-deltac-atu1(egfp)来进行修饰)，制备编码mv-deltac基因组的合适的cdna克隆。具体来说，通过将t突变为c，用“acg”密码子取代“atg”密码子(seqidno:1)(图1b)。类似的，使用具有核苷酸序列seqidno:2的变体质粒ptm-mvschw-deltac-atul(egfp)，通过反向遗传学还可拯救mv-deltac的变体，其中在第2803位进行额外的取代以便用a核苷酸取代g核苷酸。

mv-deltac的表征。为了证实编码c蛋白的基因已被敲除并且p和v蛋白仍然表达，使用特异性单克隆抗体(抗-p；抗-v和抗-c,takeuchi,k.etal.,febsletters,2003,545(2),177-182)对感染vero细胞的裂解物进行蛋白印迹(图2)。

因此，将mvdelta-c的p、v和c蛋白表达与mv、mv-deltav(mv，其中v蛋白被敲除)和mv-pg954(mv，其中p基因被野生型株(即g954)的p基因取代)获得的表达进行比较。图2显示mv-deltac不再表达c蛋白，而v和p蛋白被正确表达。在vero细胞中进行病毒的10次传代后，通过基因组测序监测mv-deltac中存在的突变的稳定性，未观察到回复突变。

mv-deltac的生长动力学。在能或不能引发i型ifn应答的不同细胞系中分析mv-deltac的生长动力学(图3)。vero细胞(非洲绿猴上皮细胞)的ifn-β基因存在缺失(mosca,j.d.,pitha,p.m.molcellbiol,1986,6(6),2279-2283)，因此病毒感染时这些细胞中无法启动i型ifn应答。相反，hela(人癌上皮细胞)、jurkat(人t淋巴细胞)和u937(人单核细胞)能够引发i型ifn应答。与在vero细胞上检测的其他mv病毒相比，mv-deltac在前24小时快速生长，然后其生长突然减慢。在检测的能够引发i型ifn应答的其他细胞类型(hela、jurkat和u-937)中证实了生长停滞。因此，与其他研究相反(takeuchi,k.etal.,j.virol.,june2005,7838-7844；patterson,j.b.etal,virology,2000,267(l):80-89)，mv-deltac的生长缺陷似乎与ifn的存在与否无关。

mv-deltac的细胞病变效应。几个原因可解释mv-deltac的突然生长停滞。实际上，mv感染的vero细胞的特征在于形成巨大的合胞体(多核细胞)，其源于表达mv糖蛋白的感染细胞与相邻的表达cd46受体的未感染细胞的融合。本发明人观察到，在vero细胞(图4)和检测的所有其他细胞类型中，mv-deltac诱导的合胞体形成比未修饰的mv快得多。在用moi1感染24小时后，vero细胞实际上都融合成一个巨大的合胞体，其在数小时后崩裂(breakout)。这解释了感染后24小时观察到的生长下降：在培养物中没有初始细胞(naivecells)保持存活以支持生产性感染。感染细胞的成熟前凋亡可能造成观察到的病毒生长停滞。先前显示来源于mv致病株(ichinose)的mv-deltac比亲代病毒具有更高的细胞病变效应(takeuchi,k.etal,j.virol,june2005,7838-7844)。

mv-deltac诱导的恶化的细胞融合可能归因于更高或更早的病毒蛋白产生，特别是感染细胞表面的h和f糖蛋白，其将促进快速和大量的细胞融合。使用免疫荧光分析在感染mv-deltac或未修饰的mv(moi＝1)的hela细胞中病毒血球凝集素(h)表达的动力学。利用偶联fitc的单克隆抗mv-h抗体对细胞进行染色(图4)。结果显示在感染后24小时，与未修饰的mv相比，mv-deltac造成更大量的感染，并诱导更高的h表达。

在感染mv和mv-deltac的vero细胞中病毒蛋白表达的动力学。为了证实在没有c蛋白表达的条件下病毒蛋白的产生增加，对mv-deltac或未修饰mv感染(moi＝1)的vero细胞裂解物中病毒蛋白n和v的含量随时间进行分析(图5)。从感染第6小时，在mv-deltac感染的细胞中检测到核蛋白n，而用未修饰mv感染21小时后才检测到核蛋白n。对于v蛋白观察到相同的现象。该结果证明，mv-deltac比未修饰mv在更早期并且以更高的量表达病毒蛋白。

mv-deltac的免疫原性。为了评价c蛋白表达沉默对mv疫苗载体的免疫原性的影响，对易受mv感染的cd46+/-ifnar-/-小鼠进行免疫(combredet,c.etal,2003,jvirol,77(21):11546-11554；mrkicb.etal,jvirol,2000,74(3):1364-1372)。将这些小鼠进行基因改造以表达mv疫苗株的人cd46受体，并使其不表达i型ifn受体(ifnar)。它们通常被用于评价mv载体的免疫原性(brandler,s.etal.,plosneglectedtropicaldiseases,2007,l(3):e96；combredet,c.etal,2003,jvirol,77(21):11546-11554)。虽然ifnα/β 在这些小鼠中不起作用，但该模型用于体内最初评估c蛋白表达沉默的影响。将mv-deltac与未修饰的mv、mv-deltav和mv-pg954进行比较。将10⁵tcid50每种病毒的单剂量经腹膜内接种入4组小鼠(每组6只)。接种后2个月收集血清，并通过elisa(trinitybiotech)定量抗mv抗体(图6)。

在这些对i型ifn无反应的小鼠中，修饰麻疹载体诱导的抗体水平与未修饰载体诱导的水平相当。对于mv-deltav和mv-pg954载体(其具有类似于未修饰mv的体外生长动力学)来说该结果并不令人惊讶。出人意料的，在体外生长降低的mv-deltac载体诱导的抗体滴度比未修饰mv诱导的仅仅低一点。该结果表明，要么是接种剂量对于待观察的差异来说太高了，或者最低的病毒复制足以诱导体液免疫饱和。先前已在猴子中证明，与野生型相比，来源于mv致病株(ichinose)的mv-deltac的传播大大减弱(takeuchi,k.etal,j.virol,june2005,7838-7844)。这些初步数据表明，在不存在i型ifn应答的条件下，c蛋白的沉默不影响抗病毒体液免疫的建立。

实施例2

mv或mv-deltac诱导的细胞死亡

细胞培养。在知情同意情况下，从癌症患者的胸腔穿刺术收集的胸膜积液中建立并表征上皮样间皮瘤细胞系(meso11、meso13和meso56)和肺腺癌细胞系(a549和adk117)(gueugnonfetal,amjpathol,2011,178:1033-1042)。b.dreno和n.labarriere(cancerresearchcentre,nantes,france)合成了黑色素瘤细胞系(m17和m18)。肺腺癌细胞系(a549)购自atcc。f.tangy(巴斯德研究院，法国)分离并表征了上皮样间皮瘤细胞系(meso11、meso13和meso56)和肺腺癌细胞系(adk117)。所有细胞系均在rpmi-1640培养基(gibco-invitrogen,cergy-pontoise,france)中培养，所述培养基添加10％(v/v)热失活的胎牛血清(paalaboratories,lesmureaux,france)，2mml-谷氨酰胺，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素(均购自gibco)。在37℃，湿润、5％co2环境下培养细胞，并通过pcr常规检查支原体污染。

细胞死亡分析。感染后3天使用凋亡检测试剂盒(bdbiosciences)测定细胞死亡。简单来说，将细胞用fitc-annexinv和碘化丙啶双重染色15分钟，并在1小时内通过流式细胞术进行分析。然后测定mv-和mv-deltac特异性细胞死亡。将细胞与下面实施例描述的特异性抗体温育，用于胞外染色。然后将细胞用pbs洗涤3次，随后通过流式细胞术(facscalibur,bd biosciences)进行分析。

为了比较mv和mv-deltac的感染和细胞死亡诱导能力，将3种上皮样间皮瘤细胞系(meso11、meso13和meso56)，两种黑色素瘤细胞系(m17和m18)和两种肺腺癌细胞系(a549和adk117)的大组用未修饰mv或mv-deltac(moi＝1)在37℃温育2小时进行感染。对照细胞系不用mv或mv-deltac感染(图7)。在感染后3天，利用fitc-annexin-v和碘化丙啶双重染色后通过流式细胞术分析肿瘤细胞。

meso11和meso13上皮样间皮瘤细胞，m18黑色素瘤细胞或a549肺腺癌细胞被未修饰的mv有效感染，而meso56上皮样间皮瘤细胞和adk117肺腺癌细胞被未修饰的mv微弱感染，m17黑色素瘤细胞未被感染。即使对于未修饰mv有效感染的细胞(meso11和meso13上皮样间皮瘤细胞，m18黑色素瘤细胞和a549肺腺癌细胞)观察到annexin-v细胞的中等或显著百分比，仍然发现mv-deltac能够甚至更有效地诱导这些肿瘤细胞的死亡。尽管未修饰mv微弱感染(meso56上皮样间皮瘤细胞和adk117肺腺癌细胞)或甚至未感染(m17黑色素瘤细胞)肿瘤细胞显示annexin-v细胞的极低百分比，本发明人出人意料的发现，对于上述两种细胞系，mv-deltac的感染诱导高得多的细胞死亡诱导(图7a)。

因此，根据这些体外结果，在感染的肿瘤细胞中mv-deltac比未修饰mv诱导更高的凋亡。

实施例3

mv或mv-deltac感染后的胱天蛋白酶-3活化

在未修饰mv和mv-deltac感染的肿瘤细胞中分析胱天蛋白酶-3活化(图7b)。将两种上皮样间皮瘤细胞系(meso13和meso56)，1种黑色素瘤细胞系(m17)和1种肺腺癌细胞系(a549)用未修饰mv或mv-deltac(moi＝1.0)在37℃温育2小时进行感染。对照细胞系不用mv或mv-deltac感染。在感染后3天，用抗胱天蛋白酶-3抗体(bdbiosciences)染色后，通过流式细胞术分析病毒感染(mv或mv-deltac)和未感染的肿瘤细胞。

mv-deltac感染诱导两种不同的被测细胞系的胱天蛋白酶-3活化：meso13上皮样间皮瘤细胞为38.2％，m17黑色素瘤细胞为30.2％，a549肺腺癌细胞为21.8％，meso56上皮样间皮瘤细胞为8.4％。与此相反，未修饰的mv感染后，没有观察到或部分观察到所述胱天蛋白酶-3活化。这 些结果表明，未修饰的mv和mv-deltac病毒可以根据两种不同的途径诱导肿瘤细胞死亡。

实施例4

mv或mv-deltac感染后，hsp70蛋白暴露于细胞表面

肿瘤细胞感染溶瘤病毒可以造成细胞应激(fabianetal,jvirol,2007,81(6):2817-2830)。感染以及由这些病毒诱导的细胞死亡还导致具有免疫原性的分子的产生和在环境中的释放(wangetal.,viralimmunol,2006,19(1):3-9)。来自感染细胞的这些内源危险信号实际上可以被防卫细胞识别，并触发获得性应答。由于表达不同的受体，单核细胞来源和浆细胞样树突细胞识别这些危险信号。因此通过活化肿瘤抗原的特异性淋巴应答，免疫系统能够与病毒的直接溶瘤活性协同作用。

溶瘤mv病毒的疫苗株对肿瘤细胞的感染允许dc的成熟和自体t淋巴细胞的活化(wo2009/047331)。为了表征感染细胞诱导免疫系统活化的机制，本发明人研究了已知参与细胞死亡免疫原性的不同细胞因子的表达、修饰和/或释放。例如，hsp70家族蛋白或钙网蛋白可以参与抗肿瘤免疫应答的活化。

分析了hsp70蛋白在未修饰mv和mv-deltac感染的肿瘤细胞表面的表达(图8)。两种上皮样间皮瘤细胞系(meso13和meso56)，1种黑色素瘤细胞系(m17)和1种肺腺癌细胞系(a549)用未修饰mv或mv-deltac(moi＝1.0)在37℃温育2小时进行感染。对照细胞系不用mv或mv-deltac感染。通过胞外染色和流式细胞术，对于meso13和meso56上皮样间皮瘤细胞在感染后2天，或对于a549肺腺癌和m17黑色素瘤细胞在感染后3天确定膜hsp70蛋白表达。

对于未修饰mv有效感染的细胞(meso13上皮样间皮瘤细胞和a549肺腺癌细胞)和mv抗性细胞(meso56上皮样间皮瘤细胞和m17黑色素瘤细胞)均观察到hsp70蛋白向细胞表面的非常小的移位。与此相反，对于所有细胞系，mv-deltac出人意料地诱导hsp70蛋白强烈暴露于质膜外层。这些结果表明，mv-deltac诱导的细胞死亡显示免疫原性特征。

实施例5

mv或mv-deltac感染后钙网蛋白的膜移位

研究了未修饰mv和mv-deltac感染肿瘤细胞对钙网蛋白移位到细胞 表面的影响。为此，通过胞外染色分析感染肿瘤细胞表面上钙网蛋白的存在(图9)。两种上皮样间皮瘤细胞系(meso13和meso56)，1种黑色素瘤细胞系(m17)和1种肺腺癌细胞系(a549)用未修饰mv或mv-deltac(moi＝1.0)37℃温育2小时进行感染。对照细胞系不用mv或mv-deltac感染。对于meso13和meso56上皮样间皮瘤细胞在感染后2天，或对于a549肺腺癌细胞和m17黑色素瘤细胞在感染后3天，利用抗钙网蛋白抗体和cy5偶联的抗小鼠二抗对未感染和感染(mv或mv-deltac)的肿瘤细胞进行染色。然后通过流式细胞术分析细胞。

与hsp70蛋白类似，对于未修饰mv有效感染的细胞(meso13上皮样间皮瘤细胞和a549肺腺癌细胞)和mv抗性细胞(meso56上皮样间皮瘤细胞和m17黑色素瘤细胞)来说，与未修饰的mv相比，mv-deltac感染出人意料地导致钙网蛋白更强烈地移位到细胞表面。这些结果同样表明，mv-deltac诱导的细胞死亡显示免疫原性特征。

实施例6

mv或mv-deltac感染后hmgb-1在胞外环境中的释放

研究了在利用未修饰mv或mv-deltac感染肿瘤细胞后，hmgb-1蛋白在胞外介质中的释放(图10)。两种上皮样间皮瘤细胞系(meso13和meso56)用未修饰的mv或mv-deltac(moi＝1.0)在37℃温育2小时进行感染。对照细胞系不用mv或mv-deltac感染。在感染后1天、2天或3天收集未感染或感染(mv或mv-deltac)肿瘤细胞的上清液，并于-20℃保存。然后通过elisa确定这些上清液中hmgb-1的数量。

mv-deltac诱导感染的肿瘤细胞有效释放hmgb-1。mv-deltac的感染诱导培养的肿瘤细胞的更快凋亡；因此，如meso13上皮样间皮瘤细胞的结果所示，与未修饰的mv相比，mv-deltac诱导hmgb-1的更早释放。

实施例7

浆细胞样树突细胞

细胞培养

按照之前实施例2的描述培养细胞系。

mv感染和uv照射

按照先前的描述(gauvrit,a.etal,cancerres.,2008,68:4882-4892)产生减毒活schwarz株mv和重组mv-增强绿色荧光蛋白(mv-egfp)。除非另 外指出，肿瘤细胞的mv感染(moi＝1.0)在37℃进行2小时。然后用新鲜的细胞培养基取代病毒接种物，持续72小时。对于pdc感染和成熟实验，mv不进行洗涤，并在整个培养过程中保留在培养基中。在感染后24、48和72小时，使用mv-egfp通过流式细胞术进行感染率的测量。使用mv进行所有其他实验。利用uv-b(312nm–100kj/m²,stratalinker,stratagene)照射肿瘤细胞。每72小时更新培养基。

dc分离和培养

按照先前的描述(coulais,d.etal.,cytotherapy,2012,14:887-896)，从健康供体的pbmc(etablissementfrancaisdusang,nantes,france)获得pdc。简单来说，首先通过逆流离心富集pdc，然后按照制造商方案的推荐(stemcelltechnologies,grenoble,france)，通过磁珠负选择进行纯化。未触及的pdc的纯度始终大于96％。将pdc(3×10⁵每ml)在含20ng/mlrhil-3(sigma,saintquentinfallavier,france)的培养集中培养，或在体外用tlr-7激动剂r848(invivogen,sandiego,usa)(5μg/ml)进行活化。pdc还与单独的mv、mv和il-3(moi＝1)、或无rhil-3或成熟剂的mv感染或uv照射的肿瘤细胞(pdc/肿瘤细胞:1/1)进行共培养。18小时后，收集培养上清液和pdc待用。对于tlr-7抑制测定，使用免疫调节dna序列，其特异性抑制通过tlr-7[irs661]的信号转导，其浓度为0.1μμ到1μμ(eurofins,munich,germany)。作为对照，使用5μg/ml的cpg-a诱导pdc的tlr-9-依赖性ifn-α分泌(invivogen,sandiego,usa)。

免疫荧光和流式细胞术

通过免疫荧光继之以流式细胞术确定pdc的表型。使用对cd40、cd86、hla-dr(bdbiosciences,sanjose,ca,usa)、cd83(biolegend,sandiego,ca-usa)和bdca-4(miltenyibiotec)特异的单克隆抗体对pdc进行染色。按照bdca-4+/hla-dr+细胞对pdc进行门控，以将它们与肿瘤细胞进行区分。按照制造商的推荐，通过(invitrogen,saintaubin,france)染色测量肿瘤细胞死亡。是具有远红外荧光的羰花青单体核酸，只进入死细胞并对dna染色。使用flowjo软件在facscantoii(bectondickinson,newjersey,usa)上分析荧光。

吞噬测定法

根据制造商的方案(sigma,saintquentinfallavier,france)，mv感染和 uv照射的肿瘤细胞使用pkh-67染色，并与pdc在4℃或37℃共培养18小时(1dc：1肿瘤细胞)。利用pbs-edta洗涤共培养物以解离细胞-缀合物。利用缀合horizonv450的抗hla-dr抗体(bdbiosciences,sanjose,ca,usa)对pdc进行染色，并通过流式细胞术(facscantoii,bd)进行分析。通过共聚焦显微术(nikon)观察pdc吞噬。mv感染和uv照射的肿瘤细胞用pkh-67染色，然后与pdc在包含聚赖氨酸载玻片的24孔板中共培养18小时(pdc：肿瘤细胞比例1：1)。利用未偶联的抗hla-dr(bdbioscience)对pdc进行染色。利用偶联alexafluor568的抗小鼠igg二抗显示hla-dr染色。

细胞因子检测

根据制造商的说明书，通过elisa测量pdc培养上清液中的ifn-α(mabtech,cincinnati,oh-usa)产生。

交叉呈递测定

nyeso-1^pos/hla-a*0201^neg黑色素瘤(m18)和nyeso-l^neg/hla-a*0201^neg肺腺癌(a549)细胞系用mv感染或uv-b照射，培养72小时，然后与hla-a*0201^pospdc(pdc：肿瘤细胞比例1：1)共培养。18小时后，在存在布雷菲德菌素-a(sigma,saintquentinfallavier,france)的条件下，将pdc与hla-a*0201/nyeso-1(156-165)-特异性cd8⁺t细胞克隆m117.167共培养6小时。通过在来自黑色素瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞的有限稀释中进行克隆，以获得m117.167克隆。按照先前的描述培养所述克隆(fonteneau,j.f.etal,jimmunolmethods,2001,258:111-126)。作为对照，本发明人使用利用0.1或1μμnyeso-1(156-165)肽脉冲处理1小时并洗涤的pdc。然后按照先前的描述(schlender,j.etal,jvirol,2005,79:5507-5515)，将细胞用包含4％多聚甲醛的pbs在室温下固定10分钟，通透处理，并用ifn-γ和cd8-特异性抗体(bdbiosciences,sanjose,ca,usa)进行染色。利用对cd8+t细胞的门控，通过流式细胞术分析ifn-γ产生。

实时rt-pcr

使用moloney鼠白血病病毒逆转录酶(invitrogen,saintaubin,france)逆转录1微克总rna。按照制造商的说明书，使用quantitect引物(qiagen,fostercity-usa)和rt²实时sybr-green/roxpcrmastermix(tebu-bio,leperray-en-yvelines,france)进行pcr反应。

统计

使用graphpadprism(inc.,sandiego,ca-usa)软件，其利用非参数曼-惠特尼比较检验。p值<0.05被认为是统计上显著的。

实施例8

肿瘤细胞和pdc对mv感染的敏感性

在感染期间，mv主要通过cd46进入细胞，并且程度稍低的通过cd150/slam进入细胞(anderson,b.d.etal,cancerres.,2004,64:4919-4926；schneider,u.etal,jvirol,2002,76:7460-7467)。在第一个实验中，本发明人研究了这两种主要mv受体，cd46和cd150/slam，在pdc、黑色素瘤(m18)、间皮瘤(meso13)和肺腺癌(a549)细胞系上的表达(图11a)。在所有细胞类型中都观察到cd46表达，在meso13和a549细胞系中的表达更高。关于cd150/slam表达，在m18黑色素瘤细胞系上发现阳性表达。这些结果表明，所有这些细胞类型对mv感染都是敏感的，因为它们都表达cd46。

然后本发明人使用编码绿色荧光蛋白的重组mv(mv-gfp)，研究了所述4种细胞类型对mv感染的敏感性。在暴露于moi＝1的mv72小时后，3种肿瘤细胞系被mv高效感染，从50％gfp阳性的a549细胞到90％gfp阳性的meso13细胞(图11b)。此外，在moi＝1时，3种肿瘤细胞系都观察到合胞体形成，而pdc没有。在没有存活信号诸如il-3的条件下，pdc在培养72小时期间死亡。因此，在向暴露于mv的pdc中添加il-3的条件下进行实验(图11c)。在存在il-3的条件下，pdc在72小时期间存活，但不被mv高效感染。为了验证这个结果，在存在il-3的条件下moi增加高达50，但本发明人仍未能检测到感染的pdc(图11d)。但是，在moi＝50时观察到小的荧光迁移，其可能归因于72小时培养期间可溶性gfp(其污染了mv-gfp制品)的摄取。类似地，当本发明人使用uv照射的mv-gfp(其不能复制)时，仍然观察到这种微小的荧光迁移(图12)。最后，将moi＝50的mv-gfp与pdc温育2小时并洗涤时，本发明人未能在70小时后检测到小的荧光迁移(图12)。

然后本发明人测量了感染后72小时的肿瘤细胞死亡，发现72小时后几乎一半的mv感染肿瘤细胞是to-pro+(图11e)。通过用uv-b照射肿瘤细胞，观察到类似的细胞死亡水平。因此，mv感染在感染后72小时诱导 大约一半肿瘤细胞的死亡。

实施例9

mv感染的肿瘤细胞诱导pdc成熟

本发明人随后研究了单独的mv和mv感染细胞对pdc成熟的影响(图13)。在这些实验中，他们评估了与uv照射(肿瘤细胞死亡的另一种诱导物)相比，肿瘤细胞的mv感染如何影响pdc成熟。作为成熟的对照，将pdc暴露于tlr7/8激动剂r848(图13a和13b)。

先前已经证明，mv感染的恶性胸膜间皮瘤(mpm)肿瘤细胞系，meso13，诱导单核细胞来源的dc的成熟，无需额外佐剂，而单独的病毒或uv照射的meso13不诱导(gauvrit,a.etal,cancerres.,2008,68:4882-4892)。本发明人对pdc进行了一组实验，以确定单独的mv、mv感染或uv照射的肿瘤细胞对pdc成熟状态的影响。比较了mv感染和uv照射的肿瘤细胞对pdc成熟状态的影响(图13)。观察到与mv感染肿瘤细胞共培养的pdc的成熟，而uv照射的肿瘤细胞未能活化pdc。实际上，mv感染细胞诱导cd83成熟标记物表达的水平与将pdc暴露于r848时观察到的水平类似。本发明人观察到在暴露于mv感染肿瘤细胞的pdc上共刺激分子(cd40和cd86)的诱导表达，尽管这种诱导低于单独r848触发的水平。

已经报道了两项研究，描述了对单独的mv触发pdc成熟能力的矛盾结果(duhen,t.etal,virusres.,2010,152:115-125；schlender,j.etal,jvirol,2005,79:5507-5515)。但是，报道称mv活化pdc的duhen等人的研究是在存在il-3(pdc存活因子)的条件下进行的，而来自schlender等人的另一项研究(其观察到与mv培养的pdc不诱导pdc成熟)是在没有il-3的条件下进行的。因此，本发明人实施并比较了两种条件，发现与两位作者描述的类似结果。实际上，moi＝1的mv只在存在il-3的条件下诱导pdc成熟(图13)。如同对于单独的r848观察到的，在存在il-3的条件下mv诱导pdc成熟，主要特征在于cd83的显著增加，以及较低程度的cd40和cd86表达。本发明人还观察到，在不存在il-3的条件下，只有当暴露于大量的mv(moi＝50)时，pdc才存活和成熟。在不存在il-3的条件下，在较低病毒浓度pdc死亡。

在最后一组实验中，本发明人检测了是否需要pdc中的mv感染和复 制来诱导它们的活化。将pdc暴露于uv照射的mv(mv*)(其不能复制)，观察到与未照射mv一样的类似水平的成熟(cd83、cd80和cd86表达)和ifn-α产生(图14a和14c)。在pdc的培养物(暴露于il-3和mv)中阻断性抗cd46特异性抗体的存在不影响pdc的成熟(图14a)。利用暴露于mv感染肿瘤细胞的pdc进行相同的实验。在暴露于pdc之前利用uv照射mv感染的肿瘤细胞时，仍然观察到成熟和ifn-α产生(图14b和14c)。最后，本发明人检测了cd46特异性单克隆抗体是否能够抑制响应mv感染肿瘤细胞的pdc成熟(图14b和14c)。没有观察到抑制，而抗cd46抗体完全抑制作为对照的meso13的感染(图14d)。总而言之，这些结果表明，pdc中的mv感染和复制不是响应mv的pdc活化所必需的。

实施例10

pdc捕获来自mv感染肿瘤细胞的细胞组分

由于tlr-7和tlr-9的内部/溶酶体表达，在病毒核酸检测中专门研究了pdc(gilliet,m.etal,natrevimmunol,2008,8:594-606)。这两种受体是活化pdc的主要先天受体(reizis,b.etal,natrevimmunol,2011,11:558-565)。因为在存在il-3或mv感染肿瘤细胞的条件下，mv能够诱导pdc成熟，所以有可能成熟刺激是mvssrna，其在内部/溶酶体小室中活化tlr7。这种假设得到以下事实的支持：mv单独不诱导dc成熟，因为这些细胞在人中不表达tlr7。这表明当pdc与mv和il-3或与mv感染的癌细胞培养时，一些mv颗粒被pdc内吞。本发明人随后研究了pdc是否有效地从mv感染和uv照射的肿瘤细胞中摄取细胞物质(图15)。利用pkh67标记mv感染和uv照射的m18和a549肿瘤细胞，并与pdc共培养。本发明人观察到，pdc在37℃有效地摄取mv感染的肿瘤细胞，而uv照射的肿瘤细胞摄取效率较低(图15a和15b)。在另两个实验中，本发明人观察到培养物中存在cd46单克隆抗体不抑制mv感染肿瘤细胞的吞噬。

这些结果得到共聚焦显微术的证实(图15c)。将pdc与pkh-67标记的mv感染肿瘤细胞共培养18小时。光学切片显示pdc内部的mv感染肿瘤细胞的荧光片段，证实了mv感染肿瘤细胞部分被pdc内化。有趣地是，本发明人从未观察到pdc和肿瘤细胞之间的合胞体形成。总而言之，这些结果表明感染肿瘤细胞包含的一些mv颗粒可以到达tlr7所处的小室。

实施例11

mv感染的肿瘤细胞通过触发tlr7诱导较强的i型ifn分泌

在tlr-7或tlr-9活化时，已知pdc是i型ifn的最强产生者，尤其针对病毒(gilliet,m.etal,natrevimmunol.2008,8:594-606)。因此，本发明人通过elisa，测量暴露于mv、mv感染或uv照射的肿瘤细胞后pdc产生的ifn-α(图16a)。只有在存在il-3的条件下直接暴露于mv才诱导ifn-α分泌，符合在图13中观察到的细胞成熟。在存在il-3的条件下响应mv产生的ifn-α量与r848(一种有效的tlr7/8激动剂)单独诱导的量相当。令人惊讶的，本发明人发现在将pdc暴露于mv感染的肿瘤细胞后在共培养上清液中存在大量的ifn-α(超过响应存在il-3条件下的mv或单独r848时观察到的量的20-40倍)。所述大量的ifn-α由pdc产生，因为在mv感染后肿瘤细胞不产生ifn-α或产生极低的量(pg/ml范围)。uv照射的a549或m18肿瘤细胞不诱导pdc产生ifn-α。这些结果表明，mv感染的肿瘤细胞能够触发pdc产生高水平的ifn-α，其显著高于暴露于mv(存在il-3的条件下)或单独暴露于r848时pdc产生的水平。

本发明人先前已经证明，在感染meso13肿瘤细胞系3天后，从1x10⁶tcid50/ml的起始病毒剂量(相当于moi＝1)，产生大量病毒，达到1x10⁸tcid50/ml(相当于moi大于100)(gauvrit,a.etal,cancerres.,2008,68:4882-4892)。因此有可能响应mv感染肿瘤细胞时pdc产生的巨大量ifn-α是这些肿瘤细胞中强烈mv复制的结果。为了验证这一假设，在moi范围从1增加到50的条件下培养pdc(存在或不存在il-3)(图16b)。在存在il-3的条件下，本发明人观察到pdc产生的ifn-α随着moi而增加。与此相反，在不存在il-3的条件下，除了最高moi(moi＝50)之外，pdc不产生ifn-α。这些结果表明，pdc产生ifn-α的水平取决于mv的数量以及il-3或其他存活信号的存在，这解释了响应肿瘤细胞感染后的高滴度病毒产生的巨大量ifn-α。

因为mv和mv感染的肿瘤细胞包含病毒ssrna，所以有可能pdc产生ifn-α主要归因于触发tlr-7。因此，进行tlr7的抑制。使用特异性免疫调节dna序列(irs)(irs661)，其抑制tlr-7介导的ifn-α表达(barrat,f.j.etal,jexpmed.,2005,202:1131-1139)。本发明人证明，当添加irs661时，在存在mv和il-3条件下培养的pdc产生ifn-α被抑制(图16c)。向 暴露于mv感染的肿瘤细胞的pdc中添加irs661时，也观察到类似的ifn-α抑制。作为对照，显示irs661不抑制cpg-a诱导pdc产生ifn-α，其是tlr9依赖性的。总而言之，这些结果证明mv或mv感染细胞诱导的ifn-α产生是tlr7依赖性的。

实施例12

pdc能够交叉呈递来自mv感染肿瘤细胞的肿瘤相关抗原

人pdc交叉呈递病毒抗原的能力已被报道(dipucchio,t.etal.,natimmunol.,2008,9:551-557；hoeffel,g.etal.immunity,2007,27:481-492；lui,g.etal,plosone,2009,4:e7111)，但肿瘤相关抗原(taa)的交叉呈递还没有被报道过。本发明人想知道暴露于mv感染肿瘤细胞的人pdc是否能够交叉呈递肿瘤细胞自发表达的人taa。他们通过rt-pcr证明，hla-a*0201^negm18黑色素瘤细胞系表达癌症睾丸抗原，nyeso-1，而a549肺腺癌细胞系不表达(图17a)。

为了确定在暴露于mv感染或uv照射的hla-a*0201^neg/nyeso-1^posm18肿瘤细胞系后，hla-a*0201^pospdc是否能够交叉呈递所述taa，使用cd8+t细胞克隆m117.167，其对hla-a*0201/nyeso-1(157-165)复合物是特异性的(图17b-d)。该实验的示意图显示于图18。m117.167t细胞克隆不产生ifn-γ(单独或存在il-3pdc的条件下)，但在存在用nyeso-1[157-161]肽脉冲处理的pdc的条件下被活化(图17b)。当将0.1μμ肽负载到pdc上时，所述克隆很快被活化(16.3％ifn-γ+细胞)，并被用1μμ肽脉冲处理的pdc更强烈的活化(77.5％)。在存在与mv感染的m18肿瘤细胞培养的pdc的条件下，11.5％的克隆群体被活化，而针对与uv照射的m18肿瘤细胞培养的pdc，所述克隆不产生ifn-γ(图17b)。针对与mv感染的m18共培养的pdc，所述克隆具有与响应用0.1μμnyeso-1(157-165)肽刺激的pdc观察到的模式类似的ifn-γ产生的模式。

作为对照，本发明人未能检测到响应单独的mv感染或uv照射的m18肿瘤细胞的m117.167t细胞克隆的活化(图17c)。该结果是预料之中的，因为m18肿瘤细胞系是hla-a*0201^neg，因此不会将nyeso-1(157-165)肽直接呈递给所述克隆。这证明，所述克隆的ifn-γ产生(响应与mv感染的m18肿瘤细胞共培养的hla-a*0201^pospdc)是归因于交叉呈递。本发 明人也未观察到响应与mv感染的nyeso-1^nega549肿瘤细胞共培养的pdc的ifn-γ产生。在该典型实验中，所述克隆响应与mv感染的m18共培养的pdc产生ifn-γ(6.5％ifn-γ⁺细胞)，这类似于响应用0.1μμnyeso-1(157-165)肽刺激的pdc观察到的产生率(10.8％ifn-γ⁺细胞)。

总而言之，这些结果显示pdc能够交叉呈递肿瘤抗原诸如来自mv感染肿瘤细胞的nyeso-1，但不交叉呈递来自uv照射肿瘤细胞的肿瘤抗原。因此，基于mv的抗肿瘤病毒疗法将能够在抗肿瘤免疫应答中利用pdc，通过活化它们产生大量ifn-α和将来自mv感染肿瘤细胞的taa交叉呈递给肿瘤特异性cd8+t淋巴细胞的能力。

本发明人还在体外表征了基于mv的抗肿瘤病毒疗法对人pdc功能的影响。首先，他们证明不论是否表达cd46，pdc对mv感染都是不敏感的。但是，pdc能够检测病毒，通过在不存在存活信号的条件下响应高病毒量产生ifn-α，或将存活信号诸如il-3添加到培养物中时响应低病毒量产生ifn-α。其次，当pdc与mv感染的肿瘤细胞共培养时，pdc经历成熟过程，其特征在于通过诱导cd83表达和ifn-α的大量产生，以及共刺激分子的稍微增加的表达。相反地，与uv照射的肿瘤细胞共培养的pdc保留当它们与单独的il-3共培养时观察到的类似的未成熟表型。随后本发明人鉴定出tlr7是导致它们活化的pdc受体，可能归因于mv感染的肿瘤细胞片段内化后单链病毒rna在pdc的内吞小室中的存在。最后，使用hla-a*0201/nyeso-1(157-165)-特异性cd8+t细胞克隆，本发明人证明hla-a*0201⁺pdc能够交叉呈递来自nyeso-1⁺hla-a*0201^negmv感染的肿瘤细胞，但非来自uv照射的肿瘤细胞的所述肿瘤相关抗原(taa)。本发明人第一次证明了人pdc将来自死的肿瘤细胞的taa交叉呈递给cd8+t细胞的能力。总而言之，这些结果表明，基于mv的抗肿瘤病毒疗法除了其直接裂解感染的肿瘤细胞之外，能够在抗肿瘤免疫应答中募集pdc，活化它们产生高水平的i型ifn和交叉呈递taa的能力。

首先，本发明人证明，体外暴露于mv(moi＝1)的人pdc在没有il-3的条件下不经历成熟过程。在这种情况下，没有存活信号，pdc经历凋亡，并且无法在胞内体小室中获得mv以参与成熟过程(通过将病毒ssrna与tlr7连接)。当在存在il-3的条件下pdc暴露于mv时，它们存活，并且观察到成熟(低ifn-α产生和cd83的诱导表达)。本发明人观察到在不存在 il-3的条件下，只有当使用大量的mv(moi＝50)时，pdc才被活化。在这种高mv浓度，本发明人认为足量的mv到达pdc的内吞小室，在它们的凋亡程序开始前提供存活/成熟信号。因此，当在存在il-3的条件下pdc暴露于mv时，pdc存活，mv被内化，从而允许通过病毒ssrna触发tlr7。当在不存在il-3的条件下pdc暴露于mv时，除非足量mv到达内吞小室以使其活化和成熟时，它们将经历凋亡。这些结果解释了文献中矛盾的报道，这是归因于实验设置的差异。实际上，本发明人获得与schlender等人和duhen等人类似的结果，schlender等人报道在不存在il-3培养的条件下少量的mvschwarz未能诱导pdc产生ifn-α(schlender,j.etal,jvirol,2005,79:5507-5515)，duhen等人声称在存在il-3的条件下mvschwarz诱导pdc产生大量的ifn-α(duhenetal,virusres.,2010,152:115-125)。但是，本发明人没有观察到mvschwarz抑制pdc产生ifn-α(31)，而在存在il-3的条件下pdc产生ifn-α。最后，这两组人均描述了通过针对mv血凝素(h)的单克隆抗体对pdc进行染色，但对结果的解释是不同的。一组人声称pdc被感染并扩增病毒(schlender,j.etal,jvirol,2005,79:5507-5515)，而另一组人的结论是，尽管pdc上有h蛋白染色，但是mv复制较低(duhenetal,virusres.,2010,152:115-125)。本发明的结果支持后一结论，因为本发明人使用mv-egfp没有观察到增殖性感染，甚至在高moi时，无论是否存在il-3。

本发明人还证明，在存在mv或mv感染的肿瘤细胞的条件下，pdc经历成熟，其特征在于细胞表面cd83分子表达的上调。与利用r848单独刺激的pdc相比，在存在mv或mv感染的肿瘤细胞的条件下，pdc响应高病毒载量产生更高量的ifn-α。但是，这些细胞不表达大部分的cd40和cd86共刺激分子。因此，这种成熟表型类似hiv感染诱导的成熟表型(fonteneau,j.f.etal,jvirol,2004,78:5223-5232；o'brien,m.etal,jclininvest.,2011,121:1088-1101)，其通过tlr7活化pdc，就像mv一样(beignon,a.s.etal,jclininvest.,2005,115:3265-3275)。实际上，现在已经清楚，取决于所用tlr激动剂的性质，在人pdc中可以触发两种主要的活化途径。这种二分法(dichotomy)由kerkmann等人第一次报道，他们证明两种tlr9激动剂，cpg-a和cpg-b，使用两种不同的途径活化pdc成熟(kerkmann,m.etal,jimmunol.2003,170:4465-4474)。最近，观察到tlr7激动剂相同 的二分法(o'brien,m.etal,jclininvest.,2011,121:1088-1101)。实际上，hiv与cpg-a作用类似，通过在pdc的早期胞内体中触发tlr7和irf7信号途径，和通过诱导ifn-α的有效产生。本发明人证明，mv+il-3或mv感染细胞诱导的成熟类似于hiv诱导的活化，表明通过mvssrna对tlr7的早期胞内体触发。这种早期胞内体活化途径与病毒感染细胞表达的抗原交叉呈递相容，因为已经证明了来自感染细胞的病毒抗原的交叉呈递(hoeffel,g.etal,immunity,2007,27:481-492)和来自mv感染细胞的taa的交叉呈递，如本文所述。相反地，schnurr等人报道称，与骨髓dc不同，pdc在体外不能交叉呈递采用单独的全长蛋白或免疫复合物形式的taa(schnurr,m.etal,blood,2005,105:2465-2472)。但是，这些作者使用可溶性蛋白，而没有使用表达nyeso-1的肿瘤细胞作为抗原来源。关于pdc在体内的抗原交叉呈递还有争论。salio等人报道称，cpg刺激的鼠pdc不能交叉呈递抗原，而它们可以建立抗内源性抗原的t细胞应答(salio,m.etal,jexpmed.,2004,199:567-579)。mouries等人证明，还是在鼠模型中，无论是体内还是体外，可溶性ova蛋白和tlr激动剂(cpg或r848)均活化pdc以将ova交叉引发特异性cd8+t细胞(mouries,j.etal,blood,2008,112:3713-3722)。类似地，最近kool等人在体外证实，在通过cpg的tlr9刺激或利用包含ova表位的流感病毒感染后，可溶性ova肽或完整蛋白的呈递和交叉呈递(kooletal,jleukocbiol,2011,90:1177-1190)。最后，liu等人报道称，向载有b16黑色素瘤的小鼠中肿瘤内注射cpg-a-刺激的pdc诱导肿瘤抗原交叉引发，但这种交叉引发是通过cd11c+dc而不是pdc进行的(liuetal,jclininvest.,2008,118:1165-1175)。本发明人已经证明，在体外人pdc暴露于mv感染的肿瘤细胞能够将nyeso-1交叉呈递给对所述taa特异的cd8+t细胞克隆。本发明人显示，mv感染的肿瘤细胞经历细胞死亡，随后被pdc吞噬。这些mv感染的细胞能够活化pdc，无需添加佐剂或tlr激动剂。在免疫缺陷小鼠的不同人肿瘤异种移植模型中体内证实了基于mv的抗肿瘤病毒疗法的功效(peng,k.w.etal.,cancerres.,2002,62:4656-4662；mcdonald,c.j.etal.,breastcancerrestreat.,2006,99:177-184；blechacz,b.etal,hepatology,2006,44:1465-1477)。基于mv的病毒疗法的第一次临床试验显示令人鼓舞的结果(heinzerling,l.etal,blood,2005,106:2287-2294；galanis,e.etal,cancerres.,2010,70:875-882)。基于 mv的病毒疗法的功效可能归因于病毒对肿瘤细胞的裂解。但是，其一部分功效还可能归因于mv感染的肿瘤细胞活化免疫系统细胞(尤其是pdc)的能力。实际上，tlr激动剂在荷瘤小鼠中活化pdc已经显示诱导抗肿瘤免疫应答和肿瘤消退(drobits,b；etal,jclininvest.,2012,122:575-585；liu,c.etal,jclininvest.,2008,118:1165-1175；palamara,f.etal,jimmunol,2004,173:3051-3061)。liu等人显示，通过tlr9激动剂刺激鼠pdc诱导nk细胞活化和募集到肿瘤，触发cd11c+dc的肿瘤抗原交叉呈递(liu,c.etal,jclininvest.,2008,118:1165-1175)。drobits等人显示，用tlr7激动剂(咪喹莫特)局部治疗小鼠的黑色素瘤肿瘤诱导pdc活化并募集入肿瘤，造成肿瘤消退(drobits,b；etal,jclininvest.,2012,122:575-585)。drobits等人证明，通过采用ifnar1依赖性机制分泌trail和粒酶b，pdc获得抗肿瘤细胞的细胞毒活性。经由pdc的ifn-α分泌不仅在pdc上诱导抗肿瘤细胞毒活性(通过自分泌循环)，还可以直接作用于肿瘤细胞以诱导凋亡(thyrell,l.etal,oncogene,2002,21:1251-1262)。i型ifn还在nk活化中起作用，在nk细胞依赖性肿瘤排异的小鼠模型中也需要i型ifn(swann,j.b.etal,jimmunol,2007,178:7540-7549)。最后，这些nk细胞还可能通过刺激骨髓dc参与抗肿瘤应答的启动，因为在ifnar1-和stat1-缺陷小鼠，未能产生抗肿瘤t细胞应答(diamond,m.s.etal,jexpmed.,2011,208:1989-2003；fuertes,m.b.etal,jexpmed.,2011,208:2005-2016)。因此，本发明人显示，mv感染的肿瘤细胞诱导pdc产生大量ifn-α，其可能有利于产生参与抗肿瘤免疫应答的多细胞亚群。此外，已知活化pdc的其他溶瘤病毒用于抗肿瘤病毒疗法的临床试验，诸如牛痘(kim,j.h.etal,molther.,2006,14:361-370)，单纯疱疹病毒(kaufman,h.l.etal,futureoncol,2010,6:941-949)和腺病毒(ramesh,n.etal,clincancerres.,2006,12:305-313)。这些病毒感染的肿瘤细胞还能够诱导ifn-α产生和pdc的肿瘤抗原交叉呈递。

基于mv的抗肿瘤病毒疗法是一种有希望的用于治疗癌症的方法，通过病毒的溶瘤活性。此外，本发明人证明，mv感染的肿瘤细胞活化人pdc的成熟和肿瘤抗原交叉呈递能力。因此，基于mv的抗肿瘤病毒疗法代表了一种令人感兴趣的在抗肿瘤免疫应答中募集pdc的方法。

实施例13

使用不同黑色素瘤细胞系对未修饰mv和mv-deltac进行比较研究

材料和方法

细胞培养。检测的肿瘤细胞系是来源于黑色素瘤的细胞系：m6，m17，m117，m88和m113。在添加10％胎牛血清(fcs)，1％l-谷氨酰胺和1％青霉素g/链霉素的rpmi1640培养基中培养细胞。在75cm²培养瓶中按照3×10⁶个细胞的初始浓度培养细胞，并在37℃5％co2中维持。对细胞进行常规检测，发现是支原体感染阴性的。肿瘤细胞的感染。感染前24小时将细胞种于12孔板，在1ml的10％fcsrpmi培养基中200×10³个细胞每孔以允许它们粘附。使用两种病毒感染肿瘤细胞：(i)mv-egfp：重组的减毒活麻疹病毒(mvschwarz)，包含编码蛋白gfp的基因，用于研究肿瘤细胞的感染；(ii)mv-deltac-egfp：重组修饰的mv疫苗株，包含编码gfp的基因。

对于两种病毒(未修饰的mv对mv-deltac)以及不同的黑色素瘤细胞系来说感染效率是不同的。本发明人观察到，在感染后24小时mv-deltac比未修饰的mv能够更有效地感染肿瘤细胞(图19和20)。

此外，已经显示，与未修饰的mv相比，在mv-deltac感染后肿瘤细胞表达更多的“危险信号”诸如hsp70和crt到膜上(图21)。这表明，通过成熟和活化树突细胞(在它们吞噬凋亡细胞后)，诱导免疫应答的更高效率。

将mv-deltac疫苗体内注射到黑色素瘤肿瘤内部证明mv-deltac比对照增强的诱导快速应答的效果(图22)。

总之，mv-deltac疫苗株显示比常规未修饰mv疫苗更令人感兴趣和更好的促凋亡特性。

实施例14

在癌细胞和非癌细胞中对未修饰mv和mv-deltac的细胞死亡诱导的比较

为了评估mv-deltac相对于未修饰mv更强的细胞死亡诱导是否对癌细胞是特异性的，本发明人比较了其对人癌细胞系(a549人肺腺癌和hela颈癌)和对非源于癌症的永生化细胞(hek293人胚肾细胞和vero非洲绿猴肾细胞)的活性。a549和hela是常用的原型人癌细胞。与此相反，作为用ad5实验转化的，hek293细胞不是癌细胞。vero细胞谱系是连续和非整倍体的，即可以通过许多分裂循环进行复制，而且并不衰老。

将细胞(96孔板中40000个每孔)与不同moi(0.1，1，5，10)的mv-deltac或未修饰mv病毒一起培养。对dmem(0.2ml)中的非粘附细胞进行感染。在培养0，24，46和68小时后，使用celltiter-glo试剂(promega)确定活细胞的数目。这种基于荧光素酶的测定法通过atp定量对培养孔中代谢活性细胞的数目进行评估。

该分析证实，与未修饰的mv相比，mv-deltac甚至在低moi也诱导对a549和hela人癌细胞的显著更高和更早的细胞死亡(图23a)。因此，mv-deltac更好的溶瘤能力延伸至间皮瘤、黑色素瘤和肺至颈部癌细胞。与此相反，在vero细胞没有观察到两种病毒对细胞死亡诱导的差异，并且在感染68小时后没有观察到hek293细胞的细胞死亡(图23b)。这表明，mv-deltac相比未修饰mv加速细胞死亡或重新激活衰老途径的机制对人癌细胞是特异的。vero细胞对mv-deltac不是比未修饰mv更敏感的现象是重要的，因为mv通常在这种细胞系中制备。

在相同细胞系中同时鉴定两种病毒的病毒生长动力学(图24)。在35mm培养孔中利用moi为1的未修饰mv或mv-deltac感染vero、hek293、hela和a549细胞。在感染后不同的时间点测定病毒滴度为tcid50。在vero和hek293非癌细胞中均观察到两种病毒的高速复制。与此相反，在hela和a549癌细胞中复制滴度较低，mv-deltac在a549细胞中以极低水平复制。这表明，癌细胞中的细胞死亡诱导导致较低的病毒子代产生，这对于溶瘤病毒来说具有安全性优势。