用于靶向连接蛋白半通道的组合物和方法与流程

本申请是要求2013年8月21日提交的美国临时专利申请序列号61/868,112的优先权的国际申请，所述临时申请整体以引用方式并入本文。

背景技术：

骨组织是乳腺癌和前列腺癌转移的优选位点。骨转移出现在高达75％的晚期癌患者中。目前，还无法治愈转移性乳腺癌，也无用于治疗骨转移的副作用极低的可靠干预药物。

骨关节炎(OA)是一种影响着大约20％的美国成年人的普遍性疾病。该疾病导致关节(包括关节软骨和软骨下骨)的退化。OA的病理特征在于关节软骨的丧失，从而导致关节空间变窄、关节摩擦增加和可能的结构重塑。当前的治疗包括锻炼、生活方式改变和止痛剂。如果症状变严重，则通常施行关节置换术。迄今为止，尚无可用于治疗OA的特定药物干预措施。

连接蛋白半通道在细胞和组织功能中发挥着重要作用，并且已知连接蛋白半通道的功能异常会导致各种病理病症。因此，仍需要用于治疗与半通道活性相关的病理病症(例如炎症、骨关节炎或骨转移)的另外疗法以及用于确定此类疗法的方法。

技术实现要素：

本发明人已发现：转移靶标的细胞中打开的半通道对癌生长、迁移和转移具有抑制作用。某些实施方案提供用来鉴定调节半通道的打开以治疗癌转移的化合物的工具和/或方法。在某些方面，可将药物用于抑制或缓解癌症向骨、脑或肝的转移。在某些方面，半通道可在骨、脑或肝细胞中表达。在又一个方面，半通道可以是骨细胞半通道、肝细胞半通道或星形胶质细胞半通道。在某些方面，半通道可以是连接蛋白Cx43、Cx32、Cx46、Cx37、Cx40、Cx50、Cx59、Cx62、Cx26、Cx31、Cx30.3、Cx31.1、Cx30、Cx25、Cx45、Cx47、Cx30.2、Cx36、Cx31.9、Cx39、Cx40.1、Cx23或Cx29半通道。在某一方面，半通道是Cx43或Cx 32半通道。例如，骨细胞中连接蛋白43(Cx43)半通道的打开对向骨骼的转移具有抑制作用，并可抑制骨转移。

半通道打开可通过使用比如荧光黄(Lucifer yellow)、溴化乙锭、Alexa 350、Alexa 485、Alexa 594染料等荧光染料进行的染料摄取测定法进行检测。半通道打开的特异性可通过使用抑制半通道打开并因此抑制靶向试剂活性的连接蛋白特异性抗体进行验证。因此，所述工具和/或方法可用于筛选、测试和鉴定打开半通道并抑制转移的试剂。

某些实施方案涉及鉴定打开半通道的化合物的方法。其它实施方案涉及正调节半通道的打开以抑制或缓解骨转移的方法。

本发明提供抗半通道的抗体，编码此类抗体和治疗性蛋白的核酸，制备抗半通道单克隆抗体和其它治疗性蛋白的方法，以及用于治疗诸如转移癌的疾病的方法。在某些方面，该抗体结合具有FLSRPTEKTI(SEQ ID NO:13)、KRDPCPHQVD(SEQ ID NO:14)或LSAVYTCKR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列的表位。在一个特定的方面，抗体结合具有FLSRPTEKTI(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的表位。

在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到半通道的分离抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链。

在某些方面，第一重链区包含具有SEQ ID NO:2的残基13至37的氨基酸序列的氨基酸序列；第二重链区具有对应于SEQ ID NO:2的残基46至66的氨基酸序列；并且第三重链区包含具有SEQ ID NO:2的残基97至116的氨基酸序列的氨基酸序列。

在另一方面，第一轻链区包含具有SEQ ID NO:4的残基9至40的氨基酸序列的氨基酸序列；第二轻链区具有对应于SEQ ID NO:4的残基49至58的氨基酸序列；并且第三轻链区包含具有SEQ ID NO:4的残基64至108的氨基酸序列的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到半通道和间隙连接部的分离抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链。

在某些方面，第一重链区包含具有SEQ ID NO:6的残基13至37的氨基酸序列的氨基酸序列；第二重链区具有对应于SEQ ID NO:6的残基46至66的氨基酸序列；并且第三重链区包含具有SEQ ID NO:6的残基97至116的氨基酸序列的氨基酸序列。

在另一方面，第一轻链区包含具有SEQ ID NO:8的残基9至42的氨基酸序列的氨基酸序列；第二轻链区具有对应于SEQ ID NO:8的残基51至60的氨基酸序列；并且第三轻链区包含具有SEQ ID NO:8的残基66至125的氨基酸序列的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到间隙连接部的分离抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链。

在某些方面，第一重链区包含具有SEQ ID NO:10的残基10至34的氨基酸序列的氨基酸序列；第二重链区具有对应于SEQ ID NO:10的残基43至59的氨基酸序列；并且第三重链区包含具有SEQ ID NO:10的残基94至109的氨基酸序列的氨基酸序列。

在另一方面，第一轻链区包含具有SEQ ID NO:12的残基9至40的氨基酸序列的氨基酸序列；第二轻链区具有对应于SEQ ID NO:12的残基49至58的氨基酸序列；并且第三轻链区包含具有SEQ ID NO:12的残基64至108的氨基酸序列的氨基酸序列。

在某些方面，抗体包括全长抗体、抗体片段、单链抗体、双特异性抗体、微抗体、域抗体、合成抗体和抗体融合体及其片段。

又一个实施方案提供包含如本文所述的抗体与药学上可接受的载体的药物组合物。还提供了用作治疗剂以用于治疗癌症和抑制癌转移的本发明的抗体或药物组合物。

又一个实施方案提供治疗或预防癌转移的方法。治疗方法可包括向对其有需要的受试者施用有效量的本文所述的分离抗体。还提供了如本文所述的抗体在制造用于治疗或预防癌转移的药剂中的用途。

某些方面涉及使用抗体、化合物或试剂抑制软骨细胞中的炎症反应的体外方法。在某些方面，方法涉及通过以下方面来确定对软骨细胞中Cx43半通道打开的抑制的作用：(i)使用荧光黄或Alexa染料通过染料摄取测定法测定半通道打开，(ii)评估IL-1β对半通道打开的抑制作用，(iii)通过流体流动剪切应力形式的机械负荷测试试剂对半通道打开的抑制作用。

某些方面涉及通过以下方面来确定抗体、化合物或试剂对抑制IL-1β和机械负荷所诱发的炎性反应的作用的方法：(i)测定对IL-1β诱导的核因子-кB(NF-кB)活化的抑制，(ii)测定对体流动剪切应力诱导的NF-кB活化的抑制。

其它方面涉及使用单克隆抗体、化合物或试剂治疗OA或确定OA的体内方法，该方法包括：(i)将抗体、化合物或试剂注射进入膝盖骨腔中，(ii)评估对IL-1β诱导的NF-кB活化的抑制，(iii)通过X射线、组织学分析和身体运动评估OA发展。

如本文所用，术语“抗原”是能够被抗体或T细胞受体结合的分子。在某些实施方案中，对抗体之外的结合部分进行工程改造以特异性结合到抗原，例如适配子、高亲合性多聚体(avimer)等。

术语“抗体”或“免疫球蛋白”用于包括完整的抗体及其结合片段/区段。通常，片段与得到所述片段的完整抗体竞争与抗原的特异性结合。片段包括单独的重链、轻链、Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc和Fv。片段/区段通过重组DNA技术或通过酶促方式或化学方式分离完整的免疫球蛋白而产生。术语“抗体”还包括与其它蛋白化学缀合或表达为融合蛋白的一条或多条免疫球蛋白链。术语“抗体”还包括双特异性抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同的重/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过多种方法产生，包括融合杂交瘤或连接Fab'片段。参见例如Songsivilai和Lachmann,Clin Exp Immunol 79:315-21,1990；Kostelny等,J.Immunol.148:1547–53,1992。

术语“分离的”可以指基本不含其来源中的细胞物质、细菌物质、病毒物质或培养基(当通过重组DNA技术产生时)或者化学前体或其它化学品(当化学合成时)的核酸或多肽。另外，分离的化合物是指可作为分离的化合物施用给受试者的化合物；换言之，如果该化合物吸附到柱上或包埋在琼脂糖凝胶中则不会被简单地认为是“分离的”。另外，“分离的核酸片段”或“分离的肽”是不天然作为片段形式存在的和/或通常不处于功能状态的核酸或蛋白片段。

本发明的部分(诸如多肽、肽、抗原或免疫原)可以缀合或者共价或非共价连接至其它部分(诸如佐剂、蛋白、肽、支持物、荧光部分或标记)。广义地使用术语“缀合”或“免疫缀合”定义一个部分与另一试剂的可操作连接，无意单独指任何类型的可操作连接，尤其不限于化学“缀合”。

术语“提供”使用其普通含义，指“提供或配备来使用”。在一些实施方案中，通过施用蛋白来直接提供所述蛋白，而在其它实施方案中，通过施用编码蛋白的核酸来有效地提供所述蛋白。在某些方面，本发明设想的组合物包括核酸、抗原、肽和/或表位的各种组合。

短语与靶标“特异性结合”或“具有特异性免疫反应性”是指在存在其它生物分子的异质群体的情况下决定分子的存在性的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，指定的分子优先结合到特定的靶标，而不会大量结合到样品中存在的其它生物分子。抗体与靶标在此类条件下的特异性结合需要针对与靶标的特异性来选择抗体。多种免疫测定法可用于选择与特定的蛋白具有特异性免疫反应性的抗体。例如，通常使用固相ELISA免疫测定法来选择与蛋白具有特异性免疫反应性的单克隆抗体。有关可用于测定特定免疫反应性的免疫测定法和条件的描述，参见例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,1988。

在本申请中讨论了本发明的其它实施方案。相对于本发明的一个方面讨论的任何实施方案适用于本发明的其它方面，反之亦然。本文所述的每个实施方案应被理解为适用于本发明所有方面的本发明的实施方案。据设想，本文所讨论的任何实施方案可相对于本发明的任何方法或组合物进行实施，反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法。

词语“一个”与术语“包括”在权利要求书和/或说明书中结合使用时可意指“一个”，但是也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。

在本申请中，术语“约”用于表示数值包括测定该数值所用装置或方法的误差的标准差。

除非明确地仅指出某些可选方式或可选方式之间互相排斥，否则权利要求中使用术语“或”意指“和/或”，但本公开也支持仅指某些可选方式和“和/或”的定义。

如本说明书和权利要求书中所用，词语“包含”(以及任何形式的包含)、“具有”(以及任何形式的具有)、“包括”(以及任何形式的包括)或“含有”(以及任何形式的含有)是包含性质的或者开放式的，且不排除另外的未陈述的要素或方法步骤。

通过以下详细描述，本发明的其它目标、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解的是，该详细描述和具体实例虽然指明了本发明的特定实施方案，但是仅以举例说明的方式给出，因为通过该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对本领域的技术人员而言将变得显而易见。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分，并包括在内以进一步阐明本发明的某些方面。通过结合这里所展示的说明书实施方案的详细描述来参考这些附图中的一个或多个可以更好地理解本发明。

图1示出了流体流动回路设备的一个实施方案。

图2示出了在不存在或存在1μg/ml Cx43(E2)抗体的情况下用20μM AD处理MLO-Y4骨细胞30分钟的结果。进行了溴化乙锭染料摄取试验，并与未处理的基础摄取水平相比进行了定量。在钙条件下进行了研究。将低钙条件用作对照(打开半通道)。还示出了用AD或AD和Cx43(E2)抗体处理MLO-A5成骨细胞的结果。

图3示出了模型系统，其用于研究骨细胞Cx43半通道在调节AD对癌细胞迁移的作用中的角色。骨细胞中的Cx43半通道通过AD或FFSS打开。AD处理或FFSS处理的CM中释放的因子减少癌细胞迁移。用对照CM处理的癌细胞表现出正常的迁移。

图4A和4B示出了使用软琼脂糖非贴壁依赖性生长测定法进行的研究，该测定法不同于贴壁依赖性生长。只有癌细胞才能在软琼脂上生长，并且其在这种基质上的生长表明癌细胞增殖的程度。来自骨细胞的CM-AD减少MDA-MB-231集落形成。

图5A和5B示出了使用伤口愈合迁移测定法进行的研究的结果。来自骨细胞的CM-AD抑制了MDA-MB-231细胞迁移。

图6示出了另一伤口愈合迁移测定的结果。AD对MDA-MB-231细胞的迁移无直接作用。

图7A和7B示出了得自transwell迁移测定的结果。(B)点表示迁移到插件的相对端并且已被染色的细胞。较小的点是所述细胞迁移通过的孔。在该测定中，将蛋白A用于从CM移除E2Ab，并且这导致迁移效应与添加E2Ab之前相同。

图8示出了得自另一transwell迁移测定的结果。MDA-MB-231迁移不受来自MLO-A5成骨细胞的CM-AD的影响。

图9示出了得自另一transwell迁移测定的结果。MDA-MB-231迁移通过来自机械负荷所刺激的骨细胞的CM而减少。

图10A和10B示出了得自注射到Cx43条件性敲除(cKO)小鼠的Py8119乳腺癌细胞的结果。Py8199肿瘤生长和转移在Cx43cKO小鼠中增加。(B)肿瘤扩散到Cx43cKO小鼠中的其它组织。

图11示出了得自注射到Cx43cKO小鼠中的Py8119的结果。Py8119肿瘤生长在Cx43cKO小鼠中增加。

图12示出了通过三种mAb对Cx43进行免疫标记。将骨细胞MLO-Y4细胞在-20℃下用70％乙醇固定20分钟，阻断过夜，用mAb在室温在上文所示的浓度下温育3h。将山羊抗小鼠FITC二抗用于评估三种mAb的活性。作为细胞标记物的WGA以红色进行标记。

图13显示了通过在pH 7.4下经过Cx43 E2柱而亲和纯化的杂交瘤上清液。对每种单克隆抗体以1:100稀释进行了western印迹。多克隆Cx43Ab稀释度为1:300。

图14显示了M1阻断半通道，但不阻断间隙连接部；M2阻断间隙连接部，但不阻断半通道；而M3则阻断两者。(A)将MLO-Y4细胞用含有低Ca²⁺和Mg²⁺的培养基温育，这种条件诱导Cx43半通道的打开。在存在EtBr具有或不具有mAb的情况下进行了20分钟的染料摄取测定。(B)将用Cx43转染的HeLa细胞用mAb温育3h，将信号细胞与AlexaFluor 488一起显微注射以评价针对间隙连接部测定的染料转移程度。

图15示出了降落染料转移(parachuting dye transfer)测定，显示了M2和M7但非M1阻断间隙连接通道。将用Cx43转染的Hela细胞用于降落染料转移实验。将供体细胞用5μM可渗透到间隙连接部的钙黄绿素红-橙-AM(790Da)和5μM不可渗透到间隙连接部的俄勒冈绿488BAPTA-2-AM(1752Da)在37℃温育40分钟。将供体细胞用胰蛋白酶处理，并将分离的预加载细胞在未标记的受体细胞顶部以1:4的供体与受体比率分层(“降落”)。使细胞贴壁90分钟。在荧光显微镜下检查细胞。

图16.显示了通过M1和M7但非M2阻断了机械负荷所诱导的半通道打开。将MLO-Y4细胞用或不用mAb预处理20分钟。使细胞接受8达因/cm²的流体流动剪切应力10分钟，并用100μM EtBr进行5分钟的染料摄取。对细胞进行漂洗、固定，并在荧光显微镜下获取图像。

图17.显示了在小鼠体内骨细胞中M1阻断了机械负荷所诱导的半通道打开。将小鼠IgG或Cx43(M1)mAb(25mg/kg)并在2小时后将伊文思蓝(Evans blue)染料注射到WT和Cx43cKO小鼠中。染料注射后30分钟，对左(L)胫骨施加一次10分钟的机械负荷。对小鼠实施安乐死，并灌注50ml PBS。分离胫骨，固定，制作骨组织切片。条，40mm。箭头指示染料摄取。

图18.显示了Cx43在软骨细胞表面上的表达。(A)Cx43在原代软骨细胞表面上的表达。(B)流体流动剪切(16达因/cm2)(FSS)打开了半通道，而这种打开被Cx43特异性抗体明显阻断。FSS与所有其它条件相比，***，P<0.001。

具体实施方式

各种细胞能够通过由连接蛋白形成的半通道和间隙连接部与彼此以及与胞外环境通讯。连接蛋白在整个体内遍在表达。六个连接蛋白构成一个半通道，而2个半通道构成1个间隙连接通道。间隙连接部是一簇通道，它们位于相邻细胞之间的质膜中并介导细胞间通讯。半通道是来自间隙连接通道的单独实体。半通道允许分子在细胞内隔室与细胞外环境之间交换。

骨细胞表达称为连接蛋白(Cx)43半通道的半通道。这些骨细胞半通道通常是关闭的，并可在暴露于机械刺激时打开，这导致各种因子释放到骨微环境中。半通道打开所释放的因子可介导其它过程，这些过程可减少肿瘤细胞迁移和骨转移。

某些实施方案涉及鉴定调节连接蛋白的打开的试剂的方法。在某些方面，该方法鉴定正调节连接蛋白半通道的打开的化合物或药物。其它实施方案涉及通过向患有癌症的患者施用打开半通道的化合物而治疗癌症的方法。在某些方面，患者具有原发性肿瘤。在某些方面，打开Cx43半通道的化合物可用于抑制或减少向骨骼的转移。

当癌症从其起源的身体部分(例如，乳腺或前列腺)扩散到其它身体部分(例如，肝或骨)时即发生癌转移，并确立继发性肿瘤。骨骼是癌转移最常见的部位之一。转移到骨骼的癌症包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、肺癌和皮肤癌(例如，黑素瘤)。在高达75％的晚期乳腺癌和前列腺癌患者中可以确定骨转移。骨转移(mets)与许多严重的临床和生活质量后果相关，诸如但不限于难治性疼痛、病理性骨折、脊髓和神经压迫、骨髓浸润和运动性受损。在许多情况下，癌症的全身性存在也可使癌症无法治愈。

正常的骨骼由三大细胞类型构成：形成骨骼的成骨细胞，再吸收骨骼的破骨细胞，和骨细胞。骨细胞占骨骼细胞的大约95％，并通过协调溶骨和成骨活动而维持骨重建过程。当癌细胞侵袭骨骼时，许多正常的骨骼功能受到影响。癌细胞与局部微环境相互作用，以经由骨骼破坏和血管形成而促进癌细胞存活。

已证实，骨细胞中的Cx43半通道通过用阿仑膦酸盐(AD)处理而打开，阿仑膦酸盐是一种有效且常用的双膦酸盐药物。双膦酸盐是一类已知用于治疗许多骨病(包括骨转移)的药物。Powles等已显示施用双膦酸盐与乳腺癌患者中的骨转移发生率降低和死亡率降低相关。AD已与减少的肿瘤生长以及降低的骨破坏和疼痛相关。AD抑制破骨细胞活性并诱导骨细胞中Cx43半通道的打开(Plotkin等，2002)。然而，AD施用伴随着多种严重的副作用。

I.与作为骨转移抑制剂的候选药物筛选相关的方法

A.体外测定

某些实施方案涉及使用染料摄取测定法在体外检测半通道的打开。在某些方面，染料是荧光示踪剂染料(例如，溴化乙锭或荧光黄)。

在检测半通道打开的体外测定法的一个实例中，可以使用流体流动回路设备(FFLA)(平行板流动小室)或其改进形式。FFLA设备的一个实例在图1中示意性示出。FFLA模拟骨骼中的动态流体微环境以产生流体流动剪切应力(FFSS)。将细胞在平行板流动小室中培养，从而将细胞暴露于稳态层流流体流动。

骨细胞感测骨细胞骨陷窝/骨小管网络中FFSS所产生的机械应变。已有人提出，骨骼流体流动受血管外压力以及骨细胞施加的循环机械负荷驱动，并且峰值生理负荷为8至30达因/cm²。在某些方面，FFSS水平在之前测量骨骼内的流体流动的研究所报道的生理值范围内。流体剪切应力幅度可通过调整流动回路的柱高而改变。

用于评估半通道功能的测定可使用足够小以穿过半通道的孔的荧光示踪剂分子。如果半通道关闭，则分子无法通过。如果半通道打开，则染料可从中通过并导致细胞产生荧光，从而允许对荧光进行定量。当溴化乙锭连接到DNA时，其变得发出荧光。荧光黄在位于细胞内后产生荧光。

染料转移方法可包括将细胞暴露于胞外荧光渗透性示踪剂。胞外渗透性示踪剂是保持在细胞外部的分子，除非一些条件增加了细胞膜的渗透性才会进入分子内部。在某些方面，示踪剂的质量低于1、2或3kDa。在其它方面，示踪剂将具有净电荷。此类渗透性示踪剂包括但不限于阴离子染料荧光黄(LY；净电荷＝-1)和阳离子探针溴化乙锭(Etd；净电荷＝+1)、碘化丙啶(PI；净电荷＝+2)。EtBr的荧光在结合到DNA时增强，从而增加对比对并使得可以更容易地进行鉴定。在某些方面，在不同的时期或在施加刺激以打开半通道后移除胞外染料，并对每个细胞保持的荧光强度定量。在某些方面，在快照图片中对荧光强度定量。

图2示出了得自体外染料转移测定的一个实例的结果。将MLO-Y4骨细胞在不存在或存在1μg/ml Cx43(E2)抗体的情况下用20μM AD处理30分钟。进行了溴化乙锭染料摄取测定，并与未处理的基础摄取水平相比进行了定量。测定在存在钙的情况下进行。将低钙条件用作对照(打开半通道)。此外，将MLO-A5成骨细胞用AD处理或将AD+Cx43(E2)抗体用作阴性对照–AD不打开成骨细胞中的Cx43半通道，并且由AD诱导的骨细胞半通道的打开被Cx43(E2)抗体阻断。

在体外测定的某些方面用于鉴定半通道的正调节物的材料包括：

半通道表达细胞或细胞系。可使用本领域已知的方法和/或表达载体获得、分离或工程改造表达各种连接蛋白半通道的细胞或细胞系。

骨细胞：从动物(包括小鼠、大鼠、兔、鸡)分离的原代骨细胞等或骨细胞系，包括但不限于MLO-Y4细胞及其它细胞。

癌细胞：乳腺癌细胞系，包括ER、PR、HER和TP53阳性/阴性细胞(例如MD-MBA-231、MCF7、T47D或ZR751)。MDA-MB-231是乳腺导管癌。从C57Bl/6MMTV-PyMT雌性(小鼠乳腺肿瘤病毒启动子驱动的多瘤居中T转基因)小鼠中产生的自发性乳腺肿瘤建立了Py8119乳腺肿瘤细胞系。癌基因(多瘤居中T转基因)的表达受小鼠乳腺肿瘤病毒启动子的驱动。

前列腺癌细胞系：包括雄性激素受体和5α-还原酶阳性/阴性和雄性激素敏感/非敏感细胞系(例如，LNCaP-Rf、BM18、pRNA-1-1/ras、RC58T/hTERT、PPC-1等)。

成骨细胞：将MLO-A5成骨细胞用作对照，因为它们表达连接蛋白43，但它们似乎在由阿仑膦酸盐刺激时不打开。

待测试的“试剂”包括化合物、肽、蛋白、反义寡聚物和/或微RNA。

示踪剂分子包括但不限于荧光黄、溴化乙锭、伊文思蓝、Alexa350、Alexa488和Alexa594。

Cx43(E2)：Cx43(E2)抗体为Cx43半通道特异性的。Cx43E2结合Cx43半通道的第2个胞外环，并防止半通道打开。

确定试剂是否打开半通道的方法包括以下步骤中的一个或多个：

(a)分离、获得或产生连接蛋白表达细胞或细胞系。例如，从颅骨分离原代骨细胞。可使用本领域已知的其它方法分离其它细胞类型。在某些方面，从动物(例如，16天胚胎鸡颅骨或新生小鼠)分离颅骨骨细胞。将动物断头处死，解剖颅骨，快速浸入70％酒精中。然后将颅骨放入αMEM中，用PBS洗涤多次。将清洗后的骨骼置入新鲜的αMEM中。将骨骼剁碎，切成1.5mm大小的片。可将骨片用胶原酶处理以移除软组织和类骨质，然后使用EDTA脱钙。最后，通过用胶原酶处理并用力搅拌而将骨细胞从骨碎片中释放出来。

(b)从长骨分离原代骨细胞。可从2-3周大的小鼠或大鼠分离长骨骨细胞。例如，向小鼠给予超剂量的麻醉，使颈椎脱位，断头处死，并浸入70％乙醇中。分离关节末端仍然完整的股骨和胫骨。将腿快速浸入70％酒精中然后置入αMEM中。将αMEM中的腿用PBS洗涤。移除大部分肌肉，并与肌腱/韧带脱离。将清洗后的骨骼置入新鲜的αMEM中。清洗所有骨骼后，将每块骨骼的两端用手术刀切掉，然后立即使用PBS冲洗出骨髓。将骨骼切成1.5至2mm长，并用胶原酶处理。在一个实例中，将骨片用胶原酶相继处理9次，以移除所有组织和类骨质，然后使用EDTA脱钙。

(c)培养细胞或细胞系。例如，将原代和/或骨细胞系在胶原包被的板上培养，然后浸入含有渗透性示踪剂的记录培养基(不含HCO₃的HEPES缓冲α-MEM培养基)浴中。

(d)施用测试试剂。将培养的细胞置于与测试试剂接触所需的时长。

(e)测定渗透性示踪剂摄取。通过检测细胞内的示踪剂的量测定渗透性示踪剂摄取。在某些方面，使用延时记录。可在不同的细胞中在所关注的区域记录荧光，其中显微镜上的eclipse滤光片基于所用的示踪剂或其它探针的荧光波长。在某些方面，通过快速冷却的数码相机每2分钟获取一次图像，并通过ImageJ软件进行图像处理。收集到的数据可示为初始荧光和所关注时间的荧光与基础荧光相比的倍数差异。

对于快照图片，可将细胞暴露于渗透性示踪剂5-10分钟，用PBS漂洗多次，然后用甲醛固定。在某些方面，用显微镜获取荧光场的至少三个显微相片。通过ImageJ软件进行图像分析。测量随机细胞的像素密度的平均值。

在某些方面，确认连接蛋白半通道的打开。可例如通过将骨细胞与Cx43(E2)抗体(特异性抑制Cx43半通道的多克隆抗体)与测试试剂一起温育而进行确认。如果试剂打开Cx43半通道，则该通道打开将被Cx43(E2)抗体阻断。为了控制Cx43半通道的打开，将骨细胞用流体流动剪切应力和/或AD处理，两者已知均可打开骨细胞中的半通道。

在一个特定的实例中，将MLO-Y4骨细胞在不存在或存在1μg/ml Cx43(E2)抗体的情况下用20μM AD处理30分钟。进行了溴化乙锭染料摄取试验，并与未处理的基础摄取水平相比进行了定量。测定在存在钙的情况下进行。低钙条件可用作对照(打开半通道)。AD诱导的骨细胞半通道的打开被Cx43(E2)抗体阻断。

骨细胞Cx43半通道的打开介导对癌细胞迁移的负面效应。骨细胞中的Cx43半通道通过施用AD或FFSS而打开。打开的半通道使得各种因子可以释放到产生条件培养基(CM)的培养基中。AD或FFSS处理的CM中释放的因子减少癌细胞迁移，如通过软琼脂和伤口愈合测定法所确定。软琼脂测定法的实例在图3中示意性地示出。如图4中所示，用对照CM处理的癌细胞表现出正常的迁移。软琼脂测定法是非贴壁依赖性生长测定法，与贴壁依赖性生长相对。只有癌细胞才能在软琼脂上生长，并且其在这种基质上的生长表明癌细胞增殖的程度。

在某些方面，所述方法包括将原代骨细胞或骨细胞系用测试试剂在α-MEM中温育各种时间段，并在各个时间点收集上清液(条件培养基)。在某些方面，将乳腺癌或前列腺癌细胞用CM温育，并测定癌细胞增殖、迁移和侵袭。

可使用WST-1(水溶性四唑鎓盐)测定法、使用台盼蓝的活细胞计数法、BrdU DNA结合和细胞增殖测定法测定癌细胞生长和活力。对于WST-1测定法，通过Synergy HT多模式酶标仪(Biotek)以450nm的发射波长测量细胞增殖。

细胞迁移测定通常在24孔组织培养板(BD Biosciences)中的transwell膜过滤器插件中进行。transwell膜过滤器插件可以为例如6.5-mm直径、8-μm孔径和10-nm厚的聚碳酸酯膜。

侵袭测定在BD Biocoat低生长因子基质胶侵袭小室(BD Biosciences)中进行。收获癌细胞系并与或不与测试试剂一起重悬在得自骨细胞的CM中。将癌细胞悬液添加到插件的上侧。将细胞在37℃温育各种时间段。移除未穿过过滤器迁移的细胞，并将穿过插件迁移的细胞固定且用Hema 3Stat Pack(Fisher Scientific)染色。在光学显微镜下对每个插件5个视野中的迁移细胞数计数。

在某些方面，当在得自用AD或FFSS处理以刺激Cx43半通道打开的骨细胞的CM中温育时，乳腺癌迁移减少。当骨细胞Cx43半通道被E2抗体阻断时，对癌细胞迁移的这种抑制作用减弱。当用从成骨细胞收集的CM温育时或直接用AD处理时，未见癌细胞迁移的这种降低。Cx43半通道的打开防止乳腺癌细胞生长和迁移。

B.体内测定

其它实施方案涉及体内检测连接蛋白半通道的打开。用来发现可用于治疗癌症向骨骼转移的试剂的体内测定法的一个实例包括确定候选试剂对骨细胞中Cx43半通道的作用以及对体内癌向骨转移的作用。在某些方面，通过以下方式测定骨细胞中的Cx43调节：将候选试剂注射到长骨中并使用荧光示踪剂染料(例如，钙黄绿素或伊文思蓝)原位检测骨细胞中半通道的打开。

体内测定化合物对骨组织的骨细胞中半通道打开的作用。分析骨细胞中的半通道的体内测定法的一个实例使用3-4个月大的小鼠或大鼠。对动物称重。将测试试剂通过腹膜内(IP)注射而引入动物体内。2-4小时后，将荧光示踪剂染料(即，伊文思蓝、Alexa 594)注射到动物的侧尾静脉中或进行腹膜内注射。注意：可注射动物体重的最多1％(体积)。在某些方面，在尾静脉注射之前给动物保暖以扩张尾静脉。2-4小时后，将动物处死，解剖不含肌肉组织的胫骨和股骨，用PBS洗涤数次。将骨骼固定在多聚甲醛中，在14％EDTA溶液中在4℃脱钙两周或在室温在恒定搅拌下脱钙3-5天。将骨骼在PBS中洗涤，浸泡在30％的蔗糖的PBS溶液中过夜，然后包埋在OCT化合物中。通常根据需要调整骨骼在模具中的位置。使用低温恒温器切割五微米厚的冷冻切片，将切片在PBS中漂洗，然后使用50％的甘油的PBS溶液固定。在荧光显微镜下检查骨切片，并使用Image J对骨中骨细胞摄取示踪剂染料的程度定量。

骨细胞中Cx43半通道的打开可通过对胫骨施加机械负荷以打开骨细胞中的Cx43半通道而确认。这可用作体内骨细胞中半通道打开的阳性对照。对于阴性对照，使用骨细胞中Cx43存在缺陷的小鼠。这种小鼠通过将10-kb DMP-1 Cre与Cx43 flox小鼠杂交而产生。

使用胫骨内注射骨转移模型和/或心内注射癌转移测定法测定测试试剂对体内对骨转移的作用。

胫骨内注射骨转移模型。该方法包括将1个月大的正常或免疫低下小鼠用异氟烷麻醉。向小鼠给予盐酸丁丙诺啡(0.3mg/ml)作为止痛剂。使用表达荧光或化学发光标记物的癌细胞进行胫骨内注射(例如，对于正常小鼠为表达Luc-GFP的Py8119细胞，或对于免疫低下小鼠为表达Luc-GFP的MD-MBA-231)。通过由配有30号针的Hamilton注射器预先产生的孔，将癌细胞接种到右胫骨的骨髓区中。将PBS注入左胫骨作为对照。将测试试剂或盐水经腹膜内施用，每周两次，持续5周。从肿瘤细胞接种后3天开始，每周通过生物发光成像或荧光来监测胫骨内肿瘤生长。在足够的生物发光成像后的研究终止时，获取X射线图像以测试骨质量并观察标记的转移癌细胞集落，且通过荧光显微镜计数。

心内注射骨转移模型。将两个月大的正常或免疫低下小鼠通过异氟烷麻醉，并且还给予盐酸丁丙诺啡(0.3mg/ml)作为止痛剂。将表达荧光或化学发光标记物的癌细胞(例如，对于正常小鼠为表达Luc-GFP的Py8119细胞，或对于免疫低下小鼠为Luc-GFP-MD-MBA-231)注射到小鼠的左心室中。程序包括：将针保持向操作者成一角度且向右，将其插入第二肋间隙，距离胸骨左侧约3mm。推进约5mm并轻轻转动针头，直到观察到鲜红动脉血的脉动流进入针座。在30秒中注射细胞悬液。取出针，在注射部位使用酒精棉施压30秒。将小鼠置于温暖的表面上，直到其完全从麻醉中恢复。从肿瘤细胞接种后3天每周在心内注射后进行生物发光或荧光成像以验证肿瘤细胞的分布。在足够的生物发光成像后的研究终止时，获取X射线图像以评估骨质量并观察标记的转移癌细胞集落，且通过荧光显微镜计数。

Cx43条件性敲除(cKO)小鼠。由于纯合Cx43整体敲除是致命的，并且还由于本发明人想要研究在骨细胞中表达的Cx43的作用，因此产生了骨细胞特异性Cx43敲除小鼠。将floxed Cx43基因纯合的小鼠与Cx43整体杂合小鼠杂交有利于骨细胞中Cx43的完全缺失。然后将Cx43fl/-小鼠(50％的子代)与表达由人类DMP-1启动子驱动的Cre重组酶的小鼠杂交。这产生了为Cx43fl/-、DMP1 Cre+或Cx43 fl/-、DMP1 Cre-的小鼠(小百分比的为Cx43fl/fl或Cx43-/-)。通过免疫组织化学确认了Cx43缺陷骨细胞。

研究可包括4组小鼠：用阿仑膦酸盐(AD)处理的WT，用阿仑膦酸盐处理的KO，无AD的WT，和无阿仑膦酸盐的KO。将AD以150μg/kg体重施用给小鼠。对于AD处理，预期骨转移在KO中与WT小鼠相比将会增加。而在无AD的情况下，骨转移在WT与敲除小鼠之间应相似。

II.治疗与连接蛋白半通道相关的病症的方法

在某些实施方案中，可将连接蛋白半通道的调节剂用于治疗与连接蛋白半通道相关的障碍，包括炎性障碍，诸如骨关节炎(OA)和脊椎损伤。本文所述的方法和组合物还可用于治疗伤口，诸如角膜和皮肤伤口。

A.骨关节炎(OA)

骨关节炎是一种影响着大约20％的美国成年人的普遍性疾病。该疾病导致关节(包括关节软骨和软骨下骨)的退化。OA的病理特征在于关节软骨的丧失，从而导致关节空间变窄、关节摩擦增加和可能的结构重塑。当前的治疗包括锻炼、生活方式改变和止痛剂。如果症状变严重，则通常施行关节置换术。迄今为止，尚无可用于治疗OA的特定药物干预措施。

软骨细胞表达连接蛋白(Cx)43半通道，并且这些通道介导小分子(低于1kDa)在细胞内/外之间的传递。在正常条件下，软骨细胞中的Cx43半通道保持关闭；然而，这些通道在炎症条件下打开并释放诸如促炎性因子的小分子。机械负荷和白介素-β1诱导软骨细胞中Cx43半通道的打开，促进炎性反应，释放诸如前列腺素E2(PGE2)和ATP的促炎性因子。

抑制软骨细胞中Cx43半通道的打开(例如，通过化学试剂等)可抑制骨关节炎的炎症和发展。软骨细胞中的半通道打开可使用本文所述的方法进行检测。Cx43半通道释放的促炎性因子(PGE2和ATP)使用ELISA测定法测量。阻断半通道打开的药剂可用作炎性疾病诸如OA的治疗剂。

升高的白介素1β(IL-1β)是OA的诱导剂。不正常的关节负荷已知也会增加OA的风险。IL-1β的暴露导致软骨细胞释放前列腺素和NO。释放的PGE₂通过抑制蛋白聚糖的合成并诱导胶原的降解而发挥分解代谢作用。已证实，机械负荷打开Cx43半通道。Cx43充当PGE₂释放进骨细胞的入口。Cx43在软骨细胞的表面上(参见18)以及在关节软骨中表达。IL-1β和机械负荷导致软骨细胞中Cx43半通道的打开(图18)，而这种打开受半通道特异性Cx43抗体抑制。当半通道被Cx43(E2)抗体阻断时，由IL-1β诱发的炎性反应受到抑制。

基于以上证据，软骨细胞中的Cx43半通道被IL-1β或机械负荷打开，并且半通道释放的PGE₂导致OA的发展。软骨细胞中Cx43半通道的特异性阻断可用于治疗性策略以治疗由升高的IL-1β或创伤(不正常的负荷)导致的OA。

用于评价Cx43通道活性的体外细胞模型。从小鼠腿骨关节分离原代软骨细胞。可检测药剂对软骨细胞中Cx43半通道打开和间隙连接部偶合的作用，并对时间和剂量依赖性作用进行评价。例如，使用荧光黄或Alexa染料通过染料摄取测定法来评估半通道打开。通过使用ELISA测定法来检测PGE₂和ATP的释放而测量下游效应。

对于脊柱损伤，局部炎症和肿胀通常由局部损伤、创伤或感染导致，而这些事件也可以是全身炎症的致因。炎症的特征通常在于增加的发红、肿胀、体温、疼痛，以及在受累区域中的一些功能丧失。在某些方面，抑制半通道打开的药剂可用于缓解与中枢神经系统炎症和/或脊髓损伤相关的炎症。

伤口愈合代表了另一个重要的健康问题，并且采用复杂的生物过程而不论原因如何。一般来讲，在相关炎性反应过程中，伤口由浸润细胞和体液清洗。该初始炎症阶段之后是增生阶段，其中不同的细胞类型提供伤口愈合或被适当的细胞(诸如成纤维细胞、角质形成细胞以及许多其它细胞)填入所必需的因子和组织环境。随着上皮细胞逐渐填入伤口，诸如血管生成和伤口收缩的另外事件也在发生。该阶段往往持续约7-10天，具体取决于伤口的严重性和炎症阶段的效率。诸如更大的年龄、免疫缺陷以及压力等情况和其它环节因素可影响伤口愈合。伤口的长期暴露导致增加的感染可能性、不良炎症作用以及结疤和可能的慢性伤口。一般来讲，伤口愈合过程以成熟和重塑阶段而结束。胶原得以更换、重塑和交联，从而增加新产生的组织的强度，并且非必需血管、细胞和组织从伤口部位缓慢移除。随着身体倾向于最终愈合阶段，该最终阶段可持续数年。

伤口的治疗通常涉及应用抗生素以及防护外部环境的药剂，诸如绷带、缝线、第二皮肤、密封剂或其它霜剂和药膏。另外，许多化合物也可用于在伤口愈合的早期治疗炎症，通常与甾体类抗炎化合物或药物相结合。本文所述的或通过本文所述的方法鉴定的药剂可用于调节与伤口愈合相关的炎症过程。

III.抗体

本发明的某些方面涉及正或负调节半通道功能的抗体。鉴定和分离单克隆抗体的实例在下文描述。

如本文所用的术语“CDR”是指抗体可变结构域的互补决定区。CDR中所包括的残基的系统性鉴定已由Kabat等(1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,United States Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda)开发。可变轻链(VL)CDR在本文定义为包括位置27-32(CDR1)、50-56(CDR2)和91-97(CDR3)处的残基。可变重链(VH)CDR在本文定义为包括位置27-33(CDR1)、52-56(CDR2)和95-102(CDR3)处的残基。

如本领域的技术人员将认识到，本文所公开的CDR还可以包括变体。一般来讲，各个变体CDR之间的氨基酸同一性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。因此，“变体CDR”是与本发明的亲本CDR具有指定的同一性的CDR并且共有生物功能，包括但不限于至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的亲本CDR的特异性和/活性。

尽管要预先确定用于引入氨基酸序列变异的位点或区域，但是突变本身不需要预先确定。例如，为了优化突变在给定位点的性能，可以在靶密码子或靶区域处实施随机诱变，并针对所需活性的最佳组合，筛选表达的抗原结合蛋白CDR变体。在具有已知序列的DNA中的预定位点处产生置换突变的技术是熟知的，例如，M13引物诱变和PCR诱变。使用如本文所述的抗原结合蛋白活性测定法进行突变体的筛选。

氨基酸置换一般是单个残基；插入通常将在约一个(1)至约二十个(20)氨基酸残基的级别上，但也可以容许明显更大的插入。缺失的范围为约一个(1)至约二十个(20)氨基酸残基，但在一些情况下缺失可以大得多。

置换、缺失、插入或其任意组合可以用来获得最终的衍生物或变体。一般来讲，在少许氨基酸上进行这些改变，以便使分子的改变(特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性)最小化。然而，在某些情况下可以容许较大的改变。

如本文所用的“Fab”或“Fab区域”意指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指分离情况下的这种区域，或在全长抗体、抗体片段或Fab融合蛋白或如本文概述的任何其它抗体实施方案的情境下的这种区域。

如本文所用的“Fv”或“Fv片段”或“Fv区域”意指包含单一抗体的VL和VH结构域的多肽。

如本文所用的“骨架”意指抗体可变结构域的不包括定义为CDR的那些区域的区域。每个抗体可变结构域骨架可以进一步再划分成由CDR分隔的连续区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留与抗原(例如，半通道)特异性结合的能力的一种或多种抗体片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括，(i)Fab片段，一种由VL/VK、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)实质上是带有部分铰链区的Fab的Fab'片段(参见FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul编著，第3版，1993)；(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341:544-546)；(vii)分离的互补决定区(CDR)；和(viii)纳米抗体，一种含有单个可变结构域和两个恒定域的重链可变区。

术语“特异性结合”(“或免疫特异性结合”)无意表示抗体专有地结合其预期靶标。相反，如果抗体与其预期靶标的亲和力比其与非靶标分子的亲和力高大约5倍，则抗体“特异性结合”。适宜地，不存在与不希望的物质的明显的交叉反应或交叉结合。抗体与靶标分子的亲和力将比其与非靶标分子的亲和力高至少约5倍，诸如10倍，诸如25倍，尤其是50倍，特别是100倍或更高。在一些实施方案中，抗体或其它结合剂与抗原之间的特异性结合意指至少10⁶M^-1的结合亲和力。抗体可例如以至少约10⁷M^-1，诸如介于约10⁸M^-1至约10⁹M^-1、约10⁹M^-1至约10¹⁰M^-1或约10¹⁰M^-1至约10¹¹M^-1的亲和力进行结合。抗体可例如以50nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、100pM或更小或更优选地10pM或更小的EC₅₀进行结合。

小鼠mAb纯化方案。蛋白G而非蛋白A是选择用来纯化小鼠IgG的柱，因为小鼠IgG1与蛋白G的结合好得多。15天后收集无胎牛血清的得自杂交瘤培养物的上清液以便产生IgG。

在实验中，使用了GammaBind Plus^TM琼脂糖快速流动柱。对柱子进行清洗，然后用结合缓冲液平衡。这些步骤的每一个使用约30ml缓冲溶液。然后将具有结合缓冲液的稀释杂交瘤上清液上样到柱子中。收集1.5ml级分(洗脱液)。将150μl 1M Tris缓冲液(pH 8)用于中和pH。将柱子用结合缓冲液(30-50ml)再平衡。最后，添加20μl叠氮化钠以便储存。柱结合能力为18mg/ml小鼠IgG。使用1ml/min的流量。将50mM磷酸钠缓冲盐水(pH 7)用作结合缓冲液，并将0.1M甘氨酸(pH 2.7)用作洗脱缓冲液。将上清液与结合缓冲液按1:1混合。

在某些实施方案中，将小鼠单克隆抗体(M1)用于研究形成间隙连接部或/和半通道的连接蛋白Cx43的功能，其中单克隆抗体的重链具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，而单克隆抗体M1的轻链具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，将小鼠单克隆抗体(M2)用于研究形成间隙连接部或/和半通道的连接蛋白Cx43的功能，其中单克隆抗体的重链具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，而单克隆抗体的轻链具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，将小鼠单克隆抗体(M7)用于研究形成间隙连接部或/和半通道的连接蛋白Cx43的功能，其中单克隆抗体的重链具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，而单克隆抗体的轻链具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

免疫印迹。将MLO-Y4细胞以3x10⁵个接种到60mm平皿中维持48h。在裂解缓冲液(5mM Tris，5mM EDTA，5mM EGTA+蛋白酶抑制剂，20μl/ml苯甲基磺酰氟(PMSF)，20μl/ml N-乙基马来酰亚胺，10μl/ml NaVO₄和10μl/ml亮肽素)中收集小鼠心脏组织，匀化并以100,000xg在4℃下离心30分钟然后重悬在裂解缓冲液中。将粗制膜蛋白通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到硝酸纤维素膜，用识别Cx43的C端的抗Cx43CT(1:300稀释)或识别Cx43的第二胞外环的抗Cx43 E2(1:500稀释)或抗Cx43的第二胞外环的单克隆抗体(1:100稀释)印迹。通过Odyssey红外检测系统(LI-COR,Lincoln,NE,USA)检测二抗即红外800抗兔IgG(1:15000)(LI-COR,Lincoln,NE,USA)的荧光。

免疫荧光：将MLO-Y4细胞在胶原包被的盖玻片上培养。将细胞用PBS漂洗2次，并用70％冷乙醇在-20℃温育20分钟。使用PFA破坏表位，该表位富含赖氨酸，因此不予推荐。然后，将细胞用PBS漂洗两次以便移除乙醇。之后，将细胞用阻断溶液(2％山羊血清、2％鱼皮明胶和1％牛血清白蛋白的PBS溶液)阻断过夜。然后，将细胞用PBS中不同浓度的单克隆抗体标记，再用FITC缀合的山羊抗小鼠抗体和WGA-alexa594(Invitrogen)(分别在阻断溶液中以1:400和1:1500稀释)标记。通过Olympus BH-2荧光显微镜观察细胞，并通过NIH Image J软件对图像进行离线处理。

半通道活性的染料摄取。使用快照照片评价了染料摄取测量结果。将MLO-Y4细胞铺板到胶原包被的35mm平皿上，并用以下记录培养基温育：不含HCO₃^–的盐水培养基，用10mM以下HEPES盐组合物缓冲(单位mM)：154NaCl、5.4KCl、1.8CaCl₂、1.0MgCl₂、5葡萄糖。向具有低浓度二价阳离子的培养基(低[X²])添加0.5mM EGTA但不添加CaCl₂和MgCl₂。记录培养基或低[X²]含有50μM EtBr用于快照记录。将细胞暴露于100μM EtBr 5分钟，然后用PBS漂洗3次，再用2％甲酰胺固定。在具有若丹明滤光片的倒置显微镜(Carl Zeiss)中，通过10倍干物镜获取荧光场的至少3张显微照片。通过image J软件离线分析图像。测量30个随机细胞的像素密度的平均值。

间隙连接部的染料偶合测定。将MLO-Y4细胞铺板到胶原包被的35mm平皿上，并用记录培养基(不含HCO₃^–的αMEM培养基，用10mM HEPES缓冲)温育。在37℃下通过alexafluor 350(Invitrogen,Eugene,Oregon,USA)(10mM的PBS溶液)使用均得自Eppendorf(Eppendorf)的显微操纵器InjectMan NI 2和Femtojet进行细胞的显微注射。在alexafluor 350注射后2分钟测量染料转移。对发生染料转移的细胞数计数，从而记录染料偶合指数。在配备氙弧灯照明和Nikon eclipse(Nikon,Japan)(激发波长330-380nm，发射波长高于420nm)的倒置显微镜下观察染料偶合。

间隙连接部的细胞降落染料转移测定。使MLO-Y4细胞在12孔板中生长到汇合。将供体细胞用5μM钙黄绿素红-橙-AM(790Da)和5μM俄勒冈绿488BAPTA-2-AM(1752Da)在37℃温育40分钟。间隙连接部分子间通讯可通过用可渗透间隙连接部的示踪剂染料钙黄绿素红-橙和不可渗透间隙连接通道的俄勒冈绿488BAPTA-2同时标记细胞而跟踪。通过胰蛋白酶消化从板移除预加载的供体细胞。使预加载的细胞在以1:4供体与受体比率培养的未标记受体细胞的顶部分层(“降落”)。使细胞贴壁1小时的时间段，然后小心洗涤3次，在新鲜的2％PFA中在室温下固定10分钟，然后再漂洗3次。通过荧光显微镜检查细胞。对于钙黄绿素红-橙转移，调整阈值以清楚区分染料转移边界。染料转移阳性标准是检测钙黄绿素红-橙/俄勒冈绿488BAPTA-2，其中接触的细胞呈钙黄绿素红-橙阳性和俄勒冈绿488BAPTA-2阴性。染料转移几乎不可检测(<1％)。在我们发现俄勒冈绿488BAPTA-2绿阳性细胞的地方获取图像。

流体流动剪切应力打开半通道。通过限定厚度的垫圈隔开的平行板流动小室以重力驱动的流体流使用蠕动泵形成流体流。垫圈厚度决定通道高度，将其与流量一起调整以产生16达因/cm²的应力水平。循环培养基为10mM HEPES缓冲的α-MEM。

将所提供的实施例以及附图包括在内以阐述本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应当认识到，实施例或附图中所公开的技术代表了本发明人发现的在本发明的实践中能很好发挥作用的技术，并因此可被视为构成本发明的优选实践模式。然而，根据本公开，本领域的技术人员还将认识到，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行多种修改，并仍得到相同或相似的结果。

IV.药物组合物

某些方面包括组合物，例如药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的单克隆抗体或其抗原结合部分中的一种或组合。此类组合物可包含本文所述的(例如，两种或更多种不同的)抗体或免疫缀合物中的一种或组合。例如，本发明的药物组合物可包含结合到靶抗原上的不同表位或具有互补活性的抗体的组合。

本发明的药物组合物还可以作为联合疗法而施用，即，与其它药剂联合。例如，联合疗法可包括与至少一种其它抗癌剂联合的抗半通道抗体。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣料、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下或肠胃外施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用途径，可将活性化合物(即，抗体或免疫缀合物)用材料包衣以避免化合物受到可使化合物失活的酸和其它自然条件的作用。

可用于本发明的药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油，诸如橄榄油，和注射用有机酯，诸如油酸乙酯。可例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、通过维持所需的粒度(就分散体而言)以及通过使用表面活性剂而维持适当的流动性。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。将这种介质和试剂用于药学活性物质是本领域已知的。除非任何常规的介质或试剂与活性化合物不相容，否则均设想了其在本发明的药物组合物中的用途。补充性活性化合物也可掺入组合物中。

治疗性组合物通常必须为无菌的且在制造和储存条件下稳定。组合物可配制成溶液、微乳液、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣料(诸如卵磷脂)、通过维持所需的粒度(就分散体而言)以及通过使用表面活性剂而维持适当的流动性。在许多情况下，将优选的是，在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。注射用组合物的延迟吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶而实现。

无菌注射用溶液可通过以下方式制备：将活性化合物按所需的量与上文列举的成分中的一种或组合一起掺入合适的溶剂中，然后进行除菌微滤。一般来讲，分散体通过以下方式制备：将活性化合物掺入无菌媒介物中，该媒介物含有基础分散介质和来自上文列举的那些成分的所需其它成分。就用于制备无菌注射用溶液的无菌粉末而言，优选的制备方式是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从之前无菌过滤的溶液产生活性成分与任何另外的所需成分的粉末。

可与载体材料结合以产生单剂量形式的活性成分的量将根据进行治疗的受试者和特定的施用模式而变化。可与载体材料结合以产生单剂量形式的活性成分的量一般将为产生治疗效果的组合物的量。一般来讲，在100％之中，该量将为约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％的活性成分与药学上可接受的载体结合。

对剂量方案进行调整以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次大剂量，可随着时间施用多个分剂量，或成比例降低或增加剂量，如治疗情形的紧急性所指示。尤其有利的是，以剂量单位形式配制肠胃外组合物，以便于施用和实现剂量均匀性。如本文所用的剂量单位形式是指适合用作待治疗的受试者的单一剂量的物理分散单元；每个单元包含预定量的经计算可产生所需治疗效果的活性化合物连同所需的药物载体。本发明的剂量单位形式规格受控于并直接取决于(a)活性化合物的独特特性和要实现的特定治疗效果，以及(b)配混这种用于治疗个体敏感性的活性化合物领域中固有的限制。

对于抗体的施用，剂量在从约0.0001至100mg/kg、更通常0.01至5mg/kg宿主体重的范围内。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案采用每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、一个月施用一次、每3个月施用一次或每3至6个月施用一次。本发明的抗半通道抗体的优选剂量方案包括经由静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中抗体使用以下给药计划给予：(i)每四周一次持续六个剂量，然后每三个月一次；(ii)每三周一次；(iii)每三周一次3mg/kg体重，然后1mg/kg体重。

在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在这种情况下，所施用的每种抗体的剂量落在指定的范围内。抗体通常多次施用。单个剂量之间的间隔可例如为每周、每个月、每三个月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者体内针对靶抗原的抗体的血液水平所指明。在一些方法中，调整剂量以实现约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度并在一些方法中实现约25-300μg/ml的血浆抗体浓度。

本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，以便获得这样的活性成分量，其对于特定患者、组合物和施用模式而言达到所需的治疗反应，而对患者无毒。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明的特定组合物的活性，施用途径，施用时间，所采用的特定化合物的排泄率，治疗持续时间，与所采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和先前医疗史，以及医学领域中熟知的类似因素。

“治疗有效剂量”的抗半通道抗体导致疾病症状的严重性减轻、无疾病症状期的频率和持续时间增加或预防因疾病困扰所导致的损伤或残疾。治疗有效量的治疗化合物或抗体可减少受试者体内的肿瘤转移或以其它方式缓解症状。本领域的普通技术人员将能够基于诸如受试者的大小、受试者症状的严重性和所选的特定组合物或施用途径等因素来确定这种量。

本发明的组合物可使用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种施用途径进行施用。如技术人员将会认识到，施用途径和/或模式将根据所需的结果而变化。本发明的抗体的优选施用途径包括静脉内、肌内、真皮内、腹膜内、皮下或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指肠道和局部施用之外的施用模式(通常通过注射施用)并包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内注射和输注。