本发明大体涉及生物分析、以及检测和筛选方法。特别地，在替代的实施方式中，本发明利用集成采用传感器或者感测系统、适体或DNAzyme的液滴微流控系统或者乳化剂来提供高通量、多路复用的系统或方法，以用于检测生物学、生理学或病理学标志物，或者单一分子或单一细胞。在替代的实施方式中，所述传感器或感测系统包括基于核酸、基于抗体、基于酶或基于化学品的传感器或感测系统。在替代的实施方式中，本发明提供了使用集成有快速、灵敏的荧光检测系统(特别地包括3D颗粒检测器)的液滴或乳液系统来检测生物学、生理学或病理学标志物，或者单一分子或单一细胞的方法。在替代的实施方式中，本发明提供用于高通量筛选小分子和生物分子，包括适体，例如寡核苷酸和肽适体的方法，以及相关的传感器例如基于适体的传感器和疗法。
背景技术：
在基因组学、蛋白质组学，细胞组学和代谢组学中的最新进展提供了调节各种生物学过程的大型的生物和化学化合物文库。这种发展使得对以平行方式执行并分析数以百万计的生物化学的、遗传学的、药理学的测定法，来发现针对生物靶标的活性化合物的高通量分析/筛选的需求成为必要。此外，这些标志物的分析、检测、鉴定和定量对研究生物学和病理学以及开发新的诊断学和治疗学提供了强大的新手段。
许多生物和疾病标志物，诸如例如分子和细胞(诸如癌细胞)，是以低浓度存在于生物样品中，但在生物和病理过程中起重要作用。快速且选择性地检测低丰度的能力对于阐明新生物，监测、检测疾病或病症以及监测治疗反应和开发新疗法是极为重要的。
已经证明癌症、阿尔茨海默氏病(AD)以及其它疾病和病症的早期识别、筛选和监测(例如，在一个人有任何症状之前)是有效地预防、治疗并且根除所述疾病的强有力且通常是必要的步骤。遗憾的是，传统的成像工具(例如，计算机断层(CT)扫描和磁共振成像(MRI))和活检分析对于常规的疾病筛选过于复杂、价格昂贵和/或具有侵入性；最重要的是，它们通常不具有在早期阶段识别疾病的灵敏度和特异性。因此，最近的努力已集中于开发靶向存在于生物样品(例如，血液、尿液、唾液、泪液和脑脊液(CSF))中的、将疾病与正常样品区分开的特异性分子生物标志物(例如，核酸和蛋白质)和细胞标志物(例如，癌细胞)的测定法。
遗憾的是，发现疾病生物标志物并将它们翻译转换进入临床试验已被证明是一个巨大的挑战。首先，尽管在基因组技术和蛋白质组技术(例如，测序、质谱(MS)和生物信息学)方面取得了一些进展，但这些技术复杂且昂贵，极少数可靠的疾病生物标志物被发现。这些技术受限于它们固有的高错误发现率以及正常样品与患病样品之间小差异和现有患病样品中的生物标志物的大异质性的事实。已经得到广泛认可的是单一生物标志物通常缺乏用于有用诊断所必需的灵敏度和特异性。此外，即使鉴定出生物标志物，在下一阶段的执行情况和临床测定法发展也是费时、昂贵并且有时是不可行的。例如，如果想开发ELISA测定法来检测前列腺特异性抗原(PSA)作为前列腺癌的生物标志物，用于PSA的抗体必须已经存在足够的特异性和选择性。当需要多个生物标志物测定法时，这一点尤其成问题。
另一个需要灵敏、快速和高通量的生物标记物鉴定和检测的重要领域是由病原体(例如，诸如结核分枝杆菌(TB)之类的细菌、病毒(例如，HIV)以及诸如疟疾之类的寄生虫)导致的感染。例如，细菌感染是主要健康问题并且是败血症的主要原因，每年影响全世界超过1800万人和影响美国超过700,000人，死亡率30-40％。败血症和其它侵袭性细菌感染在相关的高费用重症监护病房内进行管理，这强加了显著的医疗、经济和社会负担。例如，在美国，每个败血症患者在住院期间产生大约US$25,000的费用，相当于每年$170亿。特别地，抗微生物抗性在美国和世界各地都是日益增长的健康问题。根据疾病预防控制中心(CDC)，每年超过200万人感染上抗生素抗性的感染，导致超过23,000人死亡1。与抗微生物抗性相关的侵袭性细菌感染通常在相关的高费用重症监护病房(ICU)内进行管理，这强加了显著的医疗、经济和社会负担。慎用抗生素联盟(APUA)估计，每年抗生素抗性感染耗费美国医疗系统超过$200亿。
血液感染的高死亡率与细菌诊断和治疗的无效性和耗时过程相关联。人们普遍认识到，对患者体内的感染细菌进行有效检测和常规监测以在早期阶段诊断疾病对于存活率具有深远的影响。遗憾的是，血液培养，用于血液中细菌鉴定的黄金准则，需要花费数天才能得到结果。新的分子诊断方法(诸如聚合酶链式反应(PCR))可以将测定时间降至数小时，但通常对于血液中低浓度细菌(1-100个菌落形成单位(CFU)/mL)的检测不够敏感。重要的是，基于PCR的方法需要样品处理，诸如核酸的裂解和分离，以用于扩增反应。此外，所有这些技术是复杂且昂贵的，因此不适合于患者体内细菌的常规监测。因此，迫切需要用于快速且灵敏地鉴定血液中细菌的简单方法，这将显著降低与血液感染相关的死亡率和医疗费用。
近来出现了微流控系统作为针对生物和化学应用中执行多种多样的实验的有应用前景的平台。相对于传统的高通量筛选方法，基于微流控的方法具有几个优点。这些包括可忽略不计的试剂蒸发、昂贵生物试剂的最小消耗、低制造成本、减少的分析时间以及在单一芯片上集成各种功能性部件的能力。
特别地，基于微滴的微流控系统的发展为高通量生物分析提出了有前景的机会。在这些系统中，可以以千赫兹的频率产生含有纳升至皮升体积的微滴并且每个微滴用作反应的“试管”。因为每个液滴的体积小，可使用比传统的生物方法(诸如基于96微孔板的酶联免疫吸附测定(ELISA))的量少109倍的量来执行生物分子之间的反应，诸如蛋白质-蛋白质相互作用或DNA杂交和细胞-药物或细胞-细胞相互作用。此外，靶标(例如细胞)及其周围环境的液滴限制成小体积允许分析分泌性标志物，并利用它们作为单细胞检测和分选的“标志物”。与此相反，现有技术(例如ELISA)通常测量大体积的分泌蛋白，因此会错过单细胞水平的关键动态信息。对于细胞分选，荧光激活细胞分选(FACS)通常依赖于细胞表面和细胞内标志物，而不是分泌标志物。此外，相较于连续的微流控系统，基于液滴的微流控系统具有额外的优点，诸如减少试剂与通道壁的相互作用以及通过划分区室来抑制样品的分散。此外，它允许在短时间内对每个液滴的独立控制，包括液滴产生、聚结、分选、孵育和分析。
技术实现要素：
在替代的实施方式中，本发明提供用于检测、鉴定和/或定量靶标；靶标分子；病毒；生物学、生理学或病理学标志物；单一分子；或单一细胞或细胞源性颗粒(例如，单一的病原体、寄生虫、细菌细胞、病毒或真菌)的高通量、多路复用系统或装置或方法；所述系统或装置或方法使用液滴或基于乳液的微流控系统、3D颗粒检测器和/或3D颗粒计数系统，并集成使用测定法、传感器或感测系统，包括使用：小分子、生物分子、适体、DNA酶、核酸、蛋白质、肽、酶、抗体或化学或小分子，所述系统或装置或方法包括：
(a)提供能够特异性结合或者直接地或间接地检测靶标、靶标分子、核酸、蛋白质、肽、病毒(例如，诸如HIV的慢病毒，或者埃博拉病毒性疾病(EVD))、细胞源性颗粒或细胞的测定法、传感器、检测或感测系统，其中可选地所述细胞为细菌细胞(可选地为生长缓慢的生物体例如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis))、寄生虫细胞或真菌细胞，或者可选地所述细胞为哺乳动物细胞或人细胞；
其中可选地，所述测定法、传感器、检测或感测系统包括或包括采用：适体、DNAzyme(也称作脱氧核糖酶、DNA酶或者催化DNA)、核酸、蛋白质、肽、酶、抗体、或者化学品或小分子、单一核酸分子扩增，所述单一核酸分子扩增可选地包括指数扩增反应(EXPAR)、滚环扩增(RCA)、适体抑制剂-DNA-酶(IDE)或者适体-IDE系统，
并且可选地，所述靶标包括扩增的靶标，所述扩增的靶标可选地为利用滚环扩增(RCA)或者EXPAR所扩增的核酸靶标，
其中通过所述测定法、传感器、检测或者感测系统的特异性结合或者直接地或间接地检测所述靶标分子、病毒、细胞源性颗粒或者细胞导致或者产生可检测信号，所述信号可选地包括荧光团信号或者荧光，
其中可选地，核酸、适体、适体-IDE系统或者DNAzyme包括能够在单核苷酸连接处切割DNA-RNA嵌合底物的RNA-切割DNA模序，并且核苷酸切割位点的侧翼是荧光团和淬火剂，且可选地，所述核酸、适体或者DNAzyme与它的靶标分子、病毒、细胞源性颗粒或细胞的结合造成核苷酸切割位点的切割，以从荧光团或者荧光活化剂中释放淬灭剂，其中所述荧光活化剂可选地包括酶，所述酶在活化形式时能够产生可检测信号，例如荧光团信号，
并且可选地，所述传感器或者感测系统、适体、DNAzyme、适体抑制剂-DNA-酶(IDE)分子复合物(也被称作适体-IDE系统)(可选地包括如图47阐述的结构，其中当IDE分子复合物中的酶在活化(例如未在抑制剂的影响下)，未被抑制时，能够产生例如荧光信号的可检测信号，并且当IDE分子复合物没有结合到靶标时，所述IDE分子复合物中的酶被IDE分子复合物抑制剂抑制，并且当IDE分子复合物的适体结合于它的靶标时，所述IDE分子复合物抑制剂从所述酶释放、去除或者解除，进而触发酶的活化以及触发诸如荧光信号的可检测信号的产生，
并且可选地，所述测定法、传感器、检测或者感测系统包括基于核酸、基于抗体、基于蛋白质、基于肽、基于酶或者基于化学品的或小分子的测定法、传感器、检测或者感测系统，或者它们的任意组合，
其中可选地，所述测定法、传感器、检测或者感测系统对于靶标的特异性结合触发基于扩增或者非扩增的荧光信号，
并且可选地，所述靶标分子(可选地为纯化的或者复合物靶标)能够从核酸、肽或者化学文库中筛选、选择和/或分离，
并且可选地，所述靶标分子包括核酸或者多肽，可选地所述多肽为用于疾病或病症的诊断，或者为细胞表面标志物，或者是酶，其中可选地，所述酶是用于特定疾病检测的标志物或者是标志物，可选地，所述酶为β-内酰胺酶，例如碳青霉烯酶，可选地，用于检测产生超光谱β-内酰胺酶(ESBL)的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和碳青霉烯抗性的肠杆菌科(CRE)、TB以及其它抗微生物抗性病原体，
并且可选地，所述靶标分子、病毒、细胞源性颗粒或者细胞或者细菌、寄生虫或真菌，包括一种或多种生物学、生理学或者病理学标志物，或者包括单一或多个分子，或者单一或多个细胞，或者单一或多个病毒，或者细胞源性颗粒或分子；
(b)可选地提供多个液滴或微滴或者乳液，
其中可选地，液滴或微滴或者乳液是利用液滴微流控系统或者微滴操作测定法或装置，或乳化剂，或者等同装置或者系统产生，
并且可选地，液滴大小范围可以为直径大约5到50μm，大约1μm到300μm或者大约10μm到100μm之间，
并且可选地，提供标签或者染色，其中可选地靶标或者扩增的靶标被染色或者标记，可选地，采用染料、纳米颗粒、珠子或者等同物或它们的组合，
并且可选地，提供多个颗粒或者纳米颗粒，其中所述靶标由颗粒或纳米颗粒组成，包含颗粒或纳米颗粒或者包含于颗粒或纳米颗粒中；
(c)提供样品，其中可选地，所述样品包含或者源自于生物或者环境样品，
并且可选地，所述样品包含所述靶标，或者被怀疑含有待被检测的靶标，
并且可选地，所述靶标为或者包含靶标分子、核酸、蛋白质、肽、病毒、细胞源性颗粒或细胞，其中可选地，所述细胞为细菌细胞、寄生虫细胞或者真菌细胞，或者可选地，所述细胞为哺乳动物细胞或者人类细胞；
(d)可选地胶囊封装或者微胶囊封装所述样品(包含靶标或者由靶标组成)，可选地与所述测定法、传感器、检测或者感测系统一起，
并且可选地，将靶标或者样品与多个颗粒或者纳米颗粒联合、包装或者结合，或者将靶标或者样品联合、包装或者结合到多个颗粒或者纳米颗粒中，
其中可选地，所述胶囊封装或者微胶囊封装包括胶囊封装或者微胶囊封装入多个液滴或微滴，或者乳液，
并且可选地，所述靶标检测或者感测系统包括适体-IDE系统，并且可选地，当适体-IDE系统包含采用能够产生可检测信号(例如荧光信号)的酶，或者酶组合时，通过与可检测信号相互作用或处理该可检测信号，所述胶囊封装或者微胶囊封装进一步包括胶囊封装或微胶囊封装底物或者被所述酶活化的可检测信号，
并且可选地，加工或制作所述胶囊封装的或微胶囊封装的样品或者靶标，或者加工或制作包含所述胶囊封装或者微胶囊封装的样品的液滴或微滴或者乳液，包括采用液滴微流控系统或者微滴操作装置，或者高通量液滴发生器，可选地为256通道盒系统，或者乳化器，
并且可选地，标记或者染色所述靶标或者扩增的靶标，可选地采用染料、纳米颗粒、珠子或者同等物或者它们的组合；以及
(e)检测可检测信号的存在，所述可检测信号可选地包括荧光团信号或荧光，或者染料、纳米颗粒、珠子或者同等物或者它们的组合，
其中可选地，所述检测、鉴定和/或定量可检测信号的存在是在每个胶囊封装的或者微胶囊封装的样品中，或者在每个液滴或微滴，或者乳液中，或者是在每个颗粒或者纳米颗粒中，
并且可选地所述检测可检测信号的存在检测、鉴定和/或定量所述靶标分子、病毒、细胞源性颗粒或细胞，其中可选地，所述细胞为哺乳动物细胞、人细胞、细菌细胞、寄生虫细胞、真菌细胞，
其中所述荧光团信号或者荧光信号的检测指示在所述样品中所述靶标分子、病毒、细胞源性颗粒、细胞、寄生虫、真菌或者哺乳动物或者人细胞的存在，所述荧光团信号或者荧光信号可选地在胶囊封装的或者微胶囊封装的样品中，或者在液滴或微滴，或者乳液中，或者在每个颗粒或者纳米颗粒中，
并且可选地所述检测和/或定量所述靶标分子、病毒或者细胞源性颗粒或者细胞包括采用3D颗粒检测器或者3D颗粒计数系统。
在替代的实施方式中，检测的靶标被胶囊封装(或微胶囊封装)入液滴或微滴或乳液中，或者关联或关联入颗粒或纳米颗粒，或者可选地，所述靶标(所述靶标可以是，例如，除液滴或微滴外，珠子、纳米颗粒、扩增的核酸、抑制剂-DNA酶(IDE)分子复合物，及等同物)通过3D颗粒检测器，3D颗粒计数系统或等同系统直接检测和/或计数；例如如图8所示。
在替代的实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞、人细胞、循环肿瘤细胞、循环黑色素瘤细胞或者细菌细胞。
在替代的实施方式中，所述液滴微流控系统，或乳化剂，能够产生：(a)皮升液滴或者直径在大约1μm到300μm或者大约10μm到100μm之间的液滴；和/或(b)在不混溶的载体油液中的单分散的，皮升大小的液体液滴。
在替代的实施方式中，所述生物样品包括来自于患者的活组织检查、血液、血清、唾液、泪液、尿液或CSF样品，或者获自食物、水、土壤或者空气源的样品。
在替代的实施方式中，检测的靶标分子是或者包含核酸、核酸点突变，或者单核苷酸多态性(SNP)，microRNA(miRNA)或者小干扰RNA(siRNA)，或者所述靶标分子为蛋白质、脂质、碳水化合物、多糖、小分子或者金属络合物。
在替代的实施方式中，所述靶标分子是或者包含多肽或者核酸、多肽或核酸点突变、或者单核苷酸多态性(SNP)、细胞标志物(特定细胞类型，基因型或者表现型特异性的或者识别特定细胞类型，基因型或者表现型的标志物)；或者核酸疾病(例如，糖尿病、阿尔茨海默氏病等)或者癌标志物，可选地为乳腺癌生物标志物，
并且可选地，所述靶标分子的检测是对疾病(例如糖尿病、阿尔茨海默氏病等)或者癌症(例如前列腺癌、黑色素瘤、乳腺癌，可选地所述靶标为前列腺特异性抗原(PSA))的诊断，或者用于常规疾病或者癌症筛选，早期疾病或者癌症诊断和/或预后，用于监控疾病或者癌症的发展和/或复发，和/或用于监控药物有效性和安全性。
在替代的实施方式中，所述荧光团包括荧光素-dT并且所述淬灭剂为DABCYL-dTTM(Dabcyl-dT)；和/或荧光共振能量转移(FRET)染料对；和/或靶标结合染料。
在替代地实施方式中，所述荧光通过APD(雪崩光子二极管)，PMT(光电倍增管)，EMCCD(电子倍增电荷耦合器)或者MCP(微通道板)或者其它等同检测器进行检测，可选地以高通量方式。
在替代的实施方式中，所述适体为寡核苷酸、核酸或者肽适体；或者，所述适体：特异性调控干细胞分化为特定谱系，或者为直接偶联于下游信号通路。
在替代的实施方式中，所述适体作为激动剂或拮抗剂结合于靶标，或者作为传感器打开荧光信号。
在替代的实施方式中，所述传感器包括包括DNA链置换策略，或等同形式，如在Lietal.(2013)J.Am.Chem.Soc.2013,135,2443-2446中所描述的；或者邻位连接测定法，或者结合诱导DNA组装测定法，如在Lietal.(2012)Angew.Chem.,Int.Ed.51,9317；orZhang(2012)Anal.Chem.84:877中所描述的。
在替代的实施方式中，所述传感器包括结合靶标以产生荧光的荧光底物或者探针，或者等同物。
在替代的实施方式中，本发明的高通量、多路复用系统或装置，或方法进一步包括检测和/或定量所述靶标，例如一个或者多个生物学、生理学或病理学标志物，或者单一分子(如靶标)，或单一细胞整合，包括采用3D颗粒检测器、3D颗粒计数系统或等同系统。在替代的实施方式中，检测的靶标被胶囊封装(或微胶囊封装)入液滴或微滴或乳液，或者关联或关联入颗粒或纳米颗粒，或者可选地，所述靶标通过所述3D颗粒检测器、3D颗粒计数系统或等同系统直接检测和/或计数。在替代的实施方式中，本发明的高通量、多路复用的系统或装置或方法包括采用DNA珠或DNA珠液滴文库或基于FACS的分子筛选，所述分子结合于目的靶标，例如，疾病或癌细胞，或者疾病或细胞标志物，例如，核酸或者多肽例如膜标志物。
在替代的实施方式中，高通量、多路复用的系统被设计为包括以下中的一种或者任一种：理想的便携性(例如包装为背包)，自动化流体处理(即液滴生成和自动取样)，和具有3D颗粒计数系统的集成电子器件，包括二极管激光器(光源)，APD(检测器)，操作(vinci，ISSInc.)和/或数据分析软件(SimFCS)，显示器，例如，如图32、33和40所示，示出本发明示例性的便携系统设计，包括集成的微胶囊封装器和3D颗粒计数系统。
在替代的实施方式中，本发明的高通量、多路复用的系统或装置，或者方法，进一步包括一次性微流体“盒”，允许多类型靶标同时多路复用和快速检测，并且可选地，所述高通量、多路复用的系统或装置为全自动化的，或者制造为一体化系统，或者带有模块化组件，或者连接于电子装置，例如便携装置，例如智能手机和/或蓝牙，以用于及时检测(point-of-care)应用，如图32、33和40所示。
在本发明的高通量、多路复用的系统或装置，或者方法的替代的实施方式中，所述测定法、传感器或传感器系统包括：基于核酸的测定法；基于抗体的测定法；基于酶的测定法；基于化学的测定法；基于核酸的测定法；杂交；分子信标；适体；DNAzyme；实时荧光传感器；基于抗体的测定法；ELISA；基于夹心的测定法；免疫染色测定法；抗体捕获测定法；第二抗体扩增测定法；基于邻近连接的测定法；包括采用PCR、RT-PCR、RCA、环介导等温扩增技术(LAMP)、切口(nicking)、链置换和/或指数等温扩增的基于酶的测定法；或它们的任意组合，
其中可选地，所述的高通量、多路复用的系统、装置或者方法未采用液滴而检测低浓度靶标，
并且可选地，采用信号扩增过程，可选地采用滚环扩增反应(RCA)检测核酸靶标，然后采用染色探针或者纳米颗粒染色及测量，可选地采用3D颗粒计数器。
在本发明的高通量、多路复用的系统或装置，或者方法的替代的实施方式中，所述胶囊封装或者微胶囊封装乳液或液滴通过利用乳化剂或者基于液滴的微流控来制作；或者所述乳液或液滴包含油包水制剂，或者所述液滴包括水包油包水(W/O/W)双乳液制剂，或者所述乳液或液滴包括液体液滴，可选地包括琼脂糖或者PEG，或者可选地，所述液滴能够凝胶化或凝固形成液滴颗粒；
并且可选地液滴包括大小范围在大约10nm到100微米，可选地液滴为单分散或多分散的，并且可选地液滴被加热或者冷却(例如用于PCR)，融合，分裂，分选和/或制备用于长期储存，
并且可选地含有靶标的乳液或液滴，可选地荧光乳液或液滴，在3D颗粒计数系统中分选，可选地采用光学镊子、光学捕捉器、光学晶格、梯度离心，或者它们的任意组合或等同方式。这使得分选的靶标能够进一步被处理或者分析，
并且可选地液滴通过传统的1D片上(on-chip)或2D分析或通过3D颗粒计数器分析。
在本发明的高通量、多路复用的系统或装置，或者方法的替代的实施方式中，所述细胞源性颗粒包括胞外体、微囊泡、凋亡小体或者它们的任意组合；或者所述靶标分子包括核酸、蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、小分子或者金属离子。
在替代的实施方式中，本发明提供用于高通量检测特定靶标的、基于酶的靶标检测系统的鉴定和分离方法，包括：
(a)提供一种设计为结合于并且检测一种特定靶标或多种特定靶标的、基于酶的靶标检测系统分子文库，由为靶标设计的基于酶的靶标检测系统所检测的靶标，以及包括可检测部分的底物，
其中当所述基于酶的检测系统没有结合于它的靶标时，所述酶失活，
并且当所述基于酶的检测系统结合于它的特定靶标，所述酶被激活以作用于底物产生可检测信号，
其中可选地产生的可检测信号包括荧光信号，
并且可选地所述基于酶的检测系统为一种适体抑制剂-DNA-酶(IDE)系统分子，可选地如图47或图51A所示，
并且可选地所述基于酶的靶标检测系统为引起信号级联扩增的核酸起始子，可选地如图50所示；
(b)在不混融载体油液中胶囊封装所述样品，基于酶的检测系统和底物，以使得所述胶囊封装产生多个液滴，其中每个液滴包含多个样品，基于酶的靶标检测系统和底物，
其中可选地所述胶囊封装包括将所述样品，基于酶的靶标检测系统和底物泵过油流，并且可选地所述多个液滴为皮升大小的液滴；
(c)使在步骤(b)中产生的多个液滴通过分选器，这指导具有可检测信号的液滴进入分离通道，在所述分离通道中经分选的液滴被裂解、破裂、稀释或者与额外添加的靶标和底物以每滴(每个液滴中具有一种或者多种底物和靶标)大约1基于酶的靶标检测系统的浓度重新胶囊封装，
其中可选地所分选的液滴可选地采用光学镊子、光学捕捉器、光学捕捉器、光学晶格、梯度离心或者它们的任意组合或者等同方式裂解或破裂，
其中可选地产生的可检测信号包括荧光信号并且所述分选器为FACS，
并且可选地产生的可检测信号包括荧光信号并且所述分选器为微流控装置；以及
(d)进一步分选出具有可检测信号的液滴进入分离通道，
由此鉴定并分离用于特定靶标的高通量检测的基于酶的靶标检测系统或分子，
其中可选地基于酶的靶标检测系统或分子包括适体抑制剂-DNA-酶(IDE)系统分子并且对经分离的IDE分子测序。
在替代的实施方式中，本发明提供基于一种类型的分子/每个珠子或者一种类型的分子/每个液滴策略的药物或适体筛选和体外选择平台，其中DNA、RNA、多肽和/或肽被合成入液滴文库，包括：
提供本发明所述的高通量、多路复用的系统或装置，或者方法，和用于产生靶标或者靶标结合物的在微珠上的DNA，
其中所述在微珠上的DNA，或者DNA-珠文库用于筛选拥有功能(例如结合于靶标分子或调控分子或细胞功能)的药物或适体，并且可选地其中所述在微珠上的DNA被胶囊封装入液滴或微滴，可选地为皮升液滴，可选地为直径大约20μm，
通过PCR扩增在微珠上的DNA以产生液滴DNA文库，
转录和/或翻译所述液滴中的经扩增的DNA形成RNA和/或多肽或肽库，
可选地在同一液滴中，利用所述核酸序列对经转录的RNA的鉴定/测序，和/或经翻译的多肽或肽添加标签(barcode)，用以后续的筛选或生物标志物发现，
并且可选地利用本发明所述的高通量、多路复用的系统或装置或方法将RNA和/或多肽或肽作为靶标检测和/或定量。
在替代的实施方式中，本发明提供包括如图17、32和33所阐述的系统的集成式综合性液滴数字检测(IC3D)系统。
在替代的实施方式中，本发明提供一种包括如图1、2、14、15、17、32和33所示的集成有3D颗粒检测器的微胶囊封装液滴系统的多路复用系统。
在替代的实施方式中，本发明提供多路复用系统包括：集成的微胶囊封装器和3D颗粒计数系统，用于利用本发明方法检测、鉴定或定量靶标，并且可选地包括如图17所示的多路复用便携式系统。
本发明的一个或多个实施方式的详细内容借助于以下附图和描述来阐述。通过该描述和附图，以及从所述权利要求中，本发明的其它特征、目的和优点将会显现出来。
本文引用的所有出版物、专利、专利申请在此通过引用明确并入本文用于所有目的。
附图说明
除非另有说明，否则各附图中相似的参考符号指代相似的元件。
图1示出了本发明的示例性方法，包括集成的靶标液滴封装和感测机构(例如，基于核酸、抗体、酶或化学物质)，接着通过3D颗粒检测器进行液滴分析(例如，本发明的集成式综合液滴数字检测(IC3D)系统)，用于对低浓度靶标(例如，生物标志物，诸如细胞、生物分子、病毒、离子等)进行检测和生物分析以及生物分析。
图2示出了本发明的示例性方法，包括：
图2(a)是用于常规细菌检测和筛选的自动化便携式装置的示意图；示出的是分析液滴样品，例如，对一滴患者的血液或尿液，并在几分钟内于显示面板上显示样品中靶细菌的数目；
图2(b)是一示例性方法的示意图，其中将样品和DNAzyme传感器或多个传感器混合，然后胶囊封装在液滴中，例如，数百万的微米级液滴，并且DNAzyme传感器在含有细菌的液滴中产生瞬时信号，对其进行计数和分析；
图2(c)是示例性的高通量3D颗粒计数器系统的示意图，其允许在几分钟内精确检测毫升体积的单个荧光液滴；关于3D颗粒计数器的详细描述参见图17。
图3示出了在本发明的方法中使用的示例性液滴，所述方法包括单一细胞和单一细胞标志物的检测和分析，其中所述液滴已被胶囊封装入细胞表面内、细胞内和/或分泌性标志物中，它们通过本发明的示例性的集成的液滴胶囊封装和3D颗粒检测系统进行检测。
图4示出了在本发明的方法中使用的示例性液滴，所述方法包括细胞源性颗粒(例如，胞外体、微囊泡、凋亡小体)的检测和分析，其中所述液滴已被胶囊封装在液滴内，并且它们的标志物可通过本发明的示例性的集成的液滴胶囊封装和3D颗粒检测系统进行检测。
图5示出了在本发明的方法中使用的示例性液滴，所述方法包括细胞游离标志物的检测和分析，包括但不限于(被胶囊封装在液滴内的)核酸、蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、小分子、金属离子等，通过本发明的示例性的集成的液滴胶囊封装和3D颗粒检测系统进行检测。
图6示出了本发明利用锁式探针与切口酶反应相结合来检测液滴中的核酸突变的示例性方法；图6A示意性绘示了探针和酶输入细胞，它们掺入微滴中，随后荧光激发并检测的物理过程；和图6B示意性绘示了涉及使用所谓的“锁式探针”的分子机制，其中连接反应引起滚环扩增(RCA)，随后在切割位点产生切口。
图7示出了用于液滴中的靶标检测和分析的RCA的信号扩增的示例性方法，包括使用：图7A的DNA酶，图7B的DNA序列置换和图7B的切口酶。
图8示意性绘示了本发明的能够不使用液滴而检测低浓度靶标的系统和方法，例如使用信号扩增过程，诸如RCA，然后在3D颗粒计数器测量之前通过染料探针或纳米颗粒染色。
图9示意性绘示了本发明在3D颗粒探测器分析步骤之前，利用滚环扩增(RCA)来检测细胞和分子标志物的示例性方法：
图9A示出了利用滚环扩增(RCA)过程以及染色或检测过程来检测细胞或细胞表面标志物的例子，所述滚环扩增(RCA)过程包括例如靶标捕获、采用连接的环状DNA形成、经由RCA的DNA扩增在内的组件，所述染色或检测过程使用探针，例如包括染料或纳米颗粒；
图9B示出了利用滚环扩增过程以及染色或检测过程来检测分子靶标(例如蛋白质)的例子，所述滚环扩增过程例如包括靶标捕获、采用连接的环状DNA形成、经由RCA的DNA扩增在内的组件，所述染色或检测过程使用探针，例如包括染料或纳米颗粒。
图10示出了在本发明的方法中利用实时DNAzyme传感器选择性地且快速地检测靶标的示例性方法，所述靶标包括例如核酸、蛋白质和细胞，包括细菌细胞和哺乳动物细胞，例如如此处所示，大量的大肠杆菌靶标：
图10(a)示出了DNAzyme传感器如何与靶标反应产生荧光信号的示例性机制；通过细菌结合于失活的DNAzyme序列(红色)产生的靶标经历构象改变激活DNAzyme；被激活的DNAzyme催化荧光底物在核糖核苷结合点(R)处的切割，导致荧光团(F)和淬灭剂(Q)的分离，以产生高荧光信号；
图10(b)通过图表示出了在存在靶标大肠杆菌K12裂解物的情况下来自产生实时荧光信号的DNAzyme传感器的数据；突变序列为失活的；来自10,000个细菌的裂解物与50nMDNAzyme在HEPES缓冲液中混合入50μl终体积，且利用荧光板读数仪记录信号；结果显示为平均数±标准差(n＝3)；
图10(c)通过图表示出了来自特异性检测大肠杆菌菌株而非非靶标细菌或哺乳动物细胞人T细胞成淋巴细胞CCRF-CEM以及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的DNAzyme传感器的数据；来自10,000个细胞的裂解物与50nMDNA酶在HEPES缓冲液中混合入50μl终体积，并且孵育30min；通过PAGE分析DNAzyme反应产物；导出每个反应的切割百分比，对DNAzyme单独对照标准化，并且以“相对荧光显示”；
图10(d)通过图表示出了来自选择性检测临床大肠杆菌分离物的DNA传感器的数据；分离自11个不同患者样品的细菌(1000CFU)与100nMDNA酶和1mgml-1溶菌酶在10％血液中孵育30分钟；利用荧光板读数仪获得荧光强度，通常对DNAzyme单独对照(con)并以“相对荧光”显示；数据获自单盲实验；
在图10(c)和图10(d)中，所有的实验都执行三次；数据表示为平均数±标准差，n＝3，***P<0.001,****P<0.0001，双尾Student’st检验。
图11通过图表示出了来自示例性方法的数据，示出DNAzyme传感器在稀释的血液中是有功能且稳定的：
图11(a)通过图表示出了显示血液中DNAzyme传感器检测靶标大肠杆菌K12大量测定法的数据，所述血液通过传感器溶液以体积比9：1，1：1和1：9稀释，相当于最终血液浓度分别为90％，50％和10％；最终溶液为100μL，含有1000细菌，100nMDNAzyme传感器以及1mgml-1溶菌酶；所述测定法时间为30min并且反应通过荧光板读数仪监控；经切割的DNAzyme传感器(通过NaOH/加热)(列中第一组)和完整的DNAzyme传感器(列中第二组)作为阳性和阴性对照包括在内；在所有测试的血液浓度中，在大肠杆菌存在时，DNAzyme传感器产生可测量的荧光信号；数据显示为平均数±标准差，n＝3；这些图证实了DNAzyme传感器在被稀释为不同浓度的血液中是有功能且稳定的；
图11(b)通过图表示出了加入细菌裂解物之前在各种时间下在30％血液中孵育大肠杆菌DNAzyme传感器的活性数据；数据显示为平均数±标准差，n＝3；这些图阐明了DNAzyme传感器在被稀释为不同浓度的血液中是有功能且稳定的；
图12示出了显示DNAzyme传感器检测液滴中靶标细菌大肠杆菌的示例性方法：
图12(a)示出了代表性的显示出900s孵育时间后在所述液滴中单一Syto17染色细菌和DNAzyme传感器信号的共定位荧光图；
图12(b)示出了含有DNAzyme传感器和单一细菌的单一液滴的实时荧光监控；
图12(c)通过图表示出了在b)中的荧光图像的信号定量；
图12(d)通过图表示出了显示液滴的荧光强度直接地与液滴中细菌数量相关的数据；当液滴不包含细菌或者采用突变DNAzyme时，观察到最小荧光信号；在此图中采用10μm液滴。
图13示出了荧光显微镜图像，示出大肠杆菌DNAzyme传感器选择性检测患者血液中的靶标细菌；这同样阐明细菌能够进一步在液滴中培养并增殖以扩增信号；左、中和右排分别代表融合、亮视野和荧光：
图13(a)每个液滴包含以每液滴1,000～10,000个细菌培养患者血液；
图13(b)阐明细菌能够进一步在液滴中培养并增殖以扩增信号；在此例子液滴培养了5小时；
图13(c)在液滴中采用突变DNAzyme的阴性对照实验未产生荧光；和
图13(d)在液滴中采用没有细菌的健康供体血液的阴性对照实验未产生荧光。
图14示出了包括采用微型胶囊封装用于实施本发明的示例性装置：
图14(a)示出了示例性的基于液滴的微流控装置；这种示例性装置具有3个入口；一个用于油并且其它的两个用于样品(例如血液样品)和DNAzyme/细菌的裂解溶液；
图14(b)和图14(c)示出了代表性的显微镜图像，示出均匀的含有10％血液和采用流聚焦产生的传感器溶液的30μm液滴，比例尺，200μm，在图14(c)中血液内容物，特别是血液红细胞，在液滴中清晰可见；图14(d)示出了在试管中收集的用于3D颗粒计数器实验的液滴；
图14(e)示出了代表性的荧光显微镜图像，阐明了3小时反应后，DNAzyme传感器(250nM)“点亮”了液滴，所述液滴包含在10％血液中的单一大肠杆菌K12；图14(e)左面板：荧光和亮视野叠加；图14(e)右面板：荧光；比例尺，200μm。
图15(a)示出了用于实施本发明的示例性高通量血液微胶囊封装装置的示意图；双层微流控装置设计为集成8个液滴生成器于单一装置中；微流控装置采用聚二甲硅氧烷(PDMS)以软光刻法制造；传感器和血液样品从顶层引入并且油从底层注射入；传感器和血液在顶层的中间融合并且它们向下通过互联的孔进入底层，并且就这样形成混合或“融合”的样品；收集来自于底层(所述混合的或者融合的样品)上的流聚焦结构的液滴用于颗粒计数。
图15(b)示出了图15A描述的示例性装置的图像，放置合照的二十五美分以阐明装置的大小。
图16通过图表示出了来自本发明的示例性方法的数据，其中所述数据阐明了能够利用DNAzyme传感器和荧光液滴检测单一细菌，并且能够通过1D片上计数来计数；SYTO17(红色)染色的对照芽孢杆菌属图16(a)或者靶标大肠杆菌K12图16(b)以107个细胞每ml被刺入血液里，并与DNAzyme传感器(在此数据中最终血液内容物为10％)以单一细胞方式被胶囊封装入液滴；3小时反应之后，利用示例性共聚焦检测系统对液滴片上计数；在200光子计数之上的(红色)尖峰代表含有SYTO17染色细胞的液滴，这从对照图16(a)和靶标图16(b)细胞都能观察到；但是，只有靶标大肠杆菌K12(b)产生在背景(例如不含细胞的液滴)之上的(绿色)DNAzyme信号。在如此高的初始细胞浓度(107细胞每ml)，有时候在一个液滴当中会观察到2个细菌(例如，两个(红色)尖峰)。在这些情况下，DNAzyme信号直接与液滴中细菌数量相关联。图16(a)和图16(b)实施三次并且总共约70,000个液滴被计数。
图16(c)通过图表示出了含有0或1个大肠杆菌的代表性液滴的最大光子数。黑点代表来自每个液滴的光子数。实际数据叠加通过箱线图示出。平均值以红点示出。n＝200，****P<0.0001，双尾Student’st检验。如果高于被设置为空液滴最大光子数的阈值(虚线)，计数被认为是“阳性命中”。
图16(a)，图16(b)和图16(c)：这一系列实验揭示出这一本发明示例性的胶囊封装的DNAzyme传感器系统采用1D片上液滴计数具有零假阳性率和最小假阴性率(～0.5％)。
图17示意性示出本发明的示例性3D颗粒计数系统；如图所述，来自激光源(激光1和激光2)的激发光二向色镜(D1和D2)组合并且通过物镜(L1)聚焦于样品(S)；从相同物镜收集的并透射过二向色滤光片的发射光通过透镜(L2)聚焦到共聚焦小孔(PH)；光束通过另一个透镜(L3)朝向检测单元进一步被校准；二向色滤光片(D3)在发射束到达至于两个光电倍增管(PMT1和PMT2)之前的发射滤波器(Fem)之前，分裂发射束；来自PTMs(光电倍增管)的类似信号被在计算机上的用于数据分析的卡转换和获得。本发明的3D颗粒计数系统也在以下进一步详细介绍中描述。
图18示出了来自本发明的包含采用标准化PMTs(光电倍增管)以优化3D颗粒计数器的示例性方法的数据：30μm液滴由细菌刺入的液滴产生并用于校准PMTs；
图18(a)通过图表示出了来自多种PTM值(200-600)的荧光强度轨迹原始数据。
图18(b)上图示出了计数有多种PTM值的液滴柱状图，如表中所示。
图19示出了包含标准化RPM(每分钟转数)以优化3D颗粒计数器的示例性方法：30μm液滴由细菌刺入的液滴产生并且采用3D颗粒扫描仪计数明亮的液滴；
图19(a)通过图表示出了各种RPM中液滴计数的直方图，如表中所示；
图19(b)为模拟RPMs和颗粒计数之间关系的示意图；
图20通过图表示出了来自本发明包含用于单一细菌检测的最佳液滴大小的示例性方法的数据，并且所述数据阐明了较小液滴展示出对单一细菌检测的更高的分辨率；细菌被刺入健康血液(500细菌/ml)并且血液样品与DNAzyme被微胶囊封装；细菌刺入的血液被分别胶囊封装入10、25或者50μm液滴。
图21示出了来自本发明的示例性方法的图像，示出液滴尺寸(图中，40微米vs60微米)如何影响液滴检测信号；当液滴尺寸较小时，由于液滴中有效靶标浓度提高，荧光信号更高且产生更加迅速；靶标：提取自MDA-MB231细胞的基因组DNA，探针：针对BRAFV600E的TAQMANTM探针；在这些PCR反应中总共40个循环。
图22通过图表示出了来自本发明的示例性方法的数据，所述方法在3D颗粒计数器测量中，利用已知数量的刺入的颗粒，标准化了实际计数颗粒(如表中所示)。
图23通过图表示出了来自本发明的示例性方法的数据，所述方法包括采用3D颗粒计数系统(IC3D系统)连同标准化方法的单一细菌检测；将所产生的包含DNAzyme传感器(25nM)和刺入有细菌的10％血液的液滴(直径25μm)收集(2ml)到试管中并通过3D颗粒计数器分析：
图23(a)通过图表示出了混合有DNAzyme传感器的单独的供体血液(没有细菌)的强度，没有信号；
图23(b)通过图表示出了代表性的细菌样品检测，示出典型的获自含有单一大肠杆菌K12的液滴的尖峰荧光强度的时间轨迹。通过模式识别算法(插入框)分析时间谱以获得样品中液滴的浓度和/或亮度测量。在这一系列实验中，液滴中细菌刺入的血液与DNAzyme孵育3小时。细菌浓度为1000CFUml-1液滴溶液；
图23(c)通过图表示出了用于利用示例性3D颗粒计数器测量的血液液滴中定量细菌检测的DNAzyme反应动力学。总数为1000的细菌刺入这些样品。荧光液滴利用3D颗粒计数器每15分钟定量一次并且检测的细菌数量绘制为y轴，作为DNAzyme反应时间的函数。数据表示为平均数±标准差，n＝3；
图23(d)通过图表示出了实际计数细胞数，采用了集成式综合性液滴数字检测(IC3D)(y轴)vs.宽范围的刺入的细菌浓度(即“细菌的理论数”)(x轴：每毫升收集的液滴溶液中细菌数量)。Y＝0.95X。R2＝0.999。通过与细菌反应后的含有FITC的液滴或含有荧光的DNAzyme传感器的液滴建立标准曲线。为了精确地达到极低的细菌浓度(每ml为1-50细胞)，收集细菌并利用微注射器系统在胶囊封装之前刺入血液。在这一系列实验中，细菌刺入的血液与DNAzyme在液滴中孵育3小时。数据表示为平均数±标准差，n＝3。注意用于每ml为100、1,000和10,000细胞的小尺寸误差线。
图24通过图表示出利用本发明示例性的集成式综合性液滴数字检测(IC3D)对临床大肠杆菌分离物(利用大肠杆菌特异性探针)的选择性检测；代表性的3D颗粒计数器数据阐明了单盲实验中在11种不同细菌分离物(如图所示)中仅仅靶标大肠杆菌分离物产生典型的荧光强度尖峰。每个样品中计数细胞总数在左上角的框内示出。大肠杆菌K12刺入的血液用作阳性对照。
图25以表格形式总结了相比与被FDA批准用于细菌检测的PCR测试(例如FilmArrayTM,BioFireDiagnostics,SaltLakeCity,UT)，所述示例性IC3D系统和本发明的方法的主要性能说明。本发明的示例性IC3D提供了在单一位数制中以单一细胞灵敏度和检测异常限(LOD)在大约1.5-4小时内从1-10,000细菌/ml的宽泛浓度范围内血液中靶标细菌的绝对定量(液滴生产(＜40n)+DNAzyme传感器反应(大约45min用于“是或否”和大约3.5小时用于绝对定量)+3D颗粒计数(3-10min)+数据处理(5min)。
图26示出了利用市售荧光底物的β内酰胺酶产生菌的检测：
图26(a)通过图表示出了显示利用细胞裂解液的大量测试的数据。于PBS缓冲液中将细菌裂解液与2μM荧光底物混合入50μl最终体积并且孵育20分钟。反应混合物通过荧光板读数仪分析；
图26(b)通过图表示出了显示采用荧光显微镜和本发明的集成式综合性液滴数字检测(IC3D)系统能够在液滴中检测单一β内酰胺酶产生菌的数据。收集产生的(直径20μm)包含2.5μM荧光底物和单一细菌(分离菌1或7，如图26(a)所示)液滴到试管中并孵育。室温过夜孵育之后，液滴通过颗粒计数器(图26(b，上板))和显微镜(图26(b，下板))分析。通过模式识别算法(顶板面)分析时间谱。
图27示出了利用液滴数字PCR的BRAFV600E突变检测的图像。基因组DNA分离自图27(a)HCT116(野生型BRAF，阴性对照，缺少突变)和图27(b)COLO205细胞(具有所述BRAFV600E突变)。分离的基因组DNA胶囊封装入20μm液滴并且实施实时定量PCR以确定BRAFV600E突变。
图28阐明了采用本发明的工艺在含有血液内容物的液滴中的有效的核酸PCR扩增。PCR引物扩增靶标为56个核苷酸(nt)长的合成的DNA模板；阴性对照没有靶标。图中示出了代表性的的凝胶图像，示出在20％血液中合成的靶标DNA的检测。PCR执行30或者40个循环。阴性对照为没有靶标DNA的相同反应。
图29通过图表示出了来自本发明的采用3D颗粒检测器检测血液中细胞的示例性系统/方法的数据：
图29(a)示出了本发明采用3D颗粒扫描系统对血液中刺入的癌细胞的检测；
图29(b)示出了流式细胞术用作对照；
对于图29，使用淋巴细胞离心分离方法来分离WBC，且癌细胞(MDA-MB-231)刺入全血中；采用细胞追踪绿或者RFP标记染色细胞。
图30通过图表示出了来自采用本发明示例性IC3D检测血浆中Let-7a量的本发明示例性方法的数据：
图30(a)通过图表示出了具有获自空白(左板)，Let-7a(中间板)和Let-7b(右板)的液滴荧光强度分布的代表性的时间轨迹；只有靶标Let-7a组产生了荧光强度尖峰，这阐明了本发明的IC3D测定法的特异性；胶囊封装前在胞外体耗尽的血浆中的miRNA浓度为10fM；
图30(b)通过图表示出了利用本发明的示例性IC3D(y轴)vs.刺入的Let-7a浓度(x轴)的实际计数的Let-7a数目；误差基于三重实验；平均数±标准差；
图30(c)通过图表示出了来自血浆中Let-7aRT-qPCR检测数据(在miRNA提纯和反转录之后)；误差基于三重实验；平均数±标准差；
图30(d)通过图表示出了来自3个健康供体血浆样品和3个结肠癌患者血浆样品通过RT-PCR和本发明示例性集成式综合性液滴数字检测(IC3D)测定的Let-7a浓度定量数据；误差基于三重实验；平均数±标准差；P值<0.05(T检验)。
图31示出了采用本发明示例性系统的基于液滴微流控的单一细胞工程图，其中单一MCF7细胞与包含GFP表达载体的转染试剂采用微流控装置胶囊封装：图31(a)：阐明了胶囊封装之后，液滴稳定性在6小时后被确认的图像；图31(b)，阐明了转染进液滴之后，GFP蛋白在细胞中表达的图像(见右手边板面)。
图32通过图表示出了本发明的示例性便携系统，所述系统包括：集成的微胶囊封装器和本发明的3D颗粒计数系统；图17详细描述了3D颗粒计数器。本发明的集成式综合性液滴数字检测(IC3D)系统由远程设备连接，例如通过蓝牙与智能手机或者Ipad连接。所述远程，例如智能手机，界面因而可以用于操作所述系统，收集和分析数据，并发送和传送数据给医生、患者以及医疗服务提供者等。
图33通过图表示出了本发明的系统，所述系统包括本发明的集成式综合性液滴数字检测(IC3D)自动和集成装置和系统，其在可选实施方式中为便携式的，且可以为高通量液滴产生系统：：
图33(a)示出了来自Dolomite的能够用于实施本发明的70通道终端系统；
图33(b)示出了能够用于实施本发明的256通道系统，所述系统能够在少于15分钟内将3mL样品胶囊封装入直径30μm的液滴中；
图33(c)示出了ISSQUANTA3D颗粒检测器，其为自动、便携且多路复用的系统；
图33(d)通过图表示出了采用这种本发明示例性IC3D系统的“样品到结果”测量。
图34示出了本发明的示例性方法，其采用DNAzyme传感器体外演化进行简易癌症诊断：
图34(a)示出了本发明示例性系统，包括混合-读取，DNAzyme传感器癌症诊断的采用以及它用于常规癌症筛选、早期癌症诊断和预测、监控疾病进展和复发、以及监控药物有效性和安全性的应用：
图34(b)通过图表示出了能够用于实施本发明的DNAzyme传感器的示例性机制：它与靶标(F为荧光-dT，R为核糖核苷且Q表示dabcyl-dT)相互作用产生荧光信号：
图34(c)为能够用于实施本发明的体外选择过程的示意图：首先，将随机的DNA文库连接于底物并与正常血清孵育以从文库池中移除非特异性序列；纯化未切割的序列并应用于采用癌症血清的阳性选择；纯化被癌症血清切割的分子并利用PCR扩增；并且，在纯化之后，全体连接到底物并应用到下一轮选择。
图35描述了产生用于癌症诊断的DNAzyme传感器的示例性文库(所谓的“DzL”)和序列：DzL为其中N表示随机核苷酸的文库；FSS、DzL-FSS-LT、DzL-FP、DzL-RP1和DzL-RP2分别为底物、连接模板、正向引物、反向引物1以及反向引物2。
图36示出了为实施本发明而利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(dPAGE)监控DNAzyme演变和选择的示例性方法：
图36(a)DNAzyme演变第一轮阴性选择的dPAGE图像；
图36(b)DNAzyme演变第一轮阳性选择的dPAGE图像；框区域被去除，并且洗脱DNA用于PCR扩增；M＝标志物(通过在90C与0.25MNaOH加热已连接的文库制作)，RM＝反应混合物。
图37示出了为实施本发明而利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(dPAGE)监控DNAzyme演变和选择的示例性方法：分别为7轮阳性选择的dPAGE图像(图37(a))和11轮的图像(图37(b))；框区域被去除，并且洗脱DNA用于PCR扩增；M＝标志物(通过在90C与0.25MNaOH加热已连接的文库制作)，SB＝选择缓冲液。MNS＝混合的正常血清，MCS＝混合的癌症血清；框区域被去除，并且洗脱DNA用于PCR。
图38示出了采用体外演变获得的用于癌症诊断的一系列DNAzyme序列(LCS19-1、19-2、19-3和19-4,参见如下)的应用；这些DNAzyme序列采用PAGE测试；基于切割的底部条带的强度来证明切割性能；给定的DNAzyme的靶标或激活剂可以为蛋白质、核酸、小分子或金属离子，或者组合等：
LCS19-1:
GTCAGCCATGAGTAAGCGGGAAGCGTATAGCCTAAATGGGATGGACGTACCAACGAGGATCTGTCGTCTCACTC(SEQIDNO:7)
LCS19-2:
GTCAGCCATGAGTAAGCATCAGCAGCCCACTAGATAAGTGGAGGGAAAGTCTGTACAGATCTGTCGTCTCACTC(SEQIDNO:8)
LCS19-3:
GTCAGCCATGAGTAAGCGGGGAGCGAGTCATGAGAAAATCGCGGGGAAGCACAGGGTGATCTGTCGTCTCACTC(SEQIDNO:9)
LCS19-4:
GTCAGCCATGAGTAAGCAATTGATCGTGGAACCAGACGAATAAACCACAGGATTTAGGATCTGTCGTCTCACTC(SEQIDNO:10)
图39(a)示出了采用在微粒上的组合DNA合成来制备一种类型DNA/一个珠子的示例性方法(a)；图39B示出了采用一种类型DNA/一个珠子的方法构建DNA-珠子文库的示例性方法；可以并入包括引物结合位点和限制性位点的功能位点用于随后的PCR、测序、转录和翻译以及从珠子释放链的目的；所示“靶标”序列为SEQIDNO:11。
图40示出了本发明液滴产生、装置设计、操作和应用的示例性方法：示例性液滴操作包括例如液滴融合、分裂、孵育、重新注射、成像、分析以及分选：示例性液滴试验包括例如PCR、转录、翻译以及多种生物学和化学的反应和相互作用；示例性的基于液滴文库的筛选用于例如研究生物学相互作用、发展诊断方法和治疗方法。
图41示出了本发明采用用于筛选的DNA-珠子液滴文库的示例性方法。每个液滴包含固定有多个相同序列DNA的单一珠子。PCR可以在液滴中扩增DNA并产生游离DNA文库。珠子能够自我去除和/或使用以用于靶标结合和分选。液滴可以分配到微孔芯片用于进一步处理包括纯化、靶标结合、反应、筛选、测序和转移到芯片以制造核酸或蛋白阵列。
图42示出了本发明的示例性方法，其利用用于从患者血液、癌细胞等筛选生物标志物的DNA液滴文库。胶囊封装入所述液滴和/或多个液滴的分子可以条码化以允许序列分析和鉴定。液滴试验可以联合基于芯片或基于阵列的试验以进行高通量分析和生物标志物鉴定。
图43示出了阐明采用本发明示例性系统成功地将单珠胶囊封装入液滴中的图像；本例子中采用的珠子为获自BANGsLaboratories,INC.(Fishers,IN)的6μm荧光的磁性氧化铁晶体。
图44示出了本发明的示例性方法和装置以操作或处理液滴或珠子文库：磁珠可以利用磁石重新定位到液滴；液滴可以利用微刀片被分裂为两个液滴，并且这产生了液滴中带有珠子或不带有珠子的液滴文库，其各自能够用于随后的筛选或生物标志物发现。
图45示出了用于实施本发明的示例性方法，其利用DNA珠子和DNA珠子液滴文库或基于FACS筛选结合例如癌细胞或细胞膜标志物的分子；在本发明示例性实验流程或系统示意图中：DNA珠子文库首先与靶标样品(例如纯化的靶标(如蛋白)或者复合样品(如血液、细胞或组织))混合；结合的靶标/珠子复合物能够利用磁力分选，和/或，在靶标采用染料，抗体或其它探针染色之后，利用FACS分选；结合的靶标/珠子能够利用例如高或低pH缓冲液、尿液、EDTA等解离；解离的靶标可以被进一步处理并分析用于鉴定和表征；筛选可以在单一轮或多轮中进行；并且可以将利用非靶标或对照样品的阴性选择集成到选择过程中以提高结合物的结合特异性。
图46示出了本发明的示例性方法，其利用液滴文库筛选能够例如调控蛋白-蛋白相互作用或酶反应的分子。
图47示出了采用了适体抑制剂-DNA-酶(IDE)或适体IDE系统的本发明的示例性系统的图表。起初，酶由于它的抑制剂(其可以为，例如小分子抑制剂)，通过结合酶抑制剂或者变构修饰酶活性(例如通过结合或占据活性位点和/或变构位点)而处于失活状态。所述抑制剂通过含有适体的核酸(例如DNA，或者人工的或合成的核酸)序列拴在所述酶上。当加入靶标分子，适体围绕靶标构建三级结构，进而从所述酶的活性位点或变构位点替换所述抑制剂(例如，当适体IDE结合它的靶标，它的构象改变，因而从酶释放抑制剂成“释放抑制”，或激活酶)。所述酶进而被激活，或者释放，并且它可以进而酶促地产生可检测信号，例如能产生荧光，例如可以酶促地变换(turnover)多重拷贝的可检测底物(例如荧光底物)。
图48示出了本发明用于产生含有适体(例如含有适体-IDE)液滴的示例性系统和方法。所述方法命名为：通过报告子扩增的适体胶囊封装筛选(ENcapsulatedScreeNingofAptamersbyReporterAmplification，ENSNARA)，如下详细描述。
图49示出了示例性显示出液滴中单酶检测的荧光显微镜图像，图49a)示出了在30μm液滴中具有其荧光底物的β半乳糖苷酶；和图49b)为没有酶单独有胶囊封装的底物的阴性对照。
图50示出了本发明的示例性系统，其利用指数扩增反应(EXPonentialAmplificationReaction，EXPAR)用于液滴中单一核苷酸分子的扩增，所述指数扩增反应可以被用于本发明的ENSNARA系统：
图50a示出了指数扩增反应(EXPAR)的示例性机制：DNA模板设计为在被切割位点(例如，剪切酶Nt.BstNBI)分开的3’和5’端具有两个重复序列。两个重复单元在各自位点互补于靶标核酸链(例如“起始”链)；因此，靶标链能够与模板杂交，然后通过DNA聚合酶沿着模板延伸以形成双链DNA(dsDNA)；内切酶识别在dsDNA上的切割位点并且切割新合成的链；切割后，上游序列作为引物通过DNA聚合酶扩展延伸并且替换下游序列；由于替换的下游序列为与靶标核酸相同的DNA序列，它作为游离引物与游离的模板开始新的反应；混合入反应混合物的dsDNA结合染料例如EvaGreen结合到所扩增的序列产生荧光信号，这样可以以实时方式监控；以及，
图50b示出了荧光显微镜图像，阐明了EXPAR用于液滴中单一合成的核酸检测的示例性应用；所述荧光显微镜图像监控随时间推进(底行)，来自液滴的荧光信号；在胶囊封装之前刺入的合成核酸靶标的体积浓度为10fM，其在胶囊封装之后，转变为每液滴0或1个分子；在研究时间窗口中，不含有靶标核酸的对照液滴不产生荧光信号；由于几乎没有荧光液滴的原因，没有示出在时间点<40min的图像。比例尺：200μm。
图51通过图表示出了本发明的示例性“变构”IDE系统，包括：缀合于多结构域DNA序列的报告酶；左板面显示通过接触抑制剂而被抑制的所谓的“IDE”复合物的酶，而右板面显示加入26-mer互补序列(D1)到α环释放了抑制剂，进而激活所述酶。
发明详述
本发明提供强大的高通量分析平台和用于制作和使用它们的方法，该分析平台能够以极高灵敏度(例如，单分子或单细胞)监控液体样品(例如人全血、血清、盐水或水、或任何环境样品)以检测生物学、生理学和病理学标志物。在替代的实施方式中，系统集成了新颖的传感器(例如生物传感器)、技术和高通量颗粒或液滴微流控平台。在替代的实施方式中，所述生物传感器是经改造为特异性与靶标反应，导致快速荧光信号的短寡核苷酸、抗体、肽或其他传感元件。在替代的实施方式中，可以利用包括PCR、滚环扩增、邻近连接测定法和指数扩增反应(EXPAR)在内的标准的传统测定法来扩增信号。
在替代的实施方式中，本发明示例性平台或系统能够利用集成有3D颗粒检测器的微胶囊封装液滴系统(称为“集成式综合性液滴数字检测(IC3D)”)快速且灵敏地检测小分子，或者生物的、生理的或者病理的标志物，或者单分子或单细胞，所述用于检测和生物分析：低浓度生物学标志物，或者用于检测和诊断包括感染疾病、癌症、糖尿病、阿尔茨海默氏病等在内的复杂疾病的集成液滴胶囊封装和3D颗粒检测器的核心概念在图1、2、3、4、5、6、7、8和9中示意性地说明。
在替代的实施方式中，本发明提供利用集成采用传感器(例如核酸(如DNAzyme))的基于颗粒或基于液滴的微流控系统，用于检测小分子，或生物的、生理的或病理的标志物，或单分子或单细胞的高通量、多路复用的系统或方法。在替代的实施方式中，用于实施本发明的传感器，例如，DNAzyme，能够特异性结合靶标分子或特定细胞。在替代的实施方式中，所述靶标分子或细胞包括生物的、生理的或病理的标志物，或者单分子或单细胞。
证实了本发明包括集成有传感器(例如DNAzyme)的液滴微流控系统的示例性系统的有效性。DNAzyme，也称作脱氧核酶或DNA酶或催化DNA，为具有执行化学反应或者催化反应能力的DNA分子。在实施本发明的这些示例性系统和方法中，所述传感器，或DNAzyme传感器(图10a和b)能够在几小时内从全血中以单细胞方式检测细菌；同时，也在15分钟内实现了在缓冲液中的单细菌检测(图10c和d；图11)。在替代的实施方式中，液滴中人血的划分(可以为直径在大约1到300μm，或10到100μm)通过提高靶标物种的有效浓度，以及通过阻止靶标和传感器从所述液滴小空间扩散，显著提高了测定法的灵敏性，降低了背景，并且减低了测定法时间(例如如图12、13、14、15和16所示)。在替代的实施方式中，3D颗粒计数器的集成(“集成式综合性液滴数字检测(IC3D)”)能够在1.5-4小时之内从毫升全血中一步，无培养和扩增过程，以单细胞灵敏性直接地选择性检测细菌(参见例如图17、18、19、20、21、22、23、24和25)。在替代的实施方式中，本发明的微胶囊封装系统包括采用用于酶标志物的荧光底物，所述酶标志物包括用于生产超广谱β内酰胺酶(ESBL)-的肠杆菌科检测的β内酰胺酶(例如碳青酶烯酶)和碳青酶烯抗性肠杆菌科(CRE)，TB和其它抗微生物抗性病原体(参见例如图26)。
在替代的实施方式中，本发明的系统能够用于检测血液中罕见的循环肿瘤细胞。在替代的实施方式中，本发明的系统能够利用液滴-PCR、液滴RT-PCR或液滴指数扩增反应(EXPAR)特异性评估基因表达、点突变、miRNAs和SNP(参见例如图27、28、29和30)。在替代的实施方式中，本发明的系统能够利用例如实时荧光传感器特异性评估分泌的胞内蛋白标志物。在替代的实施方式中，本发明的示例性平台或系统能够用于细胞分离和分选，和用于肿瘤异质性，单细胞-细胞相互作用(干细胞-癌-免疫细胞)，癌干细胞，进化，细胞-药物相互作用和耐药性的研究。在替代的实施方式中，本发明提供研究、监控和追踪单移植细胞，包括例如干细胞和癌干细胞。在替代的实施方式中，本发明的示例性平台或系统能够用于检测血液中的循环黑色素瘤细胞，例如，利用这些细胞的内在信号优势，可选的不采用任何传感器。
在替代的实施方式中，本发明提供包括集成式综合性液滴数字检测(IC3D)的系统(例如如图32和图33所示)。
在替代的实施方式中，本发明的示例性平台或系统包括利用例如疾病和/或正常样品分别作为阳性和阴性选择靶标的多轮富集的采用(参见例如图34)。此实施方式能够用于鉴定传感器，例如DNA传感器，所述传感器特异性识别重要的(或者独特的)分子标志，例如，SNP、缺失、易位、蛋白质等，以从正常样品中区别出疾病样品。在替代的实施方式中，在选择中的靶标样品为复杂系统，包括血液、血清或组织样品。
完成了对于肺癌的本发明示例性DNA酶筛选过程，并且获得几个DNAzyme传感器(例如如图35、36、37和38所示)。在替代的实施方式中，这些DNAzyme集成液滴微流控芯片用于癌症检测。在替代的实施方式中，本发明的示例性平台或者系统采用直接偶联下游信号通路的的体外选择获得分子和细胞信号适体的策略。在替代的实施方式中，示例性DNAzyme筛选过程鉴定了特异性调控干细胞分化为特定谱系的适体。
在替代的实施方式中，本发明的示例性平台或系统能够开发强大的体外选择以产生可靠的核酸结合物、激动剂或拮抗剂、或DNA传感器以及用于包括癌症、糖尿病、阿尔茨海默氏病等在内的复杂疾病的诊断(例如图39、40、41、42、43、44、45和46中所示)。
在替代的实施方式中，本申请的液滴微流控系统相比于用于诊断和预后的现有的系统监控标志物，显著地更加有效、更加灵敏、更容易制作并且更加可调。在替代的实施方式中，本发明的方法和系统产生的液滴文库能够以小样品量显著地增加发现药物候选物和新生物标志物的机会，同时也能够降低筛选时间。
在替代的实施方式中，本发明的示例性平台或系统包括称为通过报告子扩增的适体胶囊封装筛选(ENSNARA)的方法，用于通过在液滴中采用变构控制报告子酶或者酶系统进行适体鉴定；例如如图47和图48所示，以及如如下实施例8中详细描述。在替代的实施方式中，本发明的示例性ENSNARA方法包括首先提供包含适体抑制剂-DNA-酶(IDE)文库或者多个适体-IDE(如图48所示能够大于1012分子)，荧光底物(例如酶的直接底物)和靶标分子(被适体-IDE结合，例如特异性结合)的初始水性混合物，并且将这些泵过油流。当接触不混融流体时，所述水性组分被划分为成千上万的皮升大小的液滴。
对于这种示例性ENSNARA方案，在第一阶段，每滴中有106个IDE。分选器(例如，FACS，如图中所示)将任何荧光液滴导入分离通道，在其中它们被裂解、稀释以及以在每滴中1适体抑制剂-DNA-酶(IDE)的浓度重新胶囊封装，并且补充有底物和靶标分子(底物和靶标分子加入到，或者合并入重新胶囊封装的每滴1IDE微滴中)。进而收集内含产生荧光信号的适体的液滴，并且可选地可以测序所述适体。
微流控系统和使用和输送微滴
在替代的实施方式中，本发明的系统和方法能够使用任何形式或者种类的微流控系统用于制作、使用和/或输送微滴以实施本发明。
例如，按照，例如在U.S.专利申请公开No.2013/0213812所描述，可以使用用于输送微滴的微流控输送系统。在替代的实施方式中，本发明的系统和方法能够采用连接到如在例如U.S.专利申请公开No.20130149710(其也描述了在微滴中的PCR反应)中所描述的移动和放置装置的微滴操控装置。U.S.专利申请公开No.20130139477描述了采用微滴作为“微反应器”用于内容物的受控处理，其中非常小量的材料以定量被胶囊封装入微滴中。U.S.专利申请公开No.20130130919描述了用于测序大的多聚核苷酸模板的基于微滴的方法。微滴可以采用如在U.S.专利申请公开No.20130129581中描述的仪器制作。
在替代的实施方式中，本发明的系统和方法能够利用微滴操控装置，如在例如USPN8,529,026中所描述的，其中描述了用于在微流控装置中被动周期性扰动流场以高速造成规格液滴形成的装置；或者USPN8,528,589，描述用于评估一个或多个微流控通道中的微流控液滴的预定特征或特性，并调节在该通道中的一个或多个液体流动速率以利用反馈控制选择性地改变预定微滴特征或特性的方法；或者USPN8,492,168，描述了基于液滴的亲和性测定法，例如，通过使液滴微促动器上的基于亲和性的测定法试剂结合样品/靶标分析物以产生指示分析物存在、缺失和/或量的信号，检测样品中靶标分析物；或者USPN8,470,606，描述了在液滴促动器中液滴的循环磁力响应珠子的方法，以及用于分裂液滴的方法；或者USPN8,524,457，描述了采用利用例如采用微流或纳米流产生的微滴的同质非竞争分析筛选针对靶标分子的特异性亲和分子的方法。
在替代的实施方式中，在实施本发明的方法和系统中，微胶囊封装的乳液或液滴能够利用传统方法或利用乳化剂制造(例如参见：Griffiths,A.D.&Tawfik,D.S.Miniaturisingthelaboratoryinemulsiondroplets.TrendsBiotechnol.24,395–402(2006))。在替代的实施方式中，本发明的方法和系统包括基于液滴的微流控的采用，所述微流控包括高通量液滴生成器或多通道装置例如来自DolomiteMicrofluidics(Royston,Herts,UK)的TelosSystemTM。在替代的实施方式中，含有例如琼脂糖或PEG的液体液滴能够凝胶化或固化形成液滴颗粒(例如参见：AnalChem.2012Jan3；84(1):350-355)。在替代的实施方式中，在实施本发明的方法和系统中，基于琼脂糖液滴聚合酶链反应的高度平行单分子扩增法也能够被用于高效和成本有效的适体选择，参见，例如)。
基于液滴的筛选
在替代的实施方式中，本发明提供基于一种类型分子/每个液滴策略的药物筛选和体外选择平台(参见例如图39、40、41、42、43、44、45和46)。在含有多样性为大约2×1011个不同序列的液滴文库中合成DNA、RNA和肽。在微珠上胶囊封装皮升液滴(直径20μm)合成的DNA。所述在珠子上的DNA通过PCR扩增以产生液滴DNA文库。这些DNA进而能够在液滴中转录和翻译以形成RNA和肽文库。特别地，能够在相同的液滴中利用所述核酸序列对被翻译的蛋白质/肽的鉴定/测序添加标签，这为随后的筛选提供了强大的工具。这些通过本发明的方法和系统产生的轻易可得的廉价的示例性文库对筛选和/或获得活性生物制剂，例如治疗学和诊断学，以及对于生物标志物发现目的是有价值的。
DNAzyme传感器
在替代的实施方式中，使用DNAzyme，也被称作“DNA酶”或“脱氧核酶”，实施本发明的方法和系统。它们是合成的带有催化活性的单链(ss)DNA寡核苷酸。11，12在替代的实施方式中，用于实施本发明的催化DNA分子能够利用组合方法从大随机文库体外产生，所述组合方法称作体外演变或选择13,14，其中将被选择的分子的特性能够被定制和预定义。
在替代的实施方式中，用于实施本发明的方法和系统的DNAzyme具有多种催化活性，包括DNA/RNA切割，磷酸化以及RNA连接。12用于实施本发明的DNAzyme能够利用任何已知技术制作，例如在USPN8,329,394；8,450,103中所描述的。
在替代的实施方式中，用于实施本发明的方法和系统的DNAzyme为能够在单核糖核苷连接处切割DNA-RNA嵌合底物的RNA切割DNA模序(例如参见：FluorogenicDNAzymeprobesasbacterialindicators.AliMM,AguirreSD,LazimH,LiY.AngewChemIntEdEngl.2011Apr11；50(16):3751-4.)。10,15在替代的实施方式中，这种独一无二的特性允许采用DNAzyme作为平台用于实时荧光传感器(例如参见CatalyticnucleicacidprobesasmicrobialindicatorsCA2829275A1,PCT/CA2012/000205)。
集成有3D颗粒检测器的微胶囊封装液滴系统
在替代的实施方式中，3D颗粒检测器或计数器被用于实施本发明的方法和系统，参见例如，以及例如在Gratton,etal.US专利No.7,973,294(2011)；US专利No.7,528,834(2009)；J.P.Skinner,etal.,RevSciInstrum2013,84；I.Altamore,etal.,MeasSciTechnol2013,24所描述的。在替代的实施方式中，本发明提供集成有3D颗粒检测器的微胶囊封装液滴系统，例如如图1、2、14、15、17、32和33所示。
用于实施此发明的3D颗粒计数器能够在几分钟内从毫升量中以单一颗粒灵敏度检测荧光颗粒。简单来说，如图17所示，示例性仪器包括小的便携的显微镜，所述显微镜具有水平几何结构和具有直径1cm的圆柱形试管的机械部。两个马达提供试管的转动(10到1100rpm范围)和垂直上下运动(1到15mm/s)。通过二极管激光器(例如469nm或者532nm)产生的激发光聚焦于通常置于相对靠近试管内壁的观察体积处。通过相同的物镜收集来自样品的发射光，经二色性滤光片组传送，由透镜小孔聚焦，并且进而利用第二透镜校准到光电倍增管(PMT)。光电检测器测量所述观察量的源自荧光颗粒的荧光信号并产生荧光的时间谱图。模式识别滤波器从所有其它带有非常高的信号/噪声抑制的噪声信号中提取出具有正确形状的尖峰，这使得获得了非常可靠和准确的检测。此仪器的简单和创新设计允许在大约0.01ms快速扫描相对大的体积(100pL)。所述管以螺旋运动旋转大约100秒，有效地探测约1mL的管。此外，考虑到大的测量体积以及仅有快速信号被检测，由颗粒扩散造成的波动可以忽略。还强调使用这种光学设置，仅渗透到样品中150μm。因此，对于250μm路径长度，在500nm具有大约10％的透射率的强散射样品例如全血(甚至在利用传感器溶液稀释前)都能够容易处理。
此系统能够利用荧光微珠或者SYTOX橘染色的大肠杆菌强劲地检测每毫升中非常少的颗粒(参见例如，Skinner,etal.,RevSciInstrum2013,84；I.Altamore,etal.,MeasSciTechnol2013,24)。
在替代的实施方式中，本发明提供包含集成有3D颗粒检测器的微胶囊封装液滴系统的方法和系统。例如，如图1-33所示。
在替代的实施方式中，本发明的方法和系统包含以下独特的特征，包括一些通过传统检测测定法不能轻易实现的特征：
1)低峰度标志物(例如1-1百万/mL)；
2)能够审查大样本量(μL到mL)且高通量；
3)快速(分钟到小时)；
4)宽泛的检测范围；
5)多路复用；
6)无需或者需要极少的样品制备；血液或者其他生物样品可以直接胶囊封装和分析，无需任何富集或者纯化步骤。在替代的实施方式中，所述测定法能够以单一步骤，同质的方式执行；这样可以确保所有靶标都被分析。
在替代的实施方式中，本发明的方法和系统能够分析生物样品，所述生物样品可以包括来自个体或患者的活检样品，或者血液、血清、唾液、泪液、粪便、尿液或者CSF样品。在替代的实施方式中，本发明的方法和系统能够分析获自食物、水、土壤或空气源的任何样品。
在替代的实施方式中，在实施本发明的方法和系统中，所述样品能够无需或者需要极少(例如，稀释)处理直接测定。标准，已建立的生物样品制备过程包括稀释、纯化、富集、提取、离心、磁珠测定法，和洗涤步骤，即使不需要，也能被集成入本发明的测定法、方法和系统中。
在替代的实施方式中，本发明的测定法、方法和系统能够检测和分析任何靶标，包括例如，但不限于：细胞(例如，癌细胞、干/祖细胞、免疫细胞)，病原体(例如，细菌、多药耐药菌(MDRO))，结核杆菌(TB)，寄生虫，真菌，病毒(例如，HIV)，细胞源性囊泡(例如，胞外体、微泡、凋亡小体)，核酸(例如，SNP、突变、表达)，蛋白(例如，PSA)，酶(例如，MMP)，肽，脂质，碳水化合物，多糖，小分子或金属离子。
在替代的实施方式中，通过本发明的测定法、方法和系统检测的靶标物种形式包括例如，细胞表面的(例如，EpCAM、N-钙黏蛋白、CD44、CD24)，细胞内的、和分泌的标志物(细胞分泌组)，细胞游离循环标志物(例如，miRNA、DNA、蛋白标志物)，代谢标志物，机械标志物(例如，细胞可塑性、硬度、细胞骨架等)。
在替代的实施方式中，本发明的方法和系统能够用于检测或监控生物学事件，例如，DNA杂交、蛋白受体-配体相互作用、酶-底物相互作用、和细胞表面受体二聚作用(包括同聚和异聚)、共定位、或者与可溶性配体和药物以及另一个细胞的相互作用。
在替代的实施方式中，本发明的方法和系统包括多种检测测定法的采用以分析或测量液滴中的靶标。例如，本发明的方法和系统包括采用多种多样的已建立的荧光生物测定法，以例如选择性地检测液滴中靶标，用于例如示例性的3D颗粒计数器分析实施方式。这种测定法包括，但不限于：基于核酸的测定法，基于抗体的测定法，基于酶的测定法，或基于化学的测定法或组合采用的测定法；或者基于核酸的测定法，包括例如杂交、分子信标、适体、DNAzyme，或其它实时荧光传感器；或基于抗体的测定法，包括，例如ELISA，基于夹心、免疫染色、抗体捕获、第二抗体扩增，或者基于邻近连接；包括例如基于酶的测定法，包括，例如PCR、RT-PCR、RCA、环介导等温扩增(LAMP)、切口(例如，指数扩增反应(EXPAR))、链置换和指数等温扩增(例如，参见LabChip,2012,12,2469-2486)(一些例子在图6、7和9中示出)。在一些情况下，所述靶标自身例如PSA、MMP、β内酰胺酶和碳青霉烯酶能够作为酶来触发检测过程(参见图26作为例子)。
在替代的实施方式中，在实施本发明的方法和系统中，微胶囊封装的乳液或液滴可以利用传统方法或者利用乳化剂或者利用基于液滴的微流控制作。在替代的实施方式中，本发明的方法和系统包括基于液滴微流控的采用，所述微流控包括高通量液滴发生器或多通道装置(参见图15作为例子)。液滴可以包括油包水制剂或者所述液滴可以包括水包油包水(W/O/W)双乳液制剂。在替代的实施方式中，含有例如琼脂糖或PEG的液体液滴能够凝胶化或固化形成液滴颗粒。
在替代的实施方式中，液滴制作成从10nm到100量级(100s)微米的不同大小。液滴可以以多种方式操作，包括加热/冷却(用于PCR)、融合、分裂、分选或长期存储。液滴可以通过传统的1D芯片上或2D分析，或通过在此发明的3D颗粒计数器来分析。
在替代的实施方式中，在实施本发明的方法和系统中，可以采用任何3D颗粒计数器，例如包括例如如图17所示的仪器系统(标记的“3D颗粒计数系统”)，或者用于及时检测应用的便携系统(参见，例如图32和图33)。
在替代的实施方式中，本发明提供集成的系统，所述系统例如改造为包括下述之一或或任一：带有3D颗粒计数系统的系统：理想的便携性(例如，包装为背包)，自动化流体处理(即，液滴生成和自动取样)，和集成电子器件，包括二极管激光器(光源)，APD(检测器)，操作(vinci，ISSInc.)和/或数据分析软件(SimFCS)，显示器，计算机界面，智能手机；例如如图32和图33所示，示出了本发明的示例性的便携设计或者本发明的包括采用集成的微胶囊封装器和3D颗粒计数系统的实施方式。
在替代的实施方式中，这种示例性装置与多功能一次性微流控“盒”集成，允许多路复用和多类型靶标同时快速检测。所述装置可以为全自动的，以及可以制备为一体化系统，或者带有模块化组件。它也能够连接于智能手机和蓝牙等，以用于及时检测应用，如图32所示。
在替代的实施方式中，为了允许多种靶标的多路复用和平行检测，本装置可以包括多重激光源和能够在不同波长读取的检测器。所述多路复用系统允许同时读取编码不同靶标的多重传感器(以不同颜色标记)。在替代的实施方式中，转盘可以集成入本仪器以容纳多个样品瓶用于实施平行测试。
集成有3D颗粒检测器的微胶囊封装液滴系统，或者集成有本发明的集成式综合性液滴数字检测(IC3D)的应用
在替代的实施方式中，本发明的示例性系统包括集成的液滴系统和3D颗粒计数系统，包括被称作“本发明的集成式综合性液滴数字检测(IC3D)系统”(参见例如，图1和图33)，所述系统允许在数分钟内以毫升容量选择性检测生物样品中的靶标物种。在替代的实施方式中，本发明的示例性系统使如何检测和分析低浓度生物颗粒和标志物革命化。在替代的实施方式中，本发明的示例性系统被利用于多种多样的生物分析和诊断应用，包括但不限于：
-感染病病原体(例如，细菌、病毒、真菌等)，包括皮肤感染、伤口感染、糖尿病溃疡感染、HIV、细菌、TB、MDRO(例如，MRSA)；
-癌症；
-糖尿病；
-阿尔茨海默氏病(例如，β淀粉样物、Tau蛋白)；
-脑损伤和紊乱(例如，S100B，一种神经胶质特异性蛋白，其中升高的S100B水平准确地反映了神经病理情况的出现，包括外伤性脑损伤或者神经退行性疾病)
-炎性和自身免疫疾病(例如，CD4T细胞，免疫细胞计数)；
-干细胞和再生医学(例如，间充质干细胞、内皮祖细胞、造血干细胞，包括内源性和外源性的移植细胞)；
-心血管疾病(例如，C反应蛋白(CRP)、B型钠尿肽、肌钙蛋白、胱抑素C、IL-6)；
-药物及滥用(例如，四氢大麻酚、THC)；
-新生儿筛选(例如，苯丙氨酸)。
在替代的实施方式中，本发明的示例性系统用于研究新生物学、细胞-药物相互作用和药物易感性，以发现新药物和治疗方法以及监控疾病进展和治疗效力，或者用作联合诊断和用在测序、个性化诊断和医学。在替代的实施方式中，本发明的示例性系统也能够用于其它领域，包括食品工业、农业、水系统、空气系统以及国防应用。
快速和灵敏的细菌和抗微生物抗性检测方法以加快血液感染，例如BSI的诊断和治疗：
本发明提供了用于血液中细菌的快速且灵敏的鉴定的系统和方法，其将显著地降低死亡率和血液感染相关医疗护理的费用。
在替代的实施方式中，本发明提供检测血流感染的快速且灵敏的方法，以加快血液感染的诊断和治疗。
在替代的实施方式中，本发明提供快速且灵敏的检测方法来检测包括超广谱β内酰胺酶(ESBL)和碳青酶烯抗性肠杆菌科(CREs)在内的抗微生物抗性。
癌症检测和监控
在替代的实施方式中，本发明提供快速且灵敏的检测癌症的方法，例如，检测转移，或者来自原发性肿瘤到其它器官位点的癌细胞扩散，例如，检测原发性肿瘤的形成和生长，例如，检测从原发性肿瘤脱落进入循环的被称作循环肿瘤细胞(CTC)的癌细胞。在替代的实施方式中，本发明提供用于分析和定量CTC以用于早期诊断、预后和监控疾病过程的方法。在替代的实施方式中，本发明提供用于检测癌症标志物的方法，所述癌症标志物例如蛋白质(例如，前列腺特异性抗原(PSA))、无细胞核酸(例如，DNA、mRNA、miRNA)、细胞源性颗粒(例如，胞外体、微泡、凋亡小体)。在替代的实施方式中，本发明提供用于检测非常罕见的标志物的方法，例如每107个粒细胞出现一个CTC。本发明的方法可以用于联合或代替异质的传统流式细胞术、DNA和RNA测序以及免疫学方法(例如，CellSEARCHTM平台)以例如可靠地检测癌症标志物，例如临床的CTC或者PSA。
在替代的实施方式中，本发明提供单细胞检测方法，所述方法可以提供一种剖析癌细胞异质性的方式。在替代的实施方式中，本发明提供在单细胞水平检测和分析罕见细胞的能力，包括核酸、蛋白和代谢产物的检测以用于个性化诊断和治疗。
脑、神经和CNS疾病和病症的检测和监测
在替代的实施方式中，本发明提供用于检测已建立的神经和中枢神经系统(CNS)疾病以及脑肿瘤、创伤和损伤的生物标志物的方法。在替代的实施方式，本发明提供用于检测β淀粉样(Aβ)肽(即Aβ42)和tau蛋白积累的方法，这两者为表征阿尔茨海默氏病(AD)脑的两种关键神经病理学特征，并且可能是在CSF中检测到的表征AD发病机理的重要生物标志物。在替代的实施方式中，本发明提供检测和定量这些生物标志物的方法，这可能对于旨在采用Aβ和tau蛋白作为生物标志物以1)筛选和监测AD，2)更好地理解该疾病的分子生物学和病理学，以及3)评价治疗干预的研究是极有用的。在替代的实施方式中，本发明的方法能够用于代替或者联合包括ELISA在内的现有测定法以例如检测Aβ和tau蛋白。在替代的实施方式中，本发明提供在血液和尿液中的标志物筛选和检测，所述标志物包括任何在非常低的浓度且经常由于血脑屏障(BBB)而不能被现有测定法检测的标志物，例如S100B(S100钙结合蛋白B)。
残留HIV检测
在替代的实施方式中，本发明提供了用于检测和表征逆转录病毒，例如，人免疫缺陷病毒(HIV)、HIV/抗体复合物和含有HIV的罕见存储细胞的方法。最近，有一些HIV患者似乎通过包括骨髓移植在内的新疗法治愈的事件。但是，数周之后HIV又回来了。重大的挑战为在治疗期间，病毒颗粒浓度经常变得低于现有技术的检测限，这表现为是“治愈的”，但实际上并不是。因此，本发明的方法能够检测极低数量的病毒颗粒以在这些治疗和预后中提供帮助。
液滴微胶囊封装系统
在替代的实施方式中，本发明提供包括采用液滴乳液胶囊封装(例如，油包水)的方法和系统，这是一种已建立的划分样品和试剂进入小体积的方法用于包括生化测定法、药物和食品工业在内的各种各样目的。在替代的实施方式中，本发明提供包括在微流控系统中采用多相流作为平台以用于超灵敏和高通量筛选和实验的方法。
在替代的实施方式中，本发明的方法采用“液滴微流控”以能够在不混融的载体油液中(例如，油包水乳液)产生和操控单分散的微液滴，例如皮升大小的液体液滴(参见例如，“Dropletmicrofluidicsforsingle-moleculeandsingle-cellanalysisforcancerresearch,diagnosisandtherapy”,Dong-KuKangetal.TrendsinAnalyticalChemistry,2014)。在替代的实施方式中，本发明的方法利用划分为皮升液滴(例如，直径1到300μm)通过增加靶标物的有效浓度来增加测定法的灵敏性，并减少测定法时间。
在替代的实施方式中，液滴微流控用于高通量和多路复用检测以及低浓度靶标(例如单细胞)的分析；以及在单一细胞水平的基因表达、细胞活力和增殖、细胞-细胞和细胞-药物相互作用。在替代的实施方式中，以许多方式操作液滴，包括加热/冷却(用于PCR)、融合、分裂、分选和长期储存。
在替代的实施方式中，本发明的方法包括多重(例如高达256)液滴产生通道，这能够使1mL样品在几分钟内转变为液滴。
在替代的实施方式中，本发明的方法包括凝胶材料例如琼脂糖的胶囊封装，这能够轻易制造以形成水凝胶液滴而用于不同的目的，包括重复清洗和反应步骤以及流式细胞术分析；液滴可以在芯片上检测以及例如以大于1000液滴/秒的高通量有效地分选。
3D颗粒检测器
在替代的实施方式中，本发明的方法包括3D颗粒检测器(也称作稀有事件检测器(RareEventDetector))的采用，3D颗粒扫描器或者荧光相关光谱(FCS)，例如在US专利号(USPN)7528384；US专利申请公开号20090230324；USPN7528384中所示。在替代的实施方式中，此3D颗粒检测器能够达到临床相关的通量。在替代的实施方式中，本发明的方法包括3D颗粒计数技术的采用，其能够在几分钟内从毫升(mL)容量中以单一颗粒灵敏度检测颗粒(例如，荧光珠子或染料染色的细胞)。
在替代的实施方式中，本发明的方法包括3D颗粒计数技术的采用，其能够通过移动含有在共聚焦显微镜物镜前螺旋运动的液体的试管快速地扫描一毫升液体。所述显微镜的光学可以被设计为在大约0.01ms测量相对大的体积(100pL)。试管以螺旋运动转动大约100秒有效地探究了大约1ml的所述试管。在激发体积中所述荧光颗粒的快速通道产生信噪比(S/N)远大于100的非常强的信号。由于只有快速信号被检测，因此由于旋转试管机械结构中的不完善造成的荧光信号的慢调制对S/N没有影响，此系统能够利用荧光微珠或者Sytox橘染色的大肠杆菌强劲地检测少量颗粒/mL，例如在Skinner,RevSciInstrum.,84(7),074301；Altamore(2013)FCS.MeasSciTechnol.,24(6),65702中所示。
将参照下面的例子进一步描述本发明；但是，需要理解的是本发明并不局限于这样的例子。
具体实施方式
实施例1：利用微胶囊封装传感器的生物样品中细菌的检测
实时荧光DNAzyme传感器：在一个实施方式中，使用包括大约104个随机序列的DNA文库(例如，化学合成的)来选择和/或分离DNAzyme传感器。所述文库可以由例如连接于荧光的DNA-RNA嵌合底物的大约40个核苷酸的可变序列组成(参见图10a)。7底物可以包含单一核糖核苷(核糖腺苷)作为切割位点，所述切割位点每一侧分别以荧光团和淬灭剂为侧翼。基本原理为文库中特异性DNA序列只有在靶标细菌裂解物存在的情况下存在并且在核苷酸连接处切割，进而产生荧光信号。
体外选择可以通过在HEPES缓冲液中用靶标细菌裂解物孵育初始文库大约10分钟实现。被切割的分子可以被胶分离，通过引物特异性PCR扩增，连接到底物然后用于下一轮选择。可以包括来自非靶标细菌的细菌裂解物作为阴性选择以去除非特异性DNAzyme并确保测定法的特异性。根据经验，需要8-15轮选择(约1-3个月)来完成一个选择。7可以对最后一轮的DNA池测序。采用这种选择方法，分离出快速检测各种细菌的实时DNAzyme传感器，所述细菌包括大肠杆菌、李斯特菌(Listeria)、沙门氏菌(Salmonella)和难辨梭状芽孢杆菌(Clostridiumdifficile)。如此高的选择性证实了通过在选择过程中包括合适的阴性选择靶标，产生特异性检测特定细菌、MDRO或者其它病原体的DNAzyme传感器是可行的。在替代的实施方式中，本发明的方法和系统包含任何已知的利用荧光DNAzyme探针作为细胞，例如细菌、指示剂的方法，例如在Alietal,AngewChemIntEdEngl.2011Apr11；50(16):3751-4；或Lietal.,WO/2012/119231中所描述的。
在本系统中，采用这些快速、荧光DNAzyme传感器作为例子。如图10a和10b所示，传感器含有连接有DNA-RNA嵌合底物的DNAzyme结构域，在所述结构域中核糖核苷切割位点的侧翼为荧光团和淬灭剂。这种“未活化”状态由于荧光团和淬灭剂的紧密邻近而具有最小的荧光信号。在靶标细菌，本文用大肠杆菌作为模型系统，存在时，DNAzyme将结合细菌产生的靶标分子并切割底物。切割事件使荧光团从它的淬灭剂中释放，进而产生高荧光信号。而且，DNAzyme传感器能够高选择性地区分靶标大肠杆菌和对照细菌或哺乳动物细胞(图10c)。进一步阐明来利用大肠杆菌母分离物(stockisolate)预先分离的DNAzyme传感器可以强劲地并且选择性地检测在血液中刺入的(spiked)然后裂解的临床大肠杆菌分离物(图10d)。有意思地注意到，虽然DNAzyme传感器能够检测所述有临床大肠杆菌样品，但是荧光强度在样品间变化，这可能反应出了不同大肠杆菌菌株间潜在的分子异质性。这也表明通过在体外进化过程中包括合适的阳性和阴性选择靶标，产生能够区分相同细菌物种的不同菌株的DNAzyme传感器是可行的。
由于目标是开发无需或需要最小样品处理的用于全血的“混合-读取”测定法，进一步测试了所述传感器在全血中的性能并发现Fluorescein/Dabcyl修饰的DNAzyme传感器响应于刺入血液的大肠杆菌产生足够高的荧光信号，并且因此用于随后的液滴实验(下面)，所述刺入血液的大肠杆菌被传感器溶液稀释到具有被确定为最佳的10％终血液浓度的各种体积比(图11a)。特别是采用更少被血液自荧光干扰的近红外染料的染料对优化能够进一步提高传感器在血液中的性能(例如，信噪比)。进一步证实了在对未来临床应用的目标时间框架(＜1.5-4小时)内，DNAzyme传感器在血液中展示出足够的稳定性(图11b)。在替代的实施方式中，DNAzyme的末端或骨架(例如反向T和硫代磷酸酯)可以进一步被化学修饰；或者可以在测定法缓冲液中包括RNase抑制剂(ribolock,Fermentas)以进一步提高它们的血液稳定性。
考虑到血流感染(BSI)，脓毒病和抗微生物抗性可以由多种不同病原体类型造成，传感器设置可以通过以上描述的体外DNAzyme传感器选择被扩展以检测其它病原体物种。特别地，利用细菌作为事先没有任何特定靶标分子知识的复杂靶标的无偏差筛选绕过了从极其复杂的混合物中纯化并鉴定靶标分子的繁琐过程，并且允许用于新菌种的传感器以意料之外的爆发式来快速发展。这解决了现有技术面临的一个主要挑战，所述现有技术(包括PCR)依靠预先鉴定的靶基因的检测或者其它已知的与细菌有关的快速和复杂的进化机制的生物标志物。虽然结合于DNAzyme以触发底物切割的特异性细菌生物标志物的鉴定对本测定法的操作不是必须的，但是它们可以利用亲和纯化联合质谱进行鉴定。
在替代的实施方式中，本发明采用实时的荧光DNAzyme传感器，其能够通过利用例如，主要的血液感染菌或药物抗性生物体作为靶标的体外选择来制作，所述靶标包括例如金黄色酿脓葡萄球菌(S.aureus)、粪肠球菌(E.faecalis)、凝固酶阴性葡萄球菌(Staphylococci)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)、鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、肠杆菌(Enterobacter)属和肠外致病性大肠杆菌、ESBL、CRE、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)以及病原真菌。
液滴微流控：在替代的实施方式中，本发明的系统和方法操控微流控系统中的多相流作为用于超敏感和高通量筛选和诊断的平台。这些系统，被称作“液滴微流控”，能够在不混融的载体油液(例如，油包水乳液)中产生并操控单分散的、皮升大小的液体液滴。11-14这种可控地以高速率产生带有可变分析物组分的液滴的能力，使得液滴微流控成为一种强有力的解决一系列化学和生物应用的工具，所述应用包括酶测定法、蛋白质结晶、纳米材料合成和基于细胞的测定法。11-14在皮升液滴中的划分(其为替代的实施方式，直径可以在大约1到300μm之间或者10到100μm之间)通过增加靶标物种的有效浓度增加了测定法的灵敏度并降低了测定法时间。11因此，在替代的实施方式中，液滴微流控尤其适合高通量和多路复用检测和低浓度靶标例如单一细胞的分析。事实上，已经采用液滴微流控在单一细胞水平上证实了基因表达、细胞活性和增殖、细胞-细胞和细胞-药物间相互作用。12在替代的实施方式中，以众多方式操控液滴，包括加热/冷却(用于PCR)、融合、分裂、分选和长期储存。在替代的实施方式中，液滴能够在片上检测并有效地以高通量(＞1000液滴/s)分选。11
在替代的实施方式中，本发明的系统和方法能够在数分钟内以单一细胞灵敏度检测患者血液中的细菌，如图12、13、14和16所示。在替代的实施方式中，本发明的系统和方法集成了细菌检测DNAzyme传感器与液滴微流控，所述DNAzyme传感器通过体外选择获得(图14)。在替代的实施方式中，细菌在液滴中的约束显著地增加了被释放的靶分子的浓度，所述靶分子可以通过DNAzyme传感器以快速、实时的方式检测。
图2a示出了本发明的用于常规细菌检测和筛选的示例性自动装置。分析患者血液样品并且样品中靶标细菌数量在几分钟到几小时内显示在显示面板上。液滴微流控集成DNAzyme传感器用于检测血液中细菌。含有荧光液滴的细菌能够在片上计数(图2b)或，在收集至试管中后，通过3D颗粒计数器计数(图2c)(下面实施例2)。
在替代的实施方式中，血液样品和DNAzyme传感器混合，然后胶囊封装入亿万至数十亿的微米大小的液滴。DNAzyme传感器在含有细菌的液滴中产生瞬时信号，所述信号将被计数并分析。在替代的实施方式中，患者血液与包括细菌裂解缓冲液的DNAzyme传感器溶液在微流控通道中混合，这可以胶囊封装入数百万的单个的皮升液滴中(图2b)。因为细菌在血液中以低数量存在(典型地1-100CFU/mL)，每个液滴可以含有一个或不含细菌。DNAzyme传感器可以使含有细菌的液滴瞬时发出荧光。所述液滴能够通过嵌入式APD(光子雪崩二极管)以高通量方式(大约3000液滴数/s)检测。所述系统还能够集成有多重液滴微流控“盒”，这将允许同时筛选多种主要的细菌靶标。
在替代的实施方式中，体外选择技术能够产生多重用于各种主要的致病细菌的DNAzyme传感器，使得多重细菌检测成为可能。在液滴中的单一细菌划分显著地增加了靶标分子浓度，允许快速检测以及单一细胞灵敏性。显著缩短的测定法时间(例如数分钟代替常规技术中的数小时到数天)使得能够及时并有效地处理血液感染。
在替代的实施方式中，本发明的示例性平台也能够轻易地集成于药物灵敏度筛选测定法以鉴定用于患者特异性治疗的最佳抗生素治疗方案。如此快速的检测和早期干预能够显著地提高治疗血液感染的机会并降低死亡率。因此，本发明能够显著地提高血液感染患者的生存期并降低与患者护理相关的财务费用。
在替代的实施方式中，本申请的快速的单一细胞检测方法和系统能够作为平台用于检测和筛选生长缓慢物种(例如，结核分枝杆菌)和血液中其它罕见细胞例如循环肿瘤细胞。
液滴微流控制作与设置
装置制作：液滴微流控可以按照例如以上讨论的任何已知和已建立的步骤制作和操作。26例如，在一个实施方式中，利用标准软光刻法制作具有20μm深和15μm宽通道的聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)芯片，并且安装在玻璃显微镜载玻片上。如图14a所示，PDMS装置具有一个油入口和两个水入口(一个用于细菌刺入缓冲液或者血液，而另一个用于DNAzyme传感器和细胞裂解试剂)。使用标准压力注入/抽出注射泵以0.5到2μL/min的流量递送试剂和油。以大约50Hz的速率通过所得液流的流聚焦产生均匀的皮升大小的液滴，所述所得液流为含2％(w/w)EA表面活性剂的HFE-7500氟化油。能够产生三种不同大小(直径为10、20和50μm)的液滴，其中在替代的实施方式中，所述不同大小是通过调整微流控通道大小和流速来制作。图14c示出了示意图证实了正在产生30μm的液滴。依照液滴的形成，加入一个简短的“摆动”模块用于通过混沌对流来快速混合液滴(图14a)。所述液滴进而在检测区域被检测前，将流动通过“孵育通道”(70cm)。
图14示出了：(a)液滴微流控芯片的示例性布局；(b)显示出形成均匀液滴的示例性/代表性的显微图像；c)血液内容物尤其是红细胞在液滴中清晰可见。d)收集在试管中的液滴。e)代表性的荧光显微图像证实了3小时反应后DNAzyme传感器(250nM)点亮了10％血液中含有单一大肠杆菌K12的液滴。
在替代的实施方式中，系统中的液滴能够通过带有多重液滴生成挑战或结构的高通量液滴生成器制作。在替代的实施方式中，高通量液滴生成器允许一毫升样品在数分钟内转化为液滴。如图15所示：示出了高通量血液微胶囊封装装置的例子：双层微流控装置被设计为在单一装置中集成8个液滴生成器；微流控装置通过软光刻法利用聚二甲硅氧烷(PDMS)制作；传感器和血液样品从上层引入并且油从底层注射。传感器和血液在上层中间融合并且它们向下通过互联的孔进入底层。混合的样品通过给定的油从底层上的流聚焦结构形成液滴，并且收集所产生的血液液滴用于液滴计数。
在替代的实施方式中，较大的液滴和较小的血液稀释因子的采用能够进一步显著地降低液滴产生时间。
在替代的实施方式中，液滴可以为能够轻易制作以形成用于不同目的的水凝胶颗粒的凝胶材料(例如琼脂糖)，所述不同的目的包括重复洗涤和反应步骤以及流式细胞术分析。
液滴检测和定量：液滴的荧光测量可以通过定制的共聚焦显微镜(ObserverZ1TM,Zeiss)实施。此共聚焦设置由作为激发光源的488和561nm二极管激光器，和用于荧光检测的电子倍增电荷耦合器件(QuantEM:512SC,Photometrics)组成。为了最大化筛选速度，将CSU-XI涡流盘(CSU-X1,Yokogawa,Japan)集成入共聚焦显微镜。典型地，将以每秒100s到1000s液滴的速率测量液滴，且该数据能够使用ImageJ分析。除了共聚焦显微镜，也能够使用标准流式细胞仪以高通量方式分析、定量和分选荧光液滴。35
高通量液滴检测
为了实现高通量液滴检测，在替代的实施方式中，采用集成有高灵敏度具有双波段发射滤波器(z488/635,ChromaTechnologyCorporation,USA)和双色镜(630dcxr,ChromaTechnologyCorporation,USA)的APD检测器的光学系统；这可以以～3000液滴/s的通量计数液滴(参见图16)。在替代的实施方式中，光学系统能够由复数个镜组成，所述镜反射并传输光源以及在检测前来自于样品的荧光发射。在到达检测器之前，所述荧光发射将会通过双波段发射滤波器，去除残余激发光，并且二向色镜将荧光发射分开成两路以通过APD检测器同时检测。38光学系统能够集成到共聚焦显微镜系统中用以高通量分析。
缓冲液中细菌检测优化
利用DNAzyme传感器检测液滴中细菌：能够优化集成有DNAzyme传感器的液滴微流控系统以检测采用例如50mMHEPES，pH7.5，150mMNaCl，15mMMgCl2和0.01％Tween20的反应缓冲液中的细菌。可以靶向两个重要的特性：灵敏度和检测时间。由于细菌在患者血液中以低数量存在(通常1-100CFU/ml)，当胶囊封装入皮升液滴时，每一个液滴将会含有一个或者不含有细菌。因此，有意义的是本发明的系统能够以单一细胞灵敏度检测细菌。在替代的实施方式中，靶标细菌例如大肠杆菌与它们各自的DNAzyme传感器(例如以100nM，用Fluorescein和Dabcyl修饰的)一起胶囊封装入液滴。包括突变的DNAzyme/靶标细菌和DNAzyme传感器/非靶标细菌的对照实验可以被包括在内以评估液滴测定法的特异性。溶菌酶(1mg/mL)，一种细菌裂解试剂，能够被预先混入DNAzyme传感器溶液中。所述裂解试剂的采用使得靶标分析能够从细菌中快速释放，这将会进一步降低测定法时间。细菌裂解条件可以利用多种试剂整体优化，包括例如TritonX-100，IGEPAL，SDS和溶菌酶单独或者组合，并且鉴定溶菌酶不干扰液滴形成或者DNAzyme传感器功能而最有效地裂解细菌。
细菌可以以一系列浓度进行统计学上的稀释并划分为液滴。例如，对于50μm液滴，初始细胞浓度将为3、30和300×106/mL细菌以形成每滴中1、10和100个细菌。当初始细菌溶液极稀(<3x106/mL)，形成的液滴将每滴中含有单一或者没有细菌。细菌可以用Syto9(绿色)或Syto17(红色)染色，这使得在液滴中获得它们的更好的视觉图像以利用共聚焦显微镜定量每个液滴中细胞数量。用不同颜色染色细菌允许在检测测定法中在同一液滴中与DNAzyme传感器信号共定位。
由于DNAzyme传感器产生的强烈荧光信号，可以轻易检测含细菌的液滴。已经示出了本发明的示例性大肠杆菌传感器能够检测液滴中的细菌，信号直接关联于每滴中的细胞数量(图12d)。首次证实了，在缓冲液中，DNAzyme传感器系统能够检测单一靶标大肠杆菌K12，所述单一靶标大肠杆菌K12在8min内以合适高的～4信号/背景比于液滴(直径5μm)中裂解(图12a-c)。相较于那些大量测定法，我们将液滴中此单一细胞灵敏性和降低的检测时间归因于通过单一细胞约束增加了靶标浓度。单一细胞检测能够利用它们各自的传感器通过共聚焦显微镜和高通量流式细胞技术优化以用于任何靶标细菌。
优化：用于特定测定法或靶标的液滴测定法的最佳检测时间和信号/背景比可以通过优化两个参数实现：液滴体积(或大小)和DNAzyme传感器浓度。由于较小液滴大小导致来自单一细胞的较高靶标浓度，增加了信号/背景比并降低了检测时间，可以特别地比较三种大小例如10、20和50μm的不同液滴的性能。对于液滴测定法，100nM浓度的DNAzyme传感器可以为起始点，其已经在大量测定法中显示是最佳的。DNAzyme传感器浓度例如在10、50、100、200和500nM可以被优化以达到最佳检测时间和信号/背景的平衡。
检查和优化在刺入的血液中的细菌检测：在替代的实施方式中，使用本发明的示例性系统检测未处理(或稀释的)的血液中的细菌。DNAzyme传感器能够用兼容血液检测的染料-淬灭剂对修饰。为了滴定和优化，细菌可以以各种浓度刺入未稀释的全血，其将如以上所述连同DNAzyme传感器一起被胶囊封装入液滴。为了避免在注射期间中血液样品凝固和沉淀，可以将2mm磁棒放置于注射器中，在其上放置有便携式磁力搅拌器。
含有细菌的全血能够直接胶囊封装入液滴，如图14c和d中所示。这样可以室温稳定存储数天到数月。可以优化液滴中血液和传感器溶液之间的体积比用于任何给定的测定法。这可以轻易地通过调整血液和DNAzyme传感器溶液之间的流速实现，以产生不影响通量(例如，每单位时间全血处理量)的最优的信号/背景比。为了检测血液中的细菌，可以优化液滴大小：由于较小液滴大小导致来自单一细胞较高的靶标浓度(这将会增加信号/背景比并降低检测时间)，在将包括红细胞和白细胞在内的血液内容物胶囊封装到太小的液滴中的技术上是具有挑战性的。我们证实了直径25μm的液滴对于这种目的是优选的并且进而可以用于随后的血液液滴实验。
在替代的实施方式中，本发明提供了包括采用带有DNAzyme传感器系统以在例如缓冲液和/或刺入的血液中选择性地检测单一细菌的液滴微流控的组合物和方法。利用荧光显微镜(图14e)或者1D片上液滴计数系统(图16)，本系统能够在10％血液中选择性地检测液滴中单一靶标大肠杆菌K12。而且，通过与Syto17信号共定位，发现本胶囊封装的DNAzyme传感器系统在利用大肠杆菌K12作为阳性靶标以及传感器单独或者对照细菌作为阴性对照进行的三重实验中，来自～70,000液滴计数中具有零假阳性率和最小的假阴性率(～0.5％)(图16)。最后，响应于血液中单一细菌，可以在<3小时观察到可测量的荧光信号(图14e)。
如果单一乳液液滴(油包水)与流式细胞仪系统不兼容，那么可以为那套流式细胞仪测量采用(制造)水包油包水的双重乳液液滴。水包油包水的双重乳液液滴可以利用双流聚焦结装置轻易地制作，并且已经广泛地用于流式细胞分析和分选。在胶囊封装入液滴之前，没有发现血液在通道中堵塞。如果需要，那部分通道可以用未结垢的聚乙二醇(PEG)或者肝素涂覆以进一步最小化不希望的血液组分的堵塞。36，37
检测来自临床样本的细菌：在替代的实施方式中，本发明提供具有临床应用能力的方法和组合物。
利用患者样品：在替代的实施方式中，本发明提供能够以非常高灵敏度和特异性确定细菌存在的组合物和方法，包括装置。通过确定细菌的类型和/或存在，能够确定合适的抗生素治疗-和在治疗期间监控。来自血液培养的一部分被转移至无菌15ml锥形管中；可以将可能含有或者含有特定类型细菌的患者血液(例如，大约1mL)与它的各自的DNAzyme传感器胶囊封装入液滴，例如按照如以上所讨论的最优的实验方案。荧光液滴可以通过高通量APD检测器计数。对于每一种细菌靶标，可以分析总共例如10份患者样品。可以进行一系列实验以允许确定是否任何特定的系统都能可靠地检测患者血液样品中的细菌，例如假阳性率和假阴性率。
因此，在替代的实施方式中，本发明的方法、系统和装置能够以高灵敏性和选择性从患者样品中可靠地检测细菌(<10％假阳性和假阴性率)。
便携的系统：在替代的实施方式中，装置为便携的并且提供自动流体处理(即，液滴产生)，和包括光源(薄膜LED)、二极管检测器以及检测器显示器的集成电子器件(图2a)。38，39此示例性装置可以与多重一次性微流控“盒”集成，允许同时地多路复用和快速检测参与血液感染的多种类型的细菌。
在替代的实施方式中，本发明的方法、系统和装置能够检测多药抗性生物体(MDRO)或者抗微生物抗性感染，这些是主要的全球健康问题且对战斗和创伤伤员的护理构成了特别的挑战。1-2在替代的实施方式中，本发明的方法、系统和装置提供了MDRO的早期鉴定，这对通过预防疾病传播和鉴定合适的抗生素治疗来提高患者护理是至关重要的。3在替代的实施方式中，本发明的方法、系统和装置能够用于代替，或者补充，细菌培养(其需要数天得到结果)和/或基于扩增的分子诊断方法例如聚合酶链式反应(PCR；其能够将测定法时间减少到数小时，但是仍旧在检测被感染的血液中经常以低浓度例如1-100集落生成单位(CFU)/mL出现的细菌时不足够灵敏)。4，5在替代的实施方式中，本发明的方法、系统和装置能够应用在MDRO常规筛选，或者在资源受限的环境下，例如在第三世界、紧急事件、灾害形势或者战场。
实施例2：利用3D颗粒计数器-集成系统(即IC3D)检测细菌感染
下面描述了本发明的用于检测血流感染(BSI)，以及在感染早期阶段快速检测、鉴定从而处理细菌的示例性方法。
已经证实了本发明的集成的液滴系统和3D颗粒计数器系统允许在数分钟到数小时内以单一细胞灵敏度选择性检测未处理的或者最小处理的缓冲液和血液样品中的细菌。在替代的实施方式中，本系统集成了DNAzyme传感器技术、液滴微流控和高通量3D颗粒计数系统(即，集成式综合性液滴数字检测(IC3D))(图1和图2c)。此示例性组合允许在数分钟内选择性检测毫升量的血液中的单一细胞。
在替代的实施方式中，在微流控通道内，患者全血或者其它生物样品例如尿液与包括细菌裂解缓冲液在内的DNAzyme传感器溶液混合，其将被胶囊封装入数以亿计到数以数十亿计的单个皮升液滴中，如例如在图2中所示。
DNAzyme传感器为短的催化寡核苷酸，其通过体外与靶标细菌的裂解物特异性反应产生快速、实时荧光信号的选择来鉴定。在替代的实施方式中，大肠杆菌特异性DNAzyme传感器用在此例子中以选择性地检测大肠杆菌(图10)。在替代的实施方式中，示例性的体外选择技术能够产生多重DNAzyme传感器以用于各种主要的病原菌，使得多路复用细菌检测成为可能。特别地，患者血液将会与包括细菌裂解缓冲液在内的DNAzyme传感器溶液在微流控通道中混合，其将被胶囊封装入数以百万计到数以数十亿计的单个皮升液滴中。DNAzyme传感器将会在含有细菌的液滴中瞬时发出荧光，这将通过高通量3D颗粒计数系统检测并计数，所述系统能够在数分钟内从毫升体积中强劲且精确地检测单一颗粒(图2b和c)。得到的荧光液滴进而能够以异常高的稳定性和临床相关通量被检测。
在替代的实施方式中，单一细菌划分进液滴显著地增加了靶标分子的浓度，允许无需例如PCR的扩增过程的快速检测和单一细胞灵敏性。在替代的实施方式中，如此划分的、靶标特异的反应对“点亮”含有靶标细菌的液滴，以使它们能够通过3D颗粒计数系统被检测而言是非常必要的步骤。在替代的实施方式中，本发明用于数分钟内在毫升体积中单一液滴分析的示例性3D颗粒计数系统的异常稳定性和精确性绕过了许多现有的颗粒计数技术，尤其是遭受限制的灵敏性和高假阳性率的流式细胞术所面临的挑战。
在替代的实施方式中，含有靶标的荧光液滴能够在3D颗粒计数系统中利用例如光学镊子、光学捕捉器和光学晶格分选。这使得分选的靶标能够进一步被处理和分析。
现有的1D片上液滴计数系统(其也用在液滴数字PCR系统中)和其它包括流式细胞术在内的颗粒计数系统遭受低通量：它们通常以每秒1000s颗粒运转，且只能够分析总数100,000s到1百万个液滴(或者几十微升的总样品体积)。31，34因此，现有的液滴检测系统不可避免地在液滴胶囊封装之前，需要样品制备以纯化和富集靶标，并降低样品体积。然而，在本系统中，想要快速地分析通常翻译为高达数以十亿液滴的毫升量的临床样品的未处理的生物样品(例如血液)。为了在短时间内，在本发明的集成式综合性液滴数字检测(IC3D)系统中有效地分析这些诸多液滴并从数以百万的空液滴中检测单一荧光、含有细菌的液滴，如早先描述的集成了能够数分钟内以单一颗粒灵敏性从毫升中检测荧光颗粒的3D颗粒计数器21。
图17示出了本发明的示例性3D颗粒计数系统的示意图。在替代的实施方式中，双通道设置用于同时的红色和绿色荧光检测以快速定量颗粒总数。
在替代的实施方式中，该设备包括具有水平几何结构的小型显微镜和支撑直径1cm的圆柱形试管的机械套筒。两个马达提供试管转动和垂直运动。软件使得转动速度在10-1100rpm范围内变化并且垂直速度在1-15mms-1的范围内变化。垂直和转动运动分别通过线性执行器和VEXTA步进电机模型PK233PB产生。这些马达连接到支撑含有样品的透明试管的台上。通过激光器产生的激发光聚焦于观察体积处(见照片)。激发焦点置于试管内并且相对靠近试管壁，距离壁大约1mm。可以调整这个距离以使得颗粒检测和分析即使在高散射介质中也能够实施。激发源为在469nm或532nm发射的两束二极管激光。因此，当在观察体积中时，颗粒发出荧光。采用与在物镜前的样品容器的简单机械运动联合的共聚焦显微镜，提供了不需要包括可移动光学组件的复杂光学系统，来移动并分析含有颗粒的样品通过观察区域的手段，所述可移动光学组件例如平移光学源、镜子或光电倍增器。来自两个激光器的发射光通过一套二色滤光片ZT532nbdc和Z470rdc组合成一个通路，并通过20×0.4NA空气物镜引导到相同激发量。自样品发出的荧光通过相同的物镜收集，通过整套二色滤光片传输，通过透镜聚焦进入大的针孔(直径＝2mm)，然后通过第二个透镜校准到检测器。在通过两个光电倍增管(PMT)检测发射束之前，二色分光镜T550lpxr-25mmNR将发射束分开成两个光路。双发射滤波器(FF01-HQ500/24-25和LP5600)置于每个PMT之前。来自PMT的信号被发送到模拟数字转换器(ADC)和采集卡。采样频率设置为100,000Hz，对应于10μs的时间分辨率。
在替代的实施方式中，显微镜的光学被设计为在大约0.01ms测量相对大体积(100pL)。试管以螺旋运动转动大约100秒使得可以有效地研究试管的大约1ml。当采用这种示例性光学设置时，所述装置只是穿透样品150μm。因此，能够容易处理强散射样品，例如对于250μm路径长度在500nm具有大约10％的透射率的全血(甚至在利用稀释前)。
在替代的实施方式中，本发明提供了本发明包括允许多路复用和并行分析的自动、便携装置的示例性IC3D系统可选的设计(图32和图33)。在替代的实施方式中，所述装置包括多重激光光源和能够在不同波长读取的检测器。所述多路复用系统能够允许同时读取编码用于不同病原体的多重传感器(标记为不同的颜色)。也可以在该设备中添加能够容纳多个样品瓶的转盘以用于实施平行测试。
正如先前描述的(参见例1)，胶囊封装了细菌刺入的血液和DNAzyme传感器进入液滴。靶标特异性反应的划分对“点亮”液滴“反应堆”是一个至关重要的步骤，所述液滴“反应堆”含有靶标细菌以至于能够通过3D颗粒计数系统检测它们。将液滴收集到试管中(图14d)，并且进而利用3D颗粒计数系统分析。采用此系统，已经阐明了能够在3分钟测量时间内从典型的2ml样品体积中以单一液滴灵敏度检测含有单一靶标大肠杆菌K12和DNAzyme传感器的液滴(图23a，b)。目前的系统通常以～100,000s液滴每秒的通量或者以～0.1ml每分钟的有效观察量运转。以此高通量，在本实验中因血液稀释造成的样品容量增加变得不再是一个问题。图23b示出了典型的获自含有细菌液滴的荧光强度尖峰的时间轨迹。
在替代的实施方式中，本发明包括用于IC3D测定法的模式识别算法(图23b插入框)和信号校正(图22和图23d)。在本IC3D测定法中，通过模式识别算法(图23b插入框)而非临界强度定义“命中”的检测(所述临界强度广泛用于传统的1D颗粒技术系统(例如BioRadddPCR系统)和典型地遭受高假阳/阴性率，因为所述强度依赖于多种因素，包括激光器和检测器)。简单来说，荧光颗粒(在本文章中的液滴)通过在光照体积中这段颗粒产生的“峰”来检测，这是Gaussian为本仪器提出的。在软件SimFCS(LaboratoryforFluorescenceDynamics,Irvine,CA,availableatwww.lfd.uci.edu/globals/)中实施的模式识别检测这段颗粒的时间以及检测模式的幅度。预先利用含有DNAzyme传感器的荧光液滴已经与细菌(所述“标准”)反应，本模式识别算法能够自动过滤噪音并且只报告真正的含有细菌的荧光液滴。如此的模式识别使得能够实现大样品体积中低浓度荧光液滴的异常稳定和精确的检测，这从根本上转化为零假阳性率(即一个“碰撞”即使在亿万空液滴中通常为真阳性)。这得到了对于对照样品总计数0的支持的，所述对照样品包括不带有细菌的(n＝5)或者非靶标临床细菌裂解物刺入的(n＝8)健康供体血液样品。在替代的实施方式中，本发明利用已经与细菌或者FITC反应的含有DNAzyme传感器的荧光液滴，提供了建立用于3D颗粒计数系统的校正曲线的方法。
为了确定在本IC3D系统中在未处理血液中检测细菌需要的最小DNA酶反应时间，利用3D颗粒计数器监控来自2ml液滴溶液随时间的信号(图23c)。发现在短短的45分钟的DNAzyme反应时间中，IC3D测试能够产生“是或非”结果，而这通常需要3.5小时才能提供关于样品中细胞数量的绝对定量数据。
接下来阐明了本系统能够在每毫升从1到10,000细菌的极低浓度的广泛范围以单一细胞灵敏度和在个位数制中异常检测限(LOD)提供靶标细菌的绝对定量(图23d)。在液滴的检测量和血液样品中刺入的靶标细菌的实际浓度之间有着异常的线性关系。关于在这些阳性样品中的假阴性率和分析误差，对于每毫升10-10000细胞的浓度，尽管存在分析误差，通常仍能够检测靶标大肠杆菌，例如，在“是或非”测试中报告为“阳性”，具有实质上0假阴性率。以每毫升1细胞为例子，本测定法通常在该时间检测～77％细菌。值得注意的是测量的时间可以延长以降低误差。20，21因此，LOD位于个位数制中。
为了证实潜在的临床能力，利用获自阳性血液培养的临床细菌分离物测试了本系统。发现IC3D系统能够以类似于观察阳性对照大肠杆菌K12的性能，选择性地且简单地检测临床大肠杆菌分离物(图24)。
在替代的实施方式中，本发明的示例性方法和系统包含作为用于生长缓慢生物体(例如结核分枝杆菌)的检测和筛选平台的单一细胞检测。
在替代的实施方式中，本发明的示例性方法和系统作为平台技术，在其中能够采用其它类型传感器以选择性地且灵敏性地检测血液中包括细胞(例如细菌、循环肿瘤细胞和干细胞)，病毒和其它几乎低丰度分子靶标在内的任何类型的罕见物种。
在替代的实施方式中，除了DNAzyme传感器，用于已知靶标基因或者分子的其它传感器系统(例如数字PCR)也能够与本液滴微流控和3D颗粒计数系统集成用于快速单一细菌检测。
在替代的实施方式中，靶标细菌能够在液滴中进一步培养并增殖以在测量之前扩增信号(图13)。
在替代的实施方式中，能够优化一个或多个参数，包括液滴大小、反应时间、传感器浓度、荧光团/淬灭剂对、血液稀释因子扫描时间(1-10min)、RPM(200-1000)和PMT(光电倍增管)(200-800)，以达到最佳性能(例如，信号/背景比、灵敏度、LOD和测定法时间)，如图18、19和20所示。多色传感器系统的采用能够进一步最小化假阳性/阴性率。由于更小的液滴大小导致来自单一细胞更高靶标浓度，增加了信号/背景比并降低了检测时间，特别地比较了10、20和50μm三种不同液滴大小的性能。对于液滴测定法，能够采用多种DNAzyme传感器浓度(例如10、50、100、200和500nM)以达到检测时间和信号/背景比的最佳平衡。稀释后生物样品(例如血液)浓度可以为5％-50％范围。
在替代的实施方式中，本发明提供了完全集成的IC3D系统，所述系统为台式、单步、由三个主要组件(图32和图33)组成的样品到结果诊断(sample-to-resultdiagnostic)，所述三个主要组件为1)细菌检测DNAzyme传感器，2)高通量高效率(HT-HE)胶囊封装系统(图33a和b)。例如，能够容纳高达256通道的成本有效的模块化微流控系统，允许在<15分钟内胶囊封装3mL样品，和3)3D颗粒计数器以快速测量来自大体积的小量含有细菌荧光液滴(图33c、d)。在替代的实施方式中，本发明包括(a)硬件的设计以便于使得它变得便携(即为有较小空间并带有集成到仪器的计算机)；(b)用于胶囊封装靶标细菌的液滴形成的微流控组件的集成；和(c)在人体工程学中的提升以使得所述仪器对一般的护理提供者和人员是可用的。这方面包括所述仪器的所述硬件设计和分析软件。为了操控系统，混合无菌全血样品与DNAzyme传感器和细菌裂解(溶菌酶)溶液，并加载到压力室。基于PC的控制系统将进而加压所述室并注入样品和连续相油到液滴中形成芯片。由此产生的液滴将进而被收集到试管并利用3D颗粒计数器计数。数据(即样品中细菌数量)将通过定制软件处理并显示在计算机屏幕上。以上描述的系统在未来的应用方面是丰富的。颗粒计数器中的三个激光器使得同时读取三种不同传感器(和分子靶标)成为可能。例如，CRE和ESBL传感器可以被一起以混合物形式用于确定在样品中的单个细菌是否含有一种、另一种或者同时两种抗性机制，并且定量特征意味着记录了每个组合的绝对浓度。第三传感器或染料可以被用于作为内部质量或定量参考，其组件通过仪器的试剂以已知量添加。由于所述测定法能够处理高达数毫升的血液，IC3D灵敏性可以允许每个测定法采用比为传统测试通常采用的5-10mLs更少。这将开启在一个血液描绘中进行更多特异的测定法的大门。另一方面，如果需要，可以增加试管大小以处理更大的血液量。
实施例3：利用荧光底物通过IC3D检测抗微生物抗性
作为平台技术，IC3D系统能够集成其它传感器方法(例如酶测定法，PCR和等温信号扩增)与液滴微流控并且3D颗粒计数器能够作为用于生物样品中几乎任何类型的低丰度标志物的快速检测和分析的平台，所述生物样品包括细胞(例如细菌、循环肿瘤细胞和干细胞)，细胞外囊泡(例如胞外体)，病毒(例如HIV)，和分子标志物(例如核酸和蛋白质)(图1)。
在替代的实施方式中，本发明提供采用针对β内酰胺酶和碳青霉烯酶的荧光底物用于抗微生物抗性的IC3D测试，参见例如图26。这些测试使得能够快速地在大多数普遍存在的抗微生物抗性病原菌中检测广谱β内酰胺酶(ESBL)产生-肠杆菌和碳青霉烯酶抗性肠杆菌(CRE)
实施例4：用于癌症，例如CT，胞外体、核酸、蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、小分子、金属离子的微胶囊封装的检测
在替代的实施方式中，本发明提供了用于常规检测和监控癌循环肿瘤细胞(CTCs)，其它标志物和癌症例如，核酸、蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、小分子、属离子(图3，4，和5)的IC3D测试，这比现有技术更加有效和简单。
对于许多癌，例如乳腺癌，超过90％的死亡是由于远端器官转移。由于转移是多步骤过程，在其中传播癌细胞必须在运输通过全身循环系统时存活，最近针对用于早期诊断、预后和监控疾病过程的CTCs分析和定量得到关注。由于CTCs非常稀少(每107个粒细胞一个CTC)并且异质性，传统的流式细胞术和免疫学方法(例如CellSearchTMplatform)是复杂、昂贵且耗时的，并且最重要的是缺少在临床设置中稳定检测CTC的灵敏性和特异性。在替代的实施方式中，本发明提供了数分钟到数小时内在无处理或者最小处理的患者血液样品中以单一细胞灵敏度选择性检测CTCs的平台技术。在替代的实施方式中，本发明提供了集成新颖的荧光传感器技术、液滴微胶囊封装和3D颗粒计数器(即IC3D)的系统。这些传感器包括例如DNA传感器被改造为与靶标CTCs裂解物或者完整靶标CTCs特异性反应，导致快速、实时荧光信号。患者样品(例如血液)能够与包括细胞裂解缓冲液在内的传感器溶液混合入微流控通道中，这样能够被胶囊封装入数百万单个皮升液滴中。同时本发明并不被任何机制限制，CTCs在液滴中的约束显著地增加了靶标分子(例如Her2和EpCAM)的浓度，所述靶标分子能够以快速、实时的方式被传感器检测。因此，本发明的方法和系统代表了一种新的CTC检测模式，这将会有潜力成为一种用于癌症诊断和预后，以及治疗期间监控疾病过程和药物效力的强大的工具。
在替代的实施方式中，本发明提供了微胶囊封装的传感器系统以检测临床中罕见的癌CTCs。在替代的实施方式中，液滴微流控与传感器集成用于以单一细胞灵敏度快速癌CTC检测。在替代的实施方式中，经鉴定为特异性检测癌生物标志物(例如Her2、EpCAM、CK19和MUC1)的荧光DNA传感器与液滴微流控系统集成；在其中液滴中的单一CTC的约束能够显著增加灵敏性并缩短检测时间。来自缓冲液和刺入的全血的CTCs的单一细胞检测能够被优化。
为了验证示例性装置检测来自临床样本的CTCs能力：与患者诊断相关联地使用患者血液样本以确定测定法的选择性和特异性。关于CTC检测选择性、特异性和测定法时间，利用流式细胞术和CellSearchTM平台进行的头对头比较。
本发明提供了适合在常规基础上快速且简单的CTC检测以及癌症例如乳腺癌筛选的平台技术。在替代的实施方式中，本发明的组合物、系统和方法用于测序、个性化诊断和医学，例如用于检测CTCs。在替代的实施方式中，本发明的组合物、系统和方法用于基因分析，例如检测单一细胞基因或残疾突变，或者用于检测mRNA表达。在替代的实施方式中，本发明的组合物、系统和方法用于研究和检测基于例如基因或残基突变或mRNA表达水平的单一细胞异质性。
在替代的实施方式中，细胞保持完整没有裂解，这使得也可以采用其它测试或者测定法，例如免疫染色或者蛋白谱。当作为“完整”细胞采用时，试剂(例如传感器，酶)可以通过病毒或者非病毒路径(例如转染试剂，纳米颗粒)输送到细胞。在替代的实施方式中，此发明包括在液滴内以单一细胞水平实施高通量细胞工程的方法。例如，已经阐明了MCF7能够与包含GFP表达载体的转染试剂胶囊封装并改造为表达GFP(图31)。在细胞保持完整的情况下，它使得能够同时检测和分析包括细胞内的、细胞表面和分泌标志物在内的多种类型标志物以及关联它们的表达和功能。
在替代的实施方式中，采用多重酶反应，这可以给出强烈且高的特异性信号。在替代的实施方式中，能够在血清中实施等温反应包括例如滚环扩增(RCA)反应，促进血液中CTCs直接检测(例如参见图8和图9)。在替代的实施方式中，本发明提供代替例如仅仅采用细胞表面标志物，用于在单一细胞水平检测基因突变和mRNA表达的系统和方法(图5)。在替代的实施方式中，PNA开启器以及类似物可以用于提供帮助。本发明的单一细胞基因检测和测序测定法、系统和方法提供了用于个性化诊断和治疗的强大的新工具。
在替代的实施方式中，癌细胞，例如CTCs，可以通过它们的细胞表面、细胞内和分泌蛋白(例如参见图3)或者机械特性表征或者检测。图3示意性示出了本发明的示例性方法，包括通过本发明的示例性集成的液滴胶囊封装和3D颗粒检测系统检测单一细胞和包括细胞表面、细胞内和分泌标志物在内的单一细胞标志物。
在替代的实施方式中，癌细胞例如CTCs，可以通过检测癌症标志物表征和检测，所述癌症标志物例如癌蛋白(例如前列腺特异性抗原(PSA)、Her2、EpCAM、CK19和MUC1)、游离核酸(例如DNA、mRNA、miRNA和SNP)、细胞源性颗粒(例如胞外体、微囊泡、凋亡小体)、脂质、碳水化合物、肽、酶、小分子和离子(图4和图5)。
图4示意性示出了本发明的示例性方法，包括通过本发明的示例性集成的液滴胶囊封装和3D颗粒检测系统的检测细胞源性颗粒(例如胞外体、微囊泡、凋亡小体)和它们的标志物。
图5示意性示出了本发明的示例性方法，通过本发明的示例性集成的液滴胶囊封装和3D颗粒检测系统检测包括细胞游离标志物，包括但不限于，核酸、蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、小分子、金属离子等。
在替代的实施方式中，本发明的方法进一步包括采用(能够用于联合)利用已知测定法的癌细胞和标志物检测，所述已知测定法包括基于核酸的、基于抗体的、基于酶的、或者基于化学的以及类似的测定法。生物样品在先于液滴胶囊封装之前可以首先通过例如梯度离心、清洗、富集、细胞裂解、磁珠捕获和分离、提取被处理以减少体积并提高纯度，并随后分析。
在替代的实施方式中，本发明的方法包括检测、追踪、监控单一移植细胞，包括例如干细胞和癌干细胞。在替代的实施方式中，将被移植的细胞可以设计为具有探针(例如酶，蛋白质)，探针能够被分泌到血液或者尿液中，在那里它们可以通过IC3D检测到。在替代的实施方式中，将被移植的细胞可以设计为具有位于生物信号事件中下游的探针，以致仅仅当生物信号事件被打开时，探针才能够被激活和产生。
在替代的实施方式中，本发明的方法进一步包括核酸标志物(细胞内和细胞游离循环形式)的检测，所述核酸标志物包括mRNA、DNA、miRNA、SNP等，其可以通过PCR、RT-PCR、RCA、环介导等温扩增(LAMP)、切口(例如指数扩增反应(EXPAR))、链置换、指数等温扩增和杂交、分子信标、适体、DNAzyme，或者其它实时荧光传感器检测。在替代的实施方式中，结合分子信标和切口酶反应的RCA可以用于检测核酸标志物和它们的突变，例如参照图6和图7。
图6示意性示出了本发明的示例性方法，包括采用锁式探针结合切口酶反应的液滴中核酸检测。在替代的实施方式中，本发明的方法进一步包括一本发明的示例性方法，其包括AmpligaseTM(EPICENTRE,Madison,Wisconsin)连接的测试和优化，随后利用切口酶反应用于DNA突变检测。
在替代的实施方式中，本发明的方法进一步包括本发明的一示例性方法，其包括AmpligaseTM(EPICENTRE,Madison,Wisconsin)连接的测试和优化，随后利用切口酶反应用于DNA突变检测。
在替代的实施方式中，本发明的方法进一步包括本发明的一示例性方法，其包括T4连接酶连接的测试和优化，随后是切口酶反应。
在替代的实施方式中，本发明的方法进一步包括本发明的一示例性方法，其包括大肠杆菌连接酶连接的测试和优化，随后是切口酶反应。
在替代的实施方式中，本发明的方法进一步包括mRNABRAFV600E突变检测作为例子。在此测定法中，继RCA反应后，信号可以通过包括基于DNAzyme、链置换或者切口酶在内的各种方法被扩增并产生。
核酸标志物和突变也能够通过PCR和RT-PCR检测。例如，已经阐明了利用PCR的反应检测BRAFV600E突变和BRAFG464V，例如参见图27。
已经阐明了PCR能够实施于血浆和血液样品，例如参见图28。
还阐明了Let-7a通过聚合酶链延伸和单链切口反应组合采用指数扩增反应(EXPAR)，例如参见图30。简单来说，循环miRNAs用于包括癌症和神经系统疾病在内各种疾病的新兴生物标志物。分析和定量血液中的miRNAs能够潜在地应用于早期诊断、监视监控、和药物反应评价。采用Let-7a作为靶标，阐明了IC3D能够在≤2小时内在10到10,000拷贝/mL的极低浓度范围内精准地直接定量靶标miRNA。采用这种新工具，进一步阐明了靶标miRNA含量在结肠癌患者样品中显著地高于在健康供体样品中。本测定法也能够高特异性地区分同一家族中microRNA的单核苷酸差异。更特别的是，研究了用于miRNA检测的液滴中指数扩增反应(EXPAR)。液采用标准软光刻法设计和制造滴微流控装置，并如先前所描述的进行操作。将10％血浆样品和感测试剂(DNA模板、DNA聚合酶(Vent(exo-)))、剪切酶(Nt.BstNBI)、EvaGreen和脱氧核糖核苷酸(dNTPs)混合到微流控通道中并进而利用流动聚焦机制形成均匀大小(在此工作中为直径30μm)的液滴。如果给予充分的时间，EXPAR反应具有非特异性背景扩增，为了鉴定产生带有最小背景的最大靶标特异性荧光信号的最佳检测时间，首先研究了用于单一miRNA检测的液滴中EXPAR动力学。发现在大约反应40分钟左右一些液滴开始在Let-7a样品中点亮。在50分钟，荧光液滴数量在Let-7a中增加到预测数目(在10fM大浓度每113个液滴10个)同时Let-7b和空白样品仍旧几乎没有荧光液滴。但是，在反应60分钟，一些非特异性信号开始出现。这一系列数据使得1)证实了液滴中单一miRNA检测的可行性和2)确定50分钟作为用于随后液滴测量以从非特异性信号中最好区分出靶标信号的最佳EXPAR反应时间。图30a示出了典型的获自含有Let-7a的液滴或对照的荧光强度峰时间轨迹。为了提取样品中液滴的浓度和/或亮度的测量，利用在软件SimFCS中实施的模式识别算法来分析由光电探测器产生的时间谱(图30a，中间板，插入框)。所述模式识别算法将时间谱中的振幅和形状特征匹配到预定模式中，所述预定模式的特征为通过液滴观察量时的时间依赖荧光强度。如此的模式识别使得能够获得大样品量中低荧光液滴浓度的异常地稳定和精确检测。接下来阐明了IC3D能够在～10到10,000拷贝/mL的极低浓度的广泛范围内以单一分子灵敏度和10拷贝/mL左右检测限(LOD)提供靶标Let-7a的绝对定量(图30b)。在检测的液滴数量和刺入血浆样品中的靶标miRNA实际浓度之间有着线性关系。IC3D测定法的LOD比目前的～105拷贝/mL(即在fM范围内)黄金标准RT-qPCR低几个数量级(图30c)。还要注意的是RT-qPCR不能直接采用血浆样品操作，并且需要miRNA提取和纯化。为了阐明IC3D的潜在临床应用，使用来自结肠癌患者和健康供体的血浆样品。所述血浆样品首先采用EXPAR进行大量测试并阐明了虽然不能够很好地区分健康供体和结肠癌患者样品间的荧光扩增曲线，但EXPAR还是能够用于10％血浆中的直接检测。然后IC3D用于测量3份重复结肠癌患者样品(或者健康捐赠者对照)中的Let-7a浓度，并阐明了IC3D能够简单地直接从血浆中定量靶标miRNA含量，如采用RT-qPCR对相同样品所验证的(图30d)。RNA酶处理的血浆也被包括在内作为阴性对照以确认荧光液滴是由于靶标Let-7a。有趣的是，发现如通过IC3D(其与大量EXPAR是没有区别的)数字定量的那样，Let-7a含量在结肠癌样品中统计上显著高于在健康捐赠者样品中。在癌样品中更高水平的Let-7a(虽然被认为是肿瘤抑制剂)[17]可能是由于更高的从肿瘤脱落进入血流中的胞外体和miRNA含量。[18]
在替代的实施方式中，本发明的方法用于检测蛋白标志物(细胞表面上或者分泌的)，例如，它们可以通过基于抗体的ELISA、基于夹心、免疫染色、抗体捕获、第二抗体扩增、基于邻近连接、适体、DNAzyme或者其它实时荧光传感器检测。
在替代的实施方式中，本发明的方法用于例如通过基于标准邻近连接测定法，其后可以进行信号扩增，来检测细胞表面和游离蛋白标志物(例如检测EpCAM和Her2)。在替代的实施方式中，PSA可以通过实时DNA传感器或者采用荧光底物检测。
实施例5：利用不具有液滴的3D颗粒计数器检测并分析细胞或者生物标志物
在替代的实施方式中，本发明提供利用具有或不具有直接集成3D颗粒检测器的信号扩增的靶标检测过程的快速和灵敏的系统或方法，所述系统或方法用于检测生物学、生理学或病理学的标志物，或者单一分析或单一细胞(图8)，包括：
特征：
本系统拥有以下传统检测测定法不能够轻易达到的独一无二的特征：
1)低丰度标志物(例如1-1百万/mL)
2)能够审查大样本量(微升到毫升)并且高通量
3)快速(数分钟到数小时)；
4)宽泛的检测范围
5)多路复用
6)无需或者需要最小的样品制备。
样品：
1)其中生物样品包括来自患者的血液、血清、唾液、泪液、粪便、尿液或者CSF样品
2)其中样品获自食品、水和空气。
样品制备
样品可以直接地进行测定无需或者需要最小(例如稀释)处理。
标准的、已建立的生物样品制备过程包括稀释、纯化、富集、提取、离心、细胞裂解、磁珠测定法和洗涤步骤，虽然不需要，也可以集成入本发明试验中。
靶标：
能够通过本发明的系统检测和分析的靶标样本包括，但不限于(图8)：
细胞(例如癌细胞、干/祖细胞、免疫细胞)，病原体(例如细菌、多药抗性生物体(MDRO)、结核杆菌(TB))，病毒(例如HIV)，细胞衍生囊泡(例如胞外体、微囊泡、凋亡小体)，核酸(例如SNP、突变、表达)，蛋白质(例如PSA)，酶(例如MMPs)，肽，脂质，碳水化合物，多糖，小分子或者金属离子。
靶标样本的形式包括细胞表面的(例如EpCAM,N-cadherin,CD44,CD24)，胞内的，以及分泌的标志物(细胞分泌)，细胞游离循环标志物(例如miRNA、DNA、蛋白标志物)，代谢标志物，机械标志物(例如细胞变形性、硬度、细胞骨架等)。
除了所表达的内容，本发明的系统还能够用于检测或者监控生物学事件，例如DNA杂交、蛋白受体-配体相互作用、酶-底物相互作用、以及细胞表面受体二聚化(包括同源和异源聚合)、共定位、或者与可溶性配体和药物和另一种细胞的相互作用。
靶标检测测定法
有多种多样已建立的能够利用于本系统选择性地检测靶标用于3D颗粒计数器分析的荧光生物分析方法。所述分析方法包括，但不限于，(图8)。基于核酸、基于抗体、基于酶、基于纳米颗粒、基于珠子或者组合采用等。
以下给出了一些更具体的例子：
基于核酸的测定法包括杂交、分子信标、适体、DNAzyme传感器、或者其它实时荧光传感器。
基于抗体的测定法包括ELISA、基于夹心、免疫染色、抗体捕获、扩增、或者基于邻近连接。
基于酶的测定法包括PCR、RT-PCR、RCA、环介导等温扩增(LAMP)、切口、链置换、以及指数等温扩增(LabChip,2012,12,2469-2486)。在一些情况下，靶标自身例如PSA或者MMPs可以作为酶以触发检测过程。
在基于RCA的检测中，靶标识别结合物是生物的或者化学的部分，包括适体或抗体。RCA可以为直线的或者分支的(即指数式扩增)。RCA产物可以通过染料、纳米颗粒或者量子点来装载、染色和分析。
3D颗粒计数器
3D颗粒计数器可以为如图17所示的仪器系统或者用于护理应用的便携式系统。
本发明的集成的示例性系统
本系统可以改造成具有理性的便携性、自动流体处理、以及具有3D颗粒计数系统的集成电子器件，包括二极管激光器(光源)、APD(检测器)、操作(vinci,ISSInc.)&数据分析软件(SimFCS)、显示器。这种构想的装置也能够与多功能一次性微流控“盒”集成，允许多路复用和多类型靶标同时快速检测。所述装置可以为全自动的，并且可以制备为一体化系统或者带有模块化组件。它也能够连接于智能手机和蓝牙等以用于护理应用(图32和图33)。
应用
本发明的新颖的靶标检测过程的方法(具有或不具有信号扩增)和3D颗粒计数系统是创新的和强大的：它允许数分钟内在毫升体积生物样品中选择性检测靶标样本，这是目前不可能的。因此，相信该技术具有改革如何检测和分析低浓度生物颗粒和标志物的潜力，并能够利用于多种多样的生物检测分析和诊断应用中，包括，但不限于：
-病原体(细菌、病毒、真菌等)感染疾病。皮肤感染、伤口、糖尿病性溃疡、HIV、细菌、TB、MDROs(例如MRSA)
-癌症
-糖尿病
-阿尔茨海默氏病(例如，β淀粉样物、Tau蛋白)；
-炎性和自身免疫疾病(例如，CD4T细胞、免疫细胞计数)；
-干细胞和再生医学(例如，间充质干细胞、内皮祖细胞、造血干细胞，或细胞可以为内源性和外源性移植的细胞)；
-心血管疾病(例如，C反应蛋白(CRP)、B型钠尿肽(BNP)、肌钙蛋白、胱抑素C、IL-6)；
-药物滥用(例如，四氢大麻酚、THC)；
-新生儿筛选
所述系统也能够用于研究新生物学，细胞-药物相互作用和药物易感性，以开发新的药物和治疗学方法以及监控疾病进展和治疗有效性或者用作联合诊断，以及用在测序，个性化诊断和医学中。
除此医学应用以外，本系统也能够用于其它领域，包括食品工业、农业、水系统、空气系统以及国防应用。
具有3D颗粒计数器的滚环扩增耦合检测：
在替代的实施方式中，本发明包括集成了滚环扩增(RCA)和3D颗粒计数器的新型检测系统(图9)。RCA是一种简单且高效的等温酶法，其利用了独特的DNA和RNA聚合酶(Phi29,Bst和Ventexo-DNA聚合酶用于DNA，且T7RNA聚合酶用于RNA)以产生长单链DNA(ssDNA)和RNA(RollingCircleAmplification:AVersatileToolforChemicalBiology,MaterialsScienceandMedicine,Ali,etal.Chem.Soc.Rev,DOI:10.1039/C3CS60439J.)。RCA可以用于检测各种靶标，包括DNA、RNA、DNA甲基化、SNP、小分子、蛋白和细胞。RCA可以以线性或者超支化指数方式实施。RCA产物可以被调整具有不同的长度、大小、序列和结构。RCA产物可以通过染料、探针、纳米颗粒或量子点来装载、染色和分析。生物标志物(例如细胞、囊泡和分子)可以通过RCA(例如通过如图9所示的基于邻近连接方法)检测和扩增，并且进而利用3D颗粒计数器分析和检测。
利用3D颗粒计数器的癌细胞检测
生物样品中的细胞，例如癌细胞可以被染色、处理以及通过3D颗粒计数器定向检测(图29a)，对于检测灵敏性和检测限，这相较于包括流式细胞术在内的传统测定法更加高效(图29b)。
实施例6：体外演化以产生癌特异性DNAzyme传感器
下面描述了本发明的包含体外演化产生癌特异性DNAzyme传感器的示例性方法。
本发明提供了利用强大体外演化以产生可靠的、基于DNAzyme传感器的癌症诊断学技术，如图34所示。在替代的实施方式中，采用癌症或者正常血液样品分别作为阳性和阴性选择靶标的多轮富集能够鉴定特异性识别重要(或独特框架)的分子签名的DNAzyme传感器，所述分子签名可以从正常样品或其它具有相关症状的疾病中区辨出癌症。
图34示出了本发明用于例如癌症诊断学的DNAzyme传感器体外演化示例性方案：a)设想的混合-读取，DNA传感器癌诊断学和它们的应用。b)DNAzyme传感器机制：它与靶标相互作用产生荧光信号(F为Fluorescein-dT。R为核糖核苷和Q表示dabcyl-dT)。c)体外选择过程示意图。首先，随机DNA文库连接到底物并与正常血清孵育以从文库池去除任何非特异性序列。纯化未切割的序列并利用癌血清应用于阳性选择。纯化被癌血清切割的分子并利用PCR扩增。在纯化之后，总体连接到底物并应用于下一轮选择。
在替代的实施方式中，本发明的方法和系统能够用于临床中检测几乎任何种类的癌症(图34a)。如此简单和便宜的目前不可获得的血液-测试能够轻易地合并到常规身体检测中以在显性症状出现之前筛选癌活性。这种早期干预将进而显著地增加治疗癌症的机会和降低死亡率。本发明的这些能够在治疗和监控药物效力和安全性期间报告癌症进展的示例性测定法可以作为用于治疗指导和药物发现的工具。因此，实施本发明的方法和系统能够增加患者生存期、提高生活质量并降低与患者护理相关的财政费用。
在替代的实施方式中，本发明的用于例如癌传感器筛选的方法和系统相比于目前的技术(例如蛋白质组生物标志物技术)具有许多创新特征。强大的体外选择技术和靶向复杂癌血清的组合作为整体使得能够开发通用且可靠的诊断方法，不需要鉴定任何特异性生物标志物。给定DNAzyme的活化剂可以为蛋白质、核酸、小分子或金属颗粒等。这是特别有利的，因为它使得能够绕过从极其复杂的混合物中纯化靶标的繁琐过程以用于开发检测方法：即一旦分离DNAzyme传感器就能够立即用于癌症诊断。用于鉴定DNAzyme传感器的多轮富集和扩增的必要性不仅仅最小化了传统生物标志物发现方法(例如2D凝胶电泳，以及MS)1-3中出现的高比率假阳性和阴性结果，还使得能够鉴定一些癌症和正常组织之间存在的适度差异。还可以混合多种患者的血清样品在一起作为靶标，以便于绕过患者之间的非特异异质性，并且进而真实地鉴定唯一区分癌症和正常样品的分子差异。此外，本系统具有在相同富集的文库池中同时产生多重DNAzyme传感器的潜力，所述相同富集的文库池应答于一组分子签名，所述分子签名共同检测癌症，其相比于其它基于单一生物标志物测定法具有显著更高的灵敏度和特异性。最后，得到的测定法具有许多吸引人的特征，其中一个为它固有的快速、实时、混合-读取的性质，这在常规基础上用于快速筛选和癌症监控是理想的。
在替代的实施方式中，DNAzyme传感器可以向最佳性能(例如信号/背景比和稳定性)优化以用于例如在全血中工作。在替代的实施方式中，本发明提供基于血液的诊断学以灵敏性和特异性地从健康对照中区分出癌症病例。可以实施回顾和纵向研究以进一步确认和测试与标准临床诊断和血液测试(例如用于在文献中发现的潜在蛋白生物标志物ELISA)相关的试验性能。DNAzyme传感器的灵敏性和特异性能够通过迭代、再选择过程优化。
体外演化
文库设计。含有大约1014随机序列的DNA文库用于分离DNAzyme传感器。如图34c中所示，所述文库由连接到荧光的DNA-RNA嵌合底物的40个核苷酸的可变区(蓝色)组成。10底物含有单一核苷酸(核糖腺苷)作为切割位点，所述切割位点分别以荧光团(Fluorescein-dT)和淬灭剂(Dabcyl-dT)为侧翼。理论上，仅在靶标患者血液出现时，文库中的特异性DNA序列(例如DNA酶)存在并切割该核苷酸连接，因而产生荧光信号。可以采用T4DNA连接酶按照先前实验步骤连接随机结构域和底物。值得注意的是，文库的5’和3’端固定序列结构域分别被并入作为正向和反向PCR引物结合位点。10文库和所有其它寡核苷酸在使用之前通过凝胶电泳纯化。
阳性和阴性靶标。非小细胞肺癌(NSCLC)由于它的高死亡率和早期诊断的迫切需求被用作模型系统。1-3获得年龄和性别匹配，不吸烟的健康供体样品。选择混合多个患者的样品在一起以便于最小化患者和分析前变化之间的非特异性变化，并且因此只选择通用(用于癌症的相同阶段/类型)和特异性(在癌症患者和健康捐赠者之间)的DNAzyme传感器。为了避免血型抗原的不兼容，血清样品被用在选择过程中。混合的血清样品通常用在生物标志物探索中并且不产生不利影响(例如无免疫应答被观察到)。38特别地，将10个NSCLC患者血清样品(每个0.5ml)(或者健康供体血清样品)彻底地混合、分装、存储在-80℃，并在整个选择过程中使用。
选择。如图34c中所示，体外选择可以通过孵育起始文库(图35)(1nmol)和健康供体血清(200μl)(阴性选择)开始以去除非特异性DNA酶，所述非特异性DNA酶在对所有人通用的血液中在靶标分子不存在时自我切割，或者在非特异性分子(例如金属颗粒、ATP、白蛋白)存在时切割。阴性选择可以在选择缓冲液(50mMHEPES，150mMNaCl，15mMMgCl2，0.01％Tween20，pH7.5)中实施3小时，提供充足的时间以去除所有非特异性DNAzyme。进行乙醇沉淀以回收文库，并且通过凝胶电泳纯化未切割的序列(例如参见图36和图37)。值得注意的是切割的和未切割的分子(都被染料标记)由于它们的不同大小能够轻易地在凝胶上区分。经纯化的未切割的分子可以与癌血清混合物(阳性选择)孵育仅仅10分钟。在阳性选择中的这种简短孵育时间使得能够只鉴定与靶标快速反应的DNAzyme序列，因而降低了癌症检测的测定法时间；实际上，体外选择的多功能性使得能够定制选择标准的严格性以产生理想特性的分子。13，14在阳性选择之后，用乙醇沉淀经切割的分子并凝胶分离。这些分离的序列可以通过引物特异性PCR扩增，通过凝胶电泳纯化，连接到底物并且进而用在第二轮选择中。根据经验，在5-8轮之后，切割的DNA条带变得可检测，并且完整的选择通常需要8到15轮的选择(即切割的DNA条带信号没有进一步显著的增加)。10最后，DNA池的最后一轮可以利用TA克隆试剂盒(Fermentas)克隆进入细菌，并且最少200个克隆将被发送用于测序(FunctionalBioscience,Wisconsin)。10
采用这种方法，获得了19种DNAzyme传感器，所述DNAzyme传感器在NSCLC样品中相较于在健康供体血清中显示一致的高活性(参见图38一组选定的用于分析的序列)。
朝向血液中最佳性能表征和设计DNA酶序列。经鉴定的DNAzyme序列可以分别地被验证以确定它们确实能够在靶标癌症而非正常血清存在时切割底物。此外，在选择期间血清作为靶标被采用时，临床测定法也能够采用未经任何处理的(即混合-读取)全血实施。因此，在我临床地验证它们作为癌症诊断之前，可以针对于在全血中的信号/背景比和稳定性，朝向最佳性能来表征和修饰经鉴定的DNAzyme传感器。
序列性能分析。根据经验，体外选择通常导致5-20不同种(克隆)序列。10可以从来自IDT的每一种合成具有代表性的序列。每个序列可以分别地在混合的癌患者和健康血清中测定切割性能。将会研究特异性(癌和正常血清之间的荧光信号比)和动力学两个参数。特别地，可以在96孔板中混进含有100nMDNAzyme传感器的选择缓冲液的100μL血清样品中进行切割反应，并且能够通过基于荧光信号增强的板读数器实时监控切割活性。为了进一步证实是否信号确实是由于在切割位点的切割，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反应混合物。因为假设体外选择可能鉴定限定一组独特生物标志物的多个DNAzyme序列，将继续使用所有满足下述标准的序列：1)在癌症和正常血清之间荧光信号比>3，和2)在1小时内>50％的分子被切割。满足上述标准的分子将在下面任务中被组合并作为均质的感测溶液继续使用。
血液中DNAzyme传感器的信号/背景比。DNAzyme传感器(即荧光团和淬灭剂在加入靶标前和后近距离邻近和分开放置)的特性保证了靶标缺失时极低的背景，但是在靶标出现时高信号。10通常获得在缓冲液中拥有信号/背景比>6-10的DNAzyme传感器。10但是当用在血液中时，来自血液中复杂环境的血液自发荧光和染料干扰(例如淬灭)可能损害信号/背景比。荧光素和Dabcyl最初分别被选择作为选择过程中的荧光团和淬灭剂，因为它们的简单、廉价以及切割事件在选择时通过凝胶监控。但是，由于上述所提到的原因，荧光素和Dabcyl可能用于血液中并不理想。在这一系列实验中，优化荧光团-淬灭剂对包括Cy3/BHQ2、Alexa647/QSY21、TAMRA/BHQ2、Texas红/BHQ2和Alexa546/QSY9(Glenresearch)以鉴定一个可以在血液中与荧光检测兼容并重复产生最高的信号/背景比(换言之>5)的荧光团-淬灭剂对。
血液中DNAzyme传感器的稳定性。由于DNAzyme直接被演化到血清中，期望它们在血液中至少在用于选择的时间量(即10分钟)会是耐核酸酶且稳定的。可以化学修饰DNAzyme的末端或骨架(即倒置T和硫代磷酸酯)，这样建立以使血液中核酸半衰期增加到数小时或者数天而并不损害它们的功能。15或者，为了保护DNAzyme传感器中RNA连接的降解，也可以在测定法缓冲液中引入RNA酶抑制剂(ribolock,Fermentas)。
在NSCLC所有阶段验证DNAzyme传感器的特异性和选择性。
可以测试经分离且优化的DNAzyme传感器是否能够区分患有NSCLC的人和健康对照。同样，获得来自已建立的NSCLC患者不同阶段的血液样品，并且对每一样品在DNA酶加入之前和之后，每一样品以三次荧光板读取仪测定的荧光数值分析。样品可以背景归一化并分析确定1)特异性，2)选择性，和3)NSCLC不同阶段的反应。DNAzyme传感器可以检测早期(阶段1)NSCLC用于NSCLC的早期检测。对于所有样品，可以用对于癌胚抗原(CEA)和细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)的ELISA进行头对头对比，它们是先前建立的作为对于NSCLC相对敏感和特异的两种生物标志物，虽然未完全被临床确认。1，2实验结果的意义可以采用T-检验确定。
在替代的实施方式中，在实施本发明中，在DNAzyme传感器发展中集成再选择组件以便优化DNAzyme传感器的特性(即对于灵敏性和特异性两者都为90％)。再选择是通过经鉴定的DNA序列被部分随机化以提供用于新选择过程的初始文库的过程，在新选择过程中更严格的选择标准将被强制执行。15再选择以相比第一选择需要更少轮的高效率操作产生理想的分子。事实上，再选择已经被用于提高DNAzyme的灵敏性和特异性。15
如果本DNAzyme测定法的灵敏性和特异性在临床测试中不能满足90％标准，可以进行再选择过程，其中所鉴定的DNAzyme序列被部分随机化(在每个碱基位置30％突变，例如如果原始碱基为A，它将70％保持为A，而C、T和G各10％)；并通过IDT化学合成。除了更严格和采用选择阳性和阴性选择靶标外，按上面的描述重复体外选择步骤。例如，将利用最初的DNAzyme传感器没有检测到的患者样品组隔离并用作用于选择的靶标。为了更加有效地区分不同阶段的癌患者，替代健康供体，将它们中的一个用作作为另一个的阴性选择靶标。采用再选择优化允许通用的(用于相同阶段/类型的癌症)和特异性的(在癌症，健康供体或者其它有类似症状(例如肺炎)疾病之间，以及在不同阶段癌症之间)DNAzyme传感器的选择。
因此，本发明提供了用于制作最佳灵敏性和选择性(两者都>90％)DNAzyme传感器的方法。本发明的DNAzyme传感器可以被用作筛选工具以相比现有技术在更早阶段鉴定癌症高风险患者。为了明确确认和确定癌症阶段，可以在本筛选测定法后采用其它传统诊断工具，特别是包括CT和MR1在内的成像技术。
实施例7：基于液滴的药物或适体筛选
在替代的实施方式中，开发来基于一个液滴一种类型分子的策略的药物筛选和体外选择平台，例如图39-46。在皮升微液滴中的约束反应和筛选允许有效、高通量、简单、廉价以及快速的筛选。微滴可以用于各种分子的文库系统。在DNA扩增、转录和翻译之后，每个液滴分别包含各DNA、RNA或肽。在例子中，利用一个珠子一个复合物的方法在含有大约2×1011不同差异序列的液滴文库中合成了DNA、RNA和肽(图39)。
胶囊封装在微珠上的合成的DNA进入皮升液滴(直径20μm)中(图43)。在珠子上的DNA通过PCR扩增以产生液滴DNA文库。这些DNA能够进一步在液滴中转录和翻译以形成RNA和肽文库(图39、40和41)。在替代的实施方式中，一个液滴一种类型分子可以通过在液滴中单一分子PCR获得。特别地，能够利用核酸序列在相同的液滴中对经翻译的蛋白质或/肽的鉴定/测序添加标签，这提供了用于随后筛选的强大工具。在替代的实施方式中，液滴能够被操作或处理，包括例如液滴融合、分裂、孵育、重新注射、成像、分析和分选(例如图40和图44)。这些DNA、RNA或者肽文库能够用于在各种测定法中筛选，包括例如蛋白-蛋白相互作用、酶底物相互作用、受体-配体相互作用、抗体-抗原相互作用、配体-细胞结合、适体-靶标结合、适体-细胞结合、DNAzyme反应(例如参见图41、45和46)。这些DNA、RNA或者肽文库也能够用在演化实验以产生例如新酶或者用在筛选和发现新生物标志物(图42)。在替代的实施方式中，液滴能够被直接分选以确定含有靶标的液滴。在替代的实施方式中，液滴被破坏并且进而能够分选和分析靶标结合的颗粒。在替代的实施方式中，如图41中所示，液滴可以被分配到微孔测定法中，在其中它们可以保持完整或者破碎以用于进一步的分析、分选或印刷到新的底物上(Biyani,etal.MicrointaglioPrintingofInsituSynthesizedProteinsEnablesRapidPrintingofHigh-DensityProteinMicroarraysDirectlyfromDNAMicroarrays,2013Appl.Phys.Express6087001；BiomoleculeassaychipUS8592348B2)。这些通过本发明的方法和系统产生的轻易可得的、廉价的示例性文库对于筛选和/或获得活性生物生物制剂，例如治疗剂或诊断剂，以及用于生物标志物探索目的是有价值的。
实施例8：“通过报告子扩增的适体胶囊封装筛选(ENSNARA)
在替代的实施方式中，此发明显示出用于适体筛选的被称作“通过报告子扩增的适体胶囊封装筛选(ENSNARA)”的示例性方法。如在图47和图48中所示，在一个实施方式中，可以在液滴中利用ENSNARA通过利用针对报告酶的变构控制来鉴定结构转换的适体。ENSNARA能够快速地产生用于能够立即用作实时传感器的适体的许多靶标。
在替代的实施方式中，示例性变构酶感测系统包括共价连接的抑制剂-DNA-酶(IDE)复合物，这类似于先前描述的结构，例如，被Saghatelian等描述的(“DNAdetectionandsignalamplificationviaanengineeredallostericenzyme”,J.Am.Chem.Soc.125,344–5(2003)；Gianneschi,etal.DesignofmolecularlogicdevicesbasedonaprogrammableDNA-regulatedsemisyntheticenzyme,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.46,3955–8(2007)等)。
如图47所示，在这个示例性共价连接的抑制剂-DNA-酶(IDE)复合物实施例中，在初始非活跃酶状态时，所述酶(蜡样芽胞杆菌中性蛋白酶(CNP))的催化位点被共价结合到DNA适体分子的抑制剂(亚磷酰胺二肽)阻断。当靶标分子出现时，适体通过与靶标分子形成三级结构进行构象改变。这种结构改变从所述酶的催化位点释放了抑制剂，并且允许用于与荧光底物的持续催化反应。单一分子识别事件因此可以通过连续的底物变换扩增成千上万次。通过将DNA随机序列池集成到IDE，单一DNA序列的结合特性能够耦合到酶的活性。
在本发明的适体IDE系统的替代的实施方式中，DNA可以为合成的DNA或者其它核酸，例如合成的、非天然核苷酸或者核酸类似物，例如包含非离子型骨架的肽核酸(PNA)，具有硫代磷酸酯键连接的寡核苷酸，或者具有合成的DNA骨架类似物的寡核苷酸，所述DNA骨架类似物例如硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸盐、3'-硫缩醛、甲撑基(甲基亚氨基)、3'-N-氨基甲酸酯以及吗啉酯核酸。
在本发明的适体IDE系统的替代的实施方式中，所述复合物可以设计为最大化“转换”(或者开/关)能力；并且文库设计为筛选理想性质的适体，例如γ-段双向解离是通过适体结合亲和力和所形成的适体/靶标三级结构来控制的结构。因此，通过合并在筛选中具有不同长度的γ-段，获得来具有独特亲和力和开关效率的适体。抑制剂从所述酶的催化位点的解离可能或者可能没有涉及打断双链DNA结构域。
例如，在制作用于实施此发明的示例性IDE结构中，通过存在靶标ATP或凝血酶(1pM-100μM)的情况下的荧光检测，可以实时测量每一个示例性IDE结构的活性。可以包括与α-环互补的25-merDNA的添加作为阳性对照。同样地，在α-环和GTP(用于ATP)或者白蛋白(用于凝血酶)中的扰乱序列可以用作阴性对照。用于定量每个适体性能的结果参数可以包括信号-背景比、反应时间、灵敏度(或亲和力，Kd)、特异性和动态范围。动力学参数(Kcat和Km)可以进一步通过测量在从1n到500μM的不同浓度下IDE结构和荧光底物之间的反应动力学以构造速度-底物曲线来确定。
在一个实施方式中，利用标准软光刻法制造含有深度为15-50μm且宽度为30μm的通道的聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)芯片，并且安装在玻璃显微镜载玻片上。PDMS装置可以具有一个油入口和两个水入口(一个用于IDE文库溶液，另一个用于靶标和底物)。使用标准压力注入/抽出注射泵以0.5到2μL/min的流速范围递送试剂和油。以大约50Hz的速率通过所得液流的流聚焦产生均匀的皮升大小的液滴，所述所得液流为含2％(w/w)EA表面活性剂的HFE-7500氟化油。能够产生三种不同大小(直径为10、20和50μm)的液滴，其可以轻易地通过调整微流控通道大小和流速实现。对于FACS分选，可以将所形成的油包水(W/O)单一乳液液滴引入带有亲水通道的第二微流控装置用于水包油包水(W/O/W)双乳液液滴的形成。为了最小化液滴产生时间对酶测定法上的影响，可以采用含有多个平行的、能够在数分钟内产生107个液滴的液滴产生结构的多层微流控装置。荧光液滴可以利用由448/561/633nm氩激光器和PMT检测器组成的共聚焦显微镜成像和检测。液滴可以通过FACS利用BDFACSAriaIITM细胞分选器分选，所述分选器通常以>107个液滴/小时的通量操作。
对于鉴定用在特定的测定法或方案中的特异性IDE，在一个实施方式中，利用液滴微流控将IDE文库胶囊封装入液滴(大小可以优化)；例如，初始大约1012个分子的文库可以与靶标分子(ATP或者谷氨酸酯)和荧光酶底物(DABCYL-βAla-Ala-Gly-Leu-Ala-βAla-EDANS)共胶囊封装入大约107个液滴中(即105IDE/液滴)。孵育之后，可以利用FACS分选出含有适体的荧光液滴。在液滴荧光和适体亲和力和开关特性之间的关系使得能够简单地通过调整FACS门控参数就能鉴定并分选出带有明确特性的适体。经分选的适体可以进而被收集到保持于冰上的Eppendorf管中并且随后通过加入等量的1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇(Aldrich)破碎。可以加入新鲜的含有底物的缓冲液以稀释溶液并同时提高从油相的分离效率。可以收集水相并重新胶囊封装。在这个分区步骤之后，可以预期的是只有单一分子IDE包含在任何给定的液滴中。一旦通过荧光信号确定含有适体的液滴，它们就可以通过FACS单个分离，例如到384孔板。最终，在液滴在孔中裂解后，单一适体分子可以直接从IDE进行PCR扩增，并且可以测序。在IDE文库首先与对照分子(GTP、TTP和CTP的混合物用于ATP；谷氨酰胺和天冬酰胺的混合物用于谷氨酸酯)孵育的阴性选择组分可以用于消除在初始阶段没有完全被抑制的或者为通过交叉反应或非特异性结合开启荧光信号的IDE分子。此阴性筛选步骤使得能够产生针对靶标的高特异性适体。
经鉴定的适体序列可以被表征，例如，经鉴定的适体序列可以被分别地验证以1)在靶标而非对照存在时，确保它们特异性结合并能够转换，和2)鉴定产生最佳特性(例如亲和力、特异性、反应时间和转换效率)的序列。每个传感器的荧光信号可以在靶标(例如ATP或谷氨酸酯)或者它们各自的对照存在时，在一浓度范围(例如1pM到100μM)利用板读数仪实时监控。这鉴定出所鉴定的适体/传感器的关键特性，包括亲和力(Kd)、灵敏性、选择性、信号/背景比、反应时间和动力学范围。表面等离子共振(SPR)(BIAcore3000TM)可以用于进一步评价结合动力学(Kon和Koff)和所鉴定的适体的可逆性。例如，这套测试可以鉴定用于神经递质成像的传感器结构，例如鉴定允许用于突触传递的神经递质短暂脉冲分析的、快速配体连接和解离传感器。
如图48中所示，在示例性ENSNARA步骤中，理论上，结合于靶标分子时，文库中特异性DNA序列(例如，作为适体，用于此例子)存在并经历构象变化以使抑制剂从酶催化位点解离因此产生荧光信号。在替代的实施方式中，初始文库可以含有大于1012IDE胶囊封装在大约107个液滴中(例如，大约105IDE/滴)。此文库的含有适体的液滴将产生荧光信号并被分选。随后，液滴将被破碎、稀释并重新与靶标和荧光底物胶囊封装入另一个107液滴直到只剩每个滴液中单一个IDE分子。最终，含有适体IDE的荧光液滴被分选出来并且对所选择的适体测序。
在替代的实施方式中，ENSNARA可以利用不同结构，架构和组成的IDE。在替代的实施方式中，ENSNARA可以利用其它信号扩增方法包括例如指数扩增反应(EXPAR)。在替代的实施方式中，ENSNARA可以通过多种参数优化，包括液滴大小、反应时间和在液滴中的分子浓度。可选地，液滴大小可以在直径大约5到50μm。
尽管本发明并不被任何特定的作用机制限定，但在可选的ENSNARA实施方式中：
(ⅰ)连接到IDE的适体对靶标分子的结合做出反应能够从酶催化位点分离抑制剂以产生荧光信号。这得到了以下支持：
(a)由Ghadiri和他的同事开发的IDE系统能够利用相同的开关转换机制检测靶标互补DNA(Saghatelian,etal.DNAdetectionandsignalamplificationviaanengineeredallostericenzyme.J.Am.Chem.Soc.125,344–5(2003)；Gianneschi,etal.DesignofmolecularlogicdevicesbasedonaprogrammableDNA-regulatedsemisyntheticenzyme.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.46,3955–8(2007).)，和
(b)该结构-转换适体能够在靶标结合时从DNA双链改变构象到适体/靶标复合物(例如参见Nutiu,R.&Li,Y,Structure-switchingsignalingaptamers.J.Am.Chem.Soc.125,4771–8(2003)；Tang,Z.etal.Aptamerswitchprobebasedonintramoleculardisplacement.J.Am.Chem.Soc.130,11268–9(2008))，和
ⅱ)由于酶报告子信号扩增，能够在液滴中检测被单一适体开关触发的荧光信号。这得到了广泛的先前研究的支持，包括数字PCR和本发明展示的在皮升液滴中的靶标酶的划分允许通过增加有效靶标浓度和信号背景比来检测单一分子的数据。
在替代的实施方式中，本发明的示例性NSNARA系统和方法提供了无可比拟的灵敏性和通量以用于快速筛选具有指定特性的适体。特别地，在皮升(pL)大小液滴中检测单一分子的能力，以及本发明的液滴“破碎-稀释-重新胶囊封装”划分程序允许在单一轮中直接筛选多样性高达大约1012的文库。在替代的实施方式中，示例性ENSNARA避免了传统SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyEXponentialenrichment)必须的冗长的扩增步骤。
在替代的实施方式中，一旦鉴定出适体，它们可以直接用作结构开关传感器，不需要额外的修饰和优化66，68。此外，该IDE系统自己不仅仅是强大的适体筛选平台，它也能够作为独立的、超灵敏且可逆的传感器。
在替代的实施方式中，本发明的ENSNARA系统或步骤是自动的，例如在微流控装置中；例如，通过在微流控装置将此系统自动化，能够同时检测多重靶标。
在替代的实施方式中，本发明的ENSNARA系统或步骤包括单一轮筛选方法，其能够避免对于PCR扩增的需求；同时也能够允许用于由修饰的核酸组成的初始文库，所述方法能够进一步增加高质量适体的多样性和筛选高效性。
在替代的实施方式中，本发明的ENSNARA系统或步骤包括新型适体筛选技术，其能够创建实时传感器工具箱用于体外和体内研究分子和细胞信号，进而阐明生物学和发展新的治疗学。在替代的实施方式中，本发明的ENSNARA系统或步骤包括快速且可逆的适体传感器系统，所述适体传感器系统允许以高时空分辨率持续且实时监控神经递质。在替代的实施方式中，本发明的ENSNARA系统或步骤包括用于许多适体设计的平台，所述适体能够被用作探针以研究复杂的生物学，或者作为诊断学和治疗学。
已经对本发明的诸多实施方式进行描述。尽管如此，应理解可以进行各种不脱离本发明精神和范围的修改。相应地，其它实施方式在以下权利要求的范围之内。