本发明涉及一种组合物，具体讲涉及一种苦豆子多糖组合物。
背景技术：
苦豆子(Sophora alopecuroides L.)系豆科槐属多年生草本植物，喜生于荒漠平原，广泛分布于我国新疆、甘肃、青海、宁夏、内蒙古等西部省区，适合其沙质环境生长，是很好的防沙治沙植物。根、茎、全草及种子均可药用，具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫等作用。现代医学近年对苦豆子的研究表明，苦豆子的主要化学成分有生物碱、黄酮类、有机酸、氨基酸、蛋白质和糖类成分，并发现对中枢神经系统、心血管系统、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、增强和调节免疫功能等方面具有重要的药理活性。随着现代药理、药效学研究的不断深入，苦豆子的药用价值被医药界所公认。据调查，苦豆子分布广且资源丰富。因此，大力开发苦豆子资源，充分利用它的价值，不仅对保障人类健康有重要作用，而且还有着重大的社会、经济和环境效益。
中国专利CN201110007902.4公开了一种从提取苦豆子总碱后的剩余药渣中提取多糖的方法，该方法分离高纯度的苦豆子多糖，在制备过程中将淀粉、色素等可利用物质分离出去，未实现资源的充分利用，另外将苦豆子多糖进一步细化研究，将其应用开发实现最大化是资源利用的最终目标。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种苦豆子多糖组合物及其制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种不同多糖分子量的苦豆子多糖组合物及其制备方法。
本发明的再一目的在于提供苦豆子多糖组合物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
所述苦豆子多糖组合物包括下述质量百分比的物质：苦豆子多糖40％-99％、蛋白0％-50％、色素0％-50％、淀粉0％-50％和水0％-30％。
所述的苦豆子多糖组合物的第一优选技术方案包括下述质量百分比的物质：苦豆子多糖50％-95％、蛋白0％-35％、色素0％-30％、淀粉0％-10％和水0％-15％。
所述的苦豆子多糖组合物的第二优选技术方案包括下述质量百分比的物质：苦豆子多糖64％，蛋白15％，色素9％，淀粉7％，水5％。
所述的苦豆子多糖组合物的第三优选技术方案，所述苦豆子多糖的分子量为1000-1400000道尔顿。
所述的苦豆子多糖组合物的第四优选技术方案，所述苦豆子多糖中单糖包括质量比为85.65:1.26:1.00:59.87:10.96:13.25的甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖：木糖。
所述苦豆子多糖组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)于渗漉柱内，用体积浓度为40％-100％的乙醇浸泡经粉碎、过10-60目筛后的苦豆子4-48h，用体积浓度为50％-100％的乙醇、以流速5-25ml/min提取至渗漉提取液与碘化铋钾反应无颜色变化时停止渗漉，分离渗漉液后的残渣晾干备用；
(2)方法一：向步骤(1)晾干后的固体产物中加入6-20倍体积比的水，于60-110℃下回流1-5h，过滤得滤液，向固体加水重复上述操作1-4次，合并滤液得水提物；
方法二：向步骤(1)晾干后的固体产物中加入体积为该固体产物6-20倍量的水，调节pH为5-8值，加入纤维素酶(0％-20％)、果胶酶(0-20％)和木瓜蛋白酶(0-20％)组成的复合酶，置于恒温30-80℃条件下回流提取0.5-6h。提取完成后于90-100℃条件下加热10-20min灭酶，灭酶结束，冷却至室温，以500-10000r/min速率离心分离，弃去沉淀，合并上清液得水提物。
(3)将步骤(2)得到的水提物于50-90℃减压浓缩成密度为1.02-1.1后，加入乙醇至50-95％的含醇量，2-10℃下静置4-48h，以500-5000r/min速率离心分离，真空冷冻干燥得苦豆子多糖组合物。
所述的苦豆子多糖组合物的第五优选技术方案，所述苦豆子多糖的分子量为小于6000、6000～小于1万、1万～小于3万、3万～小于5万、5万～小于10万、10万～小于20万、20万～小于30万、30万～小于100万或大于等于100万。
第五优选技术方案中所述的苦豆子多糖组合物的制备方法，步骤如下：
(1)将权利要求5所得的苦豆子多糖组合物溶解成浓度为0.2-30g/L的水溶液，在20-45℃和0.01-0.3MPa压力下，将溶液经循环泵输入到截留分子量为100万道尔顿的超滤膜组件超滤分离，分为小分子量的透过液和大分子量的截流液两部分；截流液返回继续进行循环超滤， 往复循环多次收集截流液，得到多糖分子量大于等于100万道尔顿的组合物样品液；
(2)收集从膜组件外侧的出口端流出的透过液，得到多糖分子量小于100万道尔顿的组合物样品液；
(3)将多糖分子量小于等于100万道尔顿的样品液依次经过截留分子量为30、20万、10万、5万、3万、1万、6000的超滤膜组件，可分别得到多糖分子量为30万～小于100万、20万～小于30万、10万～小于20万、5万～小于10万、3万～小于5万、1万～小于3万、6000～小于1万、6000以下的组合物样品液；
(4)将多糖分子量不同的样品液浓缩、醇沉、离心和冻干，得相应各分子量的苦豆子多糖组合物。
所述的苦豆子多糖组合物在制备抗肿瘤药物及药物组合物、食品、保健品、饮料、动物饲料、化妆品中的应用。
所述的多糖分子量不同的苦豆子多糖组合物在制备抗肿瘤药物及药物组合物、食品、保健品、饮料、动物饲料、化妆品中的应用。
优选的，所述的苦豆子多糖组合物在食品、保健品、饮料、动物饲料、化妆品中的应用。
所述的多糖分子量不同的苦豆子多糖组合物在食品、饮料、动物饲料、化妆品中的应用。
另一优选的，所述的苦豆子多糖组合物在制备抗肿瘤药物及药物组合物中的应用。
所述的多糖分子量不同的苦豆子多糖组合物在制备抗肿瘤药物及药物组合物中的应用。
食品、保健品、饮料、动物饲料、化妆品或药物组合物，其含有所述的苦豆子多糖组合物。
食品、保健品、饮料、动物饲料、化妆品或药物组合物，其含有所述的不同分子量的苦豆子多糖组合物。
含有所述的苦豆子多糖组合物的食品、保健品、饮料、动物饲料、化妆品或药物组合物。
含有所述的多糖分子量不同的苦豆子多糖组合物的食品、保健品、饮料、动物饲料、化妆品或药物组合物。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优异效果：
1)本发明所得的苦豆子多糖无毒无害，并具有抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老、增强免疫力、营养强化、美容、养颜等功能的国家新资源食品，苦豆子多糖提取物的开发和应用填补了其作为食品、保健品、饮料、动物饲料、化妆品等原/辅料应用的空白，同时也对保障人类健康、提高人类生存质量具有重要作用。
2)本发明所用的苦豆子多糖提取物的制备方法，操作步骤简单，条件易于控制，抗肿瘤活性和抗氧化性能好。分离出不同分子量的多糖组合物，为苦豆子多糖的开发和应用提供了新的应用选择。
具体实施方式
实施例1
(1)取苦豆子原料，粉碎，过20目筛；
(2)取步骤(1)过筛后的苦豆子，将其装入渗漉柱内，用浓度为50％的乙醇浸泡18h；再以浓度为80％的乙醇为提取剂，以流速10ml/min，渗漉提取，得到苦豆子中所含生物碱成分；至渗漉提取液与碘化铋钾反应无颜色变化时停止渗漉，分离渗漉液与残渣；取苦豆子提取苦豆子生物总碱后的药渣，晾干备用；
(3)向步骤(2)晾干后的固体产物中加入体积为该固体产物10倍量的水，于100℃，回流2h，重复操作4次，得水提物；
(4)将步骤(3)得到的水提物于80℃减压浓缩成密度为1.02的浓缩物，加入乙醇至乙醇的浓度为50％醇沉，4℃静置12h，以5000r/min速率离心分离，取沉淀，真空冷冻干燥得棕褐色苦豆子多糖组合物。
所制得的苦豆子多糖组合物包括下列重量百分比的物质：苦豆子多糖51％，蛋白20％，色素14％，淀粉8％，水7％。
实施例2
(1)取苦豆子原料，粉碎，过50目筛；
(2)取步骤(1)过筛后的苦豆子，将其装入渗漉柱内，用浓度为60％的乙醇浸泡20h；再以浓度为70％的乙醇为提取剂，以流速15ml/min，渗漉提取，得到苦豆子中所含生物碱成分；至渗漉提取液与碘化铋钾反应无颜色变化时停止渗漉，分离渗漉液与残渣；取苦豆子提取苦豆子生物总碱后的药渣，晾干备用；
(3)向步骤(2)晾干后的固体产物中加入体积为该固体产物12倍量的水，于80℃，回流5h得水提物；
(4)将步骤(3)得到的水提物于70℃减压浓缩成密度为1.08的浓缩物，加入乙醇至乙醇的浓度为70％醇沉，2℃静置18h，以3000r/min速率离心分离，取沉淀，真空冷冻干燥得棕褐色苦豆子多糖组合物。
所制得的苦豆子多糖组合物包括下列重量百分比的物质：苦豆子多糖64％，蛋白15％，色素9％，淀粉7％，水5％。
实施例3
(1)取苦豆子原料，粉碎，过60目筛；
(2)取步骤(1)过筛后的苦豆子，将其装入渗漉柱内，用浓度为80％的乙醇浸泡36h；再以浓度为80％的乙醇为溶剂，以流速15ml/min，渗漉提取，得到苦豆子中所含生物碱成分；至渗漉提取液与碘化铋钾反应无颜色变化时停止渗漉，分离渗漉液与残渣；取苦豆子提取苦豆子生物总碱后的药渣，晾干备用；
(3)向步骤(2)晾干后的固体产物中加入体积为该固体产物16倍量的水，于100℃，回流5h得水提物；
(4)将步骤(3)得到的水提物于75℃减压浓缩成密度为1.02的液体，加入乙醇至乙醇终浓度为90％醇沉，2℃静置36h，以5000r/min速率离心分离，取沉淀，真空冷冻干燥得棕褐色苦豆子多糖组合物。
所制得的苦豆子多糖组合物包括下列重量百分比的物质：苦豆子多糖89％，蛋白5％，色素4％，淀粉0％，水2％。
实施例4
(1)取苦豆子原料，粉碎，过10目筛；
(2)取步骤(1)过筛后的苦豆子，将其装入渗漉柱内，用浓度为40％的乙醇浸泡6h；再以浓度为50％的乙醇为溶剂，以流速20ml/min，渗漉提取，得到苦豆子中所含生物碱成分；至渗漉提取液与碘化铋钾反应无颜色变化时停止渗漉，分离渗漉液与残渣；取苦豆子提取苦豆子生物总碱后的药渣，晾干备用；
(3)向步骤(2)晾干后的固体产物中加入体积为该固体产物6倍量的水，于70℃，回流1h得水提物；
(4)将步骤(3)得到的水提物于70℃减压浓缩成密度为1.1的液体，加入乙醇至乙醇终浓度为50％醇沉，2℃静置6h，以1000r/min速率离心分离，取沉淀，真空冷冻干燥得棕褐色苦豆子多糖组合物。
所制得的苦豆子多糖组合物包括下列重量百分比的物质：苦豆子多糖40％，蛋白25％，色素10％，淀粉13％，水12％。
实施例5
(1)取苦豆子原料，粉碎，过60目筛；
(2)取步骤(1)过筛后的苦豆子，将其装入渗漉柱内，用浓度为45％的乙醇浸泡24h；再以浓度为70％的乙醇为提取剂，以流速12ml/min，渗漉提取，得到苦豆子中所含生物碱成分；至渗漉提取液与碘化铋钾反应无颜色变化时停止渗漉，分离渗漉液与残渣；取苦豆子提取苦豆子生物总碱后的药渣，晾干备用；
(3)向步骤(2)晾干后的固体产物中加入体积为该固体产物12倍量的水，于100℃，回流1-5h得水提物；
(4)将步骤(3)得到的水提物于70℃减压浓缩成密度为1.04的浓缩物，加入乙醇至乙醇的浓度为90％醇沉，4℃静置24h，以4000r/min速率离心分离，取沉淀，真空冷冻干燥得棕褐色苦豆子多糖组合物。
(5)组装好截留分子量为100万的膜组件(天津膜天膜科技有限公司)，将制得的棕褐色苦豆子多糖组合物用去离子水溶解成浓度为10g/L的提取液，在25℃、压力0.07MPa下，将提取液经循环泵输入到截留分子量为100万的超滤膜组件中，经超滤分离后提取液分为小分子量的透过液和大分子量的截流液两部分；截流液返回继续进行循环超滤，往复循环多次收集截流液收集截流液，得到多糖分子量大于等于100万道尔顿的样品液；
(6)透过液从膜组件外侧的出口端流出，合并得到的透过液，得到多糖分子量小于100万的溶液；
(7)将多糖分子量小于等于100万的溶液分别经过截留分子量为30、20万、10万、5万、3万、1万、6000的超滤膜组件，可得到多糖分子量为30万～小于100万、20万～小于30万、10万～小于20万、5万～小于10万、3万～小于5万、1万～小于3万、6000～小于1万、6000以下的样品液；
(8)将多糖分子量不同的样品液浓缩、醇沉、离心和冻干，即得各多糖分子量部分的苦豆子多糖的组合物。
所制得的苦豆子多糖组合物包括下列重量百分比的物质：
100万以上：苦豆子多糖95％，蛋白2％，色素1％，淀粉0％，水2％；
30万～小于100万：苦豆子多糖98％，蛋白0％，色素1％，淀粉0％，水1％；
20万～小于30万：苦豆子多糖94％，蛋白2％，色素2％，淀粉1％，水1％；
10万～小于20万：苦豆子多糖91％，蛋白3％，色素3％，淀粉0％，水3％；
5万～小于10万：苦豆子多糖93％，蛋白4％，色素0％，淀粉0％，水3％；
3万～小于5万：苦豆子多糖89％，蛋白1％，色素5％，淀粉3％，水2％；
1万～小于3万：苦豆子多糖85％，蛋白5％，色素7％，淀粉1％，水2％；
6000～小于1万：苦豆子多糖80％，蛋白5％，色素7％，淀粉7％，水1％；
6000以下：苦豆子多糖42％，蛋白22％，色素30％，淀粉3％，水3％。
实施例6
(1)取苦豆子原料，粉碎，过10目筛；
(2)取步骤(1)过筛后的苦豆子，将其装入渗漉柱内，用浓度为80％的乙醇浸泡22h；再以浓度为80％的乙醇为提取剂，以流速15ml/min，渗漉提取，得到苦豆子中所含生物碱成分；至渗漉提取液与碘化铋钾反应无颜色变化时停止渗漉，分离渗漉液与残渣；取苦豆子提取苦豆子生物总碱后的药渣，晾干备用；
(3)向步骤(2)晾干后的固体产物中加入体积为该固体产物8倍量的水，于110℃，回流3h得水提物；
(4)将步骤(3)得到的水提物于85℃减压浓缩成密度为1.05的浓缩物，加入乙醇至乙醇的浓度为75％醇沉，2℃静置30h，以5000r/min速率离心分离，取沉淀，真空冷冻干燥得棕褐色苦豆子多糖组合物。
(5)组装好截留分子量为100万的膜组件(天津膜天膜科技有限公司)，将制得的棕褐色苦豆子多糖组合物用去离子水溶解成浓度为20g/L的提取液，在35℃、压力0.2MPa下，将提取液经循环泵输入到截留分子量为100万的超滤膜组件中，经超滤分离后提取液分为小分子量的透过液和大分子量的截流液两部分；截流液返回继续进行循环超滤，往复循环多次收集截流液收集截流液，得到多糖分子量大于等于100万道尔顿的样品液；
(6)透过液从膜组件外侧的出口端流出，合并透过液，得到多糖分子量小于100万的溶液；
(7)将多糖分子量小于等于100万的溶液分别经过截留分子量为30、20万、10万、5万、3万、1万、6000的超滤膜组件，可得到多糖分子量为30万～小于100万、20万～小于30万、10万～小于20万、5万～小于10万、3万～小于5万、1万～小于3万、6000～小于1万、6000以下的样品液；
(8)将多糖分子量不同的样品液浓缩、醇沉、离心和冻干，即得各多糖分子量部分的苦豆子多糖组合物。
所制得的苦豆子多糖组合物包括下列重量百分比的物质：
100万以上：苦豆子多糖91％，蛋白2％，色素2％，淀粉2％，水3％；
30万～小于100万：苦豆子多糖94％，蛋白0％，色素3％，淀粉2％，水1％；
20万～小于30万：苦豆子多糖95％，蛋白1％，色素2％，淀粉0％，水2％；
10万～小于20万：苦豆子多糖96％，蛋白0％，色素0％，淀粉0％，水4％；
5万～小于10万：苦豆子多糖94％，蛋白2％，色素2％，淀粉0％，水2％；
3万～小于5万：苦豆子多糖90％，蛋白3％，色素3％，淀粉1％，水3％；
1万～小于3万：苦豆子多糖81％，蛋白4％，色素6％，淀粉6％，水3％；
6000～小于1万：苦豆子多糖70％，蛋白8％，色素10％，淀粉8％，水4％；
6000以下：苦豆子多糖53％，蛋白23％，色素13％，淀粉10％，水1％。
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明涉及如上所述的苦豆子多糖组合物作为主/辅料、添加剂用于对食品、保健品、饮料、动物饲料、化妆品或药物组合物进行富集、强化和/或着色，优选作为主/辅料、添加剂对食品、保健品进行富集、强化和/或着色、作为主/辅料、添加剂的用途。
(1)可以使用本发明的产品作为活性/功能性成分、辅料、添加剂、着色剂的饮料可以是碳酸盐饮料(例如有味道的seltzer水、软饮或矿物饮品)以及非碳酸盐饮料(例如有味道的水、果汁、水果宾治)和这些饮料的浓缩形式。它们可以以天然水果或蔬菜汁或人造香料为基础。还包括在内的是酒精饮料和方便饮料粉末。另外，含糖的饮料、含有无卡路里和人造甜味剂的减肥饮料也包括在内。
(2)得自天然来源的乳制品或合成的乳制品属于食品的范围内，其中本发明的产品可以被用作活性/功能性成分、辅料、添加剂、着色剂。这类产物的典型例子为乳饮料、冰激凌、乳酪、酸乳等等。乳替换制品如豆乳饮料和豆腐制品也包括在该申请范围内。
(3)还包括在内的是含有本发明的产品作为活性/功能性成分、辅料、添加剂、着色剂 的甜品，例如糖果制品糖果、口香糖、甜点(例如冰激凌、果冻、布丁、方便布丁粉等等)。
(4)还包括在内的是谷物、点心、曲奇、意大利面制品、汤和酱、蛋黄酱、沙拉调味品等等，其含有本发明的产品作为活性/功能性成分、辅料、添加剂、着色剂。另外，用于乳制品和谷物的水果制剂也包括在内。
(5)使用该组合物作为活性/功能性成分、辅料、添加剂、着色剂的保健品，如保健食品(营养保健品)；保健药品；保健化妆品(美颜保健品)。
(6)使用该组合物作为活性/功能性成分、辅料、添加剂、着色剂的药物组合物(如片剂或胶囊)也在本发明的范围内。片剂的着色可以如下完成：将液体或固体着色剂组合物形式的产品单独地添加进片剂包衣混合物中，或将着色剂组合物添加进片剂包衣混合物的一种组分中。有色的硬壳或软壳胶囊可以通过在胶囊物质水溶液中引入着色剂组合物来制备。
(7)使用该组合物作为活性成分的药物组合物如散剂、颗粒剂、滴丸剂、片剂(如咀嚼片剂、泡腾片剂或薄膜衣片剂)或胶囊(如硬壳胶囊)也在本发明的范围内。产品典型地作为粉末单独或直接用于散剂、颗粒剂等制剂中制成所需产品，或作为粉末被添加进滴丸基质混合物或制片混合物中，或以用于生产胶囊的本身已知的方式被填充进胶囊中。
(8)动物饲料制品，如营养成分的预混合物、配合饲料、乳代替品、液体膳食或饲料制剂也在本发明的范围内，所述动物饲料制品中组合物被用作添加剂、着色剂用于着色(例如用于卵黄、肉用鸡、小鸡或水生动物)或被用作活性成分。
(9)化妆品、美容品(toiletries)和护肤品(derma products)，即皮肤和头发护理制品，如乳霜、乳液、沐浴露、唇膏、香波、护发素、喷雾或凝胶(其中组合物被用作辅料、添加剂、着色剂或活性/功能性成分)也在本发明的范围内。
试验1苦豆子多糖相对分子质量测定
1.1色谱条件的确定
流动相的选择：根据OHpak SB-804色谱柱条件，可采用三次蒸馏水、磷酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲溶液做流动相，但缓冲液浓度控制在0.1～0.3mol/L之间，pH值控制在3.0～8.0之间；选用三次蒸馏水和0.2mol/LpH5.0磷酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液为流动相，以右旋糖酐作为分离试样在柱中进行分离检测；3种流动相对苦豆子多糖的分离效果都很好，出于保护色谱柱的考虑，选用三次蒸馏水作流动相；
流速的选择：根据色谱柱条件，流速应当不超过1.5ml/min，采用0.6、0.8、1.0、1.2ml/min的流速进行样品分离实验；
实验结果表明，出峰时间随着流速的加大而减少，其峰形也有所改变，随之柱压也明显升 高，对多糖的分离效果也有所下降；采用0.8ml/min的流速，进样量20μl；
柱温的选择：根据色谱柱条件，柱温选择30℃。
1.2多糖分子量标准曲线的制作
分别精密称取右旋糖酐标准品Mw2000000、133800、84400、41100、21400、7100、4600、2500、180各50.0mg，用三次蒸馏水定容于5ml容量瓶中，配成10.0mg/mL的标准品溶液，按照1.3.1节中确定的色谱条件下分别进样，测得各色谱峰保留时间。应用岛津GPC软件以不同分子量标准右旋糖酐的保留时间(RT)为横坐标，相应的相对分子质量对数值(lgMw)为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3苦豆子多糖样品测定
称取苦豆子多糖50.0mg，用三次蒸馏水定容于5ml容量瓶中，配成10.0mg/mL的样品溶液。按制作标准曲线的色谱条件进样，得到苦豆子多糖的保留时间和相对分子质量。
试验2柱前衍生化HPLC法分析苦豆子多糖中单糖组成
2.1分析方法
以三氟乙酸水解苦豆子多糖，加入衍生化试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)生成衍生化产物，采用RP-HPLC法，色谱柱：C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈-0.1mol·L-1磷酸盐缓冲液pH6.8(16:84)，流速:1.0mL·min-1，检测器：二极管阵列检测器，检测波长:254nm，柱温：35℃；结果苦豆子多糖由甘露糖，鼠李糖，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖和木糖等主要6种单糖组成；甘露糖，鼠李糖，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖和木糖的比例约85.65:1.26:1.00:59.87:10.96:13.25；结论该方法可以准确的测定出苦豆子多糖中含有的各种单糖。
药理作用
材料：
KM小鼠，SPF级，雄性成年小鼠，18～22g，中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心提供，许可证号：SCXK-(军)2009-003；注射用环磷酰胺：江苏恒瑞医药股份有限公司，每支200mg，批号06052021。
实验方法：
分别建立实体肉瘤(S180)(昆明种小鼠)、宫颈癌(U14)(昆明种小鼠)、肝癌(H22)(昆明种小鼠)、艾氏腹水瘤(EAC)(昆明种小鼠)、结肠癌(CT26)(BALB/c种小鼠)小鼠皮下移植瘤模型，实验分5组，每组12只，雌雄各半，阳性药组腹腔注射环磷酰胺(50mg/kg)，本发明样品设3个剂量组，即荷瘤对照组，本申请实施例1制备的苦豆子多糖组合物高剂量 组(400mg/kg)，中剂量组(200mg/kg)，低剂量组(100mg/kg)。接种肿瘤24小时后开始给药，各剂量组均每日灌胃给药1次，连续7天。接种后24小时给药一次。末次给药后24小时处死动物，剖取瘤重称重，以肿瘤生长抑制率为评价指标。结果用SPSS统计软件进行t检验，见表1-5。
表1苦豆子多糖组合物对实体肉瘤(S180)小鼠的抗肿瘤作用
与模型组比较，*P＜0.05
表2苦豆子多糖组合物对宫颈癌(U14)小鼠的抗肿瘤作用
与模型组比较，*P＜0.05
表3苦豆子多糖组合物对肝癌(H22)小鼠的抗肿瘤作用
与模型组比较，*P＜0.05
表4苦豆子多糖组合物对艾氏腹水瘤(EAC)小鼠的抗肿瘤作用
与模型组比较，*P＜0.05
表5苦豆子多糖组合物对结肠癌(CT26)小鼠的抗肿瘤作用
与模型组比较，*P＜0.05结果：
苦豆子多糖组合物对实体瘤(S180)细胞生长具有明显的抑制作用，其中苦豆子多糖组合物125mg/kg、250mg/kg及500mg/kg剂量对S180的抑制率分别为18.98％、14.31％、34.73％，高剂量苦豆子多糖组合物与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。
苦豆子多糖组合物对宫颈癌(U14)细胞生长具有明显的抑制作用，其中苦豆子多糖组合物125mg/kg、250mg/kg及500mg/kg剂量对U14的抑制率分别为44.79％、51.35％、57.41％，各剂量苦豆子多糖组合物与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。
苦豆子多糖组合物对肝癌(H22)细胞生长具有明显的抑制作用，其中苦豆子多糖组合物125mg/kg、250mg/kg及500mg/kg剂量对H22的抑制率分别为17.07％、36.70％、42.79％，高、中剂量苦豆子多糖组合物与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。
苦豆子多糖组合物对艾氏腹水瘤(EAC)细胞生长具有明显的抑制作用，其中苦豆子多糖组合物125mg/kg、250mg/kg及500mg/kg剂量对H22的抑制率分别为29.67％、34.65％、30.76，各剂量苦豆子多糖组合物与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。
苦豆子多糖组合物对结肠癌(CT26)细胞生长具有明显的抑制作用，其中苦豆子多糖组合物125mg/kg、250mg/kg及500mg/kg剂量对H22的抑制率分别为9.43％、12.73％、47.64％，高剂量苦豆子多糖组合物与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。
抗氧化作用
仪器：
RS9901型发光仪(上海容圣生物电子有限公司)
试剂：
鲁米诺(Aldrich公司)，邻苯三酚(沈阳市试剂一厂)，邻二氮菲(沈阳市试剂三厂)
实验方法：
(1)在羟基自由基体系中测定本申请实施例5苦豆子多糖组合物和多糖分子量不同的苦豆子多糖组合物的抗氧化性：
采用化学发光法，利用Fenton反应产生羟基自由基。在测定管中依次加入40μL、1mmol/L的FeCl2，60μL、1mmol/L的邻二氮菲，1.6ml碳酸盐缓冲溶液(CBSS，pH＝10.2)和1mg/mL不同分子量范围的样品溶液分别加入样品池，最后加入100μL、0.6％的H2O2。测前快速混匀，立即开始测定，每10s记录数据一次，另做空白实验，用CBSS代替样品溶液。结果用SPSS统计软件进行t检验，见表6和表7。
用下列公式计算样品的清除率：
清除率S(％)＝[1-(Ai/A0)]×100％
式中：Ai：加入样品后的发光值；A0：空白发光值。
表6苦豆子多糖组合物对羟自由基清除率的影响清除率(％)
表7多糖分子量不同的苦豆子多糖组合物对羟自由基清除率的影响清除率(％)
(2)在超氧阴离子自由基体系中测定苦豆子多糖组合物和多糖分子量不同的苦豆子多糖组合物的抗氧化性：
采用化学发光法，利用邻苯三酚自氧化体系产生超氧阴离子自由基。在测定管中依次加入50μL、1mmol/L的邻苯三酚，700μL CBSS(pH＝10.2)，200μL、1mmol/L的鲁米诺和1mg/mL实施例6不同多糖分子量范围的样品溶液分别加入样品池，测前快速混匀，立即开始测定，每10s记录数据一次，另做空白实验，用CBSS代替样品溶液。结果用SPSS统计软件进行t检验，见表8和表9。
用下列公式计算样品的清除率：
清除率S(％)＝[1-(Ai/A0)]×100％
式中：Ai：加入样品后的发光值；A0：空白发光值。
表8苦豆子多糖组合物对超氧阴离子清除率的影响清除率(％)
表9多糖分子量不同的苦豆子多糖组合物对超氧阴离子清除率的影响清除率(％)
其中，表8所用样品为实施例2所得，表9所用样品为实施例3所得。
结果：
通过实验，结果表明苦豆子多糖组合物和多糖分子量不同的苦豆子多糖组合物均具有明显的抗氧化活性。不同多糖分子量范围的苦豆子多糖组合物，其抗氧化性不同，在应用时可以根据实际需要加以选择。
毒性试验
(1)急性毒性试验
昆明种小鼠100只，体重18～22g，wistar大鼠20只，体重180～220g，雌雄各半，分组，分别以如下剂量灌服本发明实施例1制备组合物：小鼠剂量组为2g/kg、4g/kg、6g/kg、8g/kg和10g/kg；大鼠剂量组为1g/kg、2.5g/kg、4.5g/kg和10g/kg。灌胃后观察2周，大鼠和小鼠均未见异常反应，活动自如，无一死亡。结果表明，大鼠和小鼠的LD50值均大于10g/kg，属无毒级物质。
(2)慢性毒性试验
wistar大鼠80只，体重180～200g，分成4组，每组20只，雌雄各半，试验组剂量分别为0.10g/kg、0.75g/kg和1.5g/kg，掺入饲料，对照组为基础饲料组。观察6个月后处死，作尸检。结果：动物活动自如，毛发光泽、进食、大小便正常。各组间在动物外观、体重、血液指标、生化测定指标等方面均无显著差异。尸检结果未见有显著差异的病理变化。
(3)致突变和致畸试验
昆明种小鼠，25～28g，致突变试验中试验组剂量分别为1.25g/kg、2.5g/kg和5.0g/kg，致畸试验中试验组剂量分别为2.5g/kg、5.0g/kg和7.5g/kg。均以蒸馏水为阴性对照组，环磷酰胺40mg/kg为阳性对照组。按《食品安全性毒锂学评价程序和方法》分别作骨髓核试验和睾丸染色体畸变试验。结果：各试验组微核率与阴性对照组无显著差异(p＞0.05)，各试验组染色体畸变率与阴性对照组无显著差异(p＞0.05)，不存在致畸，致突变毒性。
增效试验
材料：
KM小鼠，SPF级，雌雄各半，18～22g，中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心提供，许可证号：SCXK-(军)2009-003；
氯化钠注射液(生理盐水)批号：2J73G5和3G71B1；
环磷酰胺(CTX)(阳性对照药)安瓿瓶装粉针200mg/支，江苏恒瑞医药股份有限公司，产品批号：12041025，使用时以生理盐水(N.S)配制成所需浓度的药液。用前新鲜配制，配置后0.5h内完成注射(80mg/kg，40mg/kg，20mg/kg)。
实验方法：
分别建立S180(实体肉瘤)、HepA(肝癌腹水)小鼠皮下移植瘤模型，接种次日随机分组，依实验要求分为6组，每组动物数量为12只，在肿瘤接种后24h开始给药。环磷酰胺为腹腔注射给药，本申请实施例2制备苦豆子多糖组合物为灌胃给药。环磷酰胺给药1次，连续给药4天；苦豆子多糖组合物每日给药1次，连续给药7天。末次给药后24h处死动物，称取体重，解剖并取出肿瘤组织，称取肿瘤重量，以肿瘤生长抑制率来评价药物的体内抗癌效果。
计算公式为：肿瘤生长抑制率＝(1-T/C)×100％，
式中：T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。
实验分组为：
空白对照组：生理盐水(N.S)对照组；
阳性对照组1：环磷酰胺20mg/kg组；
阳性对照组2：环磷酰胺40mg/kg组；
给药组1：环磷酰胺20mg/kg，同时给予苦豆子多糖组合物250mg/kg组；
给药组2：环磷酰胺40mg/kg，同时给予苦豆子多糖组合物250mg/kg组。
实验结果：
表1-1苦豆子多糖组合物对环磷酰胺抑制肿瘤作用的影响
注：与空白对照组比较：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；
与同剂量阳性对照组比较：△P<0.05；△△P<0.01；△△△P<0.001
结果：多糖组合物与不同剂量的环磷酰胺配伍组均能明显提高对小鼠移植性肿瘤S180、HepA二种瘤谱的抑瘤率，且与单用组比较，瘤重明显降低(P<0.05)。说明苦豆子多糖组合物能明显增强化疗药物环磷酰胺对小鼠移植肿瘤抑瘤效果，具有较好的增效作用。
减毒试验
材料：
KM小鼠，SPF级，雌雄各半，18～22g，中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医 学研究所动物实验中心提供，许可证号：SCXK-(军)2009-003；
氯化钠注射液(生理盐水)批号：2J73G5和3G71B1；
环磷酰胺(CTX)(阳性对照药)安瓿瓶装粉针200mg/支，江苏恒瑞医药股份有限公司，产品批号：12041025，使用时以生理盐水(N.S)配制成所需浓度的药液。用前新鲜配制，配置后0.5h内完成注射(80mg/kg，40mg/kg，20mg/kg)。
实验方法：
常规接种肿瘤HepA于小鼠右侧腋窝下。将接种后的肿瘤随机分为空白对照组(生理盐水)、CTX常规剂量组(30mg/kg)、本申请实施例3制备多糖组合物(250mg/kg)+CTX低剂量组(15mg/kg)、本申请实施例3制备多糖组合物(250mg/kg)+CTX中剂量组(20mg/kg)、本申请实施例3制备多糖组合物(250mg/kg)+CTX高剂量组(25mg/kg)，每组动物数量为12只，在肿瘤接种后24h开始给药。环磷酰胺为腹腔注射给药，苦豆子多糖组合物为灌胃给药。环磷酰胺给药1次，连续给药4天；苦豆子多糖组合物每日给药1次，连续给药7天。停药次日取尾尖血，常规方法进行WBC计数，然后称重处死动物，剥离瘤块、胸腺和脾脏并分别称重，计算抑瘤率和脏器指数。
注：与空白对照组比较：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；
与CTX常规剂量组比较：△P<0.05；△△P<0.01；△△△P<0.001
多糖组合物与低于常规剂量的CTX组合用时抑瘤率升高，抑瘤率达61.17％；CTX常规剂量组治疗后毒副作用较大，外周血WBC数、胸腺指数和脾指数与空白对照组比较均显著降低(P<0.05)。多糖组合物与CTX各剂量合用后，可使外周血WBC、胸腺指数和脾指数升高，与CTX常规剂量组相比有显著差异(P<0.05)；与空白对照组相比，WBC和胸腺指数仍比较低，有显著性差异(P<0.05)，而脾指数与空白对照组相比无显著性差异。说明苦豆子多糖组合物对CTX所致的外周血WBC减少、免疫器官萎缩等毒性反应，虽然不能使其完全恢复到正常水平，但均有明显保护作用，提示该多糖组合物是一种有效的化疗药物的减毒剂， 有良好的应用前景和研究价值。
以上仅仅是对本发明的较佳实施例进行的详细说明，但是本发明并不限于以上实施例。应该理解的是，在不脱离本申请的权利要求的精神和范围情况下，本领域的技术人员做出的各种修改，仍在申请待批的本发明的保护范围之内。