本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及用于增强抗原免疫应答的佐剂。
背景技术：
细菌、病毒及寄生虫感染广泛分布于人和动物，由这些感染剂引起的疾病通常对抗生素等化学物质具有抗性，因此没有有效的治疗方法。因此，本领域愈来愈多使用疫苗学方法以控制传染，具体是通过用活的病原体、经灭活的病原体或其产物、或经基因工程手段将病原体蛋白质亚基制备成疫苗进行疫苗接种来诱导特异性免疫。然而，当单独给予某些抗原时难以对免疫系统产生足够的刺激作用。因此，必须加入能够使机体免疫应答增加的免疫佐剂来获得足够量的保护性抗体。
免疫佐剂是疫苗必不可少的组成部分，不仅能影响机体对疫苗免疫应答的强度，而且能针对特定病原体诱导最有效的免疫应答类型(Mbow ML,De Gregorio E,Valiante NM,et al.New adjuvants for human vaccines.Current opinion in immunology,2010,22(3):411-416)。目前，研究的免疫佐剂类型很多，如油佐剂、弗氏佐剂、微生物及其代谢产物、核酸及其类似物、细胞因子、脂质体等(Dey AK,Srivastava IK.Novel adjuvants and delivery systems for enhancing immune responses induced by immunogens.Expert review of vaccines,2011,10:227-251)，但由于存在不同程度的毒副作用或安全隐患等一些不可避免的缺陷而难以实际应用(Mbow ML,De Gregorio E,Valiante NM,Rappuoli R.New adjuvants for human vaccines.Current opinion in immunology,2010,22(3):411-416；Batista-Duharte A,Lindblad EB, Oviedo-Orta E.Progress in understanding adjuvant immunotoxicity mechanisms.Toxicology letters,2011,203(2):97-105)，导致这些佐剂远远不能满足新型疫苗发展的需求。因此，寻找安全、有效、新型的免疫佐剂是当前疫苗研究领域的一个热点(Schijins VEJC,Lavelle EC.Teends in vaccine adjuvants.Expert review of vaccines,2011,10(4):539-550)。并且，免疫佐剂研究现已被列为疫苗研究的优先领域(Harandi AM,Medaglini D,Shattock RJ.Vaccine adjuvants:A priority for vaccine research.Vaccine,2010,28(12):2363-2366；Harand AM,Brewe J,Schijn V.Conference scene:recent advancements in immunopotentiators for modern vaccines.Immunotherapy,2011,3(11):1297-1301)。
目前商品化的菌苗(如猪肺炎支原体菌苗、副猪嗜血杆菌菌苗)是通过在含血清的培养基上生长所得的生物体制备而成，引起了对于免疫物质中存在的血清组分(如免疫复合物或非免疫原性特异性蛋白)诱导副反应发生(见中国专利CN104334186A)。
另外，在兽用生物制品技术领域临床试验的研究中，发现蛋白的重复性和稳定性十分重要，良好的稳定性是数据可靠的一个重要标志。但是，在临床试验中，一些蛋白的稳定性较差，在一般条件下极易降解或变性，直接影响试验结果的准确性。因此，如何保持蛋白的稳定性是临床试验中的关键技术。
技术实现要素：
本发明解决的主要技术问题是提供一种有效的疫苗用佐剂，能够有效增强抗原的免疫效力。所述疫苗用佐剂与抗原共同使用，能够简化免疫程序，仅需一次免疫即能达到商业疫苗两次免疫的效果。
本发明涉及一种疫苗用佐剂，所述佐剂包括丙烯酸系聚合物和纤维素醚。
本发明还涉及一种疫苗用佐剂，所述佐剂包括丙烯酸系聚合物和纤维素醚以及免疫增强剂；所述免疫增强剂为含皂苷的组合物，优选 为免疫刺激复合物。
本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的抗原和本发明的丙烯酸系聚合物和纤维素醚佐剂。
本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的抗原和本发明的丙烯酸系聚合物、纤维素醚和免疫增强剂佐剂。
本发明解决的另一技术问题是提供一种抗原蛋白稳定剂，所述抗原蛋白稳定剂能够在制备过程中和适当条件下长期保持蛋白原有分子量、结构和/或生物活性。
本发明涉及一种抗原蛋白稳定剂，所述稳定剂包括丙烯酸系聚合物和纤维素醚。
本发明还涉及一种抗原蛋白稳定剂，所述稳定剂包括丙烯酸系聚合物、纤维素醚和含皂苷的组合物。
本发明的佐剂在抗原含量较低、单次免疫时也能使动物获得较好的免疫应答水平，减少了猪的应激反应，降低了副反应的发生；所述佐剂还可以用于稀释活疫苗，并使活疫苗以肌肉注射形式免疫猪只，使操作简便。此外，所述佐剂还可用作蛋白稳定液保存蛋白，使蛋白稳定不降解或不发生不可逆变化。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
术语“佐剂”是指当与抗原连同投与时，使受试者对这一抗原的免疫反应增强的化合物。
术语“丙烯酸系聚合物”是指含有丙烯酸系部分的任何聚合物或共聚物，包括但不限于聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚丙烯酸的烷基酯。丙烯酸系聚合物的实例包括如聚(丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸丁酯)、丙烯酸-甲基丙烯酸、丙烯酸-丙烯酰胺和聚(甲基丙烯酸酯)。市售丙烯酸系聚合物的实例包括卡波普Carbopol(古德里奇公司B.F.Goodrich Co.，美国俄亥俄州克利夫兰Cleveland Ohio)、卡伯赛Carboset(古德里奇公司B.F.Goodrich Co.， 美国俄亥俄州克利夫兰Cleveland Ohio)、尼奥克Neocryl(安万克公司Avecia Inc.，美国特拉华州威尔明顿Wilmington Del.)和尤特奇Eudragit(罗姆科技公司Rohm Tech,Inc.，美国马莎诸塞州马二登Malden Mass.)。特别适用于本发明佐剂中的丙烯酸系聚合物为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)，在所述技术领域中通常还指并且已知是与聚烯丙基蔗糖交联的丙烯酸的水溶性聚合物，这些化合物见Phameuropa(1996,8(2))，本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸系聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代，优选为含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，以BF Goodrich(Ohio,USA)特别合适，它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联，这其中可提及卡波普941、980、981、940、2020、974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。
术语“纤维素醚”是指纤维素的醚类衍生物如羧甲基纤维素CMC、羟乙基纤维素HEC、羟丙基甲基纤维素HMPC，还包括它的盐类即羧甲基纤维素盐。所述羧甲基纤维素盐包括但不限于羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钾、羧甲基纤维素钙，优选为羧甲基纤维素钠。
术语“羧甲基纤维素钠”(Sodium carboxymethylcellulose)是基于纤维素的生物聚合物，并通过在含有单氯乙酸钠的氢氧化钠溶液中对纤维素进行酯化来生产(Feddersen等，羧甲基纤维素钠Sodium carboxymethylcellulose,在Whistler RL,BeMiller JN主编的《工业胶多糖及其衍生物》Industrial gums polysaccharides and their derivatives,Marcel Dekker Inc.,New York,第三版(1993):537-578)，给出了取代度DS作为酯化程度的度量，所述取代度是指葡萄糖单元中被酯化羟基的平均数量。存在三个反应性羟基允许引入三个羧甲基钠基团。羧甲基纤维素钠的特性取决于其取代度及其聚合度(Belitz等,Lehrbuch der Lebensmittelchemie.Springer-verlag,Berlin,第四版,1992)，所述聚合度是指在聚合过程中相连形成大分子的单体分子的平均数量。根据本发明，优选的羧甲基纤维素钠具有125000g/mol的平均分子质量。所述“羧甲基纤维素钠”还包含在其定义的严格意义上不是羧甲基纤维素钠，但是由于如纤维素或其他多种糖通过羟基化、羧基化、酯化和/或醚化进行的例如衍生化而具有与羧甲基纤维素钠相同或相似特性，因此能够等同地使用的多糖。
本发明的第一方面在于提供一种疫苗用佐剂，所述佐剂包括丙烯酸系聚合物和纤维素醚。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗用佐剂中，所述丙烯酸系聚合物包括聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚丙烯酸的烷基酯。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗用佐剂中，所述丙烯酸系聚合物包括卡波普、卡伯赛、尼奥克Neocryl、尤特奇Eudragit。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明的疫苗用佐剂中，所述丙烯酸系聚合物包括卡波普941、980、981、940、2020、974P、934P和971P。
作为本发明的一种实施方式，纤维素醚包括羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钾、羧甲基纤维素钙、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗用佐剂中，所述丙烯酸系聚合物以卡波姆计为2-10mg/ml，所述纤维素醚为0.1-8mg/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗用佐剂中，所述丙烯酸系聚合物以卡波姆计为4-10mg/ml，所述纤维素醚为4-8mg/ml。
术语“免疫增强剂”(immunopotentiator)是指本身不具有免疫原性，但可以用于刺激免疫系统以改善对其它具有免疫原性的物质的应答。如同目的抗原一起使用或分别施用于同一对象时，可直接或间接地调节所述抗原诱导的免疫反应或改变该抗原的免疫反应类型(包括 例如体液免疫、细胞免疫)。所述免疫增强剂包括但不限于含皂苷的组合物、活性乳酸菌、蜂胶、维生素E、左旋咪唑、转移因子、白细胞介素、干扰素、胸腺肽、转移因子、球蛋白、卡介苗或其组合。
术语“含皂苷的组合物”可包含纯化或部分纯化制剂如QS21(商品名为StimulonTM)，以及脂质制剂如免疫刺激复合物ISCOM。所述皂苷(saponin)又称皂角苷、皂素、碱皂体或皂草苷，是固醇苷和三萜苷的异源基团，可见于多种植物的皮、叶子、茎、根、甚至花中包括但不限于Quilaja皂苷、Ginseng皂苷、Panax notoginseng皂苷、Platycodon grandiflorum皂苷、Astragalus皂苷、Achyranthes皂苷、Polygala皂苷，以及Sun等文献中所提及的皂苷(Sun HX,Xie Y,Ye YP.Advances in saponin-based adjuvants.Vaccine,2009,27(12):1787-1796)，优选为Quilaja皂苷。所述纯化或部分纯化制剂可用HPLC和RP-HPLC纯化，利用这些技术已鉴定出特异性的纯化组分，其中包括QuilA、QS21、QS7、QS17、QS18、QH-A、QH-B、QH-C、VaxSap、SuperSap、GPI-0100、QP UF1000的至少一种。
术语“免疫刺激复合物”(immunostimulating complex,ISCOM)是指不含有抗原的免疫刺激复合物即免疫刺激复合物基质(ISCOM-matrix)与疫苗混合后也同样能够起到免疫佐剂的效果，是在糖苷如三萜式皂苷(具体为Quil A)和胆固醇，例如欧洲公开号EPA109942和180564。典型的ISCOM是含皂苷、胆固醇的独特粒子，进一步还包括磷脂如脑磷脂或卵磷脂，任何已知的皂苷都可用于ISCOM中。优选ISCOM包含QuilA(南美Quillaja saponin三萜烯皂甙)、胆固醇、卵磷脂，混匀共价结合而成，电镜下呈笼式或高尔夫球氏的免疫复合物。关于皂苷和ISCOM以及形成ISCOM的方法详见Barr等文献(Barr IG,Sjolander A,Cox JC.ISCOMs and other saponin based adjuvants.Advanced drug delivery reviews,1998,32(3):247-271)。用标准技术制备用于本发明的ISCOM，这些技术是本领域熟知的，描述于例如美国专利号4981684、5178860、5679354、6027732，欧洲公开号EPA109942、180564、231039，以及Coulter等(Coulter A,Wong TY,Drane D,et al.Studies on experimental adjuvanted influenza vaccines:comparison of immune stimulating complexes(IsxomsTM)and oil-in-water vaccines.Vaccine,1998,16(11-12):1243-1253)。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗用佐剂中，所述佐剂还包括免疫增强剂，所述免疫增强剂包括含皂苷的组合物、活性乳酸菌、蜂胶、维生素E、左旋咪唑、转移因子、白细胞介素、干扰素、胸腺肽、转移因子、球蛋白、卡介苗或其组合。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗用佐剂中，所述免疫增强剂包括含皂苷的组合物，所述含皂苷的组合物优选为免疫刺激复合物。所述含皂苷的组合物包括QuilA、QS21、QS7、QS17、QS18、QH-A、QH-B、QH-C、VaxSap、SuperSap、GPI-0100和QP UF1000、免疫刺激复合物的至少一种。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗用佐剂中，所述丙烯酸系聚合物以卡波姆计为2-10mg/ml，所述纤维素醚为0.1-8mg/ml，和所述含皂苷的组合物以QuilA计为0.1-10mg/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗用佐剂中，所述丙烯酸系聚合物以卡波姆计为4-10mg/ml，所述纤维素醚为4-8mg/ml，和所述含皂苷的组合物以QuilA计为4-10mg/ml。
术语“免疫有效量”又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫原性应答的量。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。
术语“抗原”又称免疫原，是指任何刺激免疫应答的物质，是一种能够被抗体结合的分子，还能够诱导产生B-和/或T-细胞的体液免疫应答和/或细胞免疫应答，还具有一个或多个表位(B-和T-表位)。所述抗原包括杀死的、灭活的、减毒的或经修饰的活的细菌、病毒或寄生虫，或其培养细胞制剂、上清液；还包括亚单位抗原，所述亚单位抗原为个别的或其任何组合的多核苷酸、多肽、重组蛋白质、合成的肽、蛋白质提取物、细胞、组织、多糖、脂质或其片段，亦包括抗体如抗受试者遗传型抗体或其片段以及可模拟抗原或抗原决定簇(表位)的合成肽模拟位mimotopes。其中，所述杀死的、灭活的细菌、病毒或寄生虫是指含有不再能够复制或生长的感染性生物体或病原体，病原体可通过各种方法包括冻融、化学处理(如用硫柳汞或福尔马林处理)、声处理、照射、热或任何其它足以阻止生物体复制或生长的常用方法来实现灭活而维持其免疫原性；所述经修饰的活的细菌、病毒或寄生虫是指在人工条件下促使其变异，失去致病性但保留免疫原性、繁衍能力和剩余毒力的抗原，接种后在动物体内有一定程度的繁殖或复制，但不会导致发病。
术语“猪圆环病毒抗原”是指含有至少一种猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)抗原形式的任何组合物，所述猪圆环病毒抗原可诱导、刺激或增强抵抗猪圆环病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原。所述猪圆环病毒抗原包含SH株(保藏号为CGMCC No.23890，参见中国专利CN101240264A)、SD株(保藏号为CGMCC No.7707，参见中国专利CN103421748A)、D株(保藏号为CGMCC No.7245，参见中国专利CN103275938A)、WH株(保藏号为CCTCC No.V201333，参见中国专利CN103409374A)、ZJ/H株(保藏号为CGMCC No.6391，参见中国专利CN102787100A)、DBN-SX07株(保藏号为CGMCC No.3064，参见中国专利CN101549155A)、V201312株(保藏号为CCTCC No.V201312，参见中国专利CN103436498A)，还可以包含以下组合物的任一种抗原如梅里亚公司Merial的辉瑞公司Pfizer 的PCV2、哈尔滨维科生物技术开发公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)、浙江诺倍威生物技术有限公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(ZJ/C株)、勃林格殷格翰公司Boehringer-Ingelheim的Ingelvac
术语“猪肺炎支原体抗原”是指含有至少一种猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)抗原形式的任何组合物，所述猪肺炎支原体抗原可诱导、刺激或增强抵抗猪肺炎支原体感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原，或其培养上清液。所述猪肺炎支原体抗原包含HN0613株(保藏号为CCTCC No.M2012230，参见中国专利CN103083655A)、J株(购自美国典型培养物保藏中心ATCC，ATCC编号为25934)、NJ株(保藏号为CCTCC No.M2012286，参见中国专利CN103585622A)、HDZK-Mhp57株(保藏号为CGMCC No.8096，参见中国专利CN103484414A)、AN306株(保藏号为CCTCC No.M2012431，参见中国专利CN103740625A)、DJ-166株(保藏号为CGMCC No.4545，参见中国专利CN103184171A)和NM04/41259株(保藏号为NM04/41259株，参见中国专利CN102458462A)，还可以包含以下组合物的任一种抗原如哈药集团公司的瑞倍适Respisure和瑞倍适-旺RespisureOne、英特威公司的安百克M+PAC、勃林格殷格翰公司的M.hyo、美国普泰克公司的MycoGard、美国辉瑞公司的RespiFend MH、硕腾(上海)动物保健品有限公司的瑞富特-旺Suvaxyn MH-one、梅里亚动物保健公司的猪克喘SprintVac、海博莱公司的喜宜丰Mypravac Suis、国内生产的Z株活疫苗、168株活疫苗和RM48株活疫苗。
术语“副猪嗜血杆菌抗原”是指含有至少一种副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)抗原形式的任何组合物，所述副猪嗜血杆菌抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗副猪嗜血杆菌感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原，或其培养上清液。所述副猪嗜血杆菌抗原包括本领域技术人员熟知的临 床分离的野毒株，包含目前已鉴定的1-15个血清型或无法测定血清型的副猪嗜血杆菌，包含至少两个血清型的混合抗原如4型(如JS株，保藏号为CCTCC No.M2011172，参见中国专利CN103083655A)和5型(如ZJ株，保藏号为CCTCC No.M2011173，参见中国专利CN103083655A)的混合抗原，还可以包含以下组合物的任一种抗原如勃林格殷格翰公司的Ingelvac HP-1、海博莱公司Hipra的Hiprasuis-Glasser、中牧实业股份有限公司成都药械厂和武汉科前动物生物制品有限责任公司的副猪嗜血杆菌灭活疫苗(4型MD0322株+5型SHO165株)。
本发明的第二方面在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的抗原和本发明的佐剂。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述抗原包括猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪细小病毒抗原、多杀巴斯德菌抗原、猪链球菌抗原、猪葡萄球菌抗原、支气管炎博德特菌抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、肠炎沙门氏菌抗原、猪红斑丹毒丝菌抗原、猪鼻支原体抗原、猪滑液支原体抗原、猪钩端螺旋体细菌抗原、猪呼吸道冠状病毒抗原、猪流行性腹泻病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪细环病毒抗原、猪巨细胞病毒抗原、猪肠病毒抗原、脑心肌炎病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪瘟病毒抗原中的一种或多种；以及所述佐剂包括丙烯酸系聚合物和纤维素醚。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述抗原包括上述抗原的一种或多种；以及所述佐剂包括丙烯酸系聚合物、纤维素醚和含皂苷的组合物。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述抗原由猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌抗原组成，所述佐剂包括丙烯酸系聚合物和纤维素醚。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述 抗原由猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌抗原组成，所述佐剂包括丙烯酸系聚合物、纤维素醚和含皂苷的组合物。
作为本发明的一种最优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述抗原由猪圆环病毒SH株灭活抗原、猪肺炎支原体HN0613株灭活抗原、副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株灭活抗原组成，所述佐剂包括丙烯酸系聚合物、纤维素醚和免疫刺激复合物。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述佐剂的含量为5％-30％V/V。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述佐剂的含量为10％-25％V/V。
术语“蛋白”包括化学合成的蛋白、培养细胞的基因编码的天然合成的蛋白以及由细胞分泌的重组蛋白。所述重组蛋白是由分子生物技术引入细胞的转基因编码的那些，可通过化学方法或翻译后过程中的酶进行修饰。所述蛋白包括动物蛋白，是通过细胞培养产生的那些，也包括其他来源例如昆虫、细菌、植物等表达的蛋白，以及突变的、人工的、合成的、融合的或嵌合的蛋白。根据本发明，所述蛋白包括但不限于兔病毒性出血症病毒RHDV的VP60蛋白，犬细小病毒PPV的VP2蛋白，猪圆环病毒PCV2的Cap、Rep蛋白，猪肺炎支原体的P46、P65、NrdF、P97R1、P102、PdhA、XylF、P78、EutD、Mhp145、P132、Mhp389蛋白，副猪嗜血杆菌HPS的PilA、OMP、HbpA、OppA、PalA蛋白，猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的Nsp2、GP3、GP4、GP5、M、N蛋白，猪细小病毒PPV的VP2蛋白，多杀巴斯德菌P.multocide的hyaE蛋白，猪链球菌S.suis的38KDa、SaoA、MRP、HM6、GAPDH、Omp40、VirB4、SLY蛋白，猪葡萄球菌S,hyicus的ExhA、ExhB、ExhC、ExhD蛋白，支气管炎博德特菌Bb的P68蛋白，大叶性肺炎放线杆菌APP的Omp20、OmpW、Omp27、Omp27、OmpA1和OmpA2蛋白，大肠杆菌E.coli的K88、K99、987P、F41、F17、LTB、Orf353、TolC蛋白，猪萎缩性鼻炎AR的PMT，猪伪狂犬病毒PRV的gB、gC、gD、gE，肠炎沙门氏菌S.enteria的Hfq蛋白，猪红 斑丹毒丝菌E.rhusiopathiae的SpaA、Lipo蛋白，猪鼻支原体Mhr的P37蛋白，猪呼吸道冠状病毒PRCV的S、N蛋白，猪流行性腹泻病毒PEDV的S、M、N蛋白，猪轮状病毒PRV的VP4、VP6、VP7蛋白，猪传染性胃肠炎病毒TGEV的S、M、N蛋白，猪细环病毒TTSuV的Cap蛋白，猪巨细胞病毒PCMV的gB蛋白，猪脑心肌炎病毒EMCV的VP1、VP2、3AB蛋白，猪流感病毒的HA、NP、NA、M、NS蛋白，猪瘟病毒CSFV的E0、E1、E2蛋白中的一种或多种。
术语“蛋白稳定液”是指使免疫原性蛋白成分的稳定性得以显著改善，在制备过程中和适当条件下长期(例如数月至数年)优选地超过12个月(例如24个月或36个月)保存后，保持蛋白原有分子量、结构和/或生物活性的至少80％优选至少90％不变，保持蛋白生物稳定性、物理稳定性、化学稳定性，不会形成化学降解产物，不会发生不可逆变化(例如聚集、沉淀或变性)。所述化学降解产物与天然蛋白结构相比具有潜在的更低生物效价和/或潜在的更低免疫原性。
本发明的第三方面在于提供一种抗原蛋白稳定剂。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述抗原蛋白稳定剂包括丙烯酸系聚合物和纤维素醚。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述抗原蛋白稳定剂包括丙烯酸系聚合物、纤维素醚和含皂苷的组合物。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述抗原蛋白稳定剂包括丙烯酸系聚合物、纤维素醚和免疫刺激复合物。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述抗原蛋白稳定剂中所述丙烯酸系聚合物以卡波姆计为2-10mg/ml，所述纤维素醚为0.1-8mg/ml，和所述含皂苷的组合物以QuilA计为0.1-10mg/ml。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或 替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中猪圆环病毒抗原以灭活的猪圆环病毒2型SH株，猪肺炎支原体抗原以灭活的猪肺炎支原体HN0613株和活的猪肺炎支原体168株，副猪嗜血杆菌抗原以灭活的4型副猪嗜血杆菌JS株和5型副猪嗜血杆菌ZJ株为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明实施例中肺病变指数采用28分法进行评判。所述28分法是根据猪支原体肺炎的典型肺部眼观病变，对发病程度进行量化判定，包括肺尖叶、心叶、膈叶、中间叶出现的实质样病变，如“肉样变”、“胰样变”。肺炎病变评分标准为：2个尖叶、2个心叶、2个膈叶、1个中间叶共计7个肺叶，每个肺叶满分为4分，共计28分。根据发生实质病变的肺叶面积所占该叶的比例，分别对每个肺叶进行打分。无肺炎病变记为0分；病变面积比例为1％-25％，记为1分；病变面积比例26％-50％，记为2分；病变面积比例为51％-75％，记为3分；病变面积比例为76％-100％，记为4分。如肺叶正反两面均有病变，以病变面积大的一面进行记分。各个肺叶打分总和即为该发病株的肺炎病变得分。分别对免疫组猪和对照组猪进行记分后，按照以下公式计算免疫组猪的肺叶病变减少率：
本发明实施例统计分析方法为：统计7个肺叶的肺病变指数，确定病变程度。用SPSS计算机软件进行ANOVA分析，比较各组间差异，确定病变差异的有效性。
本发明中所用的pH7.2PBS溶液配方为：800ml蒸馏水中加入NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO41.42g、KH2PO40.27g，调pH值至7.4，定容至1000ml，经121℃高压灭菌30分钟后使用，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1抗原的制备及鉴定
1.1猪圆环病毒抗原的制备及含量测定
1.1.1猪圆环病毒2型SH株的制备
将毒种猪圆环病毒2型SH株用MEM液体培养基(用购自美国Invitrogen公司的MEM干粉培养基按说明书配制)作1:9V/V稀释，然后按细胞培养液体积的5％接种于PK15(ATCC，保藏号为CCL-33)单层细胞，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液(MEM液体培养基中添加4％犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸)，37℃培养4日，冻融2-3次，收获病毒，病毒滴度为106.5TCID50/ml。
用转瓶细胞培养法培养病毒液，将长满单层的PK15细胞，倒去细胞培养液(MEM液体培养基中添加6％犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸)，将毒种液按0.1-0.2TCID50/个细胞的接种量接种于PK15细胞上，旋转细胞瓶2周，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液，置37℃旋转(10-12转/小时)培养。每日观察1-2次，细胞生长良好，37℃培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20℃以下保存病毒液。
将制备的病毒液用中空纤维滤柱(Millipore公司孔径10μm与0.45μm)过滤，除去细胞碎片，然后用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为300Kda)作5倍V/V浓缩。
1.1.2猪圆环病毒2型SH株病毒液含量测定
将病毒液用MEM液体培养基按本领域技术人员通用方法作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-73个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15细胞单层4孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5％CO2的温箱中继续培养24小时，换细胞维持液，继续培养 24小时；用冷丙酮固定细胞，用间接免疫荧光试验IFA测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞(呈绿色)的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID50。计算结果表明：猪圆环病毒2型SH株的含量为5×106.0TCID50/ml。
1.1.3猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活及检验
将检验合格的病毒液加入甲醛溶液(洛阳市化学试剂厂分析纯，含量为37％-40％V/V)，使甲醛溶液的终浓度为0.2％V/V，37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次10分钟，灭活结束后将灭活病毒液置2-8℃保存。
对灭活病毒液进行灭活检验，取少量灭活病毒液接种已长成单层的PK15细胞，37℃吸附1小时后弃病毒液，加入新的细胞维持液，37℃培养2日，无细胞病变CPE，连续盲传3次，长成细胞单层后换成细胞维持液，37℃培养2日，用间接免疫荧光法IFA检测，无绿色PCV2阳性细胞产生，表明猪圆环病毒2型SH株病毒液灭活成功。
1.2猪肺炎支原体抗原的制备及含量测定
1.2.1猪肺炎支原体HN0613株的制备及含量测定
冻干菌种启封后，按10％接种量接种液体培养基，37℃振荡培养3-7日，待pH值由7.5降至6.8时收获，经纯粹检验，作为一级生产种子。取一级种子按5％接种量接种液体培养基，37℃振荡培养3-7日，待pH值由7.5降至6.8时收获，经纯粹检验，作为二级生产种子。
其中，猪肺炎支原体液体培养基的配方：牛心浸出液(BD公司)300ml，双蒸水360m1，校正pH值到7.4，121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank's平衡盐溶液(10×)40m1，0.25％W/V酚红10m1，马血清200m1，5％W/V水解乳蛋白100m1，25％W/V酵母浸出液20m1，10000IU/ml青霉素10ml。
将鉴定合格的猪肺炎支原体HN0613株的二级种子分别按5％V/V接种于液体培养基，37℃振荡培养3-7日，待pH值由7.5降至6.8时收获菌液。将收获到的菌液用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为300Kda)作10倍V/V浓缩。
按照菌液活菌计数法测定猪肺炎支原体菌液含量，将含酚红指示剂的液体培养基分装至小试管中，设两排，每排13支，1.8ml/支，取0.2ml待检培养物接种至第一支小试管，混匀后依次10倍稀释至第12支小试管，第13管为对照管，置37℃摇振培养，记录21天为止产生颜色变化的最高管数，以判定CCU滴度，取两排结果的平均值。结果表明：猪肺炎支原体HN0613株的含量为1×109CCU/ml。
1.2.1.1猪肺炎支原体HN0613株菌液的灭活及鉴定
在收获的菌液中加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.3％V/V，37℃灭活24小时，其间每隔4小时搅拌1次，每次10分钟，灭活结束后将灭活菌液置2-8℃保存。
对灭活后的菌液进行灭活检验，取1ml灭活菌液接种50ml液体培养基，37℃培养，于第5、10日各移植一次，最后一次移植后继续培养观察11日，培养基pH值不降低，培养基着色均未发生变化。
1.2.2猪肺炎支原体168株抗原
猪肺炎支原体168株活疫苗冻干粉，购自南京天邦生物科技有限公司，每份含猪肺炎支原体168株活菌为1×107CCU。
1.3副猪嗜血杆菌抗原的制备及鉴定
1.3.1副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株的制备
将副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株划线接种于含5％新生牛血清和0.005％烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD(美国BBI公司)的胰蛋白大豆琼脂平板(简称TSA/NAD平板)，37℃培养24-48小时，各挑选5个以上典型菌落，纯粹检验合格后，作为一级种子。一级种子挑取单个菌落，接入含5％新生牛血清和0.005％NAD的胰蛋白大豆肉汤(简称TSB/NAD液体培养基)，37℃摇床180转/分钟振荡培养12小时，同时取样革兰氏染色，在显微镜下观察细菌形态均匀，符合副猪嗜血杆菌的形态特征，无任何杂菌生长，作为二级种子。
其中，含5％血清的TSA/NAD平板的制备方法：胰蛋白大豆琼脂(Tryptic Soy Agar，TSA，BD Difico产品)40克加入945ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，温度 降至60℃左右，加入50ml过滤除菌的牛血清，5ml过滤除菌的1％NAD，充分摇匀后倒平皿；含5％新生牛血清的TSB/NAD液体培养基的制备方法：胰大豆蛋白肉汤(Tryptic Soy Broth，TSB，BD Difico产品)30g加入940ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，加入50ml过滤除菌的牛血清，10ml过滤除菌的0.01％NAD即成。
将鉴定合格的副猪嗜血杆菌4型JS株与5型ZJ株的二级种子分别按1:100V/V接种于TSB/NAD液体培养基，置37℃摇床200rpm培养。培养至12-16小时，收获菌液。
将收获的菌液(副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株)分别以连续离心机(10000转/分钟)离心后再以PBS溶液复溶至离心前的体积，然后用密理博膜包(分子截留量为300Kda)作5倍V/V浓缩。
菌液取样，按本领域技术人员熟知的方法作10倍系列稀释，取10-6、10-72个稀释度接种于前述TSA/NAD固体培养基，每个平板接种0.1ml，37℃培养24小时后，选择菌落数在30和300之间的平板进行菌落计数。计数结果表明：副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株的含量均为5×109CFU/ml。
1.3.2副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株菌液的灭活及鉴定
在收获的菌液中加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.3％V/V，37℃灭活24小时，其间每隔4小时搅拌1次，每次10分钟，灭活结束后将灭活菌液置2-8℃保存。
对灭活后的菌液进行灭活检验，制备6个平皿的TSA/NAD固体培养基，无菌操作将灭活的菌液在其中3个TSA/NAD固体培养基平皿上滴加1滴，用接种环划线，置37℃普通温箱培养，同时设立3个不接菌的TSA/NAD固体培养基作对照。24小时后观察，平皿中无任何细菌生长，同时对照未接菌的2个培养基也应无细菌生长，继续观察结果至48小时6个平皿中均无细菌生长。
实施例2佐剂的制备
卡波姆母液的制备：取卡波姆971P溶于蒸馏水，室温放置过夜使其充分溶胀得到20mg/ml的卡波姆溶液，加入3M氢氧化钠溶液调节溶液pH值至7.2，加适量蒸馏水调节卡波姆溶液，得到终浓度为15mg/ml的卡波姆母液。
羧甲基纤维素钠母液的制备：将1g羧甲基纤维素钠与100ml蒸馏水混合，加热煮沸直到完全溶解，然后冷却至室温，即配置成浓度为10mg/ml的羧甲基纤维素钠母液。
ISCOM基质母液的制备：取12mg/ml的脂类混合物储备液加入PBS溶液中，再加入30mg/ml QuilA储备液，使终浓度为QuilA 15mg/ml、磷脂酰胆碱3mg/ml、胆固醇3mg/ml，充分混匀后冰浴超声处理，室温放置1.5小时后，转移至透析袋中，以PBS溶液为外液室温透析3天，经0.22μm滤膜除菌后于4℃保存，得QuilA终浓度为15mg/ml的ISCOM基质母液。
以上母液均于121℃高压灭菌30分钟后备用。
实施例3灭活疫苗组合物的制备及动物试验
3.1灭活疫苗组合物的制备
将实施例1制备的抗原、实施例2制备的佐剂之各成分母液，使用PBS溶液稀释，使稀释后的各抗原溶液与佐剂终浓度按表1中灭活的疫苗组合物所含组分混合，以500-800转/分钟的转速搅拌10-15分钟，在终止搅拌前加入1％V/V的硫柳汞(购自国药集团化学试剂有限公司)溶液，使其终浓度不超过万分之一，充分振荡混匀、分装，分装后2-8℃保存备用。
表1灭活疫苗组合物所含组分
3.2灭活疫苗组合物之猪圆环病毒抗原的效力试验
将实施例3.1所制备的疫苗1-1、1-2、1-3、1-6、1-7、1-9、2-1、2-2、2-3、2-6、2-7、2-9以及参考疫苗对照组(PCV2疫苗，由普莱柯生物工程股份有限公司生产)分别颈部肌肉注射免疫14-21日龄仔猪(排除猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型和猪瘟)，5头/组，2ml/头，同时设置空白对照组，共14组(共70头仔猪)。免疫接种后21天、35天、60天、90天对每头猪采血，收集血清，保存在-20℃直到测试。
按照血清学方法对猪圆环病毒抗原部分的免疫效果进行评价，具体为：
(1)ELISA抗体检测用大肠杆菌表达的PCV2ORF2蛋白(按 照中国专利CN101101296A制备)作为抗原，通过方阵滴定试验确定抗原的最佳包被浓度。将抗原稀释到最佳包被浓度后包被酶标板，100μl/孔，后4℃包被过夜；洗涤3次，每次3-5分钟；每孔加200μl的0.15％M/V BSA封闭液封闭板子，37℃作用2小时；洗涤；将待检血清用PBS倍比稀释，每个样品一行，每孔加100μ1，37℃作用1h；洗涤；然后加入酶标的SPA(1:10000倍稀释)，100μl/孔，37℃作用1h；洗涤；加底物液TMB显色，最后用2mol/L的H2SO4终止反应。结果判定：待检血清OD450值/阴性血清OD450值≥2.1为阳性。
(2)血清中和试验采用固定病毒稀释血清法。待检血清56℃加热30分钟，10000转/分钟离心5分钟，小心吸出上清，做1:2稀释后进行倍比稀释；分别与等量PCV2病毒液混合，37℃1h,接种于含单层PK15细胞的96孔板内，100μ1/孔，每一稀释度接种4孔，同时设细胞对照和病毒对照孔。37℃培养12h，用300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理，37℃继续培养48h，80％丙酮固定细胞，用间接免疫荧光法测定每个稀释度含有荧光的孔数。以能够抑制50％特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组平均值。
血清学评价结果见表2。
表2灭活疫苗组合物之猪圆环病毒抗原的效力试验结果
注：参考疫苗对照组所用的PCV2疫苗由普莱柯生物工程股份有限公司生产，抗原含量为107.0TCID50/ml，按厂家说明书进行两次免疫。
由表2可知：A1-1至A1-3、A2-1至A2-3组同一含量的PCV2抗原(单苗)不同佐剂含量时，免疫后所产生的抗体随佐剂含量的增大而略微升高，且与高抗原含量的PCV2参考单苗所产生的抗体基本一致，并能持续到并能持续至少60天；含相同含量佐剂的PCV2联 苗免疫后所产生的抗体与PCV2参考单苗所产生的抗体基本一致，并能持续到并能持续至少60天，表明疫苗1-1、1-2、1-3、1-6、1-7、1-9、2-1、2-2、2-3、2-6、2-7、2-9分别免疫动物后能刺激机体产生PCV2特异性抵抗力，效果确实，并且疫苗1-6、1-7、1-9、2-6、2-7、2-9之其他抗原对PCV2抗原的免疫效果无影响；并且疫苗组合物中佐剂含卡波姆、ISCOM和羧甲基纤维素钠的免疫效果优于含卡波姆、羧甲基纤维素钠的。
3.3灭活疫苗组合物之猪肺炎支原体抗原的效力试验
将实施例3.1所制备的疫苗组合物1-4、1-6、1-8、1-9、2-4、2-6、2-8、2-9，分别颈部肌肉注射免疫14-21日龄仔猪(排除猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环2型和猪瘟)，5头/组，2ml/头，同时设置参考疫苗对照组、攻毒对照组，共10组(共50头仔猪)。免疫接种后观察体温、副反应至28日，并于28日对所有猪气管注射猪肺炎支原体济南系强毒CVCC354株(保藏号为CVCC354，保藏单位为国家兽医微生物菌种保藏管理中心)，100MID50/头，观察28天后解剖，并观察肺部病变，按照28分法对肺部病变进行评分。攻毒前后，分别对试验组仔猪进行称重，并计算平均日增重。
攻毒后大约10天左右，攻毒对照组其中4头猪陆续出现咳嗽、气喘等症状，皮毛不光滑；参考疫苗对照组有1头猪出现了咳嗽的症状、并发生了副反应；其他免疫组的猪未出现气喘病的类似症状。攻毒前后，各试验组猪的肺炎病变平均得分和平均日增重结果见表3。
表3灭活疫苗组合物之猪肺炎支原体抗原的效力试验结果
注1：参考疫苗对照组所选用的疫苗为现有产品中的猪支原体肺炎灭活疫苗(J株)，即安百克(M+PAC)，按厂家说明书进行免疫。
注2：体温“无”表明未发生一过性体温升高，“有”表明发生一过性体温升高，其中一过性体温升高是指于二免疫后第1-2天体温会短暂呈现40.5度，并于第3天恢复正常体温。
注3：副反应“无”表明未发生过副反应，“有”表明发生过副反应，其中副反应是指出现过短暂性精神沉郁、食欲减退、过敏反应中的至少一种。
注4：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著(p＜0.05)。
由表3可知：第B1-1至B1-4组(即分别免疫疫苗1-4、1-6、1-8、1-9)、第B2-1至B2-4组(即分别免疫疫苗2-4、2-6、2-8、2-9)使用含猪肺炎支原体抗原和同样含量佐剂的单苗或联苗进行免疫，之后进行攻毒，结果显示免疫猪均未发生一过性体温升高，也未出现副反应，并且肺炎病变减少率分别均＞73％、＞84％，平均日增重分别为0.0412-0.0415kg、0.0445-0.0453kg，B1、B2各小组之间差异不显著(p＞0.05)；与参考疫苗对照组相比，差异均显著(p＜0.05)；与攻毒对照组相比，差异均显著(p＜0.05)；并且疫苗组合物中佐剂含卡波姆、ISCOM和羧甲基纤维素钠的免疫效果显著优于含卡波姆、羧甲基纤维素钠的(p＜0.05)。
3.4灭活疫苗组合物之副猪嗜血杆菌抗原的效力试验
将实施例3.1所制备的疫苗组合物1-5、1-7、1-8、1-9、2-5、2-7、2-8、2-9，分别颈部肌肉注射免疫14-21日龄仔猪(排除猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环2型和猪瘟)，5头/组，2ml/头，同时设置参考疫苗对照组、攻毒对照组，共10组(命名为C1-1、C1-2、C1-3、C1-4、C2-1、C2-2、C2-3、C2-4、参考疫苗对照组1、攻毒对照组1)；同时做重复试验，共10组(命名为C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、参考疫苗对照组2、攻毒对照组2)，详见表4。
免疫接种后28天进行攻毒，前10组用副猪嗜血杆菌4型腹腔注射3ml进行攻毒，攻毒剂量为9.0×109CFU/头；后10组用副猪嗜血杆菌5型腹腔注射3ml进行攻毒，攻毒剂量为6.0×109CFU/头，攻毒后观察各组猪临床表现，观察14天后剖杀进行病理观察。攻毒前后分别对试验组仔猪进行称重，以计算平均日增重。
表4灭活疫苗组合物之副猪嗜血杆菌抗原的效力试验结果
注1：参考疫苗对照组所用副猪嗜血杆菌病灭活疫苗为中牧实业股份有限公司成都药械厂生产的，抗原含量为4.0×109CFU/头份，按照厂家说明书进行两次免疫。
注2：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著(p＜0.05)。
由表4可知：第C1-1至C1-4组、第C1-5至C1-8组(即分别免疫疫苗1-5、1-7、1-8、1-9)，第C2-1至C2-4组、第C2-5至C2-8组(即分别免疫疫苗2-5、2-7、2-8、2-9)使用含副猪嗜血杆菌抗原和同样含量佐剂的单苗或联苗进行免疫，之后进行攻毒，结果显示免疫猪获得完全保护，平均日增重分别为0.0311-0.0317kg、0.0388-0.0344kg，C1、C2各小组内相互之间差异不显著(p＞0.05)；与参考疫苗对照组相比，抗原含量低还能使免疫保护效率高，并且平均日增重差异均显著(p＜0.05)；与攻毒对照组相比，平均日增重差异均显著(p＜0.05)；并且疫苗组合物中佐剂含卡波姆、ISCOM和羧甲基纤维素钠的免疫效果显著优于含卡波姆、羧甲基纤维素钠的(p＜0.05)。
实施例4活疫苗组合物的制备及动物试验
4.1活疫苗之猪支原体肺炎活疫苗(168株)的制备
活疫苗组合物以猪支原体肺炎活疫苗(168株)为例，将实施例1.2制备的猪肺炎支原体168株抗原、经PBS稀释的实施例2制备的佐剂作为活疫苗稀释剂按表5进行配制，用2ml活疫苗稀释剂溶解1头份猪支原体肺炎活疫苗(168株)。
表5猪支原体活疫苗稀释后所含组分及终浓度
4.2猪支原体肺炎活疫苗(168株)的动物试验
将实施例4.1所制备的疫苗组合物，分别按表5采用颈部肌肉注射免疫14-21日龄仔猪45头(排除猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环2型和猪瘟)，5头/组，2ml/头，同时设置参考疫苗对照组、现有技术对照组、攻毒对照组，共9组。
免疫前及接种后观察体温、副反应至28日，并于28日对所有猪气管注射猪肺炎支原体济南系强毒CVCC354株(保藏号为CVCC354，保藏单位为国家兽医微生物菌种保藏管理中心)，100MID50/头，观察28天后解剖，并观察肺部病变，按照28分法对肺部病变进行评分？。攻毒前后，分别对试验组仔猪进行称重，并计算平均日增重。
安全性试验结果：免疫组I-VI的体温无明显变化，剖杀后观察肺病变时也未发现明显的病理变化。
攻毒试验结果：攻毒后大约10天左右，攻毒对照组猪只(其中4只)陆续出现咳嗽、气喘等症状，皮毛不光滑；第VII、VIII组各有一头猪出现了咳嗽的症状；其他组别没有猪只出现气喘病的类似症状。攻毒前后，各试验组猪只的肺炎病变平均得分和平均日增重结果见表6。
表6猪支原体活疫苗免疫后观察结果及效力试验结果
注1：参考疫苗对照组为南京天邦生物科技有限公司生产的支必宁，按厂家说明书进行肺内注射；现有技术对照组为按照中国专利CN103071151B制备的猪肺炎支原体活疫苗(168株)，含该专利提及的疫苗专用稀释剂，按该专利颈部肌肉注射方式免疫，共免疫2次间隔2周。
注2：体温“无”表明未发生一过性体温升高，“有”表明发生一过性体温升高，其中一过性体温升高是指于二免疫后第1-2天体温会短暂呈现40.5度，并于第3天恢复正常体温。
注3：副反应“无”表明未发生过副反应，“有”表明发生过副反应，其中副反应是指出现过短暂性精神沉郁、食欲减退、过敏反应中的至少一种。
注4：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著(p＜0.05)。
由表6可知：
(1)第I-III组(即免疫活疫苗1-3)使用含卡波姆、羧甲基纤维素钠的佐剂稀释猪肺炎支原体活疫苗(168株)进行颈部肌肉注射免疫，之后进行攻毒，结果显示：随佐剂中各组分含量的升高免疫效果(肺炎病变减少率、平均日增重)增加，免疫猪只未发生一过性体温升高，也未出现副反应，并且各组之间免疫效果差异显著(p＜0.05)；与第VII组(即参考疫苗对照组，免疫组分为支必宁)相比，除第I组外差异均显著(p＜0.05)，并且肌肉注射比肺内注射操作简便、可接受度高；与VIII组(即现有技术对照组)相比，除第I组外差异均显著(p＜0.05)，且免疫次数少，降低了免疫成本，节约了免疫程序，经济可靠；与攻毒对照组相比，差异均显著(p＜0.05)。
(2)第IV-VI组(即免疫活疫苗4-6)使用含卡波姆、ISCOM、羧甲基纤维素钠的佐剂稀释猪肺炎支原体活疫苗(168株)进行颈部肌肉注射免疫，之后进行攻毒，结果显示：随佐剂中各组分含量的升高免疫效果(肺炎病变减少率、平均日增重)增加，免疫猪只未发生一过性体温升高，也未出现副反应，并且各组之间差异显著(p＜0.05)；与第I-III组相比，除ISCOM外相同含量组分的佐剂稀释活疫苗后的免疫效果较优，且差异显著(p＜0.05)；与第VII组(即参考疫苗对照组，免疫组分为支必宁)相比，差异均显著(p＜0.05)，并且肌肉注射比肺内注射操作简便、可接受度高；与VIII组(即现有技术对照组)相比，差异均显著(p＜0.05)，且免疫次数少，降低了免疫成本，节约了免疫程序，经济可靠；与攻毒对照组相比，差异均显著(p＜0.05)。
实施例5蛋白稳定液的应用
5.1RHDV VP60蛋白稳定性研究
按照中国专利CN103555766A中所描述的方法制备兔出血症病毒(Rbabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)的免疫原性VP60蛋白，对表达后的VP60蛋白进行鉴定确认无疑后进行纯化，并用人的O型红细胞的凝集价进行检测，检测结果表明VP60蛋白的血凝价HA为1:217。
将实施例2制备的佐剂各成分母液即卡波姆母液、ISOCM基质母液、羧甲基纤维素钠母液用以制备VP60蛋白稳定液，用PBS稀释制备RHDV VP60蛋白溶液(溶液1-2)，使各组分终浓度为：VP60HA为1:214，卡波姆为1mg/ml，羧甲基纤维素钠为0.1mg/ml。同时，制备溶液(溶液3-4)使各组分终浓度为：VP60HA为1:214，卡波姆为1mg/ml，皂苷为0.1mg/ml，羧甲基纤维素钠为0.1mg/ml。
取同样剂量的RHDV VP60蛋白溶液各2份在2-8℃分别存放6、12、18、24、30、36个月，并用PBS稀释的VP60蛋白溶液2份做对照，对不同保存条件下的蛋白溶液进行血凝检测，结果见表7。
表7 RHDV VP60蛋白稳定性试验结果
由表7可知：含卡波姆、羧甲基纤维素钠的溶液作为RHDV VP60蛋白稳定液使VP60蛋白稳定至少24个月，含卡波姆、ISCOM、羧甲基纤维素钠的溶液作为RHDV VP60蛋白稳定液使VP60蛋白稳定至少30个月，而以PBS作为保存溶液的对照组HA随时间的延长而逐渐降低，表明蛋白出现了一定程度的降解或发生了不可逆变化。
5.2PCV2Cap蛋白稳定性研究
按照中国专利CN104017813A中所描述的方法制备猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)的免疫原性Cap蛋白，对表达后的Cap蛋白进行鉴定确认无疑后进行纯化，按照BCA蛋白定量试剂盒(购自Merck公司)说明书的方法定量Cap蛋白的浓度，结果表明：Cap蛋白的浓度为2mg/ml。
将实施例2制备的佐剂各成分母液即卡波姆母液、ISOCM基质母液、羧甲基纤维素钠母液用以制备Cap蛋白稳定液，用PBS稀释制备PCV2Cap蛋白溶液(溶液1-2)，使各组分终浓度为：Cap蛋白浓度为0.40mg/ml，卡波姆为1mg/ml，羧甲基纤维素钠为0.1mg/ml。同时，制备溶液(溶液3-4)使各组分终浓度为：Cap蛋白浓度为0.40mg/ml，卡波姆为1mg/ml，皂苷为0.1mg/ml，羧甲基纤维素钠为0.1mg/ml。
取同样剂量的PCV2Cap蛋白溶液各2份在2-8℃分别存放6、12、18、24、30、36个月，并用PBS稀释的Cap蛋白溶液2份做对照，对不同保存条件下的蛋白溶液分别进行BCA测定，结果见表8。
表8 PCV2Cap蛋白稳定性试验结果
由表8可知：含卡波姆、羧甲基纤维素钠的溶液作为PCV2Cap蛋白稳定液，使Cap蛋白稳定至少24个月，含卡波姆、ISCOM基质、羧甲基纤维素钠的溶液作为PCV2Cap蛋白稳定液，使Cap蛋白稳定至少30个月，而以PBS作为保存溶液的对照组中Cap蛋白的浓度随保存时间的延长而逐渐降低，蛋白出现了一定程度的降解或发生了不可逆变化。
综上所述，含卡波姆、免疫刺激复合物和羧甲基纤维素钠佐剂的疫苗组合物的免疫效果显著优于含卡波姆、羧甲基纤维素钠的，这些疫苗组合物(1)免疫动物后的免疫应答水平随佐剂含量的增加而升高，且与现有商品化疫苗的免疫应答水平基本一致，免疫持续时间也较长，效果确实；(2)在抗原含量较低时也能使动物获得较好的免疫应答水平及完全保护，免疫次数少使猪的应激反应减少甚至无，且无副反应发生；(3)该佐剂还可以用于稀释活疫苗，使活疫苗以肌肉注射形式免疫猪只，使猪只无一过性体温升高、副反应发生，使猪只肺炎病变率较少、平均日增重升高等良好的免疫效果，优于现有活疫苗，并使操作简便、成本降低、程序节约、经济可靠；(4)该佐剂可作为蛋白稳定液使用，使蛋白稳定不降解或不发生了不可逆变化。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。