本发明涉及恶性肿瘤治疗的技术领域。具体地，本发明涉及恶性胶质瘤治疗的领域。更具体地，本发明涉及一类能够封闭人类细胞缺氧反应途径的多肽在治疗肿瘤，尤其是恶性胶质瘤，更特定地是根据WHO2007病理分级为IV的恶性胶质瘤，以及胶质母细胞瘤中的用途。
背景技术：
恶性肿瘤是严重危害人类健康的高发病率和高致死率疾病。胶质瘤(glioma)是由神经外胚层分化而来的胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜等)引发的肿瘤，在颅内肿瘤中发病率位列第一。依据恶变细胞的来源类型不同，胶质瘤可分为：星形胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突-星形胶质细胞混合瘤三种。按组织学形态又可分为：核异质型、有丝分裂型、微血管富集型以及坏死型4个等级。1级通常预后较好，可通过外科手术完全切除；2级病变加重，病灶开始向周围播散，界限不清；3-4级属恶性胶质瘤，侵袭及增殖活跃，易转移，预后差。根据WHO2007年中枢神经系统肿瘤分类，恶性胶质瘤定义为高于或等于WHOIII级的胶质细胞瘤，具体包括间变性星形细胞瘤(III级)、间变性少突胶质细胞瘤(III级)、间变性少突星形细胞瘤(III级)、胶质母细胞瘤(IV级)、巨细胞胶质母细胞瘤(IV级)、嗅神经母细胞瘤(IV级)和幕上原始神经外胚叶肿瘤(IV级)等，其中前三者可统称为“间变性胶质瘤”。恶性胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，恶性胶质瘤的发病率约为5～8/10万，约占所有胶质细胞瘤的50％。在美国，每年新增病例有14000例，近20年来发病率呈上升趋势。而且，因恶性胶质瘤呈浸润性无限制增生、与正常脑组织无明显界限并富含血管，还具有高复发率和低治愈率。虽经多年努力，其死亡率和致残率仍很高，间变型星形细胞瘤的中位生存期为2～5年。胶质母细胞瘤IV级恶性胶质瘤，在所有类型的脑胶质瘤中侵袭性最强、恶性程度最高，平均存活期仅12个月。
目前恶性胶质瘤的治疗已发展为手术、放疗和化疗联合的综合治疗模 式。各治疗方法在改善患者生存、提高患者生活质量方面协同发挥作用，由于恶性胶质瘤具有侵袭性强的特点，致使神经外科手术无法完全切除，而后续进行的放疗和化疗又难以彻底地消除残存肿瘤细胞，这些细胞最终引起肿瘤的复发，导致患者预后差，死亡率高。恶性胶质瘤对传统的放疗和化疗不敏感，即使经过多年发展，目前治疗效果仍并不能令人满意。
有研究表明，胶质瘤侵袭和复发均与某些基因或细胞因子过度表达有关，而myc和HIF就是近几年来发现的一些调控基因。近年来低氧诱导因子在肿瘤发生发展和预后中的作用受到关注。缺氧诱导因子是一类介导低氧反应的转录因子，能激活许多缺氧相关基因的表达，是在缺氧条件下维持氧稳态的关键性物质。大量资料显示，HIFs与肿瘤行为的诸多重要方面均有关。首先，在实体瘤内，很易观察到HIFs的活化：其次，细胞培养时，HIFs可调控与肿瘤相关的基因的表达；第三，HIFs的失活对肿瘤模型的行为有重要作用。
现有技术中发展了一些针对癌细胞增殖所涉及的特定基因的多肽或蛋白质，如CN100484575C记载了7种多肽，其能够特异性牢固地结合到myc家族基因的启动子和其表达的转录因子驱动的下游基因启动子上，长久地关闭myc家族基因和相关下游基因，终止由于myc家族基因突变和相关基因变异引起的myc家族基因的过度表达，和/或终止myc家族基因调控的下游转录因子和细胞生长因子基因的过度表达，从而长期关闭通过myc家族基因逃脱细胞增殖调控而因起的细胞恶性增殖途径。CN100418574C记载了20多种肽，其能够特异性牢固地结合到HIF-1α基因自身启动子或其表达的转录因子驱动的超过40个下游基因启动子上，所述分子可长久地关闭包括细胞糖酵解反应和/或免疫发炎反应和/或血管发生反应的细胞缺氧反应的分子途径，从而长期关闭晚期癌症细胞或者慢性炎症细胞在缺氧条件下无控制增殖。
但是，胶质瘤的发生与发展是一个多因素多步骤的复杂过程，包括癌基因的启动，扩增或过度表达以及抑癌基因的突变和缺失。近几年来研究发现了一些对胶质瘤发生发展较为重要的相关基因，包括IMP3、ATX、EMP1、IDH1、myc、Micro-RNA7、PTEN、HIF、TIP30、p53等。一些基因本身与多种癌症相关，例如myc基因在Burkitt淋巴瘤，非Burkitt淋巴瘤，乳腺癌，宫颈癌，前列腺癌，胃肠癌，骨肉瘤，黑素瘤，畸胎瘤，粒细胞和浆细胞及B淋巴细胞白血病，恶性胶质瘤，神经母细胞瘤和小细胞肺癌，鼻咽癌恶性细胞内过度表达，针对一种特定基因的药物是否确实能够具有治疗发病机理 复杂的癌症的作用，尚需要进行不断的探索和验证。上述两个专利CN100484575C和CN100418574C也仅仅是利用细胞或动物模型等验证了在肺癌、乳腺癌、鼻咽癌等中的一定的作用。对于恶性胶质瘤，其中所涉及的肽是否同样能够具有治疗作用，并不能简单推断得到，尚需要对其进行进一步的研究。鉴于现有技术的状况，寻找更具有针对性的治疗胶质瘤，尤其是恶性胶质瘤，更具体地是胶质母细胞瘤的药物仍将是目前急需解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种治疗胶质瘤，尤其是是根据WHO2007病理分级为III和IV的恶性胶质瘤，尤其是胶质母细胞瘤的药物。
本发明以特异性封闭人类细胞缺氧反应途径的一系列多肽为研究对象，确定了其对肿瘤，尤其是恶性胶质瘤，更特定地是根据WHO2007病理分级为III和IV的恶性胶质瘤，更特定地是胶质母细胞瘤的治疗作用
因此，本发明提供：
结合HIF基因的多肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用；
其中所述肿瘤为胶质瘤，尤其是胶质母细胞瘤；
其中所述多肽序列如SEQ ID NO.1-22所示。
上述的多肽可与药学上可接受的载体混合，用于制备药物或药物组合物；其中所述药物或药物组合物可制备成栓剂、注射剂、吸入制剂或外用制剂。
在本发明的背景下，适宜的药物制剂包括适于口服、鼻、局部(包括口腔或舌下)、非消化道(包括肌内、皮下和静脉内)施用的制剂，或用于通过吸入施用的制剂。优选静脉内施用。制剂可以任选包装在离散的剂量单位中。
适于非消化道施用的制剂包括水性和非水性的无菌注射溶液，其中任选地含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与预期接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其中含有悬浮剂和/或增稠剂。所述制剂可以提供为单位剂量或多次剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶；还可以在冷冻-干燥(冻干的)条件下保存，仅需要在即将使用前添加无菌液体载体例如盐水、注射用水。或者，可提供所述制剂用于连续输注。可以从前述的无菌粉末、颗粒及片剂的类型制备即配即用的注射溶液和悬浮液。
吸入给药时，可以由吹入器、雾化器、加压包装或其它便利的气溶胶喷 雾递送装置方便地递送化合物。气溶胶包装可含有适宜的喷射剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜气体。或者，通过吸入或吹入给药时，化合物可以采取干粉组合物的形式，例如该化合物与适宜粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以提供为单位剂型，例如作为胶囊、凝胶或发泡包，借助吸入器或吹入器，可由上述剂型施用所述粉末。其它的制剂包含可释放治疗剂的可植入装置及粘性贴片。
需要时，可以采用适于活性成分缓释的上述制剂。药物组合物中还可以含有其它活性成分，诸如抗微生物剂，免疫抑制剂和/或防腐剂。这些药物分子能够透过细胞膜，核膜，到达靶部位，因此，可以通过肌肉注射，静脉注射，口服胶囊，静脉输液途径及肿块部位原位注射和皮肤渗透的方法给药。给药量根据病人的具体情况，例如体重，年龄，具体的疾病和病情，以及医生的临床经验来决定，但通常可以是0.01-20mg/天，可以分一次或多次给药。
设计了如下用于人类恶性肿瘤治疗的药物多肽分子。药物多肽分子和靶向位置见如下表1和序列表。
封闭HIF-1a和相关转录因子基因的染色质肽药物氨基酸序列和靶位
分析表明，这些染色质肽药物分子对癌细胞的HIF-1α基因的封闭具有高度专一性。第一是很少正常细胞的HIF-1α基因被封闭，而癌细胞的等位基因能与这些染色质肽特异结合，这可能是正常细胞的HIF-1α编码基因区域的DNA处于高度凝缩状态，不易与这些染色质肽结合；而在恶性细胞，HIF-1α编码基因被激活，处于舒展状态，易于和染色质肽药物分子结合。第二，在正常细胞和癌细胞的与转录调控因子HIF-1α网络调控无关的DNA区域，没有这些封闭剂的结合位点。这些染色质肽能够被用来同时封闭HIF-1α基因本身的转录和HIF-1α转录因子所驱动的导致细胞缺氧反应(糖酵解反应，免疫炎症反应和血管新生反应)的超过40个功能基因的转录；从而关闭了癌细胞原位缺氧条件下的恶性增殖，通过炎症反应向邻近组织侵润和通过新生血管向全身转移的HIF-1α途径。重要的是，这些染色质肽没有直接封闭对身体许多组织更新增殖必需的至关重要的细胞增殖/Cycle蛋白质活动瀑布，也没有封闭启动Cycle基因群转录的共同转录因子E2元件/E2F1转录因子；它只是关闭了癌细胞所单独居住的低氧环境下细胞继续增殖/侵润/转移途径，因此，它对身体正常细胞无害而能够特异选择性地关闭肿瘤细胞恶性增殖/侵润/转移，能够被开发成为对大多数组织类型癌症的治本药物。
基于此，我们对上述多肽是否能够适用于治疗恶性胶质瘤，尤其是胶质母细胞瘤进行了进一步的研究和探索。
下面通过具体实施方式对本发明进一步描述，但本发明并不限于实施例所述的范围。
实施例
多肽合成
通过固相肽合成技术(SPPS)合成序列表中SEQ ID NO.1-22的多肽，包括将用保护基保护的氨基酸分步添加到增长的寡肽链上，该寡肽链锚固于化学稳定的颗粒上，以便能通过简单过滤将合成的肽与试剂和溶剂分离，合成结束后，将链从载体上裂解下来，再进行提纯。
多肽药效试验
对癌细胞的抑制作用
细胞系和临床材料
胶质母细胞瘤细胞系U-87、A172，前沿淋巴结星细胞瘤细胞系SHG-44、胶质瘤细胞系SW1783，星形胶质瘤细胞RA，结肠癌细胞系HCT116，肺癌细胞系NCI-H460、乳腺癌细胞系MCF-7均通过商业途径获得，其在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，MD)保藏。所有这些细胞均在合适的培养基中单层培养，例如McCoys 5A(Invitrogen，Carlsbad，CA)用于HCT116，培养基均添加了10％胎牛血清(Cansera Intemational Inc.，Ontario，Canada)和1％抗生素/抗真菌剂溶液(Sigma-Rich)。将细胞维持在37℃、5％CO2的加湿气氛下。
将上述细胞按照标准流程培养，培养的细胞以5000-10000个/孔的密度接种于96孔板。培养24小时后，分别加入上述多肽(SEQ ID NO.1-22，分别简称为肽1-22)。其中每种多肽浓度为15μmol/L，对于每种细胞的每个多肽实验组设5个复孔。继续培养20小时后每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，4小时后吸去培养液，每孔加入DMSO 150μl，震荡10分钟。酶标仪570nm测定吸光度。
细胞抑制率按下式计算：
细胞抑制率＝(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值×100％。具体结果如下：
结果表明，上述SEQ ID NO.1-22的多肽对各类细胞系的抑制作用分为四个层次，其中对胶质母细胞瘤细胞系U-87、A172(IV级)的抑制作用显著地高于其他癌细胞系，其次为前沿淋巴结星细胞瘤细胞系SHG-44、胶质瘤细胞系SW1783(III级)，再者为星形胶质瘤细胞RA(II-III级)，最后为结肠癌细胞系HCT116、肺癌细胞系NCI-H460和乳腺癌细胞系MCF-7。这四个层次抑制率经过t检验计算p值，相互之间均达到了显著差异，前两者p值＜0.001，第二和第三者之间p值＜0.005，第三和第四者之间p值＜0.01。可以看出，上述肽对于胶质瘤细胞的抑制作用远远超出对其他类型肿瘤细胞的抑制，而在胶质瘤细胞系中，对恶性程度最高的胶质瘤细胞抑制作用显著强于分组处于II-III级的细胞系。
另外，在这22个肽中，SEQ ID NO.1-4，12-22所示的多肽对各类肿瘤细胞系的抑制作用相类似，但显著强于SEQ ID NO.5-11所示的多肽(p值＜0.01)。
随后，以每种多肽浓度为7.5μmol/L进行重复试验，其结果整体上与上述浓度下进行的试验相一致，即抑制率达到浓度为15μmol/L时的大约60％。但令人惊奇的是，对于胶质母细胞瘤细胞系U-87、A172(IV级)，在多肽浓度为7.5μmol/L的情况下产生了与多肽浓度为15μmol/L比较接近的抑制率，SEQ ID NO.1-4，12-22多肽的抑制率达到62％以上，SEQ ID NO.5-11多 肽达到53％以上，而对于其他类型的胶质瘤细胞系，并不存在类似的情况。这表明，对于恶性程度最高的胶质母细胞瘤细胞的抑制，加入的多肽浓度为对其他类型胶质瘤细胞多肽浓度的一半时，仍能获得几乎相同的抑制作用。
另外，还以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的组合为例，在如上两种总浓度下重复进行了细胞抑制试验(两者浓度相同，总浓度同上)，结果表明组合肽的效果比单一肽明显更优，例如对于U-87，在7.5μM和15μM浓度时的抑制率，两者分别为66％和80％，以及69％和84％。这表明，上述肽可以组合使用，并能获得更优的抑制效果。
动物用药
材料方法与CN100418575C中所述建立乳腺肿瘤模型的实例类似，每组小鼠为5只。试验用多肽(SEQ ID NO.1-22)，化学合成，纯度98.5％。
将上述胶质母细胞瘤细胞系U-87，胶质瘤细胞系SW1783，星形胶质瘤细胞RA，乳腺癌细胞系MCF-7接种至裸鼠形成肿瘤。实验用6-8周龄的BALB/c小鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)。对于胶质瘤细胞系，取对数生长期的上述胶质瘤细胞，每只裸鼠脑部接种6×105个细胞(分散于5μl PBS缓冲液中)，实验前用8％的水合氯醛将裸鼠麻醉，置于脑立体定位仪固定，细胞接种于纹状体右部(前囟前0.6mm，侧1.8mm，深3mm)，根据WHO2007的病理分级标准进行检验，分别获得与上述胶质瘤细胞系对应的处于IV级-II级的小鼠。分别在建模后第10，15，20和25天尾静脉注射200μl生理盐水(其中含有的各肽，单次给药剂量为30μg/只和60μg/只)。
结果分析
SEQ ID NO.1-22肽药物处理组的试验鼠，对于60μg/只的用量，U-87建立的胶质母细胞瘤肿块在第18-22天消失，SW1783建立的胶质瘤肿块在第23-27天消失，RA建立的胶质瘤肿块在第25-28天消失，乳腺肿瘤肿块在用药后第34-37天完全消失。对于30μg/只的用量，U-87建立的胶质母细胞瘤肿块在第22-25天消失，SW1783建立的胶质瘤肿块在第31-35天消失，RA建立的胶质瘤肿块在第34-37天消失，乳腺肿瘤肿块在用药后第43-46天完全消失。可以看到，对于恶性程度最高的胶质瘤，即使在注射多肽的浓度存在一倍差异时，其肿瘤消失时间并无显著区别，而这在其他类型胶质瘤 中并非如此。而就胶质瘤整体相对于乳腺肿瘤而言，上述多肽的治疗结果前者明显优于后者。上述结果与细胞实验的结果相一致。
对于U-87建立的胶质母细胞瘤肿块，60μg/只的用量时，所有给药治疗组肿块在给药第7天开始萎缩，其中，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16多肽处理组消失最快，分别在第一次治疗后第14天和第15天，肿块完全消失。SEQ ID NO.1-4，12-22相比SEQ ID NO.5-11在使得肿块消失的天数上有明显优势，即为上述的平均18天和22天。30μg/只的用量时，所有给药治疗组肿块在给药第9天开始萎缩，其中，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16多肽处理组消失最快，分别在第一次治疗后第18天和第19天，肿块完全消失。SEQ ID NO.1-4，12-22相比SEQ ID NO.5-11在使得肿块消失的天数上有明显优势，即为上述的平均22天和25天。这两组肽在其他肿瘤类型中的表现与在U-87建立的胶质母细胞瘤中一致(具体数据如上所示)。
对于乳腺癌，60μg/只的用量时，所有给药治疗组肿块在给药第12天开始萎缩，其中SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16多肽处理组分别在第一次治疗后第29天和第30天，肿块完全消失。30μg/只的用量时，结果与60μg/只的用量时相对应。
另外，还以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的组合为例，进行了上述试验。对于U-87建立的胶质母细胞瘤肿块，总浓度60μg/只的用量时，两个组合给药治疗组肿块在给药第5天开始萎缩，其中，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的组合处理组消失在所有处理组中最快，在第一次治疗后第11天，肿块完全消失。SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的组合，在第一次治疗后第13天，肿块完全消失。30μg/只的用量时，两个组合给药治疗组肿块在给药第7天开始萎缩，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的组合处理组消失在所有处理组中也是最快，在第一次治疗后第16天，肿块完全消失。SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的组合，在第一次治疗后第18天，肿块完全消失。可以看出，在组合使用上述多肽后，能够产生协同作用，获得显著更优的治疗效果。
动物安全性试验
采用包含上述多肽的生理盐水溶液。
安全试验1
取健康20-25g的健康小白鼠，分组，每组24只，雌雄各12只。各组分别用上述多肽腹腔注射，浓度为0.4mg/ml的封闭剂生理盐水溶液0.25ml，即0.1mg。对照组注射生理盐水。在注射后7天内，观察中枢神经系统、心血管系统、皮肤、毛、自主神经系统、胃肠系统、黏膜、眼睛、呼吸系统和生殖系统的变化。并在48小时内每小时测量肛温一次。对照组注射生理盐水。结果，48小时内，体温全部正常。用药组和对照组各相观察指标都没有异常变化。
安全试验2
取1.3kg-1.5kg健康大白兔，分组，每组五只。腹腔注射浓度为1mg/ml的封闭剂生理盐水溶液。注射剂量为0.1g/kg体重。对照组注射生理盐水。90天内每天一次，观察中枢神经系统、心血管系统、皮肤、毛、自主神经系统、胃肠系统、黏膜、眼睛、呼吸系统和生殖系统的变化。并在48小时内每小时测量肛温一次。对照组注射生理盐水。用药组和对照组各相观察指标都没有异常变化。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书的内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。