一种鸡尾酒疗法在制备防治肝纤维化药物中的应用的制作方法

本发明属于制备防治肝纤维化的药物领域。
背景技术：
：迄今为止，对肝纤维化的治疗尚缺乏理想的治疗方案。多年来针对肝纤维化的药物治疗在众多离体和动物模型实验中显示了一定的疗效，主要包括抑制肝星状细胞的药物如干扰素，作用于细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）和细胞因子的药物，抗氧化剂，抗炎制剂等。但令众多学者困惑的是几乎所有的抗肝纤维化药物在动物模型有效而临床无效或效果很差，这严重限制了抗肝纤维化药物的临床应用和治疗效果。因为肝纤维化是一系列复杂的多因素过程，许多药物由于抗肝纤维化作用靶位单一导致疗效并不理想，而有些药物毒副作用大于治疗作用，不宜用于临床。因此，将作用于肝纤维化发生发展不同环节、靶点的药物联合应用，以阻断肝纤维化发展，达到保护肝脏的目的，可能是抗肝纤维化药物研究的新方向。牛磺酸、表没食子儿茶素没食子酸酯及三羟基异黄酮已有报道具有抗肝纤维化的作用；其中，牛磺酸能促进肝星状细胞的凋亡，TGF-β1的表达和阻断TGF-β1/smad信号通路；EGCG具有很强的抗氧化作用并能抑制胶原的形成。本发明人通过CCl4诱导大鼠肝纤维化模型,联合应用以上三种作用于肝纤维化不同环节的药物干扰肝纤维化的大鼠，发明了鸡尾酒疗法防治肝纤维化的应用。技术实现要素：本发明提供鸡尾酒疗法在制备防治肝纤维化药物中的应用。本发明提供鸡尾酒疗法中各药物的口服剂量为牛磺酸100mg、表没食子儿茶素没食子酸酯15mg、三羟基异黄酮10mg。本发明发现将鸡尾酒疗法应用于预防和治疗实验性肝纤维化具有显著的作用，其可以（1）明显改善肝纤维化大鼠肝组织结构和肝纤维化；（2）抑制肝组织中TGF-β1、COLⅠ及COLⅢ表达，并且鸡尾酒组与单一用药各组相比有统计学意义。附图说明图1各组对CCl4诱导的模型大鼠肝组织病理学HE染色结果（×100）A:正常组;B:模型组;C:秋水仙碱组;D:牛磺酸;E:EGCG;F:三羟基异黄酮;G:鸡尾酒。图2各组对CCl4诱导的模型大鼠肝组织中的TGF-β1免疫组化结果（×100）A:正常组;B:模型组;C:秋水仙碱组;D:牛磺酸;E:EGCG;F:三羟基异黄酮;G:鸡尾酒图3各组对CCl4诱导的模型大鼠肝组织中的COLⅠ免疫组化结果（×100）A:正常组;B:模型组;C:秋水仙碱组;D:牛磺酸;E:EGCG;F:三羟基异黄酮;G:鸡尾酒图4各组对CCl4诱导的模型大鼠肝组织中的COLⅢ免疫组化结果（×100）A:正常组;B:模型组;C:秋水仙碱组;D:牛磺酸;E:EGCG;F:三羟基异黄酮;G:鸡尾酒。具体实施方式为了更好地理解本发明，下面通过使用联合用药进行的防治大鼠肝纤维化的药效学试验来解释本发明。本发明所使用联合用药是本发明人的现有技术，在这些试验中的有关条件如下:为更好地理解本发明的技术，下面用联合用药进行关于防治肝纤维化的药效学试验，说明其在制药领域中的新用途。联合用药对大鼠肝纤维化的保护作用研究1　实验材料1.1　实验动物：SD雄性大鼠,体重(180~220)g，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK桂(2003-0003)。药品与试剂：牛磺酸(Sigma)；EGCG(四川乐山禹伽茶业科技开发有限公司)；三羟基异黄酮（深圳市迈瑞尔化学技术有限公司)；秋水仙碱（sigma公司）；CCl4（重庆川江化学试剂厂）；实验时用花生油配成40%四氯化碳溶液。一抗：CollagenⅠ(BA0325)、Ⅲ型(BA0326)及TGFβ1（BA0290）兔抗大鼠多克隆抗体（即用型，武汉博士德生物工程有限公司）；二抗：即用型免疫组化MaxvisionTM抗兔-HRP检测试剂盒、DAB显色试剂盒(福建迈新公司)。剂量设置：（1）鸡尾酒：牛磺酸（100mg/kg）+EGCG（15mg/kg）+三羟基异黄酮（10mg/kg）；（2）秋水仙碱(0.5mg/kg)。1.4数据处理应用SPSS13.0软件进行统计分析。数据均以mean±SD表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为有统计学差异。2实验方案和结果2.1　动物分组与处理　105只SD健康大鼠随机分为7组,每组15只,分别为正常组、模型组、秋水仙碱阳性对照组、牛磺酸组、EGCG组、三羟基异黄酮组、鸡尾酒组。除正常对照组外,其余各组大鼠于首次在背部皮下注射纯CCl45mL/kg,以后皮下注射40%CCl4溶液2mL/kg,每周注射2次,共10周。自造模之日起的第6周开始，各用药组每天1次灌胃给牛磺酸（100mg/kg,）、EGCG（15mg/kg,）、三羟基异黄酮（10mg/kg）、鸡尾酒（同时应用牛磺酸、EGCG、三羟基异黄酮剂量不变）,阳性对照组灌胃给秋水仙碱(0.5mg/kg)。至10周末处死大鼠取肝组织，肝组织经10%甲醛固定,做HE染色和免疫组化检测。病理学检查：肝组织经10%甲醛固定,石蜡包埋,做常规组织切片,HE染色观察。免疫组织化学检测TGF-β1、COLⅠ及COLⅢ表达：石蜡包埋常规组织切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。然后将脱蜡水化后的组织切片放入已沸腾的柠檬酸缓冲液中进行酸化修复。取出玻片，先用自来水冲洗后，置放于卵育盒中。PBS冲洗三次，每次间隔3min，除去PBS液。每张切片加1滴3%过氧化氢，室温下孵育10min。PBS冲洗三次，每次间隔3min，除去PBS液。每张切片加50μl的TGF-β1、COLⅠ及COLⅢ兔抗大鼠多克隆抗体，在4℃温度下孵育过夜。PBS冲洗三次，每次间隔3min。除去PBS液，每张切片加50μlMaxvisionTM抗兔-HRP检测试剂盒，室温下孵育15min。PBS冲洗三次，每次间隔3min，除去PBS液。每张切片加50μl新鲜配制的DAB溶液显色观察。自来水冲洗，苏木素复染30秒，自来水冲洗，返蓝。切片经梯度酒精脱水干燥、中性树胶封固。在OLYMPUS倒置金相显微镜（GX51）的全自动图像分析系统上,每张切片随机选取10个视野(×100倍)测定阳性细胞面积百分比(阳性着色面积百分比=阳性着色面积/肝组织面积×100%),平均值越大表明组织中该抗原含量越高,据此分析TGF-β1、COLⅠ及COLⅢ的表达。　结果2.4.1HE检测结果：HE染色后观察,正常组肝小叶结构完整,中央静脉及静脉窦状隙无扩张,肝细胞排列整齐,无变性及硬化；模型组大鼠肝细胞高或中度浊肿变性,形成大小不等的圆形或椭圆形肝细胞结构结节构成假小叶，结节周围纤维组织沉积、增生。牛磺酸、EGCG、三羟基异黄酮、鸡尾酒组和秋水仙碱组大鼠纤维程度均有不同程度减轻,肝小叶结构基本完整，少量肝细胞轻度浊肿，汇管区少量纤维组织增生，纤维间隔变窄，炎脂肪空泡的形成明显降低。见图1。2.4.2　鸡尾酒对CCl4诱导的模型大鼠肝组织TGF-β1表达的影响按“1.4”中的方法定量分析各组肝组织中TGF-β1表达，正常对照组中的大鼠肝组织仅在中央静脉和汇管区有少量浅淡着色,TGF-β1仅微量表达；模型组中大量阳性染色分布于变性的肝细胞、中央小叶和门静脉周围纤维带及肝纤维间隔，TGF-β1阳性表达显著增强(P<0.05vs对照组)；各用药组和秋水仙碱阳性对照组中大鼠肝组织中TGF-β1染色程度均较模型组明显减轻，仅少量或微量表达(P<0.05vs模型组)；并且鸡尾酒组与单一用药各组相比显著减轻(P<0.05)。见表1和图2。表1各组对CCl4诱导的模型大鼠肝组织中相关蛋白表达的影响（N=10,Mean+SD）组别剂量（mg/kg）TGF-β1（%）COLⅠ（%）COLⅢ（%）对照-1.28±0.131.35±0.181.74±0.32模型-12.11±0.62a13.06±0.24a15.15±0.43a秋水仙碱0.52.12±0.25b2.33±0.32b2.56±0.27b牛磺酸1004.81±0.16bc4.79±0.29bc5.24±0.18bcEGCG154.93±0.21bc5.04±0.31bc5.51±0.25bc三羟基异黄酮104.21±0.35bc4.88±0.42bc5.73±0.23bc鸡尾酒-2.57±0.23b2.69±0.10b3.17±0.42baP<0.05vs对照组；bP<0.05vs模型组；cP<0.05vs鸡尾酒组2.4.3　鸡尾酒对CCl4诱导的模型大鼠肝组织COLⅠ、COLⅢ表达的影响正常组中的大鼠肝组织中的Ⅰ型胶原纤维少量分布于汇管区和中央静脉管壁，在肝实质内沿肝窦壁形成的细丝状着色,免疫组化染色呈弱阳性；Ⅲ型胶原分布于大血管周围，免疫组化染色呈弱阳性；模型组大鼠肝脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原除汇管区、中央静脉及肝窦四周增多外,在纤维隔内呈弥漫分布，广泛存在于纤维间隔及肝细胞内，呈连续细分枝状或间断分枝状；各用药组大鼠肝脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原明显减少,纤维间隔较薄，无明显假小叶形成。按“1.23”中的方法定量分析各组肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达，各用药组和秋水仙碱阳性对照组的大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原染色程度均较模型组明显减轻，仅少量或微量表达(P<0.05vs模型组)，并且鸡尾酒组与单一用药各组相比也有显著减轻(P<0.05)。见表1和图3、图4。结论（1）本实验的肝组织HE染色表明鸡尾酒疗法干扰组的大鼠肝纤维化程度较轻，肝小叶结构基本正常，与模型组大小不等的圆形或椭圆形肝细胞结构结节构成的假小叶，及结节周围纤维组织沉积、增生相比，其假小叶形成和纤维不明显，表明鸡尾酒疗法对实验性大鼠肝纤维化具有很好的逆转作用。（2）鸡尾酒疗法干扰肝纤维化大鼠后，明显抑制肝组织中TGF-β1的表达和COLI、COLⅢ的水平，鸡尾酒组与单一用药各组相比有显著性差异(P<0.05)，从而进一步证实了鸡尾酒疗法对大鼠肝脏的保护作用。当前第1页1 2 3