台湾冬虫夏草在第一型糖尿病及其并发症上的医药用途的制作方法

本发明涉及台湾冬虫夏草的医药用途，特别是台湾冬虫夏草在治疗第一型糖尿病和忧郁症上的医药用途。本发明又涉及台湾冬虫夏草在用于提升体内脂联素含量上的医药用途。

背景技术：

昆虫病原性(entomopathogenic)真菌中的广义虫草属(Cordyceps s.l.(sensu lato))中有部分物种具有药学活性，包括有西藏冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)和蛹冬虫夏草(Cordyceps militaris)等物种，是一种极负盛名的传统汉药，长年以来被使用做为补品和民间药方，与人参、鹿茸并称“中药三大宝”。台湾冬虫夏草(Ophiocordyceps formosana)是在公元1981年由日人小林氏和清水氏在中国台湾南投县溪头地区发现并率先提出报告(Kobayasi,Y.,Bull.Natn.Sci.Mus.,Tokyo.Ser.B 7,p.113-122(1981))，其原本被认定为中国台湾的原生菌种。公元2001年，安徽大学李春如教授在安徽省黄山地区也采集到台湾冬虫夏草，意味着台湾冬虫夏草的分布范围并不限于中国台湾(Li,et al.,Mycosystema 24,p.349-355(2005))。台湾冬虫夏草非常不容易采集到，因此少有文献报告，也没有足够的材料针对其可能的医药用途做进一步的鉴定和探讨。

在中国专利申请CN201520126690.X中，申请人公开了一种新颖的台湾冬虫夏草分离株，通过形态学、生化学和系统发生学上的分析显示出，其适合做为台湾冬虫夏草这个物种的一个典型菌株。该件专利申请进一步公开，台湾冬虫夏草在抗氧化活性和癌细胞抑制活性上较广义虫草属中的其他物种更为优越，而且对于正常细胞具有更低的毒性。

糖尿病是一个以血糖长时间高于标准值为主要特色的代谢性疾病。根据世界卫生组织的统计，公元2013年全球共有三亿八千二百万名糖尿病患者，预计公元2035年全球患者将增长到五亿九千二百万名。美国国内在公元2014年即有高达两千九百万人罹患糖尿病，而在中国台湾地区则估计超过百万人。糖尿病于公元2012年仍高居中国台湾地区居民十大死因第四位。糖尿病不但严重影响民众健康，对于各国医疗和财政体系更是造成巨大负担。

在临床上，糖尿病大致可区分为四种类型：第一型糖尿病、第二型糖尿病、妊娠期糖尿病(gestational diabetes)和续发性糖尿病，其中第一型糖尿病早年又被称为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，其成因可能是由于患者慢性自体免疫失调、受到病毒感染或是受到环境因子和遗传因子所影响，致使产生胰岛素的胰岛β细胞遭到破坏，造成患者体内停止制造胰岛素。患者通常必须注射外源性胰岛素来代谢体内的葡萄糖，而胰脏移植、β细胞移植等其他疗法在临床上都有所限制，故治疗效果有限。相较于其他类型的糖尿病，第一型糖尿病常见于儿童和青少年，所以又曾经被称为“幼年型糖尿病(juvenile-onset diabetes)”。在中国台湾地区，根据公元2002及2004年的调查，第一型糖尿病患者约占所有糖尿病患者的2-4％。

罗格列酮(rosiglitazone)等噻唑烷二酮类(thiazolidinediones；TZDs)药物在临床上常用于控制糖尿病患者的血糖，但给予这类药物也经常引起胃痛、腹泻、心脏衰竭和水肿等不良副作用。

此外，糖尿病患者不仅面对着体重下降、体液消耗增加、尿频等典型临床问题，根据统计显示，糖尿病患者中更约有15％有罹患忧郁症和焦虑症的风险，而第一型糖尿病患者相较于第二型糖尿病患者在贝克氏忧郁量表(Beck depression inventory score)上的评分更高，因而具有更高的忧郁症风险。治疗忧郁症的药物可大致区分为第一代抗忧郁剂与第二代抗忧郁剂。第一代的三环/杂环抗忧郁剂(tricyclic and tetra/heterocyclic antidepressants；TCAs)会导致人体高血糖。虽然第二代的选择性血清回收抑制剂(selective serotonin re-uptake inhibitors(SSRIs))已被广泛地使用作为治疗忧郁症的第一线用药，但是这类药物容易产生恶心、厌食、性无能等副作用，对糖尿病患者而言更容易造成血糖失调。因此，相关技术领域中极需一种新的医药组成物，其对于第一型糖尿病及/或忧郁症具有治疗或预防上的有效性，而且对于人体和动物体具有高安全性。

郭等人曾报导，西藏冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)和钒可以协同作用于改善大鼠的糖尿病和忧郁症症状(Guo J.Y.et al.,Evid Based Complement Alternat Med,2011；Article ID 450316)，但单独给予西藏冬虫夏草则没有功效。中国台湾专利公开案第201136599号公开了蝉花(Cordyceps sobolifera)的发酵培养物有用于治疗或预防糖尿病及其并发症。广义虫草属中只有部分物种被证实具有药学活性，而且这些药用虫草物种的适应症也彼此不尽相同。基于上述文献并无从推知台湾冬虫夏草的药学活性。

技术实现要素：

本申请发明人已针对台湾冬虫夏草的药学活性进行广泛的研究。现在，本申请发明人发现，台湾冬虫夏草，特别是本申请所公开的台湾冬虫夏草分离株，能够改善第一型糖尿病及其所引起的并发症，也可以促进脂联素和各种神经传导物质在脂肪组织和脑边缘区域内的含量。本申请发明人更通过在小鼠体内引发第一型糖尿病所建立起来的忧郁症动物模式，发现台湾冬虫夏草，特别是本申请所公开的台湾冬虫夏草分离株，在改善焦虑症和忧郁症上具有优越效果。本申请的公开内容显示出，台湾冬虫夏草对于治疗第一型糖尿病及其并发症和忧郁症有效，因而可供用作治疗这些疾病的补充性或替代性药物。

因此，在本申请所公开的第一方面是提供一种台湾冬虫夏草的用途，其供用于制造一用来在一个体中治疗第一型糖尿病及其并发症的医药品。优选为所述第一型糖尿病的并发症选自由高血糖症、糖尿病酮酸中毒、高血糖高渗透压状态、低血糖症、忧郁症、体重下降、神经病变、肾脏病变、发炎、心血管和高胆固醇并发症、眼部病变和肝脏病变所组成的群组。更优选为所述第一型糖尿病的并发症选自由高血糖症、忧郁症和体重下降所组成的群组。

在本申请所公开的第二方面是提供一种台湾冬虫夏草的用途，其供用于制造一用来在一个体中治疗忧郁症的医药品。

在本申请所公开的第三方面是提供一种台湾冬虫夏草的用途，其供用于制造一用来在一个体中增加脂联素含量的医药品。

附图说明

图1为本申请各实施例的实验流程概图；

图2A为一柱状图，显示各组糖尿病小鼠模型在实验期间的体重变化；

图2B为一柱状图，显示各组糖尿病小鼠模型在灌食处理后接受葡萄糖耐量试验(POST GTT)所得到的断食血糖值的曲线下方面积(AUC)；

图2C为一示意图，显示各组糖尿病小鼠模型的皮下脂肪组织累积情形；

图3A为一柱状图，显示各组糖尿病小鼠模型的血浆中脂联素含量；

图3B为白色皮下脂肪组织(SAT)的脂联素染色切片影像；

图3C为一柱状图，显示图3B切片影像中的脂联素信号强度数值；以及

图4A-4C为柱状图，分别显示各组糖尿病小鼠模型在旷场任务试验(OFT)、高架十字迷宫试验(EPM)和悬尾试验(TST)中的表现。

具体实施方式

除非另行说明，否则本申请专利说明书和各权利要求中所使用的下列用语具有下文给予的定义。请注意，本申请说明书和各权利要求中所使用的单数形用语“一”是指涵盖在一个以及一个以上的所载事项，例如至少一个、至少二个或至少三个，而非意味着仅仅具有单一个所载事项。此外，本申请各权利要求中使用的“包含”、“包括”等开放式连接词是表示权利要求中所记载的元件或成分的组合中，不排除权利要求未载明的其他元件或成分。

本说明书中所使用的术语“台湾冬虫夏草”是指涵盖被分类于Cordyceps formonsana的物种以及被分类于Ophiocordyceps formosana的物种中的所有分离株，特别是依据RPB1、RPB2和EF1-α基因的核苷酸序列相同性，而被分类于Ophiocordyceps formosana的物种中的所有分离株。这些台湾冬虫夏草菌株包括本领域技术人员可易于获得的台湾冬虫夏草菌株，例如可由国内或国外寄存机构购买或是通过申请分享而获得的分离株，或者是利用本技术领域中所惯用的微生物分离方法而从天然来源中分离出来的台湾冬虫夏草菌株。在一优选实施方案中，所述台湾冬虫夏草为本申请所公开的台湾冬虫夏草分离株，其是以BCRC 930172的寄存编号被寄存在中国台湾食品工业发展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)，以及以DSM 32000的寄存编号被寄存在德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)。

本申请所公开的台湾冬虫夏草分离株可以参照常用的虫草菌丝体培养方法进行菌丝体的培养和增殖。一般来说，适合于虫草菌丝体的培养条件为使用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、玉米淀粉、麦芽萃出物或是其组合作为碳源，且使用硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、酪蛋白氨基酸(casamino acid)、酵母菌萃出物、蛋白胨(peptone)及胰化胨(tryptone)或是其组合做为氮源，另将培养基的酸碱值调整到中性至微酸性，优选为pH 5.0-7.0，例如pH 5.5-6.0。在一优选的实施方案中，所述培养基是适合摇瓶发酵培养以获取虫草菌丝体的液态培养基，例如马铃薯右旋糖液态培养基(potato dextrose broth)。在另一优选实施方案中，所述培养基是固态培养基，例如马铃薯右旋糖琼脂(PDA)或沙氏右旋糖琼脂酵母菌萃出物(S-DAY)。培养温度优选为被控制在室温或略低于室温，例如15℃-25℃。

大体来说，冬虫夏草不容易以人工培养方式生产子实体，通常只能利用发酵技术大量生产菌丝体。虽然目前已经成功地使用人工培养方式培养出蛹冬虫夏草的子实体，但子实体长成所需要的时间长，且子实体的出菇率低且变异率高，因此仍以菌丝体的生产较具经济效益。如本领域技术人员所公知，虫草子实体中的腺苷和虫草素(cordycepin)等活性成份的含量远比菌丝体高，因此一般认为虫草子实体相比于菌丝体具有更高的药用价值。然而，依据本申请说明书的公开内容，台湾冬虫夏草，特别是本申请所公开的台湾冬虫夏草分离株，其菌丝体萃出物也能够显示出优越的医药活性。

本申请说明书中所使用的术语“第一型糖尿病”是指因胰脏β细胞遭受破坏而使得胰脏无法分泌胰岛素或分泌量过低所造成的糖尿病。第一型糖尿病并发症的发生多半是由于血糖浓度失调，而相比于第二型糖尿病患者，第一型糖尿病的患者罹患并发症的机率也比较高。

尤其是，在第一型糖尿病患者未规律注射胰岛素时，会发生血糖浓度过高，即其典型症状高血糖症(hyperglycemia)。如果第一型糖尿病患者持续处于胰岛素含量过低的状态，身体不能利用葡萄糖作为能量来源，而使用体内的脂肪来替代，则脂肪代谢所产生的过量酮体在体内累积后便导致糖尿病酮酸中毒(diabetic ketoacidosis；DKA)，长期下来更会造成体重下降。糖尿病酮酸中毒的一般症状包括：容易饥饿、极度干渴、频尿、呼吸困难、腹痛、心律不齐、低血压、休克、呼气带有酸味或果味、厌食甚至恶心、呕吐等。此外，体内高血糖也会导致渗透性利尿作用，导致水份通过尿液大量丧失而呈现明显的脱水现象。若未适当补充水分，就会造成高血糖高渗透压状态(hyperglycemic hyperosmolar state；HHS)，患者意识状态逐渐变差，四肢肌肉抽动、严重时会导致昏迷和休克。

此外，由于第一型糖尿病的患者需要长期注射胰岛素来控制血糖，一旦胰岛素注射过量就容易导致血糖浓度过低，在临床上造成急性的低血糖症(hypoglycemia)。低血糖症发生时常伴随着心动过速、盗汗、皮肤苍白、焦躁不安、四肢麻木、嗜睡、慌乱困惑、头痛等症状。

糖尿病病人通常合并多种引发心血管病变的危险因子，血糖浓度的长期失调对于大、小血管造成伤害，高血糖会造成动脉硬化，也会使微血管壁增厚、血液浓稠，降低通往皮肤、手臂、腿和脚的血液循环，也会改变眼睛与及肾脏的血液循环，进而引起慢性且不可逆转的并发症。大血管病变是指心脏冠状动脉或脑血管，而小血管病变是指微细小动脉病变，如视网膜、肾脏及周围神经病变。糖尿病引起的神经病变会导致麻痹，有时也会引起手、手臂、脚和腿的疼痛与无力。神经病变亦可造成消化系统、心脏和性器官的问题。若伤害出现在下肢末梢小动脉就会造成糖尿病足，这是是糖尿病人截肢的主要原因。

第一型糖尿病几乎无法根治，一旦没有及早发现并接受妥善治疗更容易引起不可逆转的慢性并发症，进而导致患者因长期处于病情逐渐恶化、生活作息饮食改变和医疗支出增加的多重压力下而并发焦虑症和忧郁症。患者面对压力所引起的沮丧、忧郁、焦虑、紧张、愤怒等症状，更容易促进体内肾上腺皮质素、肾上腺素和升糖激素的分泌，使高血糖症状更加明显而造成糖尿病的恶化。

链佐霉素(streptozotocin；简写为STZ)的IUPAC命名是2-脱氧-2-({[甲基(亚硝基)胺基]羰基}胺基)-β-D-葡萄哌喃糖，它是一种对于胰脏β细胞具有选择性细胞毒性的天然物质。因此，在相关技术领域中经常用于建立第一型糖尿病的动物模型。本发明通过这个常用的动物模型来检验台湾冬虫夏草在第一型糖尿病及其并发症上的医药用途。依据本发明，给予台湾冬虫夏草可以改善第一型糖尿病的典型症状，即高血糖症。如前所述，高血糖症所导致的血糖浓度失调是造成第一型糖尿病后续发生急性和慢性并发症的根本因素，所以给予台湾冬虫夏草也将有利于改善这些并发症，而本申请的实施例也示例性地显示了给予台湾冬虫夏草确实可以改善第一型糖尿病所引起的体重下降、焦虑症和忧郁症等并发症。

因此，本发明的一个方面是提供一种台湾冬虫夏草的用途，其供用于制造一用来在一个体中治疗第一型糖尿病及其并发症的医药品。此处所称“并发症”是指伴随着第一型糖尿病的发展及其治疗过程所显现的急性和慢性症状。优选为所述第一型糖尿病的并发症选自由高血糖症、糖尿病酮酸中毒、高血糖高渗透压状态和低血糖症等急性并发症，以及忧郁症、体重下降、神经病变(包括但不限于肢端麻痹、膀胱耗弱、便秘、腹泻、性无能和知觉丧失)、肾脏病变(包括但不限于肾小球性肾炎、肾丝球硬化症、肾病症候群、高血压肾硬化症、尿酸血症、末期肾病和尿毒症)、发炎、心血管和高胆固醇并发症(包括但不限于中风、心肌梗塞、冠状动脉血栓症、心绞痛、心脏衰竭、周边循环不良、坏疽和足部感染)、眼部病变(包括但不限于视网膜病变、白内障、青光眼和视野缩减)和肝脏病变(包括但不限于肝纤维化、脂肪肝和肝硬化)等慢性并发症所组成的群组。更优选为所述第一型糖尿病的并发症选自由高血糖症、忧郁症和体重下降所组成的群组。

在一实施方案中，所述第一型糖尿病的并发症为高血糖症，其是指相较于正常个体的基准断食血糖数值更高的血糖数值。就人类个体而言，通常为高于100mg/dl的血糖值，例如高于110mg/dl的断食血糖值，或是进食2小时后高于140mg/dl的血糖值。如下文实施例3所示，第一型糖尿病所引发的高血糖症可以通过给予台湾冬虫夏草而获得改善。

在一实施方案中，所述第一型糖尿病的并发症为体重下降，其是指第一型糖尿病患者在体重、身体质量指数(BMI)或其他类型的身体质量度量上的任何减少。如下文实施例2、3所示，第一型糖尿病所引发的体重下降和皮下脂肪组织减少都可通过给予台湾冬虫夏草而获得改善。

在一实施方案中，所述第一型糖尿病的并发症为忧郁症，其泛指未接受药物治疗下发生持续至少两周的情绪低落或兴趣丧失，其范围是指涵盖从一般性的心情不佳、轻度忧郁乃至于重郁症(major depressive disorder)的所有临床症候群，优选为通过美国精神医学会所出版的精神疾病诊断与统计手册(The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)第四版或第五版(简称DSM-IV和DSM-5)所记载方法进行诊断而确定为忧郁症。由于焦虑和忧郁在临床症状上多有重叠，而且在用药上许多抗忧郁药物也有抗焦虑效果，本申请中所述“忧郁症”也涵盖焦虑性疾患(anxiety disorder)。在一优选实施方案中，所述“忧郁症”包括但不限于重郁症、轻性抑郁症(minor depression)、躁郁症(bipolar disorder)、持续型轻郁症(dysthymia)、持续性轻躁症(cyclothymia)、经期前症候群(pre-menstrual syndrome)、经期前情绪障碍症(premenstrual dysphoric disorder)、广泛性焦虑症(generalized anxiety disorder)、恐慌症(phobia，包括社交恐惧症(social phobia)、幽闭恐惧症(claustrophobia)和广场恐惧症(agoraphobia)等特定对象恐慌症、恐慌性障碍(panic disorder)、强迫症(obsessive compulsive disorder)和创伤后压力障碍症(post-traumatic stress disorder))、暴食症(bulimia)、厌食症(anorexia)、青少年忧郁症(adolescent depression)和拔毛癖(trichotillomania)。

本申请采用三种广泛使用的忧郁症和焦虑症动物行为试验来评估台湾冬虫夏草对于忧郁症的治疗效果。

高架十字迷宫试验(EPM)由亨德利等人于1984年首次提出，其原理在于：小鼠等啮齿类动物对未知新环境具有喜好探索的天性，但处于高架十字迷宫中高悬的开放臂时又会因其厌恶高度和空旷的天性而形成恐惧心理，藉此造成矛盾心理以模拟焦虑症状。由于小鼠对于开放臂的偏好程度与其焦虑程度呈负相关，意味着小鼠进入开放臂的时间越长、次数越多，代表焦虑程度越低。

悬尾试验(TST)是将小鼠尾巴吊起而呈倒挂状态悬于半空中，计算其挣扎扭动的时间和不再扭动的时间。小鼠变得无助而不再挣脱扭动的时间越长，代表其忧郁失望、自我放弃的程度越高。

旷场任务试验(OFT)的原理在于，试验装置的边缘设有墙壁，小鼠等啮齿类动物倾向于在周边活动相对有安全感，而中央空旷区域就是没有屏障的旷野。如果小鼠停留在空旷区域的次数和时间增加，即表示焦虑程度减轻。

如下文实施例5所示，上述三种动物行为试验一致性地显示出，由第一型糖尿病所引发的忧郁症症状可以通过给予台湾冬虫夏草而改善。然而，根据本发明的另一方面，第一型糖尿病是被选用作为代表性的忧郁症引发模型，因为通过其所引发的典型忧郁症症状也普遍出现于许多承受其他类型的生理、心理和环境压力的患者中。因此，本申请也包含一种台湾冬虫夏草的用途，其供用于制造一用来在一个体中治疗忧郁症的医药品，其中所述“忧郁症”不局限于由第一型糖尿病所引发，也涵盖因罹患其他慢性疾病、滥用药物、酗酒、丧亲或经历其他环境压力所引起的忧郁症。

本申请另包含一种台湾冬虫夏草的用途，其供用于制造一用于在一个体中增进脂联素(adiponectin)含量的医药品。脂联素亦被称为GBP-28、apM1、AdipoQ和Acrp30，是一种由脂肪组织分泌至血液中的蛋白质激素，其作用涉及葡萄糖的代谢和脂肪酸的氧化。目前已经知道，血液中脂联素的浓度过低与胰岛素抗性、高血压、高三酸甘油酯、动脉硬化症的发生相关。相较于未患有糖尿病的人，糖尿病患者体内的脂联素含量通常较低，而且脂联素有助于改善身体对于胰岛素的敏感性(Yamauchi T.et al.,Nat Med.2001Aug；7(8):941-6)。提升脂联素在血液或脑内的浓度可以改善实验动物的忧郁表现(Liu,J.,et al.,Proc Nat Acad Sci,2012,109:12248-12253；以及Yau S.Y.et al.,Proc Nat Acad Sci,111:15810-15815)。这些事实都指出，增加体内的脂联素含量不仅可以改善糖尿病及其并发症，也有助于改善忧郁症的症状。

如下文实施例4所示，台湾冬虫夏草萃出物可以向上调控内源性(endogenous)脂联素在SAT中的表现量和血液循环中的浓度。就人类个体而言，“脂联素”这个术语是指脂联素前驱物(序列识别号：第1号)、删除位于该前驱物的N-端14个或17个胺基酸引导序列的成熟全长脂联素、彼等的转译后修饰形式(包括糖基化形式和球状脂联素(globular adiponectin))，以及彼等的天然寡聚体，例如三聚体、六聚体和十二聚体。“增进脂联素含量”这个术语是指使内源性脂联素于给药后的体内含量提升至比给药前更高的水平，这可通过取得个体的血液样品并测量其中的脂联素含量来进行判断。就人类来说，脂联素在血液中的含量依个人体质和性别不同而有所差异，一般位于5至10微克/毫升之间。在给予台湾冬虫夏草的个体是人类的情形下，优选为脂联素在血液中含量提升至5至10微克/毫升甚至更高的浓度，例如1微克/毫升至100微克/毫升的浓度，优选为5微克/毫升至75微克/毫升的浓度，例如10微克/毫升至50微克/毫升。

如本领域技术人员所熟知，忧郁症的发生与脑中多巴胺(dopamine)、血清素(serotonin)与去甲肾上腺素(norepinephrine)等单胺类神经传导物质的缺乏和失衡密切相关。因此，目前许多的抗忧郁和抗焦虑药物都以提升脑边缘区域内的单胺类神经传导物质为主要目标。值得注意的是，下视丘内的血清素含量会随着糖尿病所引起的高血糖症而上升，意味着控制血糖浓度也有助于改善忧郁症。下文实施例6的数据显示，台湾冬虫夏草萃出物可以明显提升上述神经传导物质及其代谢物在脑边缘区域内的含量。

虽然不希望被任何理论所拘束，但本申请的公开内容显示，台湾冬虫夏草可能通过至少三种不同途径来改善忧郁症的症状：(1)降低血糖浓度；(2)提升体内脂联素的表现量；以及(3)提升脑边缘区域内的单胺类神经传导物质含量。

本说明书所称“治疗”等用语是指将本申请说明书所述疾病或是它们的一或多种症状的进展予以逆转、缓和、延迟发作或抑制。在一些实施方案中，治疗可在发展出一或多种症状后再进行。在其他实施方案中，治疗可在无症状下进行。例如，治疗可在症状发作前进行至易染病个体(例如根据症状历史及/或根据遗传或其他感病性因素)。治疗亦可于症状解除后持续进行，以进行预防或延迟其复发。

依据本申请公开内容，可以将能够有效治疗本申请说明书所述疾病或是将能够有效减缓这些疾病的严重性的任何用量的台湾冬虫夏草，通过任何投药途径给予需要的个体。所需要的精确用量随个体不同而有别，依据个体的物种、年龄和健康情况、性别和饮食、患病的严重性、特定药剂形式、投药模式、治疗持续时间以及合并使用或同时使用的药剂等因素而定。本领域技术人员应当知道，台湾冬虫夏草的每日总和用量将在合理医学判断的范畴内由医师来决定。当给予人类个体时，台湾冬虫夏草萃出物通常是以每日一至三次、每周一至三次或是每双周一次的频率，以每次约0.01-1000毫克/公斤体重的用量进行给予，优选为以每次约0.1-100毫克/公斤体重的用量给予，更优选为以每次约1-50毫克/公斤体重的用量给予。在一实施方案中，台湾冬虫夏草的给予量可以使人类个体的血糖值低于约100mg/dl的血糖值，例如断食血糖值低于约110mg/dl，或是进食2小时后的血糖值低于约140mg/dl。在另一实施方案中，台湾冬虫夏草的给予量可以使人类个体血液中的脂联素含量达到1微克/毫升至100微克/毫升的浓度，优选为5微克/毫升至75微克/毫升的浓度，例如10微克/毫升至50微克/毫升的浓度。

本申请说明书中所使用的术语“个体”是指涵盖人类或非人类脊椎动物，例如非人类哺乳动物。非人类哺乳动物包括畜产动物、伴侣动物、实验动物和非人类灵长类动物。非人类哺乳动物非限制性地包括有马、牛、猪、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、兔、貂等。优选为人类，且更优选为罹患第一型糖尿病及其并发症的人类个体，或是罹患忧郁症的人类个体。

为了供研究之用，本申请说明书中所使用的术语“个体”也是指涵盖细胞、组织和器官。本申请所公开的发明也因而不仅适用于活体内，也适用于活体外。

台湾冬虫夏草可以子实体和菌丝体的形式给予个体。由于子实体不易培养，所以优选为呈菌丝体的形式给予个体，更优选为呈菌丝体的干燥粉碎颗粒、水性萃出物或是水性萃出物的制剂的形式给予个体。

可以使用研磨机将干燥后的冬虫夏草子实体或菌丝体直接予以研磨，而制成前述干燥粉碎颗粒。干燥粉碎颗粒的粒径并无特别限制，只要适合于直接给予个体且有利于个体的摄取和吸收，或是有利于进一步加工制成其他适合给予个体的形式即可。

可以选用任何常规方法来制备出虫草的水性萃出物，只要所述萃取方法可以有效地将虫草的水溶性以及水可混溶性组份由虫草的固体部分转移至水性溶剂中即可。一般来说，所述萃取方法包括将台湾冬虫夏草的子实体或菌丝体加以粉碎，再以水、具有1至6个碳原子且优选为1至4个碳原子的低级醇类(例如甲醇、乙醇)或其组合等水性溶剂进行萃取操作，且优选为在萃取操作进行同时施加热能、超声波振荡或机械性搅拌等手段来促进萃取的效率，最后再以过滤、离心等手段去除固体部分，从而获得虫草的水性萃出物。优选为所述萃取方法是选自于由浸提法、热水回流法、热醇回流法、超声波水提法，超声波醇提法所组成的群组。在一较佳实施方案中，是以热水回流法来制备台湾冬虫夏草的水性萃出物，也就是使定量热水持续地流过虫草材料以提取水性萃出物，优选为热水温度为30-100℃，更优选为40-60℃，最优选为45-55℃，例如50℃，而且萃取操作历时30分钟至12小时，优选为1-6小时，例如2小时。在一优选实施方案中，萃取操作的效率可以通过D-甘露醇、腺苷及/或虫草素等虫草活性成份的萃出量来进行评估。

前述台湾冬虫夏草的水性萃出物可经调制成适当浓度后，再配制成口服形式或非经肠形式而给予个体。调制这些给予形式时，可加入例如填充剂、膨化剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、界面活性剂等稀释剂，或是加入其他类型的赋形剂。

口服用液态制剂的形式包括悬浮液、溶液(糖浆、饮料等)、乳剂等。除了可以添加水或液态石蜡等最常用的稀释剂以外，也可额外添加湿润剂、增甜剂、调味剂以及防腐剂。口服用固态制剂的形式包括锭剂、药丸、粉末、颗粒、胶囊、糖锭等。

非经肠给予用制剂的形式包括无菌溶液、非水性溶液、悬浮液、乳剂、冷冻干燥剂等。非水性溶液用溶剂、悬浮液或乳剂所使用的溶剂包括但不限于蔬菜油、丙二醇、聚乙二醇、橄榄油及油酸乙酯。

一般而言，这些制剂是通过将至少一种赋形剂加入前述粉碎颗粒或水性萃出物中，必要时加以干燥，然后再进行造粒、打锭或囊封而制备出来。所述赋形剂包括但不限于水、具有1至4个碳原子的低级醇类、天然油或合成油、胶凝剂、助悬剂、乳化剂、增稠剂、惰性粉末、天然和合成的聚合物、湿润剂、增甜剂、调味剂、芳香剂、香料、着色剂，防腐剂、润滑剂、介面活性剂。优选的赋形剂包括但不限于水、乙醇、淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶、树胶类、糊精、环糊精、微晶性纤维素、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠等。此外，除了单纯地添加赋形剂以外，还可加入例如硬脂酸镁、滑石等润滑剂。

因此，本申请所公开的冬虫夏草组合物包含台湾冬虫夏草子实体或菌丝体的水性萃出物或是干燥粉碎颗粒，且任选地包含有一可接受的赋形剂。本申请所称“可接受的赋形剂”是指被使用做为本申请冬虫夏草组合物的载体的惰性物质，其对于给予的个体不具有毒性、刺激性、热原性、抗原性及溶血性，而且无实质的药理活性，也不会妨碍本申请冬虫夏草组合物的有益效果的发挥。本申请所公开的另一方面为一种保健食品，其包含前述的冬虫夏草组合物，以供直接食用、入菜、掺混于饮料、零食、动物饲料、膳食补充品、其他中草药材等各种可食性材料中，或是包装成其他适合服用的形式，例如将前述干燥粉碎颗粒以茶袋包装成茶包形式以供冲泡饮用。在一优选实施方案中，本申请所公开的冬虫夏草组合物可以搭配来自于其他虫草物种的组合物，例如搭配来自于西藏冬虫夏草及/或蛹冬虫夏草的子实体或菌丝体组合物，从而调配成适合个体摄取且能兼顾安全性及有效性的健康食品和医药品。

在另一优选实施方案中，本申请的冬虫夏草组成物主要由如前所述的台湾冬虫夏草分离株的水性萃出物或是干燥粉碎颗粒及前述可接受的赋形剂所组成。此处所称“主要由…所组成”意指所记载的成分组合中不排除另外含有实质上不会影响水性萃出物或是干燥粉碎颗粒的性质的其他没有述及的结构组成部分。在另一优选实施方案中，本申请的冬虫夏草组成物仅由前述台湾冬虫夏草分离株的水性萃出物或是干燥粉碎颗粒及前述可接受的赋形剂所组成。

下列实施例仅供用于例示，而非意在限制本发明的范围。实施例中所显示的所有数据都经由至少三个独立实验来完成，且以平均值±标准偏差表示的。统计学分析是利用单因子变异数分析(ANOVA)再进行杜凯氏测验(Tukey’s test)或司徒登氏测验(Student’s test)来完成，并通过实施例中所述方式判定其显著性。

实施例1：台湾冬虫夏草萃出物(OFE)的制备

本申请各实施例中所使用的台湾冬虫夏草萃出物是由以BCRC930172的寄存编号被寄存在中国台湾食品工业发展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)，以及以DSM 32000的寄存编号被寄存在德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的台湾冬虫夏草分离株，运用中国专利申请CN201520126690.X中所公开的方法所生产出来。简单来说，将上述台湾冬虫夏草分离株的菌丝体转移至含有0.4％马铃薯淀粉、2％右旋糖和1.5％琼脂的马铃薯右旋糖琼脂培养基中(PDA；购自于位在美国马里兰州Sparks市的Difco Becton Dickinson公司)，并在25℃下予以培植28日。在55℃下将所采收到的菌落加以干燥至隔日，再将其储存在干燥器(desiccator)中，供后续分析或制作萃出物之用。

运用一台均质机(日本Kurabo公司所出品的SH-100型均质机)在1300rpm的运转速度下将经干燥的虫草样品加以粉碎。在一个50毫升离心管(购自于美国Becton Dickinson and Company)中，以固体相对于溶剂的比例为1：40的条件，使1克冬虫夏草粉末溶于去离子水中，并施以振荡30秒。接着，使50℃热水回流2小时来进行萃取操作(前30分钟另施加超声波振荡)。经过在4000rpm(约3200×g)下加以离心20分钟后，收集上清液，并通过0.22微米孔径的滤器(美国Millipore公司)进行过滤。

所得到的台湾冬虫夏草萃出物接受高效液相层析(日立D-2000型HPLC管理系统)，以监控萃出物中的内容物质量和含量。高效液相层析是在RP-18管柱(150252STAR RP-18endcapped(5μm)250-4；美国Merck公司)中进行，流速为每分钟1毫升。流动相的组成为20％甲醇/H₂O。萃出物储存在-20℃供下列实施例使用。

实施例2：糖尿病动物模式

由位于台北市的财团法人国家实验研究院实验动物中心(NLAC)购得30只8周龄雄性C57BL/6小鼠(平均体重20±3克)。饲养小鼠的环境温度保持在21±3℃，相对湿度50±10％，日夜周期为12/12小时。小鼠在标准动物房中适应7天后，才进行分组与试验。使24只小鼠断食6小时后，经由腹腔注射给予每只小鼠40毫克/公斤体重的链佐霉素(STZ；美国密苏里州圣路易市Sigma-Aldrich公司)，每日一次，连续5日，其后让小鼠休息2日。确认这24只接受链佐霉素处理的小鼠显现糖尿病症状后，将它们随机分成3组，分别灌食以100微升磷酸盐缓冲化生理食盐水(STZ-PBS组)、25毫克实施例1中所制得的台湾冬虫夏草萃出物(STZ-OFE组)，或是10毫克罗格列酮(美国Sigma-Aldrich公司)(STZ-ROSI组)，历时28日。其余6只未接受链佐霉素处理的小鼠，则给予100微升PBS，以作为对照组。每日记录小鼠体重和摄食情形。在小鼠处死前，采集其血样，储存于在-80℃供血液分析用。处死小鼠后，采取胰岛细胞并予以计数。采集皮下脂肪组织(SAT)，加以称重，并计算出组织相对于体重的比例。也将位于小鼠脑部的前额叶皮质(prefrontal cortex)、纹状体(striatum)和海马体等脑组织快速地取出并称重。本申请各实施例的实验流程请参见图1。

如图2C所示，相较于STZ-PBS组的小鼠，STZ-OFE组的小鼠明显累积有比较多的皮下脂肪组织，甚至比STZ-ROSI组的皮下脂肪组织含量还要更多。另外，在STZ所引发的糖尿病小鼠模式中，可以观察到胰岛β细胞的数量减少，而无论给予ROSI或是OFE都无法在实验期间使β细胞的数量恢复(数据未出示)，这意味着台湾冬虫夏草对于第一型糖尿病的并发症的治疗效果不是透过使β细胞的数量增加。

实施例3：腹腔内葡萄糖耐量试验(GTT)

如图1所示，分别在灌食处理前后(分别以PRE GTT和POST GTT表示)，使小鼠断食6小时，经由腹腔注射给予每只小鼠2克/公斤体重的葡萄糖。在葡萄糖输注后第0、30、60和120分钟时，分别从小鼠尾部采取血样，并运用active血糖仪(德国曼罕市罗氏诊断有限公司)来测定血糖浓度。

如图2A所示，由STZ所引发的糖尿病小鼠模式中显现出第一型糖尿病的典型症状，即体重下降。图2B进一步显示，由STZ所引发的糖尿病小鼠模式中，若未给予任何药物，其断食血糖值超过200mg/dL(STZ-PBS组为392.2±38.7mg/dL)。相对来说，对照组的断食血糖值仅为119.5±24.2mg/dL(p<0.001)。然而，当给予台湾冬虫夏草萃出物或是罗格列酮后，糖尿病小鼠的上述症状都会获得明显的缓解(STZ-OFE组和STZ-ROSI组)。特别是，STZ-OFE组中的小鼠接受葡萄糖耐量试验(POST GTT)后，其所得断食血糖值的曲线下方面积(AUC)相较于STZ-PBS组明显降低，几乎与对照组相当，显示台湾虫草不仅可以改善第一型糖尿病的葡萄糖代谢情形，也能够促进病人体内的能量运用，从而改善第一型糖尿病的并发症病况。

实施例4：免疫组织化学分析

将实施例2中所采集到的皮下脂肪组织(SAT)以4％多聚甲醛加以固定，包埋于石蜡中进行切片。接着脱除组织切片的石蜡，再在95℃下于抗原修复液中(美国麻萨诸塞州康桥市Abcam公司；编号ab93680)处理15分钟，使抗原暴露出来，并以配于80％甲醇中的0.3％H₂O₂溶液处理30分钟，以减少内源性过氧化酶的含量。以1％牛血清蛋白(BSA)处理切片，随后于4℃下与抗小鼠脂联素抗体(美国麻萨诸塞州康桥市Abcam公司；编号ab22554)共同培育18小时。随后，使切片与山羊抗小鼠二级抗体共同培育30分钟，并运用Link System HRP(DAB+)套组(美国加州Dako Cytomation公司)加以呈色。切片以苏木精进行套染，以二次去离子水润洗10分钟，再以甘油胶(美国Surgipath Medical Ind.公司)加以固着。拍摄切片影像，在各影像中选择5个位点就脂联素的信号强度进行测量，并利用影像分析软件Image J(由美国马里兰州Bethesda市国立卫生研究院所开发)计算出各组小鼠的SAT中的脂联素表现量。

图3A显示各组小鼠的血浆中的脂联素含量，其中给予STZ的三组小鼠在血液中所具有的脂联素相较于对照组都降低，然而，STZ-OFE组小鼠的血浆脂联素相较于只给予PBS的小鼠(STZ-PBS组)则明显升高，这个数据指出给予台湾冬虫夏草可以恢复部分的血液中脂联素含量。SAT的代表性脂联素染色切片影像放大40倍，显示于图3B，而影像中所测得的脂联素信号强度数值则显示于图3C。图3B和3C指出，在STZ-OFE组和STZ-ROSI组小鼠的SAT中所重新合成出来的脂联素，相较于STZ-PBS组分别提升了16％和27％。综合这些数据显示，台湾冬虫夏草萃出物可以向上调控脂联素在SAT和血液中的含量，进而促进SAT的生物合成。

实施例5：动物行为试验

本实施例通过测量实施例2所建立的小鼠模型在旷场任务试验(OFT)、高架十字迷宫试验(EPM)和悬尾试验(TST)中的表现来判断小鼠的焦虑和忧郁程度。在一个配备有通风孔的消音室中设置监视器，以监视并记录完整试验过程。在OFT中，将小鼠个别地放置在一个旷场装置的中央(43.3×21.7×20.8厘米，由透明树脂玻璃制成)，并容许其自由探索60分钟。通过TOP SCAN v2.0软件(美国维吉尼亚州Reston市Clever Sys公司)来分析每只小鼠的移动总距离、在中央区域的停留时间，以及在中央和周边区域的移动速度。在EPM中，将具有两个开放臂(30厘米长×5厘米宽)和两个封闭臂的高架十字迷宫抬高至距离地板50厘米的高度。封闭臂具有与开放臂相同的尺寸，但另被50厘米高的透明墙所封闭。各个臂体皆由白色压克力板所制成，由中央平台(5厘米见方)辐状设置成十字形。实验开始时，将各只小鼠放置在中央平台，且面向其中一个封闭臂。记录各只小鼠在5分钟内的动作路径以及在装置中所花费的时间，通过TOP SCAN v2.0软件(美国维吉尼亚州Reston市Clever Sys公司)进行分析。TST是用以评价动物的忧郁行为。在TST中，通过胶带将各只小鼠的尾端2-3厘米处黏贴在消音室天花板的塑料管上，使小鼠离最近的物体相距10厘米，距离地板35厘米，且其尾部距离天花板38厘米，并加以隔音和隔光。计算各只小鼠在试验中静止不动的时间，并由三位测试者分别就每只小鼠在试验中的行为表现加以评分。此处所称“静止不动”是以小鼠的头部和所有脚爪都处于完全停止动作的状态来定义。

如图4A至4C所示，STZ-PBS组小鼠相较于对照组显现出显著的焦虑症和忧郁症行为，这指出本申请使用STZ在小鼠体内引发第一型糖尿病，成功地建立了焦虑症和忧郁症的动物模式。图4A进一步显示，给予ROSI或是OFE都可以延长小鼠在旷场任务试验(OFT)中逗留在中央区域的时间，其中对照组小鼠在中央区域的停留时间相对于总时间的比值为0.18±0.01％；STZ-PBS组的比值为0.12±0.02％；STZ-ROSI组为0.23±0.07％；而STZ-OFE组为0.24±0.01％。在高架十字迷宫试验(EPM)中，STZ-OFE组小鼠在开放臂中的停留时间最长，这指出给予台湾冬虫夏草萃出物可以促进小鼠的探索行为。如图4B所示，对照组小鼠在开放臂中的停留时间比例为19.7±9.3％；STZ-PBS组的比例为9.8±4.7％；STZ-RODI组为16.8±7.8％；STZ-OFE组为41.0±12.3％)。又如图4C所示，在悬尾试验(TST)中，STZ-PBS组小鼠相较于对照组显现出明显更长的静止不动时间，显示STZ引起了焦虑和忧郁的症状。相对来说，STZ-OFE组小鼠的静止不动时间则恢复成仅略高于对照组小鼠。综合本实施例所得数据显示，台湾冬虫夏草可以改善由第一型糖尿病所导致的焦虑症和忧郁症的病理并发症。

实施例6：脑边缘区域(limbic regions)中的单胺类物质含量

在1毫升由0.1M HCl,10^-7M抗坏血酸和50pg/μL异丙基肾上腺素(isoproterenol)所构成的萃取液中，将实施例2所采得的脑组织分别予以均质化。随后在4℃下，将均质液以13200rpm的速率予以离心三次，各历时20分钟。使上清液通过0.22微米孔径的滤器(美国Millipore公司)进行过滤，再将其注入反相C18管柱中(Hypersil^TM GOLD aQ,5μm,150mm×4.60mm)。通过耦合有电化学传感器(日本Shiseido Co.,Ltd.出品，型号P/N 70-9143，范围10nA，具有1Hz滤光片和0.7V AppE电池)且配备有自动采样仪(美国Dionex公司WPS-3000)的HPLC系统来测量去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、5-羟基色胺(5-HT)和5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)的浓度。层析的泳动相含有0.17M NaH₂PO₄、0.63mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.60mM辛烷-1-磺酸钠盐和2.0mM KCl，配制于20％甲醇中，并以85％H₃PO₄调整酸碱值至pH 3.30。流速维持于每分钟0.6毫升。上述化合物的标准品购自于美国密苏里州圣路易市Sigma-Aldrich公司。HPLC系统对于样品的测量下限为0.1pg。

各组小鼠在前额叶皮质、纹状体和海马体等脑边缘区域中的神经传导物质(DA和5-HT)及其代谢物(DOPAC和5-HIAA)的含量显示于下表1。

如表1所示，相较于对照组，给予小鼠STZ(STZ-PBS组)会导致DA、DOPAC、5-HT和5-HIAA在所载三个脑边缘区域中的含量降低。但是，给予STZ的小鼠再接受ROSI或OFE处理即可在其前额叶皮质和纹状体中使上述神经传导物质及其代谢物的含量明显恢复。这个数据与实施例5和图4A-4C中显示ROSI和OFE可以改善焦虑症和忧郁症的结果相吻合。综合本实施例的数据显示，台湾冬虫夏草能够增进神经传导物质在多巴胺和血清素信息传递路径中的含量，进而改善第一型糖尿病所引起的焦虑和忧郁症状。

虽然本发明已被详细描述于说明书中，但在本发明含义和范围内的各种修改和变化对于本领域技术人员而言属于明显。基于前述的公开内容，相关技术中的知识以及在发明背景和发明的详细叙述中所讨论到的参考文献的公开内容完全地被纳入于此作为参考。