包含咪唑二肽的试剂的制作方法

本发明涉及一种试剂，其以选自由咪唑二肽及其代谢产物组成的组中的至少一种作为有效成分。本发明的试剂能够用于认知功能改善、心理功能改善、抗老化、健康维持。本发明在一般食品、健康食品、药品、美容、健康和医疗相关领域中有用。

背景技术：

肌肽是由β-丙氨酸和组氨酸构成的二肽，鹅肌肽是由β-丙氨酸和甲基化组氨酸构成的二肽。已知它们均含有于鸡肉等中。对于肌肽和鹅肌肽的促进皮肤代谢(专利文献1)、自主神经调节作用(专利文献2)、缓解应激(专利文献3)、以及提高学习机能和抗焦虑(专利文献4)作用进行了研究。

近年来，预防与老化相伴的疾病、增强免疫力等维持健康并长寿的方面逐渐受到关注。老龄化在多数情况下伴随着某种程度的认知功能的降低。另外，由阿兹海默氏病的发病、进展也会产生认知功能的降低。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2000-201649公报

专利文献2：WO2002/076455公报

专利文献3：日本特开2007-70316公报

专利文献4：日本特开2000-116987公报

技术实现要素：

发明所要解决的课题

希望通过适当的饮食、运动、精神疗法等，在日常生活中延缓老化的进行，并且能够尽早应对与老化相伴的疾病。

食品除了作为能量源和必需营养素源(营养性)以外，还提供品尝的乐趣(适口性)，对健康生活做出贡献(功能性)。食品或包含食品来源的功能性成分的制品被期待在健康及美容方面发挥作用，作为健康食品等广泛普遍地被人们所接受。从安全、安心的观点出发，认为也优选利用具有食用经验的天然物。

用于解决课题的手段

本发明人有效利用天然物，致力于对健康有益的食品和材料的研究开发。其中，此次发现鸡肉来源的肌肽和鹅肌肽具有心理功能改善作用等，从而完成了本发明。本发明提供下述技术方案。

[1]一种用于神经心理功能的改善的试剂，其含有选自由咪唑二肽及其代谢产物组成的组中的至少一种。

[2]如[1]所述的试剂，其中，神经心理功能与阿兹海默氏病或老龄化有关。

[3]一种基于神经心理功能的改善的抗老化剂，其含有选自由咪唑二肽及其代谢产物组成的组中的至少一种。

[4]一种用于改变下述基因的表达的试剂，其含有选自由咪唑二肽及其代谢产物组成的组中的至少一种，

该基因为选自由下述基因组成的组中的至少一种：

作为转运蛋白基因的SLC23A2、SLC43A2、SLC29A3、SLC35C1、SLC25A33、SLC25A23、SLC6A12和SLC6A13；

作为趋化因子基因的CXCL12和CCL17；

作为老化相关基因的TSPO和P2RY1；

作为神经系统基因的CAMK1；

作为线粒体系统基因的ACO2、ATP7A、POLG、IDH3G、UCP2、BCKDHA和TAP2；以及

作为抗老化基因的SMARCD1和SIRT6。

[5]如[1]所述的试剂，其具有抗炎症作用。

[6]一种用于调控下述细胞因子的血液中浓度的试剂，其含有选自由咪唑二肽及其代谢产物组成的组中的至少一种，该细胞因子为选自由IP-10(CXCL10)、IL-2、IL-5、IL-7、IL-8(CXCL8)、IL-13、G-CSF和MCP-1(CCL2)组成的组中的至少一种。

[7]如[1]所述的试剂，其对血糖值具有上升抑制作用或降低作用。

[8]如[1]所述的试剂，其对血中的胰岛素浓度具有上升抑制作用或降低作用。

[9]如权利要求[1]～[8]中任一项所述的试剂，其用于使对象摄取每日量为200mg以上的选自由咪唑二肽及其代谢产物组成的组中的至少一种。

[10]一种营养组合物，其包含每日量为200mg以上的来自动物肉的咪唑二肽中的至少一种。

[11]如[10]所述的营养组合物，其中，咪唑二肽中的至少一种来自鸡肉。

[12]如[1]～[11]中任一项所述的试剂或营养组合物，其中，进一步包含肌酸和核酸。

[13]如[1]～[12]中任一项所述的试剂或营养组合物，其以老年人或具有轻度情绪障碍的人作为对象。

[14]一种用于糖尿病和/或阿兹海默氏病的处置的试剂，其含有选自由咪唑二肽及其代谢产物组成的组中的至少一种。

[15]一种饮食方法，其包括使希望改善神经心理功能的对象摄取包含选自由咪唑二肽及其代谢产物组成的组中的至少一种的营养组合物的步骤。

[16]一种对象的神经心理功能的判定方法，该方法基于对象所具有的肌肽分解酶(CNDP1)活性。

[17]一种通过使对象摄取[1]～[14]中任一项所述的试剂或营养组合物而产生的神经心理功能的改善效果的预测方法，该方法基于对象所具有的CNDP1活性。

[18]一种用于检测神经心理功能的改善或恶化的、基于下述基因的表达分析的方法，

该基因为选自由下述基因组成的组中的至少一种：

作为转运蛋白基因的SLC23A2、SLC43A2、SLC29A3、SLC35C1、SLC25A33、SLC25A23、SLC6A12和SLC6A13；

作为趋化因子基因的CXCL12和CCL17；

作为老化相关基因的TSPO和P2RY1；

作为神经系统基因的CAMK1；

作为线粒体系统基因的ACO2、ATP7A、POLG、IDH3G、UCP2、BCKDHA和TAP2；以及

作为抗老化基因的SMARCD1和SIRT6。

[19]一种用于检测神经心理功能的改善或恶化的试剂盒，其包含由下述碱基序列构成的核酸，该碱基序列选自由序列号1～20中的任一碱基序列的全部或一部分、以及与序列号1～20中的任一碱基序列互补的碱基序列的全部或一部分组成的组中的至少一种碱基序列。

[20]一种用于脑的功能老化和/或痴呆症的处置的药物组合物，其包含式I或II所表示的化合物。

【化1】

【化2】

(式I、式II中，

R¹、R²和R³各自独立地为H或C_1-6烷基，

X为H或-COR⁴，此时R⁴为H或C_1-6烷基。)

[21]一种探索用于脑的功能老化和/或痴呆症的处置的有效成分的方法，其使用[20]中定义的式I或式II所表示的化合物作为先导化合物。

附图说明

图1是心理功能检查(BDI检查)的结果。

图2是心理功能检查(评价脑老化的ADAScog检查)的结果。表示出改善、无变化、恶化各自的比例。

图3-1是通过咪唑二肽的摄取而使萎缩得到改善的脑部位(灰质)。将p<0.005的部位用彩色表示。

图3-2是通过咪唑二肽的摄取而使萎缩得到改善的脑部位(白质)。

图4是通过咪唑二肽的摄取而引起的神经回路功能的改善。伴随着老龄化，海马和扣带后回的神经回路功能降低(左图)，但在试验饮食摄取组中，摄取后该功能降低得到了改善(右图)。

图5是通过咪唑二肽的摄取而变化的基因。在属于SLC(转运蛋白)的6个基因中，通过试验饮食的摄取，与安慰剂饮食摄取相比，基因表达水平显著地发生变化。除此以外，可知趋化因子类等图中所示的各基因的表达水平发生了变化。

图6是通过咪唑二肽的摄取而变化的血中细胞因子、趋化因子。平均值±SE，试验饮食：实线，安慰剂：虚线，配对t检验，*：p<0.05，**：p<0.01

图7是通过咪唑二肽的摄取而引起的血糖值的降低。

图8-1是痴呆症模型小鼠中的血中细胞因子类的减少。在含肌肽饮食组中，细胞因子类减少，暗示炎症得到了抑制。wt：野生型，tg：转基因，*：p<0.05，**：P<0.01(Dunnett检验对tgHFD)，#：p<0.05，##：P<0.01(学生t检验)

图8-2是痴呆症模型小鼠中的脑内炎症反应的抑制(小鼠MRI图像)。观察到通过咪唑二肽的摄取而引起的炎症抑制。

图8-3是通过高功能二肽摄取而引起的胶质细胞的GABA转运蛋白基因表达的抑制。Slc6A13：在星形胶质细胞中表达的GABA转运蛋白2(GAT-2)、Slc6A12：在星形胶质细胞中表达的甜菜碱/GABA转运蛋白1(BGT-1)

图8-4是小鼠的血中胰岛素浓度。在阿兹海默氏病(AD)高脂饮食组与AD高脂饮食+肌肽组的值之间确认到显著性差异(学生t检验，P<0.05)。

图9是ASL分析。

图10是通过ASL分析在两组间观察到差异的部位(扣带后回)。

图11是逻辑记忆II的得分(60岁以上的亚组分析的结果)。两组间的显著性差异(P<0.01)。需要说明的是，摄取后试验的难度远高于摄取前试验。

图12是逻辑记忆II的得分(60岁以上的亚组分析的结果)。在试验饮食组中，所有年龄的情况下功能均未降低，与此相对，在安慰剂饮食组中，具有与年龄相应地、功能降低变得显著的倾向。

具体实施方式

[有效成分]

本发明涉及一种试剂，其以选自由咪唑二肽及其代谢产物组成的组中的至少一种作为有效成分。本说明书中，提及咪唑二肽时，除了特别记载的情况外，是指具有咪唑环的氨基酸与其它氨基酸结合而成的二肽。

本发明中所说的咪唑二肽可以用下述的式I或式II表示。

【化3】

【化4】

式I、式II中，R¹、R²和R³各自独立地为H或C_1-6烷基，X为H或-COR⁴，此时R⁴为H、C_1-6烷基、具有或不具有取代基的苄基、或H₂C＝CH-。

式I中，R¹、R²优选任意一者为C_1-6烷基，另一者为H。式II中，R²、R³优选任意一者为C_1-6烷基，另一者为H。C_1-6烷基的优选例之一为甲基。

作为X为-COR⁴时的具体例，可以举出甲酰基、乙酰基、丙酰基、苯甲酰基、丙烯酰基。

关于式I或式II所表示的化合物的制造方法等，可以参考日本特表2003-520221、日本特开2006-232686、日本特表2006-504701、日本特表2008-517911、日本特表2009-512459、日本特开2010-31004、日本特开2011-37891、日本特开2011-37892、日本特开2013-165728、日本特开2014-12735等。

咪唑二肽包括肌肽、鹅肌肽、鲸肌肽和高肌肽。肌肽是由β-丙氨酸和组氨酸构成的二肽。根据构成肌肽的组氨酸的立体结构，肌肽存在L体和D体。在本发明及其说明中，仅称为“肌肽”时，除了特别记载的情况外，是指L-肌肽、D-肌肽或它们的混合物。已知L-肌肽在人等哺乳类中以比较高的浓度存在于肌肉和神经组织中。

下面示出L-肌肽(L-carnosine、IUPAC名：(2S)-2-[(3-氨基-1-氧代丙基)氨基]-3-(3H-咪唑-4-基)丙酸)的结构。

【化5】

在一部分动物中，多见由β-丙氨酸和甲基化组氨酸构成的L-鹅肌肽。在本发明及其说明中，仅称为“鹅肌肽”时，除了特别记载的情况外，是指L-鹅肌肽、D-鹅肌肽或它们的混合物。下面示出L-鹅肌肽(L-anserine、IUPAC名：(2S)-2-[(3-氨基-1-氧代丙基)氨基]-3-(3-甲基-4-咪唑基)丙酸)的结构。

【化6】

肌肽和鹅肌肽均为水溶性(肌肽在25℃为1g/3.1ml)。

本说明书中，在提及咪唑二肽的代谢产物时，除了特别记载的情况外，是指选自由肌肽、鹅肌肽、鲸肌肽和高肌肽组成的组中的一种咪唑二肽的代谢产物。咪唑二肽的代谢产物包括β-丙氨酸、组氨酸、甲基化组氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)。

本发明中提及“选自由咪唑二肽及其代谢产物组成的组中的至少一种”时，除了特别记载的情况外，是指咪唑二肽中的一种或两种以上。例如，在提及“包含选自由咪唑二肽及其代谢产物组成的组中的至少一种作为有效成分”时，包括以肌肽作为有效成分而不包含其它咪唑二肽的情况、以及以肌肽和鹅肌肽作为有效成分的情况等。另外，关于“选自由咪唑二肽及其代谢产物组成的组中的至少一种”，在提及量或浓度时，除了特别记载的情况外，在存在两种以上的咪唑二肽及其代谢产物时是指所有咪唑二肽及其代谢产物的合计的量或浓度。需要说明的是，本说明书中，在咪唑二肽及其代谢产物中，有时以使用了咪唑肽或肌肽或鹅肌肽的方式为例进行说明，但该说明也适合使用其它咪唑二肽及其代谢产物的情况。

本发明中，作为有效成分使用的咪唑二肽及其代谢产物可以是合成的物质，也可以是发酵生产的物质，还可以是由天然物获得的物质。另外，也可以为分离得到的物质、精制得到的物质。更具体而言，咪唑二肽及其代谢产物可以来自各种动物、例如牛、马、猪、鸡、鲸、鱼(例如鲣鱼、金枪鱼、鳗鱼。优选例之一为来自鸡肉。咪唑二肽及其代谢产物也可以作为天然物的提取物、浓缩物、粗精制物等含有于试剂中。

[用途、功能]

本发明的试剂能够用于神经心理功能的改善。神经心理功能的改善包括抗抑郁(心理功能的改善)和认知功能的改善。另外，神经心理功能的改善包括与神经心理功能有关的、脑萎缩的抑制、脑功能降低的抑制(与海马的功能连接的增强)、以及炎症引起的神经元损伤的改善。神经心理功能也可以与阿兹海默氏病或老龄化有关。另外，神经心理功能的改善包括脑的功能老化和/或痴呆症的处置。

本发明的试剂所产生的抗抑郁(心理功能的改善)效果可以通过BDI问卷调查(http：//www.chibatc.co.jp/catalogue/04/1/67.html)来评价。BDI问卷调查的分数高表示具有抑郁倾向，因此，例如通过在本发明试剂的摄取期间的前后进行调查并对摄取前的分数和摄取后的分数进行比较，能够比较出心理功能改善的程度。本发明的试剂特别是对于具有轻度情绪障碍的对象能够期待改善心理功能的效果。

本发明的试剂所产生的认知功能的改善效果可以通过ADAS-cog(Alzheimer's Disease Assessment Scale-cognitive subscale，阿兹海默氏病评定量表-认知分量表)法来评价。本发明所产生的认知功能的改善效果包括：对与老化相伴的记忆力变差的程度进行改善的情况、和对病态性的认知能力降低(痴呆症)进行改善的情况。本发明的试剂特别是对于与阿兹海默氏病或老龄化有关的认知功能的降低能够期待改善效果。

本发明的试剂可以用于脑萎缩的抑制、脑功能降低的抑制(与海马的功能连接的增强)、或炎症引起的神经元损伤的改善。对于这些障碍的效果可以通过图像诊断等本领域技术人员熟知的方法来评价。根据本发明人的研究，在包括老年人的对象组中，脑的灰质和白质中分别观察到萎缩的发展得到抑制的部位。这种效果未见于施用了不含鹅肌肽和肌肽的安慰剂的组中。

本发明的试剂可以用于处置脑的功能老化和痴呆症的发病，更特定而言，可以用于预防、延迟或抑制脑的功能老化和痴呆症的发病或者防止重症化。这种效果可以通过对对象者的扣带后回部位的血流变化、或以60岁以上的被测者为对象的逻辑记忆(延迟回忆任务)进行评价来确认。根据本发明人的研究可知，在以包括60岁以上的人的被测者作为对象的情况下，在包含咪唑二肽的试验饮食摄取组中，与安慰剂饮食组相比，扣带后回部位的血流保持有显著性差异。另外可知，在以60岁以上的人作为被测者的情况下，在3个月试验饮食摄取组中，与安慰剂饮食组相比，逻辑记忆的分数具有显著性差异。

本发明的试剂可以用于改变转运蛋白的表达。转运蛋白是与通道、受体一同存在于细胞膜的膜蛋白，但与通道不同，转运蛋白不仅识别内源性物质作为输送底物，还识别包括药物、环境化学物质在内的许多外源性物质作为输送底物。转运蛋白目前分为利用ATP的水解能进行输送的ABC(ATP结合盒)家族、和不利用ATP的能量进行输送的SLC(溶质携带蛋白)家族这两种，对于人而言，已鉴定出48种ABC转运蛋白基因和319种SLC转运蛋白基因。因转运蛋白的异常而产生的疾病随着老龄化而增加，认为约10％的50岁之后的高龄化疾病相关基因与转运蛋白有关。

本发明的试剂特别是可以用于改变选自由SLC23A2、SLC43A2、SLC29A3、SLC35C1、SLC25A33、SLC25A23、SLC6A12、SLC6A13组成的组中的至少一种、优选至少3种以上、更优选5种以上、进一步优选所有转运蛋白的表达。表达的变化包括增加表达和减少表达。

本发明的试剂可以用于改变趋化因子的表达。趋化因子是藉由G蛋白偶联受体表现出其作用的碱性蛋白质，是细胞因子中的一类。其引起白细胞等的游走，参与炎症的形成。迄今为止已发现了数量众多的趋化因子。根据结构上的不同，分类成CC趋化因子、CXC趋化因子、C趋化因子、CX3C趋化因子。迄今为止已鉴定出50种以上的趋化因子。

本发明的试剂特别是可以用于改变选自由CXCL12和CCL17组成的组中的至少一种、优选两种趋化因子的表达。表达的变化包括增加表达和减少表达。

本发明的试剂可以用于改变老化相关基因的表达。老化相关基因作为与个体老化、细胞老化相关的基因被鉴定，迄今为止已鉴定出数量众多的老化相关基因。

本发明的试剂特别是可以用于改变选自由TSPO和P2RY1组成的组中的至少一种、优选两种老化相关基因的表达。表达的变化包括包括增加表达和减少表达。

本发明的试剂可以用于改变神经系统基因的表达。神经系统基因是与神经产生、神经分化等有关的基因，迄今为止已鉴定出数量众多的神经系统基因。

本发明的试剂特别是可以用于改变神经系统基因CAMK1的表达。表达的变化包括增加表达和减少表达。

本发明的试剂可以用于改变线粒体系统基因的表达。线粒体系统基因是与线粒体生物合成、融合、TCA循环、呼吸有关的基因，迄今为止已鉴定出数量众多的基因。

本发明的试剂特别是可以用于改变选自由ACO2、ATP7A、POLG、IDH3G、UCP2、BCKDHA和TAP2组成的组中的至少一种、优选至少3种以上、更优选5种以上、进一步优选全部线粒体系统基因的表达。表达的变化包括增加表达和减少表达。

本发明的试剂可以用于改变抗老化基因的表达。抗老化基因是实现细胞老化抑制、抗衰老的基因，迄今为止已鉴定出数量众多的基因。

本发明的试剂特别是可以用于改变选自由SMARCD1和SIRT6组成的组中的至少一种、优选两种趋化因子的表达。表达的变化包括增加表达和减少表达。

另外，本发明的试剂可以用于选自由IP-10(CXCL10)、IL-2、IL-5、IL-7、IL-8(CXCL8)、IL-13、G-CSF和MCP-1(CCL2)组成的组中的至少一种细胞因子的调控。调控包括使水平上升和下降。

另外，本发明的试剂还可以用于抗炎症剂或者血糖值的上升抑制或降低。

本发明中，关于疾病或状态，在提及“改善”或“处置”时，包括发病风险的降低、发病的延迟、预防、治疗、恶化的停止和延迟。用于改善或处置的行为包括：医生所进行的以疾病的治疗为目的的医疗行为；医生以外的人、例如营养师(管理营养师、保健师、助产士、护士、临床检查技师、美容人员、美容师、食品制造者、食品销售者等所进行的非医疗行为等。另外，处置包括：特定食品的给予或摄取的推荐、饮食方法指导、保健指导、营养指导(包括对于伤病者的疗养所需要的营养指导、和用于保持增进健康的营养指导)、供给饮食管理、与供给饮食相关的营养改善方面所需要的指导。本发明中的处置的对象包括人(个体)，优选为希望实施上述中任一种处置、或者需要实施上述中任一种处置的人。

需要说明的是，本发明人为了验证咪唑二肽的有效性所产生的个体差异，测定了被测者血清中的血清肌肽分解酶(下文中称为CNDP1)活性。活性测定的结果，确认到根据被测者的不同存在很大的个体差异。CNDP1存在于血液中，将咪唑二肽分解。因此，CNDP1会对咪唑二肽摄取后的血中咪唑二肽浓度产生影响，因而，有可能对咪唑二肽的有效性产生影响。因此认为，对象中的CNDP1的活性信息对于预先判定基于咪唑二肽的摄取的处置是否有效是有用的。因此，本发明提供一种对象的神经心理功能的判定方法，该方法基于对象所具有的肌肽分解酶(CNDP1)活性；并且提供一种通过使对象摄取本发明的试剂或营养组合物而产生的神经心理功能的改善效果的预测方法，该方法基于对象所具有的CNDP1活性。这些方法中，可以是预先确定用于判断的基准值并根据该基准机械地进行预测的方法。

[试剂]

本发明中在提及“试剂”时，除了特别记载的情况外，包括为有效成分本身的情况、和包含有效成分及其以外的成分的情况，不包括含有选自由咪唑二肽及其代谢产物组成的组中的至少一种的现有食品、例如鸡肉本身。

只要能够发挥目标效果，本发明的试剂中可以混配有效成分以外的其它成分。其它成分可以是作为食品所允许的各种添加剂、或作为药品所允许的各种添加剂。其示例包括赋形剂、抗氧化剂、香料、调味料、甜味料、着色料、增稠稳定剂、发色剂、漂白剂、防霉剂、胶基、苦味料等、酶、光泽剂、酸味料、乳化剂、增强剂、制造用剂、粘结剂、等渗化剂(等渗剂)、缓冲剂、助溶剂、防腐剂、稳定剂、凝固剂等。

其它成分也可以为有效成分以外的功能性成分。作为其它功能性成分的示例，可以举出氨基酸类(例如支链氨基酸类、鸟氨酸)、不饱和脂肪酸类(例如EPA、DHA)、维生素类、微量金属类、葡糖胺、软骨素类等。

本发明的试剂由有效成分和有效成分以外的其它成分构成的情况下，关于有效成分的含量，本领域技术人员可以从制造容易性、使用容易性等方面出发进行适当设计，例如可以为0.1％～99.9％、并且可以为1％～95％、并且可以为10％～90％、进而可以为51％～90％以上。另外，作为肌肽可以为21％以上，作为鹅肌肽可以为31％以上。

如上所述，除现有的食品外，本发明的试剂的形态可以为各种形态。例如，可以为经口药品等药物组合物或营养组合物。另外，本发明的试剂可以添加至经口药品等药物组合物或营养组合物中来使用。本发明中在提及“营养组合物”时，除了特别记载的情况外，不仅包括固体物质，还包括液态的物质、例如饮料。另外，本发明中在提及“营养组合物”时，除了特别记载的情况外，包括健康食品、营养补充剂、保健功能食品(包括营养功能食品和特定保健用食品)，并且包括治疗食物(起到治疗目的的食物。医生开出饮食处方，基于根据该处方由营养师等制作的菜谱而烹调的食物)、饮食疗法食物、成分调整食物、低盐食物、护理食物、低卡路里食物和减肥食物、以及用于这些食物的材料。

作为本发明的试剂、药物组合物或营养组合物的形态的示例，可以举出散剂、细粒剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、液态制剂(包括酏剂、柠檬水剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、溶液剂、饮料剂)、凝胶状制剂、治疗食物、饮料、点心、食用肉加工品、鱼贝类加工品、蔬菜加工品、副食、调味料组合物、食品添加物。

关于本发明的有效成分的摄取量，本领域技术人员可以根据进行摄取的对象的年龄、体重、性别、所适用的疾病或状态等进行适当设计。有效成分的摄取量例如可以为200mg/天、优选为400mg/天、更优选为500mg/天以上、进一步优选为750mg/天以上。另外，可以为1,000mg/天以上、可以为2,000mg/天以上、可以为5,000mg/天以上、也可以为7,500mg/天以上。无论哪种情况，均可以为10,000mg/天以下。另外，无论哪种情况，下限值均可以为50,000mg/天以下、优选为30,000mg/天以下、更优选为20,000mg/天以下、进一步优选为10,000mg/天以下。作为有效成分，可以一次摄取上述的每一天的摄取量，也可以分成两次以上来摄取。

关于本发明的试剂、药物组合物或营养组合物中的有效成分的量，本领域技术人员可以适当设计，例如可以为1,000mg/100g以上、优选为1,500mg/100g以上、更优选为2,000mg/100g以上、更优选为2,500mg/100g以上、更优选为3,000mg/100g以上、进一步优选为3,500mg/100g以上。无论哪种情况，均可以为50,000mg/100g以下、优选为40,000mg/100g以下、更优选为30,000mg/100g以下、进一步优选为20,000mg/100g以下。

另外，本发明的试剂、药物组合物或营养组合物也可以包含有效成分以外的成分。有效成分以外的成分例如为肌酸和核酸。关于肌酸的含量，例如一天量可以为10mg以上、优选为20mg以上、更优选为30mg以上、更优选为60mg以上、更优选为100mg以上、进一步优选为200mg以上。无论哪种情况，均可以为2,000mg以下、优选为1,000mg以下、更优选为750mg以下、进一步优选为500mg以下。关于核酸的含量，例如一天量可以为0.15mg以上、优选为0.30mg以上、更优选为0.50mg以上、更优选为1.0mg以上、更优选为2.0mg以上、进一步优选为3.0mg以上。无论哪种情况，均可以为50mg以下、优选为40mg以下、更优选为20mg以下、进一步优选为10mg以下。

在将本发明的试剂、药物组合物或营养组合物制成治疗食物(起到治疗目的的食物。医生开出饮食处方，基于根据该处方由营养师等制作的菜谱而烹调的食物)、饮食疗法食物、成分调整食物、低盐食物、护理食物、低卡路里食物、减肥食物、或运动食物(包括以有氧运动中的能力增强为目的的食物、以有氧运动中的持久力增强为目的的食物、为了至比赛当天为止使身体蓄积营养的食物、比赛中用于补充营养的食物、和以恢复比赛结束后的疲劳为目的的食物)的情况下，有效成分的含量可以考虑作为一餐的摄取量来进行设计。

本发明的试剂、药物组合物或营养组合物可以反复使对象摄取，并且可以长时间使对象摄取。特别是在以增强与运动相关的能力为目的的情况下，优选在运动前摄取，并且优选日常进行摄取。

可以在本发明的试剂、药物组合物或营养组合物上进行能够用于神经心理功能、脑的萎缩或功能降低、以及炎症引起的神经元的损伤的表示，并且进行推荐特定对象、例如65岁以上的老年人或具有轻度的情绪障碍的人进行摄取的表示。表示可以直接或间接地进行，直接表示的示例是在制品本身、包装、容器、标签(label)、标签(tag)等有形物体上进行记载，间接表示的示例包括利用网站、店铺、展览会、广告牌、布告栏、报纸、杂志、电视机、收音机、邮寄物、电子邮件等场所或手段所进行的广告和宣传活动。

[制造方法]

本发明的试剂、药物组合物或营养组合物可以利用各种公知的技术来制造。将有效成分调整为规定浓度的步骤可以在制造步骤的各种阶段应用。本领域技术人员可以考虑有效成分的溶解性、稳定性、挥发性等来适当设计用于本发明的试剂的制造步骤。根据本发明人的研究，确认到鹅肌肽和肌肽在常温下充分稳定，并且在180℃以下的烹调条件下充分稳定。此外确认到，在溶液状态下至少能够稳定地保存2年9个月。

在以鸡肉提取物构成本发明的有效成分的情况下，对鸡肉提取物的制造方法的一例进行具体说明，将鸡肉切碎，加入温水，根据需要调节pH，根据需要进行加热，用几分钟～几天进行提取。提取条件的一例为50℃～100℃下处理1小时～10小时。所得到的提取液可以根据需要通过硅藻土过滤、超滤等进行精制和分级。可以根据需要进行脱盐处理、蛋白酶处理。作为原料的鸡肉的部位没有特别限定，基于大量含有肌肽和/或鹅肌肽的原因，优选包含胸肉。所得到的提取物可以通过热风干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等进行干燥，制成干燥物。也可以进行造粒，制成颗粒。

[表达分析]

另外，本发明还提供一种用于检测神经心理功能的改善或恶化的基于下述基因的表达分析的方法，该基因为选自由下述基因组成的组中的至少一种：作为转运蛋白基因的SLC23A2、SLC43A2、SLC29A3、SLC35C1、SLC25A33、SLC25A23、SLC6A12和SLC6A13；作为趋化因子基因的CXCL12和CCL17；作为老化相关基因的TSPO和P2RY1；作为神经系统基因的CAMK1；作为线粒体系统基因的ACO2、ATP7A、POLG、IDH3G、UCP2、BCKDHA和TAP2；以及作为抗老化基因的SMARCD1和SIRT6。并且还提供一种用于检测神经心理功能的改善或恶化的试剂盒，其包含由选自由序列号1～20中的任一碱基序列的全部或一部分、和与序列号1～20中的任一碱基序列互补的碱基序列的全部或一部分组成的组中的至少一种碱基序列构成的核酸。

表达分析优选对下述基因的表达进行分析：选自由SLC23A2、SLC43A2、SLC29A3、SLC35C1、SLC25A33、SLC25A23、SLC6A12和SLC6A13组成的组中的至少一种转运蛋白基因；选自由CXCL12和CCL17组成的组中的至少一种趋化因子基因；选自由TSPO和P2RY1组成的组中的至少一种老化相关基因；选自CAMK1的神经系统基因；选自由ACO2、ATP7A、POLG、IDH3G、UCP2、BCKDHA和TAP2组成的组中的至少一种线粒体系统基因；选自由SMARCD1和SIRT6组成的组中的至少一种抗老化基因。更优选对上述所有的基因的表达进行分析。

在新药、功能性食品成分的开发等中，下述方法受到关注：在细胞水平上对候选药剂、成分的作用进行监控，对它们的药效及安全性进行评价，在整个基因组范围内捕捉药剂施用前后在细胞中表达的基因，以基因表达量的变化定量地捕捉药剂或成分的作用。在这种方法中，通过对由本发明提供的基因的组合进行表达分析，能够分析出候选药物对神经心理功能的效果。

在与表达分析有关的本发明中，作为由选自由序列号1～20中的任一碱基序列的全部或一部分、和与序列号1～20中的任一碱基序列互补的碱基序列的全部或一部分组成的组中的至少一种碱基序列构成的核酸，可以是能够与作为检测对象的试样中的转录产物特异性杂交的探针、或者能够作为对转录产物的全部或一部分进行扩增的引物而发挥功能的一对引物对。核酸可以为DNA，也可以为RNA。

在与表达分析有关的本发明中，关于由选自由序列号1～20中的任一碱基序列的全部或一部分、和与序列号1～20中的任一碱基序列互补的碱基序列的全部或一部分组成的组中的至少一种碱基序列构成的核酸的长度，在作为探针使用的情况下，例如为15碱基长以上、优选为20碱基长以上、更优选为25碱基长以上。对于探针核酸，为了能够进行靶核酸的检测、定量，例如可以利用放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质进行了标记。作为探针的核酸可以固定于固相上。

作为引物使用时的核酸的长度例如为15～约100碱基长、优选为15～50碱基长，优选为设计成可扩增100bp～几kbp的DNA片段的引物对。

所使用的核酸可以通过利用市售的DNA/RNA自动合成仪等进行化学合成来制造。另外，也可以通过在硅或玻璃等固相上直接合成核酸而制成固定有核酸的芯片(阵列)。作为以核酸探针被固定化于基板的状态进行提供的优选方式，可以举出DNA微阵列。

为了利用微量的试样定量地对规定的基因簇的表达进行分析，可以使用竞争性RT-PCR或实时RT-PCR。作为分析对象的试样，可以为由人采集的血液。

[作为先导化合物的利用]

根据本发明，提供一种探索用于神经心理功能的改善、特别是脑的功能老化和/或痴呆症的处置的有效成分等的方法(筛选方法)，其使用上述咪唑二肽及其代谢产物作为先导化合物。先导化合物通常是指药理活性的特性明确、通过对其进行化学改变能够期待活性提高、毒性减弱的化合物。咪唑二肽及其代谢产物如上所述具有神经心理功能的改善、特别是脑的功能老化和/或痴呆症的处置这样的药理活性，通过对其进一步进行化学改变，能够期待活性的提高、毒性的减弱。

化学改变例如是指，通过对上述先导化合物进行化学修饰而进行先导化合物的优化。化学修饰例如可以为部分氨基酸的置换、去除、至少一个氨基酸的添加、插入。另外，可以考虑对各氨基酸的官能团添加、置换、去除；以及各氨基酸向D体氨基酸或人工氨基酸的置换等。

根据本发明，通过以咪唑二肽及其代谢产物作为先导化合物进行优化，能够探索出在物性、药代动力学和毒性等方面更为优异的有效成分。

下面，利用实施例对本发明进行说明，但本发明的范围不限于实施例中记载的范围。

实施例

[利用健康人志愿者进行的评价1]

使被测者(将28名40岁以上的健康人男女志愿者分成试验饮食组和安慰剂饮食组这2组)摄取3个月包含鸡肉来源咪唑二肽(以肌肽、鹅肌肽计，1天1000mg)的试验饮食，在其前、中、后对脑功能的变化等进行评价。将试验饮食和安慰剂饮食的配比(以每天量计)示于下表。

【表1】

1.抗抑郁效果(通过BDI问卷调查进行的评价)

在摄取期间的前和后，通过BDI问卷调查(http：//www.chibatc.co.jp/catalogue/04/1/67.html)对抑郁倾向进行了评价。需要说明的是，BDI问卷调查的分数高，表示具有抑郁倾向。

结果示于图1。通过BDI分数的变化、即摄取前的分数(测试1)－摄取后的分数(测试2)对改善的程度进行了比较，结果在安慰剂组中几乎没有观察到改善，与此相对，在试验饮食组中观察到改善倾向。另外，按照排名示出了摄取前后的变化(排名的数字越大，越得到改善)，结果试验饮食组观察到变化更大的倾向。健康人有时也具有轻度抑郁的倾向，认为咪唑二肽可能是通过调整GABA神经系统的功能而改善了该抑郁倾向。

2.认知功能的改善效果(基于ADAS-cog的评价)]

在摄取期间的前和后，通过ADAS-cog(Alzheimer's Disease Assessment Scale-cognitive subscale，阿兹海默氏病评定量表-认知分量表)对认知功能进行了评价。

结果示于图2。示出了在摄取前后改善了3分以上的人、恶化了3分以上的人的比例，结果，在试验饮食组中，改善的人数比例多于安慰剂组。

3.对于脑的萎缩等的效果

进行了基于三维T1加权图像的脑结构分析、基于静息态功能MRI的功能连接分析。在试验饮食组15名、安慰剂饮食组13名的基线以及3个月后的结构变化的纵切分析中，可知：在灰质中在右额下回和左颞下回(图3-1)、在白质中在右扣带后回，试验饮食组与安慰剂饮食组相比抑制了萎缩的进行(图3-2)。

另外，在基于静息态功能MRI的功能连接分析中，在基线中，随着老龄化，与海马的功能连接在扣带后回处降低(图4)。扣带后回与记忆的再现有关，已知在阿兹海默氏病中其功能是最先降低的。试验饮食组在3个月后与安慰剂饮食组相比，在该部位与海马的功能连接得到增强。另外，该部位与在试验饮食组中观察到萎缩抑制效果的白质部位(图3-2)是一致的。

4.基因表达分析

试验饮食组使用13名(2名无法制备)被测者血液样品(初次检查时和中间检查时的样品)，安慰剂组使用全部13名被测者血液样品(初次检查时和中间检查时的样品)，利用PAXgene RNA采血管(日本Becton Dickinson、东京)进行采血后，利用PAXgene血液RNA试剂盒(Qiagen)制备高品质RNA，通过微阵列分析了基因表达的变化。

方法

微阵列利用Agilent公司(CA，USA)的全人类基因组低聚DNA微阵列(4×44K)v2来进行。

(1)标记

首先，利用PAXgene血液RNA试剂盒(Qiagen)从被测者的血液样品提取总RNA，利用Agilent Low-Input QuickAmp标记试剂盒、单色分别对各200ng进行标记。首先，向预先准备的单色加标混合物储存液(One-Color Spike Mix stock solution)2μL中加入200ng的总RNA 2.5μL。接着，加入T7启动子引物0.8μL，用微量恒温仪于65℃温育10分钟，之后在冰上骤冷5分钟。进而，加入预先制备的cDNA混合母液4.7μL，利用40℃的微量恒温仪温育2小时，之后移至70℃的微量恒温仪并进一步温育15分钟。之后，在冰上骤冷5分钟，加入预先制备的转录混合母液6μL。利用40℃的微量恒温仪遮光温育2小时后，加入84μL的无RNA酶水使总量为100μL，进一步加入缓冲液RLT 350μL，进一步加入250μL的乙醇。接着，将全部量添加至RNeasy柱中，以13000rpm在4℃离心30秒，利用缓冲液RPE 500μL清洗2次后，最后用30μL的无RNA酶水进行洗脱。

(2)杂交

接着，按照Agilent公司推荐的操作规程进行杂交。首先，将之前洗脱的RNA与片段混合物(Fragmentation mix)混合而进行片段化，利用60℃的微量恒温仪温育30分钟，立即冰冷1分钟。接着，在该来自片段混合物的cRNA中混合2x GEx杂交缓冲液HI-RPM，制作出杂交混合物。将杂交混合物加样至微阵列载玻片后，设置于杂交室中，并设置于分子杂交仪中，在65℃以10rpm用17小时进行杂交。

(3)微阵列载玻片的清洗和扫描

使用预先准备的基因表达清洗缓冲液进行微阵列载玻片的清洗。首先，在杂交结束前，在3个清洗用玻璃容器中的2个中装满基因表达清洗缓冲液1，在其余的1个中装满37℃的基因表达清洗缓冲液2。将杂交结束后的杂交室在第1个清洗用玻璃容器中进行分解，取出微阵列载玻片，在第2个清洗用玻璃容器中进行清洗。在第3个清洗用玻璃容器中进一步清洗微阵列载玻片后，将微阵列载玻片从水面缓慢地提起，由此使其干燥，最后设置于专用的扫描仪中，进行微阵列载玻片的扫描。

(4)数据分析

利用Agilent公司的特征提取软件进行数据的数值化。标准化使用统计分析软件R，通过分位数法来进行。另外，由标准化后的信号值计算出Z分数和比例，仅提取具有±2以上的变化的基因，利用注释数据库DAVID(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)对所得到的数据进行分析。

首先，向数据库中输入确认到变化的基因的GenBank登录号，之后进行功能注释聚类，对发生了基因变化的功能分别进行聚类。另外，同样地利用DAVID进行了KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书)的通路分析。

结果

基于p<0.05的显著性差异水平，将通过试验饮食的摄取与安慰剂饮食组相比发生了显著变化的基因示于图5。由该基因表达分析的结果可知，血液细胞上存在的各种转运蛋白分子的表达发生了大幅变化。特别是发现，通过咪唑二肽的摄取，位于淋巴细胞的膜表面的维生素C转运蛋白(图5中，SLC23A2)的表达量显著地上升。另外，对于与线粒体的能量代谢相关的多个基因而言，其表达增加(作为TCA循环的酶的ACO2(顺乌头酸酶)、IDH3G(异柠檬酸脱氢酶))。利用这样的机制，咪唑二肽有可能发挥出增进健康的作用。

在趋化因子类中，观察到CXC趋化因子、CC趋化因子的表达降低。暗示了试验饮食具有抑制炎症的倾向。

另外，确认到老化相关基因的表达增强。暗示了试验饮食所引起的老化调控。

此外，确认到抗老化基因的表达增强。暗示了试验饮食所引起的抗老化。

已知肌肽具有肌肉疲劳改善效果，认为疲劳恢复是对肌肉中的pH进行中和的效果。但是，此次，通过试验饮食的摄取，观察到线粒体系统的基因的增强，因而还暗示了经由糖酵解系统的线粒体的功能增强这种对于肌肉的新功能。另外，此次获知，作为长寿基因而已知的SIRT6的表达增强。已知该基因在小鼠个体中高度表达时，小鼠的寿命延长。因此，或许还可以期待通过咪唑二肽来延长寿命。进而，就咪唑肽的摄取导致各种SLC的基因表达发生变化这一点而言，通过与肌肽配伍食用，或许可以期待对各种生理活性物质、食物成分的应答发生变化的、所谓配伍食用效果。

5.血清中细胞因子类的浓度变化

在3个月的摄取期间，对于来自食品摄取前、摄取中(开始6周后)、期间刚结束后的被测者的血液样品，进行了生物化学检查、血细胞计数检查、血糖检查、凝血检查。通过试验饮食的摄取，观察到血糖值的降低倾向。关于除此以外的指标，在摄取前后未观察到变化，因而再次确认了试验饮食和安慰剂饮食摄取的安全性。

另外，对于相同的血液样品，实施了27种细胞因子、趋化因子的定量分析。利用使用了xMAP技术(Luminex公司)的基于微珠的多重分析对被测者外周血的血清中细胞因子浓度进行了定量分析。该方法使用结合在分别以不同荧光进行了标记的微珠上的特异抗体，利用流式细胞术的原理，同时对各细胞因子进行定量分析。下面示出使用了Bio-Plex Pro^TMHuman Cytokine Grp I panel 27-pLex试剂盒(Bio-Rad公司)的分析方法的概要。将各抗体微珠分注于96孔分析板中，用Bio-Plex清洗缓冲液清洗2次后，添加血清和标准溶液，遮光在室温下于摇床上温育1小时。用清洗缓冲液清洗3次后，加入检测抗体溶液，遮光在室温下于摇床上温育30分钟。用清洗缓冲液清洗3次后，加入PE标记链霉亲和素溶液，遮光在室温下于摇床上温育10分钟。用清洗缓冲液清洗3次后，加入检测缓冲液，遮光振荡10秒。利用Bio-Plex 200系统(Bio-Rad公司)测定各微珠的PE荧光强度，由使用已知试样求出的标准曲线计算出血清中的各细胞因子浓度。对于各被测者在摄取前后利用配对t检验进行统计分析，将在试验饮食组中确认到变化的细胞因子示于图6。

可知：通过试验饮食的摄取，以IL-8(CXCL8)为代表，IL-5、IL-7、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、MCP-1(CCL2)等许多细胞因子、趋化因子分子的血中水平显著地降低。另一方面，还可知：IP-10(CXCL10)的血中水平通过试验饮食摄取而显著地上升。需要说明的是，为了使必需氨基酸量与试验饮食相符，此次的安慰剂饮食中包含组氨酸，已知组氨酸具有抗炎症作用。因此，对于上述分子组中的IL-5、IL-7、MCP-1(CCL2)而言，通过安慰剂饮食的摄取，其血中水平也显著地降低。

对血糖值进行了测定。结果示于图7。安慰剂组具有上升倾向，试验饮食组具有降低倾向。与安慰剂组相比，试验饮食组中具有血糖值改善的倾向。另一方面，此次的试点试验是以健康的中老年人为对象，因此被视为糖尿病的标记分子的HbA1c(糖化血红蛋白)在许多被测者中处于正常值的范围内，通过试验饮食的摄取，其值未发现变化。

[利用病态小鼠进行的评价]

对转基因小鼠(阿兹海默氏病模型小鼠)提供高脂饮食(HFD：High Fat Diet)，诱导脑功能降低。对小鼠施用肌肽(L-组氨酸-β-丙氨酸)，评价了肌肽的影响。

将结果示于图8-1、8-2、8-3和8-4。在含肌肽饮食组中，细胞因子类减少，暗示炎症得到了抑制(图8-1)。另外，由MRI检查的结果显示，在肌肽施用组中脑的炎症得到了抑制(图8-2：红色部分)。微阵列分析的结果，在阿兹海默氏模型中观察到的7Slc6a12、slc6a13之类的GABA转运蛋白的表达上升在肌肽施用组中被抑制(图8-3)。暗示了如下可能性：在阿兹海默氏病模型小鼠中，由于转运蛋白表达上升，能够作为递质发挥作用的GABA量减少，而肌肽抑制GABA量的减少。

另外，使小鼠断食一晩后，采集血液，利用试剂盒(morinaga)检测血中胰岛素浓度。血液检查的结果可知，在肌肽施用组中，在高脂饮食施用所引起的阿兹海默氏病中观察到的血中胰岛素浓度的上升被抑制(图8-4)。

[利用健康人志愿者进行的评价2]

与上述同样地，使被测者(将40岁以上的健康人志愿者分成试验饮食组和安慰剂饮食组)摄取3个月包含鸡肉来源的咪唑二肽的试验饮食，在其前、中、后对脑功能的变化等进行评价。试验饮食和安慰剂饮食的配比(以每天量计)如表1所记载的那样。进行了第1次试点试验和第2次试点试验。

第1次与第2次合在一起的被测者的合计为试验饮食组30名、普通饮食组(安慰剂饮食组)30名(参照下表)。

【表2】

第1次试点试验的研究参加者

【表3】

第2次试点试验的研究参加者

1.基于MRI摄像法的分析

在第2次试点试验中，进行了对伴随痴呆症的进展而变化的脑血流进行直接测定的MRI摄像法。

脑的血流变化可以利用MRI装置通过不使用标记体而使用磁来实现血流变化的方法─动脉自旋标记法等进行测量。

将结果示于图9和10。可知：在试验饮食摄取组中，其血流随着从痴呆前阶段的进展和发病而发生变化的扣带后回部位的血流变化的降低与安慰剂饮食组相比具有显著性差异(P<0.005)。

2.亚组分析

以第1次和第2次试点试验的被测者的亚组分析(60岁以上)为对象，对随着从痴呆前阶段的进展和发病而降低的逻辑记忆(延迟回忆任务)进行评价。

将结果示于图11和12。可知：本试验的情况下，由于第2次试验的难度比第1次试验高，因此存在第2次的分数比第1次变差的倾向，但在试验饮食摄取组中，与安慰剂饮食组相比，以统计学上的强显著性(P<0.01)抑制了分数变差。

由这两个结果暗示，包含鸡肉来源的咪唑二肽的试剂具有预防脑的功能老化和痴呆症的发病的作用。

[制造例]

(1)鸡肉提取物的制造

通过下述步骤制造出包含鸡肉来源的咪唑二肽的试验饮食。

利用绞肉机将鸡胸肉切碎，在鸡胸肉中加入相对于肉的重量为1.5倍量的温水，在90℃加热4小时，浓缩至Brix为20％以上后，进行硅藻土过滤和超滤，最终制备成肌肽+鹅肌肽浓度为约10％(w/v％)。

(2)胶囊剂

将肌肽1.0重量份、胎盘提取物(粉末)0.2重量份和乳糖1.3重量份混合并使其均匀后，根据常规方法填充至硬胶囊中，制造出内容量为250mg的胶囊剂(肌肽100mg/胶囊)。

(3)片剂

制造出片剂，在每一片(300mg)中，与麦芽糖、糊精、淀粉、含维生素E的植物油、低聚异麦芽糖、难消化性糊精、贝钙、海藻糖、蔗糖酯、维生素C、柠檬酸、磷酸钙、香料、虫胶、烟酸、维生素K、甜味料、氯化钾、维生素A、泛酸钙、生物素、焦磷酸铁、维生素B类、维生素D、碳酸镁、叶酸一同包含肌肽、鹅肌肽混合物60mg。

序列表自由文本

序列号1：SLC23A2，NM_203327

序列号2：SLC43A2，NM_152346

序列号3：SLC29A3，NM_018344

序列号4：SLC35C1，NM_018389

序列号5：SLC25A33，NM_032315

序列号6：SLC22A23，NM_015482

序列号7：CXCL12，NM_199168

序列号8：CCL17，NM_002987

序列号9：TSPO，NM_000714

序列号10：P2RY1，NM_002563

序列号11：CAMK1，NM_003656

序列号12：ACO2，NM_001098

序列号13：ATP7A，NM_000052

序列号14：POLG，NM_002693

序列号15：IDH3G，NM_004135

序列号16：UCP2，NM_003355

序列号17：BCKDHA，NM_000709

序列号18：TAP2，NM_018833

序列号19：SMARCD1，NM_139071

序列号20：SIRT6，NM_016539