FGF‑18化合物给药方案的制作方法

本发明涉及软骨治疗，特别是软骨/骨疾病、骨关节炎和软骨损伤的治疗。更具体地说，本发明涉及用于特定治疗方案的FGF-18化合物。本发明具体地涉及治疗方案，所述治疗方案包括在每个治疗周期中进行三或四次每2周一次的FGF-18化合物的给药。所述给药方案还可包括施用对症状(疼痛和功能)有效的抗炎药，例如阿那白滞素或双氯芬酸。
背景技术：
：软骨由分散在基质(坚硬的凝胶状的基质)中的软骨细胞(源自间质细胞的细胞)组成。软骨基质由这些细胞产生，并主要包含II型胶原纤维(纤维软骨除外，纤维软骨还包含I型胶原纤维)、蛋白多糖、和弹性蛋白纤维。软骨存在于关节、胸廓、耳、鼻、喉、气管和椎间盘等部位。主要有三种类型的软骨：透明软骨、弹性软骨和纤维软骨，根据它们的组织学形态提供显著不同的功能特性。举例来说，关节软骨是一种透明软骨，其具有粘弹性，覆盖骨头的关节表面。关节软骨的主要功能是提供平滑的表面，以确保关节骨头的几乎无摩擦的运动。一般来说，软骨疾病是指以软骨的退化/解体和结缔组织中的异常为特征的疾病，其表现为受影响身体部分的炎症、疼痛、僵硬及活动受限。这些疾病可由病原体引起或者由创伤或损伤造成。成熟软骨的自身修复能力非常有限，这主要是因为软骨细胞中的营养供应有限，而且没有血管，这使得成熟软骨细胞几乎没有增殖的潜力。损伤或疾病引起的的受损软骨、特别是关节软骨的置换是医生的一大挑战，而现有的手术治疗程序被认为是不可预测的，并且对没有骨关节炎变化的年轻患者来说只在有限的时间内有效。因此，大多数患者不寻求治疗，或者被建议尽量推迟治疗。当必须进行治疗时，标准程序是依年龄而定的，并且在全关节或部分关节置换术、软骨块或软骨细胞移植或骨髓刺激技术(例如微裂手术)之间也有所不同。微裂手术是一种涉及穿刺软骨下骨以通过骨髓干细胞刺激软骨沉积的廉价及常见的程序。但是，这种技术已被证明不能充分修复软骨缺陷，并且形成的新软骨主要是纤维软骨，这导致修复组织的寿命很短。事实上，纤维软骨不具备与透明关节软骨同样的生物力学性质，并经常缺乏与周围软骨的适当的横向整合。因此，新合成的纤维软骨可能更容易损坏(预计期限：5-10年)。对于骨关节炎(OA)患者来说，上述软骨修复技术都没有用。其他非手术治疗主要包括物理治疗、生活方式改变(如减少体重)、支持装置、口服药物(如非类固醇抗炎药)、注射药物(如透明质酸和肾上腺皮质激素)和食品补充剂。所有这些治疗都不能阻止OA病情的进展。如果疼痛疗法也失效，患者的选择就只剩下手术，例如关节置换术或膝关节胫骨高位截骨术。胫骨或股骨截骨术(切开骨骼以使关节磨损重建平衡)可减轻症状，有助于维持积极的生活方式，延缓对全关节置换的需求。全关节置换可改善晚期骨关节炎症状，但一般需显著地改变患者的生活方式和/或活动水平。目前可用的药物疗法主要用于缓解疼痛。市场上目前还没有能够修复软骨损伤的疗法(见Lotz，2010)。白细胞介素-1α(IL-1α)和白细胞介素-1β(IL-1β)是天然存在的I型IL-1受体(IL-1RA)的激动剂。促炎细胞因子如IL-1的过度表达已被证明在诸如类风湿性关节炎(RA)(Bingham，2002)或骨关节炎(OA)(Lee等，2013)的免疫炎性疾病的发病机制中起主要作用。已用阿那白滞素(KineretTM)研究了拮抗IL-1α和IL-1β在RA中的临床应用，阿那白滞素(KineretTM)是人IL-1ra的重组非糖基化形式。这种治疗性蛋白质的使用降低了RA患者关节损伤的频率和严重程度(Bresnihan,2002；St.Clair,2002)，并且缓解了疼痛(Mertens等,2009)。该分子已于2001年获得批准用于治疗某些类型的RA。虽然OA也涉及IL-1，但与安慰剂相比，阿那白滞素疗法与OA症状的改善并无显著关联，但有研究发现，与安慰剂相比，150mg的阿那白滞素往往可缓解疼痛(Chevalier等,2009)。成纤维细胞生长因子18(FGF-18)是成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族的成员，其与FGF-8和FGF-17密切相关。FGF-18已被证明是软骨细胞和成骨细胞的增殖剂(Ellsworth等,2002；Shimoaka等,2002)。FGF-18已被建议单独(WO2008/023063)或与透明质酸结合(WO2004/032849)用于治疗诸如骨关节炎和软骨损伤的软骨疾病。已有多种关于FGF18的给药方案的建议。例如，Moore等(2005)公开了每周两次、持续3周的给药，而WO2008/023063教导了每周一次、持续3周的给药。后一给药方案已经过临床试验研究(详情请参阅例如NCT01033994、NCT00911469及NCT01066871)。虽然WO2008023063中描述的给药方案在关节软骨修复中获得了良好的效果，但仍有发生急性滑膜炎的风险。因此，需要一种用于降低与治疗相关的发生急性滑膜炎的风险、并提高患者对关节内注射的耐受性、同时维持对软骨疾病的疗效的方法，所述疗效主要是通过软骨细胞增殖和随后的软骨修复来实现的。所述方法应当不仅能够修复关节软骨而尽可能不发生滑膜炎，而且能够重新形成新的具有良好性能的软骨(即，主要是透明软骨)。实际上，所述透明软骨的形成在作为治疗剂以及作为生物基质的成分两方面都是有价值的(Getgood等,2010)。还需要一种用于缓解疼痛/改善功能、同时维持对软骨疾病的疗效的方法。实际上，疼痛不仅经常与软骨疾病有关，而且是这些疾病的临床诊断的主要症状。技术实现要素：本发明的目的是提供一种用于治疗患有软骨疾病的患者的方法，所述方法包括施用FGF-18化合物，其中，所述FGF-18化合物在每个治疗周期中至少给药两次，所述给药相隔约2周，优选地相隔2周(每两周给药)。在一个优选实施例中，所述给药相隔固定的间隔，每个间隔为约2周。优选地，所述FGF-18化合物以固定的间隔每两周给药一次。本发明还提供一种用于治疗患有软骨疾病的患者的FGF-18化合物，其中，所述FGF-18化合物在每个治疗周期中至少给药两次，所述给药相隔约2周，优选地相隔2周(每两周给药)。在一个优选实施例中，所述给药相隔固定的间隔，每个间隔为约2周。优选地，所述FGF-18化合物以固定的间隔每两周给药一次。优选地，所述施用的FGF-18化合物是在本文中称为trFGF-18(或sprifermin)的FGF-18片段，剂量学周期为每次关节内注射3至300微克、每2周一次、连续给药3次(一个治疗周期)。在作为一个整体的本发明的上下文中，任何使用FGF-18化合物的治疗(或任何治疗方法)还可包括施用对症状(疼痛和功能)有效的抗炎药，例如阿那白滞素或双氯芬酸。优选地，所述给药与所述FGF-18化合物的给药同时进行。如果需要抗炎药，则所述抗炎药在每个治疗周期中至少与所述FGF-18化合物同时给药两次，所述给药相隔约2周，优选地相隔2周(每两周给药)。优选的，所述抗炎药是阿那白滞素或双氯芬酸，剂量学周期为每次给药0.01至500毫克、每2周一次、连续给药3次(一个治疗周期)。在一个优选实施例中，可在前一个治疗周期的最后一次注射若干个月后重复该治疗周期(单独施用FGF-18化合物或结合对症状(疼痛和功能)有效的抗炎药)，例如在2、4或6个月后或甚至1年后。在本发明的优选实施例中，待治疗的软骨疾病是关节炎，例如骨关节炎，或者已经或未经手术干预(例如微裂手术)的软骨损伤。发明人意外地发现，本发明的方法和用途显著地改善软骨修复并刺激软骨细胞的增殖，同时提高患者对关节内注射的耐受性。发明人还意外地发现，当阿那白滞素或双氯芬酸与FGF18一起使用时，能够有效地恢复FGF-18化合物的增殖活性。与其他给药方案相比，本发明的另一个优点是减少了滑膜炎。定义本说明书所用的术语“FGF-18化合物”或“FGF-18”，意指保持人FGF-18蛋白的至少一种生物活性的蛋白质。FGF-18可以是天然的、以其成熟形式、重组形式或截短形式存在。人FGF-18蛋白的生物活性特别包括软骨细胞或成骨细胞增殖的增加(见W098/16644)或软骨形成的增加(见W02008/023063)。天然的即野生型人FGF-18是由关节软骨的软骨细胞表达的蛋白质。W098/16644将人FGF-18首次指定为zFGF-5并加以充分描述。SEQIDNO:1对应于天然人FGF-18的氨基酸序列，其信号肽由氨基酸残基1(Met)-27(Ala)组成。成熟形式的人FGF-18对应于SEQIDNO:1的残基28(Glu)-残基207(Ala)的氨基酸序列(180个氨基酸)。在本发明中，FGF-18可由重组方法产生，例如专利申请W02006/063362所教导的方法。根据表达系统和条件，在本发明中FGF-18在重组宿主细胞中表达并具有起始甲硫氨酸(Met)残基或具有分泌信号序列。当在原核宿主(如大肠杆菌)中表达时，FGF-18在其序列的N-末端包含一个额外的Met残基。例如，在大肠杆菌中表达时，人FGF-18的氨基酸序列以N端(位置1)的Met残基开始，接着是SEQIDNO:1的残基28(Glu)-残基207(Ala)。本说明书所用的术语“截短形式”的FGF-18，指的是包含或由SEQIDNO:1的残基28(Glu)-196(Lys)组成的蛋白质。优选地，FGF-18蛋白的截短形式是命名为“trFGF-18”的多肽(170个氨基酸；又称为rhFGF18或sprifermin)，它以Met残基开始(N-末端)，接着是野生型人FGF-18的氨基酸残基28(Glu)-196(Lys)。trFGF-18的氨基酸序列见于SEQIDNO:2(SEQIDNO:2的氨基酸残基2-170对应于SEQIDNO:1的氨基酸残基28-196)。trFGF-18是一种在大肠杆菌中产生的截短形式的重组人FGF-18(见W02006/063362)。已证明FGF-18显示与成熟人FGF-18类似的活性，例如，它增加软骨细胞的增殖和软骨的沉积，导致多种软骨组织的修复和重建(见W02008/023063)。本说明书中所用的术语“对症状(疼痛和功能)有效的抗炎药”或“抗炎药”，指的是对与待治疗的软骨疾病相关的症状(例如疼痛和功能)有效的抗炎药。根据本发明使用的优选“抗炎药”是阿那白滞素和双氯芬酸。阿那白滞素是人白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)的重组非糖基化形式。其商品名为其序列对应于SEQIDNO.3。双氯芬酸(2-(2,6-二氯苯胺)苯乙酸)是一种公知的药物，其用于减少炎症和在某些情况下作为缓解疼痛的镇痛剂。其有多个商品名。“约2周”或“约每2周”中的“约”包括相隔2周(14天)的给药，以及相隔2周+/-数天(例如，+/-1、2、3天)的给药。实际上，应当理解的是，从实际的角度来看，FGF-18化合物(例如trFGF-18)的给药不可能总是按准确的间隔进行，例如，在上一次给药的正好2周(14天)后进行。因此，在本发明的上下文中，2周的意思可以是14天，但也可以是上一次给药的11、12、13、15、16或17天后，以方便患者。在本发明的上下文中，“2周”的意思与“每2周”、“每隔一周”或“每两周”类似，这些词可互换使用(图1)。当提及“星期几”(例如，第一次注射在星期一进行，下一次注射在2周后的星期一进行)或提及“日期”(例如，第一次注射在8月1日进行，下一次注射在8月15日进行)时，均可使用“2周”。“治疗周期”或“周期”指一段时间，在这段时间中每2周施用FGF-18化合物(连续给药)。例如，一个治疗周期可包括3次间隔2周的注射。这种“治疗周期”可以重复进行。例如，可在上一个周期的最后一次注射的2、3、4、5或6个月后进行第二个“治疗周期”。或者，可在第一个周期的第一次注射的1年或2年后进行第二个周期。例如，第一个治疗周期可包括3次间隔2周的注射，在该周期的最后一次注射的3个月后，进行包括3次间隔2周的注射的第二个治疗周期。本说明书所用的“软骨疾病”，包括由于诸如外伤的损伤、软骨病或关节炎造成的损害而引起的病症。可以通过施用本说明书所描述的FGF-18制剂来治疗的软骨疾病的例子包括(但不限于)关节炎(如骨关节炎)和软骨损伤。该术语也包括软骨或关节的退化性疾病/病症，例如软骨钙质沉着病、多软骨炎、复发性多软骨炎、强直性脊柱炎或肋软骨炎。国际软骨修复学会提议了一种评估软骨缺陷的严重程度的关节镜评级系统：0级：(正常)健康软骨，1级：软骨有软点或水疱，2级：软骨中可见微小裂口，3级：损伤有深裂缝(超过软骨层的50％)，以及4级：软骨裂口暴露下层(软骨下)骨头(见http://www.cartilage.org/_files/contentmanagement/ICRS_evaluation.pdf第13页)。本说明书所用的术语“关节炎”包括诸如以下的疾病：骨关节炎，类风湿性关节炎，幼年型类风湿关节炎，感染性关节炎，牛皮癣关节炎，斯蒂尔病(幼年型类风湿关节炎的发病)或剥脱性骨软骨炎，优选地包括软骨受损的疾病或病症。所用的术语“骨关节炎”或“OA”意指关节炎的最常见形式。术语“骨关节炎”包括原发性骨关节炎和次发性骨关节炎(例如，见TheMerckManual,第17版，第449页)。骨关节炎可由软骨断裂而引起。软骨的小片可能折断并导致骨头之间的关节疼痛和肿胀。随着时间的推移，软骨可以完全磨损，骨头会相互摩擦。骨关节炎可累及任何关节，但通常涉及手、肩及负重关节，如髋、膝、脚和脊柱。在一个优选的实施例中，骨关节炎可以是膝骨关节炎或髋骨关节炎。该术语主要包括根据OARSI分类系统可分类为第1期至第4期或第1级至第6级的骨关节炎形式。本领域技术人员熟知本领域中使用的骨关节炎分类，特别是所述OARSI评估系统(又称OOCHAS；例如，参阅Custers等，2007)。骨关节炎是可通过施用本发明的FGF-18化合物进行治疗的优选的软骨疾病之一。本说明书所用的术语“软骨损伤”主要是指由创伤引起的软骨疾病或软骨受损。软骨损伤主要可在创伤性机械破坏、特别是事故或手术(例如微裂手术)后发生。该术语“软骨损伤”还包括软骨或骨软骨骨折和半月板损伤。该定义还包括与运动有关的损伤或与运动有关的关节组织的磨损。该术语还包括微损伤或钝伤、软骨断裂、骨软骨断裂或半月板损伤。在本发明的上下文中，治疗的“疗效”可基于软骨厚度的变化来测量，例如关节的关节软骨的厚度。例如，可以通过X射线计算机断层扫描、磁共振成像(MRI)或超声波测量来测量该厚度。发明的详细说明本发明提供使用FGF-18化合物治疗诸如骨关节炎和软骨损伤的各种软骨疾病的给药方案。优选地，所述FGF-18化合物是如上述定义的trFGF-18。在本发明的上下文中已证明，当根据本发明的方法和用途给药时，FGF-18化合物对软骨疾病的病情或症状的改善具有最佳的效果。发明人意外地发现，本发明的给药方案(即：给药频率低于每个治疗周期三周、每周一次)能够减少下一次注射期间的炎症(例如，急性滑膜炎)，因此能够发挥FGF-18化合物的全部活性。这一发现是出人意料的，因为FGF-18在关节中的半衰期是很短的(小于24小时)。在作为一个整体的本发明的上下文中，任何使用FGF-18化合物的治疗(或任何治疗方法)还可包括施用对症状(疼痛和功能)有效的抗炎药，例如阿那白滞素或双氯芬酸。优选地，所述给药(或联合给药)与所述FGF-18化合物的给药同时(即同步)进行。在一个实施例中，本发明提供一种用于治疗患有软骨疾病的患者的方法，所述方法包括施用FGF-18化合物，其中，所述FGF-18化合物在每个治疗周期中至少给药两次，所述给药相隔约2周，优选地相隔2周(即每2周、每隔一周或每两周)。所述FGF-18化合物优选为trFGF-18。在一个优选实施例中，FGF-18化合物可在每个治疗周期中以2周或约2周的固定间隔给药3次(即：每个治疗周期3次，固定间隔为2周或每2周一次)。所述治疗可包括每年进行1、2或3个治疗周期。可在施用所述FGF-18化合物的同时施用抗炎药，例如阿那白滞素或双氯芬酸。本发明的另一个方面提供一种用于治疗患有软骨疾病的患者的FGF-18化合物，其中，所述FGF-18化合物在每个治疗周期中至少给药两次，所述给药相隔约2周，优选地相隔2周。所述FGF-18化合物优选为trFGF-18。在一个优选实施例中，所述FGF-18化合物在每个治疗周期中以2周或约2周的固定间隔给药3次(即：每个治疗周期3次，固定间隔为2周或每2周一次)。所述治疗可包括每年进行1、2或3个治疗周期。可在施用所述FGF-18化合物的同时施用对症状(疼痛和功能)有效的抗炎药，例如阿那白滞素或双氯芬酸。根据本发明，所述FGF-18化合物的给药(单独给药或结合诸如阿那白滞素或双氯芬酸的抗炎药)以固定间隔进行，但+/-数天的微小变动是允许的(优选地不超过3天)。例如，在给药相隔约2周的情况下，如果治疗周期的第一次给药在星期二进行，则第二次给药可在第一次给药的2周后的星期二进行(固定间隔)，或者在其前几天或后几天进行(例如，之前的星期一或之后的星期四)。类似地，例如，如果第一次给药在8月1日(例如，星期一)进行，则第二次给药可在8月15日(星期一)、即第一次给药的2周后进行(固定间隔)，或者在其前几天或后几天进行(例如，8月15日之前的星期五或星期六，或8月15日之后的星期二或星期三)。这种灵活性使得给药方案的限制更少、更方便患者。优选地，以固定的间隔进行给药，例如，每2周给药。在一个优选实施例中，所述给药相隔2周(即每两周给药)。在作为一个整体的本发明的上下文中，所述FGF-18化合物在每个治疗周期中至少给药两次。也可在每个周期中例如至少给药3次或至少给药4次。优选地，在每个治疗周期中给药3次或4次。在一个优选实施例中，所述FGF-18化合物(单独给药或结合诸如阿那白滞素或双氯芬酸的抗炎药)在每个治疗周期中连续给药至少2次、至少3次或至少4次。在一个更优选的实施例中，所述FGF-18化合物(单独给药或结合诸如阿那白滞素或双氯芬酸的抗炎药)在每个治疗周期中连续给药2次、3次或4次。在一个更优选的实施例中，连续给药3次。在作为一个整体的本发明的上下文中，所述治疗可包括每年进行数个治疗周期，例如每年进行1、2或3个治疗周期。在一个优选实施例中，所述治疗包括每年进行2个治疗周期。或者，所述治疗包括每年进行1个治疗周期，并在第一个治疗周期开始的1年或2年后重复。例如，如果治疗包括1个周期，所述治疗可包括以2周的间隔进行3次注射。又例如，如果治疗包括至少2个周期，第一个治疗周期可包括以2周的间隔进行3次注射，并在该周期的最后一次注射的数个月后进行包括以2周的间隔进行3次注射的第二个治疗周期。优选地，本发明的FGF-18化合物选自由以下组成的组：a)包括人FGF-18成熟形式或由人FGF-18成熟形式组成的多肽，所述人FGF-18成熟形式包括SEQIDNO：1的残基28-207，或者b)包括FGF-18(170个氨基酸)(SEQIDNO：2)或由FGF-18(170个氨基酸)(SEQIDNO：2)组成的多肽。具体地说，所述化合物选自人野生型成熟FGF-18或trFGF-18。所述化合物增加软骨沉积并允许软骨修复。在另一个优选实施例中，所述治疗包括在每次关节内给药中以3-600微克(μg或mcg)、优选为3-300μg、或优选为10-200μg、或更优选为30-150μg、或更优选为30-120μg的剂量施用所述FGF-18化合物。在一个优选实施例中，所述治疗包括在所述FGF-18化合物的每次关节内给药中，以约3、10、20、30、40、50、60、90、100、120、150、180、200、240或300μg的剂量给药。所述FGF-18化合物的每次关节内给药优选的剂量包括10、20、30、60、90、120、180、240或300μg。应理解的是，取决于待治疗的患者是人还是非人类哺乳动物，FGF-18化合物的给药剂量会有所不同。例如，狗的剂量优选地比人的剂量低5倍。例如，如果人的剂量为每次关节内给药30至120μg，则狗的剂量可为每次关节内给药5至20μg。在实施例部分中给出了鼠和兔的剂量的例子。在作为一个整体的本发明的上下文中，所述FGF-18化合物可结合对症状(疼痛及功能)有效的抗炎药使用。优选的抗炎药是阿那白滞素(见SEQIDNO.3)或双氯芬酸。当施用阿那白滞素或双氯芬酸中的任一个时，所述治疗包括在每次给药中以0.01-500毫克(mg)、优选为0.1-250mg、或更优选为0.5-150mg的剂量通过关节内注射(施用例如阿那白滞素的优选方式)或通过口服(施用例如双氯芬酸的优选方式)施用所述抗炎药。在一个优选实施例中，所述治疗包括在每次所述抗炎药的给药中以约0.03、0.1、0.25、0.3、0.5、1、1.5、2、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或300mg的剂量给药。每次给药优选的剂量包括0.5、1、5、1.5、10、50、100及150mg。应理解的是，取决于待治疗的患者是人还是非人类哺乳动物，FGF-18化合物的给药剂量会有所不同。例如，狗的剂量优选地比人的剂量低6倍。例如，如果人的剂量为每次关节内给药150mg阿那白滞素，则狗的剂量可为每次关节内给药25mg。医生会根据患者的情况以及施用的抗炎药来具体地调整抗炎药的给药方案。例如，口服双氯芬酸的给药方案可为50或75mg、每天两次或三次。FGF-18化合物可配制成药物组合物，即与药学上可接受的载体、赋形剂或类似物一起。“药学上可接受的”的定义是指包括任何不干扰活性成分的生物活性的有效性、并且对给药的患者无毒性的载体、赋形剂或类似物。例如，对于肠胃外给药，活性蛋白可以例如盐水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer溶液为载体配制成注射用单位剂量的形式。用于关节内注射的制剂将符合大部分也适用于其他注射制剂的要求，即必须是无菌的，并且必须与应用部位(例如，膝关节，滑液)的生理条件相容。用于关节内注射的赋形剂也可存在于其它注射制剂中，例如用于肌肉内注射或皮下注射的制剂。这种包括至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或类似物的FGF-18化合物的制剂在此也称为“FGF-18组合物”或“FGF-18制剂”。所述“FGF-18组合物”或“FGF-18制剂”也在本发明的上下文中使用。如果抗炎药(例如阿那白滞素或双氯芬酸)与FGF-18化合物一起使用，可在给药前将所述抗炎药加入到FGF-18化合物制剂中，或者使用2个不同的注射器/针头进行联合给药，或使用2个不同的注射器但优选地使用同一个针头进行联合给药以方便患者。或者，可通过口服或任何其他给药方式施用所述抗炎药。FGF-18化合物，例如trFGF-18，以及包括FGF-18化合物的组合物(“FGF-18组合物”)可用于治疗软骨疾病。具体来说，可用于治疗例如由表浅纤毛化(早期骨关节炎)引起的滑膜关节中的关节软骨缺损、由骨关节炎引起的软骨退化、以及由损伤或疾病引起的软骨或骨软骨缺损。FGF-18化合物和组合物还可用于治疗由剥脱性骨软骨炎引起的关节疾病和退行性关节病。在重建和整容手术领域中，FGF-18化合物和组合物可用于为大范围组织缺损的重建而进行的自体或同种异体软骨扩张和转移。FGF-18组合物可与关节灌洗、骨髓刺激、磨损关节造形术、软骨下钻孔、或软骨下骨的微裂手术结合，用于修复软骨损伤。可选的与对症状(疼痛和功能)有效的抗炎药(例如阿那白滞素或双氯芬酸)结合的联合给药，可减轻与待治疗的软骨疾病相关的疼痛。在一个优选实施例中，根据本发明的待治疗的软骨疾病是骨关节炎，例如膝关节骨关节炎或髋关节骨关节炎。待治疗的骨关节炎例如但不限于原发性骨关节炎或继发性骨关节炎，以及按照OARSI分类系统分类为第1期至第4期或第1级至第6级的骨关节炎。在另一个优选实施例中，根据本发明的待治疗的软骨疾病是已经或未经手术干预(例如微裂手术)的软骨损伤。此外，在施用FGF-18组合物(单独施用或与诸如阿那白滞素或双氯芬酸的抗炎药一起施用)而引起的软骨生长之后，可能需要进行手术治疗，以适当地调整新形成的软骨表面的轮廓。在一个优选实施例中，所述治疗包括FGF-18化合物或FGF-18组合物的关节内给药，所述给药单独进行或者与诸如阿那白滞素或双氯芬酸的对症状(疼痛和功能)有效的抗炎药一起进行。FGF-18化合物或FGF-18组合物可单独或与诸如阿那白滞素或双氯芬酸的抗炎药一起，直接注射到关节的滑膜液中或缺损处，所述注射可单独进行，或者与合适的载体混合，以实现蛋白质的延长释放(例如缓释制剂)或限制性局部释放。优选地，本发明所述的单独进行或者与诸如阿那白滞素或双氯芬酸的抗炎药一起进行的FGF-18化合物的给药方式选自由以下组成的组：滑膜周围给药，滑膜内给药，关节周围给药，关节内给药。在一个优选实施例中，本发明所述的FGF-18化合物的给药通过关节内给药单独进行或者与诸如阿那白滞素或双氯芬酸的抗炎药一起进行。优选地，所述抗炎药通过关节内给药(阿那白滞素的优选方式)或通过口服给药(双氯芬酸的优选方式)。所述关节内给药在选自以下的关节中进行：髋，膝，肘，腕，踝关节，脊柱，脚，手指，脚趾，手，肩，肋骨，肩胛骨，大腿，小腿，脚跟以及沿脊柱骨点的关节。在另一个优选实施例中，所述关节内给药在髋或膝关节中进行。附图说明图1：治疗时间表略图。图1a：每周一次的给药方案；图1b：每月(或每4周)一次的给药方案；图1c：每月(或每4周)一次的给药方案，允许+/-数天的变动以方便患者。图2：FGF-18化合物引起大鼠OA模型中的剂量依赖的关节基质沉积，通过番红O染色定量。图3：不包括股骨的总关节分数图4：总关节分数图5：实质性胫骨软骨变性宽度图6：以IL1α刺激或不刺激并立即施用(A)或延后6小时后施用(B)100ng/mLrhFGF-18和/或100ng/mL阿那白滞素的猪软骨细胞培养8天后的细胞浓度。(A)中N＝4，(B)中N＝6。图7：血清α2MG水平随时间的变化图8：目标膝盖(OA关节)与对侧关节(健康膝盖)之间的关节直径的AUC(曲线下的面积)的差别随时间的变化图9：胫骨内侧的软骨体积(mm3)序列描述：SEQIDNO.1：天然人FGF-18的氨基酸序列。SEQIDNO.2：重组截短FGF-18(trFGF-18)的氨基酸序列。SEQIDNO.3：重组人iIL-1受体拮抗剂(阿那白滞素)的氨基酸序列。实施例材料以下实施例中的重组截短FGF-18(trFGF-18)根据专利申请WO2006/063362中所描述的技术通过大肠杆菌中的表达来制备。在以下实施例中，trFGF-18和FGF-18可互换使用。重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(阿那白滞素)购买自Phartmacia。关节的评分处死后，将右膝移除并在5％甲酸中脱钙4-6天，然后在冠状面中对切并以石蜡包埋。以200微米的间隔切出三个截面，以甲苯胺蓝染色，并使用ImageProPlusTM软件(MediaCybernetics)进行分析。在对关节的三个截面评分时，每个载玻片上的两个半体的最差的状况被确定为软骨病变的软骨变形宽度(μm)。这反映了胫骨软骨病变的面积，其中软骨细胞和蛋白聚糖的损失延伸软骨厚度的≥50％。在胫骨表面的三个区域中的每一个中具有最严重的病变的区域中进行所述测量。确定每个评分和测量的治疗组平均值±SE。使用单向方差分析(单向ANOVA)或Kruskal-Wallis检验(非参数)以及合适的测试后多重比较对数据进行分析。使用学生t检验比较右膝与左膝的卡尺测量结果。除非特别说明，BolderBioPATH,Inc.只对原始数据(未经转换)进行统计学分析。统计检验对数据的正态性和方差齐性做出某些假设，如果测试结果与这些假设相矛盾，则可能需要进一步的分析。所有检验的显著性设定为p≤0.05。在每一组与赋形剂对照组之间、以及对之间进行比较。实施例1方法：在10-15周龄的雄性Lewis大鼠中进行不稳定诱导OA的前交叉韧带切断与内侧半月板切除(ACLT+TMX)模型。简要地说，在异氟醚麻醉下，打开每只大鼠的右膝的关节囊，快速切断前交叉和半月板固定韧带，除去半月板，通过缝合封闭关节囊、肌肉和皮肤。将动物随机分为10组，每组n＝10。研究了以下剂量：每次关节内注射0、0.3、1、3和10μg。第1-5组接受一个治疗周期，包括每周一次的三次注射，第6-10组接受每月一次的三次注射。手术的三周后开始关节内治疗。这时已可见诸如软骨基质损失的病理生理变化。手术的17周后对动物施行安乐死并对关节进行研究。结果：1μg/关节的trFGF-18诱导了软骨组织的剂量依赖性新形成(在侧部胫骨中可见)，并与注射方案无关(见图2a)。根据每周一次的给药方案1μg/关节的trFGF-18诱导了软骨组织的剂量依赖性新形成(在胫骨内侧可见)，而根据每月一次的给药方案0.3μg/关节的trFGF-18诱导了软骨组织的剂量依赖性新形成(在胫骨内侧可见)。实施例2方法：雄性Lewis大鼠接受手术(在异氟醚麻醉下)以在右膝关节中诱导内侧半月板撕裂。按照两个不同给药方案(见下表)之一对动物关节内施用赋形剂或FGF-18，然后在第105天处死动物。在基线及第21、42、56、84和105天对膝盖进行卡尺测量。在基线、第21和105天以及最后一次给药(第42或84天)一周后评估血清的α2巨球蛋白水平。收集右膝以进行组织病理学评估。表1:治疗组组别大鼠数量治疗(每50μl10μg)110正常+赋形剂d21,35,49210手术+赋形剂d21,35,49310手术+FGF-18d21,28,35(每周治疗)410手术+FGF-18d21,35,49(双周)510手术+FGF-18d21,49,77(每月治疗)610手术+FGF18d21,35710手术+FGF18d21,77结果和结论：所有动物术后从麻醉中苏醒后都立即恢复负重。所有动物在研究过程中都获得体重增加，体重的变化在组别之间没有显著差别。在注射FGF-18后，由卡尺测量的膝盖直径以及血清的α2巨球蛋白水平增加，但在本研究中使用这些参数未观察到某个特定治疗方案与其他方案相比具有明显的优势。相比之下，每月注射的方案带来的结构上的优势是最大的(图3、4、5)。每两周一次的注射也是有前景的，其也取得了令人感兴趣的结构上的改善。整体来说，本研究的结果显示，使用FGF-18的治疗显著地增加了第一次注射后被治疗的膝盖中的肿胀而与给药方案无关。组织病理学评估显示，治疗大体上增大了胫骨表面上的损伤的范围，特别是胶原质损伤的范围，但减小了其严重程度。这种效果在接受了三次而不是两次给药的治疗组中、以及在最迟时点(第77天)接受最后一次给药的治疗组中最为明显。治疗还有若干其他副作用，包括软骨肥大、滑膜炎、和滑膜纤维化。这些变化在快速地连续接受了三次给药的动物(第3和4组)中最为明显和严重，而在只接受了两次给药(第6和7组)或者在较长的时间范围内接受给药(第5组)的动物中变化稍微不那么严重。结果具有最好的整体形态的治疗方案是三次每月一次的注射(第4组；在第21、49、和77天注射)，这表明给药之间留有一定的恢复时间是有益的。此外，三次每2周一次的注射(第5组；在第21、35、和49天注射)的结果也具有良好的整体形态。实施例3方法：本研究使用60只雄性空白新西兰白兔。动物的年龄约3-4个月。对兔子进行手术，以构建软骨缺损的右膝。在滑车沟的关节软骨中构建2mm乘6mm全厚度缺损。使用18号针头构建微裂。穿过缺损的基部处的软骨下骨构建了两个3mm深的微裂，一个在近端，一个在远端。每个微裂的直径约为1.5mm，孔洞之间相隔2mm。实验包括以下六个治疗组，每组10只动物，共60只兔子(表2)。第3、4、5和6组中的兔子通过关节内施用rhFGF-18治疗，给药方案为一个周期包括三次每周一次的注射，每次注射100μg的rhFGF-18(第3和5组)，或者一个周期包括三次每月一次的注射，每次注射100μg的rhFGF-18(第4和6组)。所有动物在手术的6个月后处以安乐死并进行尸检。表2:治疗组结果：尸检结果(表3)：第5组动物和第6组动物的ICRS总软骨分数分别为1.9+/-0.3SE和2.4+/-0.2SE，说明每月注射的方案与每周注射的方案相比具有优势。在第6组动物中，有3/10的动物的髁间沟被填满细颗粒状至颗粒状的软骨，其余7/10的动物的髁间沟被填充50％至完全填满颗粒状至粗颗粒状的软骨。总结而言，通过每周一次或每月一次的单独给药或结合微裂手术，注射rhFGF-18导致股骨髁区域和增厚或扩大，以及髁间沟病灶中的粗糙或粗颗粒状软骨的增殖，内侧和外侧滑车脊上的骨赘的刺激、偶尔的胫骨平台骨赘形成、或滑膜脂肪垫中的髌骨上或髌骨附近的异常软骨生长。不进行微裂手术时的病理形态学：进行了三个月每月一次的rhFGF18治疗的动物的右股骨病灶部位具有显著增加的缺损填充百分比(48％)，这导致缺损填充分数显著提高了49％。其他分数非显著性地提高了20-23％。沟病灶的总宽度非显著性地增加了36％，而不具有活软骨的病灶的宽度显著减小了94％。所有部位均有从轻微至严重的、大体上为局灶性的、并且通常伴有纤维软骨的退化。中央MFC厚度显著增加了120％。进行微裂手术时的病理形态学：进行了微裂手术但未经治疗的对照组中的软骨病灶区部位具有整体上轻度重建的骨软骨交界、轻度减少的基质染色、以及50％的缺损填充。细胞形态主要是纤维软骨。进行了三周每周一次的rhFGF18治疗的动物的病灶区部位在所有评分参数以及缺损填充百分比中都有44-69％的显著提高(趋向正常)。总分数显著提高了53％。沟病灶的总宽度轻微增加了5％，而不具有活软骨的病灶的宽度(非显著性地)减小了59％。所有部位具有软骨肥大。这些部位的中央MFC厚度显著增加了112％。进行了三个月每月一次的rhFGF18治疗的动物的病灶区部位在所有评分参数以及缺损填充百分比中都有61-97％的显著提高(趋向正常)。总分数显著提高了76％。沟病灶的总宽度和不具有活软骨的病灶的宽度分别非显著性地减小了19％和69％。所有部位具有软骨肥大。这些部位的中央MFC厚度显著增加了106％。结论：异常临床体征轻微，并与膝盖手术之后和/或重复的样本收集(从侧耳脉收集血样或从膝关节收集滑液)导致的兔子的常见异常临床体征一致。第1组和第2组动物的髁间沟愈合的比较显示髁间沟中良好而自发地填充了总体上看似软骨的物质。有迹象表明微裂手术可能促进髁间沟中的软骨再生长，因为第2组中9/10的动物的髁间沟填充了软骨，而第1组中只有7/10的动物的髁间沟填充了软骨，但这个差别是轻微的。同样，两组之间的ICRS或骨赘分数没有差别，因此软骨愈合的质量是好的，两组中都几乎没有刺激骨赘形成。在其余的使用rhFGF18治疗的组中，第4组(髁间沟，三个月每月一次关节内注射100μgrhFGF18)的反应似乎是最好的，有6/9的动物的髁间沟填充了总体上看接近正常至轻微粗糙或颗粒状的软骨。此外，第4组的ICRS软骨分数(2.1+/-0.3)是使用rhFGF18治疗的四个组中第二低的，并且该组具有所有rhFGF18组中最低的骨赘分数(3.8+/-0.8)。相比之下，第6组(髁间沟，微裂手术，三个月每月一次关节内注射100μgrhFGF18)中只有3/10的动物具有髁间沟填充，其ICRS分数是所有组中最高的(2.4+/-0.2)，其骨赘分数是所有rhFGF18治疗组中第二高的(5.1+/-0.7)。此外，第5组(髁间沟，微裂手术，三周每周一次关节内注射100μgrhFGF18)的骨赘分数是所有组中最高的(5.7+/-0.7)。当以延长的时间长度进行治疗时，可取得较大的有益效果，且所述效果在进行了微裂手术的兔子中比在未进行微裂手术的兔子中更为明显。实施例4方法：从猪臀部的股骨头软骨分离猪软骨细胞(猪约一岁)。关节解剖后，收集软骨并在室温下的胶原酶0.25％(将胶原酶NGB42.5％用HAM’sF12稀释10倍)中消化45分钟。将松弛的细胞丢弃，并将软骨在37℃的胶原酶0.1％(将胶原酶NGB42.5％用HAM’sF12稀释25倍)中消化过夜以提取软骨细胞。在本研究中，软骨细胞以单层培养。用10ng/mLIL1α刺激原生关节猪软骨细胞，或不进行刺激，并立即或在6个小时后施用100ng/ml阿那白滞素和/或100ng/mltrFGF-18。每种条件进行4或6个重复实验。作为对照，单独用阿那白滞素、单独用trFGF-18或不用任何药物(培养基)培养细胞。预培养：在细胞分离之后，以20000细胞/cm2接种猪软骨细胞，并在完整HAM’sF12中培养一周。然后用accutase收集细胞，计数并按以下描述的方式使用。直接施用阿那白滞素的细胞：在24孔板上以15000细胞/孔在0.5mL完整HAM’sF12中接种软骨细胞。然后，向细胞添加0.25mL400ng/mL的trFGF-18和/或0.25mL400ng/mL的阿那白滞素。在处理样本中，还向细胞添加10μL1000ng/mL的IL1α。trFGF-18、阿那白滞素和IL1α均以完整HAM’sF12稀释。培养孔中的最终体积用完整HAM’sF12调整至1mL。最终浓度为10ng/mLIL1α,100ng/mLtrFGF-18及100ng/mL阿那白滞素，总培养时间为八天。在4天后进行培养基完全更换。N＝4。在IL1α处理后6小时施用阿那白滞素和trFGF-18的细胞：在24孔板上以15000细胞/孔在包含或不包含10ng/mLIL1α的1mL完整HAM’sF12中接种软骨细胞。6小时候，移除培养基，并替换为0.25mL400ng/mL的trFGF-18和/或0.25mL400ng/mL的阿那白滞素。在处理样本中，还向细胞添加0.25mL40ng/mL的IL1α。trFGF-18、阿那白滞素和IL1α均以完整HAM’sF12稀释。培养孔中的最终体积用完整HAM’sF12调整至1mL。最终浓度为10ng/mLIL1α,100ng/mLtrFGF-18及100ng/mL阿那白滞素，总培养时间为八天。在4天后进行培养基完全更换。N＝6。培养八天后，用accutase收集细胞，所得细胞悬浮液用ViCellTM细胞分析仪(购自BeckmanCoulter)分析细胞浓度和细胞活力。统计分析以单向ANOVA进行，并随后进行Dunnett事后分析。结果和结论：与预计相同，在没有IL1α的情况下，rhFGF18增加了猪软骨细胞的增殖。与对照组(培养基，无IL1α)相比，在存在100ng/mLrhFGF18的情况下，在培养8天后，两组实验中的细胞数量均有11.25和7.75倍的增加(图6)。但是，在存在10ng/mLIL1α的情况下，与对照组(培养基，IL1α，10ng/mL)相比，两组实验中由rhFGF18刺激的增殖仅分别为2.38和2.44倍。不管是直接施用还是延后施用，100ng/mL的阿那白滞素都能完全恢复rhFGF18的活性。用不含IL1α的rhFGF18培养的细胞的细胞密度与用IL1α处理但施用了阿那白滞素的细胞的细胞密度并无显著差别。最后，单独使用阿那白滞素对软骨细胞的增殖没有效果。本研究证实，100ng/mL的阿那白滞素完全阻断了IL1α对rhFGF18的增殖活性的抑制。这与以下事实一致：阿那白滞素是IL1受体拮抗剂，其阻断由IL1引发的炎症信号。本研究证实了阿那白滞素能够恢复用IL1α处理的猪软骨细胞中的rhFGF18的增殖效果。实施例5方法：雄性Lewis大鼠接受手术以在右膝关节中诱导内侧半月板撕裂。在第21、28、和35天对动物关节内施用FGF-18(10μg/每个关节)，并在第21-23、28-30、和35-37天口服施用双氯芬酸(1mg/kg或3mg/kg)或赋形剂，然后在第42天或第63天处死动物。收集血清并在第-3、21、42、和63天评估血清的α2巨球蛋白(α2MG)水平。α2MG是一种炎症血清生物标记物。α2MG与炎症之间的关联已被证实(Kuribayashi等,2013)。结果：FGF-18+赋形剂对照组在第24天发生轻微至温和肿胀，并在第36天之前增大为严重肿胀，但未见跛行。膝部肿胀从第44天开始轻微减小至相当严重。卡尺测量支持上述结果，在第21天及其后的时间点，右膝与左膝之间有显著的差别，但在基线则没有显著差别。与赋形剂对照组相比，施用了3mg/kg双氯芬酸的动物在第24-29、31、和36-43天的肿胀分数明显较低。膝部卡尺测量结果在第42天明显较低，但在其他时间点则不受显著影响。与赋形剂对照组相比，施用了1mg/kg双氯芬酸的动物在第24-29、31、和36-43天的肿胀分数明显较低。膝部卡尺测量结果在第42天明显较低，但在其他时间点则不受显著影响(数据未示出)。第-3天(手术前)的α2MG水平高于手术后的第21天。在手术前的时间点，与赋形剂对照组相比，施用3mg/kg双氯芬酸的动物中的水平轻微但显著地较低。在治疗前的第21天，所有组中的水平基本相同。在第42天，疾病对照组中的α2MG水平明显升高(约为第21天的水平的四倍)，这明显有别于两个双氯芬酸组。在第63天，所有组的水平又变得接近。(图7)结论：总的来说，基于临床观测和卡尺测量的结果，本研究的结果显示，在具有内侧半月板撕裂并施用了FGF-18的大鼠中施用1或3mg/kg的双氯芬酸显著地减少了膝部肿胀。上述效果在最后一次施用双氯芬酸后可持续约一周。在第-3、21、和63天，血清的α2MG水平与赋形剂对照组接近，但在第42天由于对照组的水平急剧上升而显著较低。实施例6方法：本研究的目的是评估在相同的sprifermin总剂量下(3x1μg)，不同的周期内给药频率对大鼠OA模型中的软骨体积的影响。以实施例1中所述的方法进行前交叉韧带切断(ACLT)与内侧半月板切除(tMx)。本研究施用来自ListerHooded大鼠(200–260g,CharlesRiver)的关节。动物在手术后18周处以安乐死。研究了关节中的变化与OA临床评估(软骨损失、骨赘、软骨下硬化)的相关性。每周、每2周、每3周、每4周或每5周注射盐水中的1μgsprifermin，共注射三次，并与适当的赋形剂组比较。每周研究体重、关节直径和临床健康分数。结果结果显示，关节内注射对体重增加无影响：药物或治疗方案对生前(in-life)参数未见影响。但是，每两周注射盐水的组(n＝4)具有最高的体重增加趋势(数据未示出)。在第3、4和5周进行注射的组的关节直径显著大于在第3、8和13周进行注射的组(见图8)。在每2周、每3周或每4周进行注射的组之间则未见显著差别。在每5周进行注射的组中，关节直径的AUC与盐水注射相同。因此，就趋势而言，关节直径AUC随着注射频率降低而减小。体视学定量组织学分析揭示受影响的关节中有严重的类似OA的变化。rhFGF18基本上阻止了软骨的完全脱落。1μg/每个关节以及每3周一次的注射(共三次注射)导致与盐水相比在药学上有意义及统计上显著的差别(终点：胫骨内侧的软骨体积，见图9)。结论：低于每周一次连续三周的注射频率似乎使得注射后的关节肿胀能更好地恢复。所有施用了rhFGF18的组都显示了结构上的改善，表现为与安慰剂相比较大的软骨体积值。但是，在研究时间固定(所有动物的研究时间相同)和剂量固定的情况下，每3周一次的注射频率取得的结构上的改善是最大的。可以推测，rhFGF18的注射之间较长的间隔是更为有益的，因为与每周一次连续三周的注射方案相比，软骨细胞的增殖可更好地转化成细胞外基质的生成。所得的钟形曲线是生长因子的的疗效测试结果中常见的。参考文献1.Ellsworth等,2002,OsteoarthritisandCartilage,10:308-3202.Shimoaka等,2002,JBC277(9):7493-75003.WO20080230634.WO20040328495.WO98166446.WO20060633627.Custers等,2007,OsteoarthritisandCartilage,15:1241-12488.Lotz,2010,Arthritisresearchtherapy,12:2119.Moore等,2005,OsteoarthritisandCartilage,13:623-631.10.Arnaud-Dabernat等,2008,JournalofCellularPhysiology,216:261-268.11.TheMerckmanual,第17版,199912.Getgood等,2010,P116,ICRSMeeting2010,Barcelona.13.ICRS出版物:http://www.cartilage.org/_files/contentmanagement/ICRS_evaluation.pdf,第13页14.Bingham,2002,J.Rheumatol.29:3-9.15.Lee等,2013,Gene,527:440-447.16.Bresnihan,2002,Ann.Rheum.61:ii74-ii7717.St.Clair,2002,J.Rheumatol.29:22-26,18.Mertens等,2009,,J.Rheumatol.,36(6):1118-112519.Chevalier等,2009,Arthritis&Rheumatism,61(3):344-35220.Kuribayashi等,2013,Inflammation,36(6):1448-52当前第1页1 2 3