鼠李糖乳杆菌促进生态失调后肠道菌群多样性恢复的应用的制作方法

本发明涉及益生菌领域。具体地，本发明与鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)在受试者中维持和增加肠道菌群多样性中的应用有关。

背景技术：

根据联合国粮食及农业组织/世界卫生组织(FAO/WHO)中对具有活乳酸菌的奶粉的健康和营养特性的专家评议会在2001年批准的定义，益生菌是“活的微生物，该活的微生物当以恰当的量施用时，赋予了宿主健康益处”。已在属于乳品工业中常用的乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)和乳球菌属(Lactococcus)的物种中，描述了益生菌。据认为，益生菌通过阻碍致病微生物的生长和/或通过更直接地作用于免疫系统，在肠道菌群的水平上进行干预。

导致医疗保健相关感染(HAI)的机会细菌感染对患者死亡率和发病率，以及发达国家和发展中国家的医疗保健成本造成了深远影响(WHO，2008)。胃肠道(GIT)是机会致病菌的贮主，其中机会致病菌受益于肠道菌群平衡的破坏或生态失调而侵入和感染易感患者。具体地，抗生素治疗对肠道菌群的多样性产生有害影响，并且抗生素治疗促进了人的细菌性机会致病菌(包括粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)或艰难梭菌(Clostridium difficile))的扩增。

在获得抗生素耐性和其他致病性状后，植入和/或侵入的多重耐药性粪肠球菌(E.faecalis)菌系(其导致严重的院内感染)被分类为7种医院适应(hospital-adapted)的复合体，这7种医院适应的复合体被命名为高风险肠道球菌克隆复合体(HiRECC)。HiRECC在GIT内的增殖和持久生存是产生耐万古霉素性肠球菌(VRE)感染的主要风险，从而非常需要更好地了解粪肠球菌(E.faecalis)定植在GIT中所涉及的生物因素和生化因素。在美国和几个欧洲国家中，属于HiRECC-2的菌系是粪肠球菌(E.faecalis)感染的最常见病因之一。

从上文清楚的是，需要用于治疗或预防粪肠球菌(E.faecalis)感染的抗生素的替代物或补充物。

“肠道菌群”是指居于隶属动物界的任何生物体(人、动物、昆虫等)的肠内的微生物群落。虽然每个个体具有独特的菌群组成(来自总共400至500个不同细菌种类/个体的50％以上的取样群落中，60至80种的细菌是相同的)，但是它总是实现类似的主要生理功能，并且对个体健康具有直接影响：

·有助于消化胃和小肠不能消化的某些食物(主要是非消化性纤维)；

·有助于产生一些维生素(B和K)；

·保护免受其他微生物的侵袭，维持肠粘膜的完整性；

·在适当免疫系统的发育中发挥重要作用；

·健康、多样且平衡的肠道菌群是确保适当肠道功能的关键。

考虑到肠道菌群在身体正常功能中发挥的主要作用及其所完成的不同功能，有时认为肠道菌群是“器官”。然而它是“获得性”器官，因为婴儿出生时是无菌的；也即，肠道定植始于出生，之后逐渐形成。

肠道菌群在扰动(诸如，饮食变化、抗生素治疗和外源微生物的侵入)之后出现紊乱的幅度，以及恢复到扰动前状态的速度和程度被限定为“菌群的恢复力”。菌群的恢复力在个体间以及个体内不同扰动之间是有差异的。

从上文可知，还非常需要用于提高菌群恢复力的治疗。

越来越多的证据表明，益生菌或粪菌移植预防或治疗包括肠道感染的许多疾病。这样的方法也与小鼠中的肠道VRE的较高清除率相关。

令人惊奇地是，本发明人已经发现，细菌菌种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)能够在体内促进肠道菌群多样性的恢复。

因此，本发明的主题是鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)在提高肠道菌群的恢复力中的应用。特别地，本发明与鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)在维持或提高受试者的肠道菌群多样性中的应用有关。在具体的实施方式中，使用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)能够在患有由抗生素引起的肠道生态失调的受试者中，维持或提高肠道菌群的多样性。

本发明的其它方面提供了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)在以下方面中的应用：预防、缓解或治疗肠道生态失调；和/或预防由存在于胃肠道中的致病菌引起的疾病；和/或在增加受试者中短链脂肪酸的水平。

本发明还提供了组合物，该组合物包括用于本发明的应用的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。

技术实现要素：

在本文中，短语“维持菌群多样性”用于表示：尤其是在生态失调的情况下，不会显著地改变或影响个体中菌群的物种多样性(物种丰富度和/或物种均匀性)。特别地，维持菌群多样性可以帮助受试者在有生态失调风险的情况下更快地恢复，或者可以避免生态失调恶化。短语“增加菌群多样性”、“促进菌群多样性的恢复”、“生态失调的治疗/缓解/降低”等用于表示：个体中菌群的物种多样性(物种丰富度和/或物种均匀性)的增加。用于计算物种多样性、物种丰富度和物种均匀度的方法是本领域已知的，包括但不限于辛普森指数，辛普森多样性指数和辛普森相互指数，曹指数(Chao Index)和香农指数。

此外，“加速肠道菌群多样性的增加”、“促进肠道菌群多样性的恢复”、“有利于恢复至基线/正常/健康的肠道菌群多样性”、“加速生态失调的缓解/降低/消失”等用于表示：在抗生素治疗后患有肠道生态失调的个体内的菌群多样性(丰富度和/或均匀性)在服用益生菌菌株的受试者中比未服用益生菌菌株的对照受试者在统计学上增加更快，从而抗生素治疗后三周的菌群的结构在服用益生菌菌株的受试者中比未服用益生菌菌株的受试者在统计学上更接近于治疗前的结构。

如本文中所使用的，术语“生态失调”应当被理解为与健康或普通群体相比，菌群共生物种多样性的改变，并且应包括有益微生物的减少和/或致病菌(致病性微生物或潜在致病性微生物)的增加和/或总体菌群物种多样性的减少。许多因素可能伤害肠道菌群的有益成员，从而导致生态失调，这些因素包括抗生素的使用、心理和生理压力、辐射和饮食变化。抗生素的使用是导致正常菌群中发生重大改变的最常见且不可忽略的原因。因此，如本文所使用的，术语“抗生素诱导的生态失调”是指由抗生素所引起的生态失调，包括促进细菌性机会致病菌的过度生长，其中细菌性机会致病菌包括粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)或艰难梭菌(Clostridium difficile)。

如本文所使用的，术语“乳品组合物“应当被理解为适于动物食用，特别是人类食用的奶类组合物。

如本文所使用的，术语“奶”应理解为包括蔬菜奶或动物奶，例如但不限于大豆奶、杏仁奶、斯佩尔特小麦奶(spelt milk)、燕麦奶、麻籽奶(hemp milk)、椰奶、米奶、山羊奶、绵羊奶或牛奶。

如本文所使用的，术语“x％(w/w)”被认为等于“x g/100g”。

如本文所使用的，所提及的细菌菌株或物种应当被理解为包括由此衍生的保留缓解受试者(优选患有抗生素诱导的生态失调的受试者)的肠道生态失调的能力的细菌。为了评估该能力，可使用与下文实施例中所述相同的模型。源自于可以根据本发明使用的亲本菌株的菌株包括突变菌株和遗传转化菌株。这些突变菌株或遗传转化菌株可以是其中亲本菌株中的一个或多个内源基因已经发生突变的菌株，例如改变它们的一些代谢性质(例如它们发酵糖的能力，它们对酸度的耐性，它们在胃肠道中运输的存活能力，它们的后酸化性质或它们的代谢产物)。它们还可以是由亲本菌株经遗传转化以增加一个或多个感兴趣的基因而产生的菌株，其中增加一个或多个感兴趣的基因例如是为了给予所述遗传转化菌株额外的生理特征，或允许它们表达希望通过施用该菌株来表达的感兴趣的治疗性蛋白质或疫苗。这些突变体或遗传转化菌株可以利用细菌的随机或定点诱变和遗传转化的常规技术，或利用被称为“基因组重排”的技术由亲本菌株来获得。在本文中，当提及亲本物种或菌株时，应理解其涵盖衍生自所述亲本物种或菌株并且保留在患有抗生素诱导的生态失调的受试者中维持或增加肠道菌群多样性的能力的菌株、突变体和变体，例如，短语“鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)”和“菌株CNCM I-3690”应被理解为包括衍生自它们的菌株、突变体和变体。

如本文所使用的，术语“食物补充剂”应被理解为由食品中常用的化合物制成的产品，但其为片剂、粉末、胶囊、饮剂的形式或通常不与营养物相关的任何其它形式，并且对个体健康具有有益的影响。

如本文所使用的，术语“功能性食物”应被理解为除了提供营养之外，还对个体的健康具有有益效果的营养物。特别地，食物补充剂和功能性食物可以具有生理效应-用于疾病(例如慢性疾病)的预防、改善或治疗疾病。

如本文所使用的，术语“发酵乳”或“发酵奶”是指分别通过至少一种乳酸菌的酸化作用从乳品组合物或奶品组合物得到的组合物，所述乳酸菌可包含在发酵物、培养物或引酵物中。

如本文所使用的，术语“可勺取的”应被理解为可利用勺子或其他器具食用的固体或半固体。

鼠李糖乳杆菌(L.RHAMNOSUS)的应用

本发明提供了鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，优选菌株CNCM I-3690在受试者(优选患有肠道生态失调的受试者)中维持或增加肠道菌群多样性中的应用。

因此，一个实施方式中，本发明提供了鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，优选菌株CNCM I-3690在预防或缓解受试者肠道生态失调中的应用。根据布达佩斯条约，将菌株CNCM I-3690于2006年11月9日保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,25rue du Docteur Roux,巴黎)。该菌株公开在国际申请WO 2009/122042中。

在优选的实施方式中，肠道生态失调由受试者的抗生素治疗引起或在受试者的抗生素治疗后引起。

在又一实施方式中，本发明提供了鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，优选菌株CNCM I-3690在预防胃肠细菌感染中的应用和/或预防由胃肠道中存在的致病菌(优选共生和/或机会致病菌)所引起的疾病的发展中的应用。这些疾病可位于GIT中，或在机会致病菌穿过肠道屏蔽(显著和/或长期的生态失调有助于所述穿过)的情况中，扩散至腹腔、血液等。因此，本发明进一步提供了用于预防胃肠细菌感染的方法和/或预防由受试者胃肠道中存在的致病菌引起的疾病的发展的方法，所述方法包括：将有效量的组合物施用予受试者，所述组合物包括鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，优选菌株CNCM I-3690。优选地，所述受试者患有肠道生态失调。在优选的实施方式中，所述肠道失衡由受试者的抗生素治疗所引起，或在受试者的抗生素治疗后引起。在进一步优选的实施方式中，所述致病菌为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。

短链脂肪酸的增加

本发明人已证明：鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，优选菌株CNCM I-3690的施用在维持或增加菌群多样性的同时，还使受试者中短链脂肪酸的水平增加。如先前在本领域中所述，菌群的广泛多样性和菌群中的SCFA(特别是丁酸盐/酯)的高水平单独或组合地对健康是有利的。因此，在生态失调的情况下，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)允许菌群多样性增加和SCFA的增加这一事实，表明鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)尤其可以是健康有益的。

因此，在又一实施方式中，本发明提供了鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，优选菌株CNCM I-3690在增加受试者中的短链脂肪酸的应用。在一个实施方式中，所述短链脂肪酸是肠道的，典型地为结肠、远端结肠、盲肠或排泄物。在优选的实施方式中，所述短链脂肪酸为丁酸盐/酯。在替代性实施方式中，本发明提供了鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，优选菌株CNCM I-3690在增加丁酸盐/酯与乙酸盐/酯的比例中的应用。优选地，上述受试者患有肠道生态失调。在又一优选的实施方式中，肠道生态失调由受试者的抗生素治疗所引起或在受试者的抗生素治疗后引起。

组合物

本发明的另一方面提供了包括鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，优选菌株CNCM I-3690的组合物，用于本发明的应用中。因此，本发明提供了包括鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，优选菌株CNCM I-3690的组合物，用于：维持或增加肠道菌群多样性；和/或在预防或治疗肠道生态失调；和/或预防由胃肠道内存在的致病菌(优选共生和/或机会致病菌)所引起的疾病；和/或增加受试者中的短链脂肪酸水平。优选地，所述受试者患有肠道生态失调，进一步优选地，所述生态失调由受试者的抗生素治疗所引起或在受试者的抗生素治疗后引起。

因此，在本发明优选的实施方式中，菌株鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，优选菌株CNCM I-3690以可口服施用组合物的形式提供。在这样的组合物中，所述菌株可以以活的或死的全菌形式使用。可替代地，所述菌株可以细菌裂解物的形式来使用。优选地，细菌细胞以活的且可存活的细胞形式存在。

根据本发明，所述组合物可以是适合于口服施用的任何形式。这包括例如固体、半固体、液体和粉末。半固体组合物(诸如酸奶)和液体组合物(例如饮料)是优选的。

优选地，所述组合物包括每克重量至少1.10⁶菌落形成单位(cfu)、至少1.10⁷菌落形成单位(cfu)或优选至少1.10⁸cfu的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，优选菌株CNCM I-3690。优选地，基于本发明的每克(g)组合物，根据本发明的组合物包括至多约10¹¹菌落形成单位，更优选至少10¹⁰菌落形成单位并且最优选至少10⁹菌落形成单位(CFU)的根据本发明的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，优选菌株CNCM I-3690。

所述组合物可进一步包括：除上述菌株之外的乳杆菌属(Lactobacillus)的其它菌株和/或细菌的其它菌株，特别是益生菌菌株，例如嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)和乳球菌(Lactococcus)菌株。

所述组合物可为药物组合物或营养组合物。根据优选的实施方式，所述组合物是营养组合物，诸如食品(包括功能性食物)或食物补充剂。

可根据本发明使用的营养组合物包括乳品组合物，优选发酵乳品组合物。发酵组合物可以是液体形式，或者是通过干燥发酵液体而获得的干粉形式。乳品组合物的实例包括乳酪、酸奶，和凝固、搅拌(stirred)或可饮用形式的发酵奶和/或发酵乳清。发酵产品还可以是凝固、搅拌或可饮用形式的发酵植物，例如发酵的大豆、谷物和/或果实。可根据本发明使用的营养组合物还包括幼儿食物、婴儿配方奶粉和婴儿后续(follow-on)配方奶粉。在优选的实施方式中，发酵产品是新鲜产品。未经过严格热处理步骤的新鲜产品具有细菌菌株以存活形式存在的优点。

特别优选的是，根据本发明的组合物是乳品组合物，特别是发酵乳品组合物。

优选地，根据本发明的乳品组合物包含或衍生自(特别是通过发酵)：含有30％至100％(w/w)的奶、更优选50％至100％(w/w)的奶和甚至更优选70％至100％(w/w)的奶的组合物。还优选地，根据本发明的乳品组合物包括或衍生自(特别是通过发酵)：基本上由奶(优选牛奶)组成的组合物，或仅由奶(优选牛奶)组成的组合物。

优选地，根据本发明的乳品组合物包括或衍生自(特别是通过发酵)：含脱脂奶或非脱脂奶之一或两者的组合物。优选地，所述奶或多种奶可以是液体、粉末和/或浓缩形式。在一个实施方式中，所述奶或多种奶可以富含或强化了用另外的奶组分或其它营养物，诸如但不限于维生素、矿物质、微量元素或其它微量营养物。

所述发酵乳品组合物通过至少一种乳酸菌的酸化作用衍生自本发明的乳品组合物，该至少一种乳酸菌可以包含在发酵物、培养物或引酵物中。更优选地，根据本发明所述的发酵乳品组合物通过至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或更多种乳酸菌菌株的酸化作用获得。因此，“发酵乳品组合物”包括至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或更多种乳酸菌菌株。

用于制备发酵乳品(诸如酸奶或其等同物)的方法是本领域公知的。典型地，通过与合适的微生物一起培养热处理(例如巴氏杀菌的)脱脂奶和/或非脱脂奶以使pH降低，来制备发酵奶制品。合适的微生物(例如嗜热乳酸菌)的选择在本领域技术人员的范围内。

根据本发明的乳品组合物，特别是发酵乳品组合物可选地进一步包含辅助成分，诸如果实、蔬菜、营养性和非营养性甜味剂、谷物、调味剂、淀粉、增稠剂、防腐剂或稳定剂。优选地，根据本发明的乳品组合物，特别是发酵乳品组合物应包含至多约30％(w/w)的所述辅助成分，例如，至多约10％、15％、20％、25％(w/w)的辅助成分。

优选地，根据本发明的乳品组合物是发酵乳品组合物、更优选发酵奶品组合物，包括或基本上包括经过至少相当于巴氏杀菌的热处理的奶，或由经过至少相当于巴氏杀菌的热处理的奶组成，优选所述热处理在制备所述乳品组合物或发酵乳品组合物之前进行。

优选地，根据本发明的乳品组合物是发酵乳品组合物，更优选每100g重量包含约0.3g以上游离乳酸的发酵奶品组合物，更优选地，本发明提供了每100g包括约0.7g或0.6g以上游离乳酸的发酵奶品组合物。优选地，根据本发明的乳品组合物是发酵乳品组合物，更优选地是包括至少与奶或其来源的奶的蛋白含量相等的发酵奶品组合物。

优选地，根据本发明的乳品组合物是发酵乳品组合物，更优选地是pH等于或低于5、更优选约3.5至约4.5的发酵奶品组合物。

优选地，根据本发明的乳品组合物是发酵乳品组合物，更优选地是在10℃下，64/s的剪切速率时，粘度低于200mPa.s、更优选低于100mPa.s并且最优选低于60mPa.s的发酵奶品组合物。在一个实施方式中，根据本发明的乳品组合物是可饮用的发酵乳品组合物，更优选地是饮料发酵奶饮料，诸如但不限于酸奶饮料、克非尔(kefir)等。在替代性实施方式中，根据本发明的乳品组合物是发酵乳品组合物，更优选地是可勺取的发酵乳品组合物。

还优选地，根据本发明的乳品组合物，特别是发酵乳品组合物或根据本发明的产品可以在1℃至10℃的温度下储存。

根据本发明的乳品组合物，特别是发酵乳品组合物，更优选根据本发明的发酵奶品组合物或者产品的单份量以重量计，优选为约50g、60g、70g、75g、80g、85g、90g、95g、100g、105g、110g、115g、120g、125g、130g、135g、140g、145g、150g、200g、300g或320g，或者可替代地为约1盎司、2盎司、3盎司、4盎司、5盎司、6盎司或12盎司。

优选地，根据本发明的乳品组合物、特别是发酵乳品组合物，更优选根据本发明的发酵奶品组合物包括：每克(g)根据本发明的组合物，至少10⁶、更优选至少10⁷、并且最优选至少10⁸菌落形成单位(CFU)的根据本发明的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，优选菌株CNCM I-3690。

治疗用途

本发明的主题还在于鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，优选菌株CNCM I-3690或如上定义的组合物，在制备用于以下方面的药物中的应用：用于维持或增加肠道菌群多样性；和/或用于预防或治疗肠道生态失调；和/或用于预防由胃肠道内存在的致病菌(优选共生和/或机会致病菌)所引起的疾病；和/或用于增加受试者中短链脂肪酸的水平。优选地，所述受试者患有肠道生态失调，进一步优选地，所述生态失调由受试者的抗生素治疗所引起或在受试者的抗生素治疗后引起。

本发明的主题还在于如上所限定的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)菌株，优选菌株CNCM I-3690或如上所限定的组合物在用于以下方面的应用：维持或增加肠道菌群多样性；和/或预防或治疗肠道生态失调；和/或预防由胃肠道内存在的致病菌(优选地，共生和/或机会致病菌)所引起的疾病；和/或增加受试者中短链脂肪酸的水平。优选地，所述受试者患有肠道生态失调，进一步优选地，所述生态失调由受试者的抗生素治疗所引起或在受试者的抗生素治疗后引起。

本发明的主题还在于用于维持或增加胃肠菌群多样性的方法；和/或预防或治疗肠道生态失调的方法；和/或预防由胃肠到中存在的致病菌(优选地，共生和/或机会致病菌)所引起的疾病的方法；和/或增加在需要的受试者中短链脂肪酸的水平的方法，所述方法包括将治疗有效量的如上所限定的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)菌株，优选菌株CNCM I-3690或如上所限定的组合物施用予所述受试者。优选地，所述受试者患有肠道生态失调，进一步优选地，所述生态失调由受试者的抗生素治疗所引起或在受试者的抗生素治疗后引起。

特别是在考虑到本文提供的详细公开内容下，治疗有效量的确定是本领域技术人员熟知的。

本发明的主题还在于用于制备药物的方法，所述药物用于：维持或增加胃肠菌群多样性；和/或预防或治疗肠道生态失调；和/或预防由胃肠道中存在的致病菌(优选地，共生和/或机会致病菌)所引起的疾病；和/或增加受试者中短链脂肪酸的水平，所述方法包括将如上所限定的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)菌株，优选菌株CNCM I-3690并入到至少一种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂中。

服用量(dosage)

在一个实施方式中，本发明提供了食用或施用剂量约10⁸至约10¹¹菌落形成单位(CFU)的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，优选约10⁸至约10⁹菌落形成单位、更优选约10⁹至约10¹⁰菌落形成单位(CFU)，并且在一替代性实施方案中，约10¹⁰至10¹¹菌落形成单位(CFU)的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，更优选菌株CNCM I-3690，用于本文所公开的应用和方法。在另一实施方式中，在24小时时段内提供至少1、2、3或4剂。进一步优选地，日剂量方案保持至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天；或在替代性实施方式中，该日剂量方案保持至少约1周、2周、3周、4周、5周、6周或7周。

因此，在一个实施方式中，本发明提供每日食用或施用至少1份、2份、3份或4份根据本发明的乳品组合物、特别是发酵乳品组合物，更优选根据本发明的发酵奶品组合物。每份可以单独地被食用或施用，或者在单次中可食用或施用多份。上述多份中的每一份可在进餐时或在进餐之间食用(例如作为零食，在体育活动等之后)。

根据本发明的乳品组合物，特别是发酵乳品组合物，更优选根据本发明的发酵奶品组合物的单份量以重量计，优选为约50g、60g、70g、75g、80g、85g、90g、95g、100g、105g、110g、115g、120g、125g、130g、135g、140g、145g、150g、200g、300g或320g，或者约1盎司、2盎司、3盎司、4盎司、5盎司、6盎司或12盎司。

优选地，根据本发明的组合物包含：每克(g)根据本发明的组合物，至少10⁶菌落形成单位、更优选至少10⁷菌落形成单位并且最优选至少10⁸菌落形成单位(CFU)的根据本发明的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，更优选菌株CNCM I-3690。还优选地，根据本发明的组合物包括：每克(g)根据本发明的组合物的细菌为至少10¹¹菌落形成单位，更优选至少10¹⁰菌落形成单位，最优选至少10⁹菌落形成单位(CFU)的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，更优选菌株CNCM I-3690。

例如，在一个实施方式中，本发明提供了至少2份或至少3份的100g或125g份的发酵奶品的日食用量，所述发酵奶品包括每g制品约至少10⁷至至少10⁸菌落形成单位(CFU)的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)I-3690。在另一实施方式中，维持所述日食用水平至少1周、2周、3周、4周或更多周的时段。

从以下进一步描述和附图中将更清楚地理解本发明，其中，该进一步描述涉及阐述鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，例如菌株CNCM I-3690缓解体内生态失调以及增加短链脂肪酸的能力的实施例。

附图说明

图1：表示实验顺序的图示。

图2：通过Chao指数测量的菌群的丰富度。C：对照，Lr：鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus。

图3：克林霉素治疗和恢复后，肠球菌和肠杆菌相对于基线的相对丰度。

图4：在D0、D7、D10、D11和D21时，从对照组和鼠李糖乳杆菌(L.Rhamnosus)组(每组和每个时间点n＝3)收集的样品的加权Unifrac距离的主坐标分析。

具体实施方式

实施例

本发明人开发了基于由克林霉素诱导的菌群生态失调以模拟肠球菌过度生长和VRE建立的肠道定植小鼠模型。小鼠皮下接受克林霉素3天，之后口胃接种粪肠球菌(Enterococcus faecalis)VRE菌株(V583)。小鼠的天然菌群中几乎或完全没有粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；此外，在小鼠中不会发生共生至致病菌的转变。使用该模型，在抗生素治疗前一周开始，直到停止抗生素治疗和接种VRE之后两周，每天将益生菌菌株口服施用予小鼠。通过选择性铺板，监测建立的动力学和VER清除率以及固有肠球菌群落水平。同时，收集粪便样品，用于全菌群的16S rRNA基因调查分析。在该模型中诱导的生态失调模拟在人中观察到的抗生素诱导的生态失调。因此，该模型构成了良好模型，以研究相对肠球菌过度生长的肠道定植屏蔽的机制。菌株V583属于CC2，并且是美国报道的第一个耐万古霉素的菌系(Sahm等，1989)。该菌株在下面报道的实验中作为CC2分离株，并且更常见的致病菌粪肠球菌(E.faecalis)的模型菌株中。

方法

细菌生长

粪肠球菌(E.faecalis V583菌株在补充有0.5％葡萄糖的M17(GM17)中生长，并在达到稳定期后通过离心1小时来收集。细菌细胞用0.9％盐水溶液洗涤两次，并于-80℃下以干燥冷冻块状物的形式储存。该菌株属于CC2，并且是在美国报道的第一个耐万古霉素的分离株(Sahm等人，1989)。

使益生菌菌株在MRS培养基中生长，并如上所述进行收集。

在接种前至少两天，将冷冻的细菌悬浮在盐水溶液中，并将连续稀释液铺板在GM17或MRS琼脂平板上，以测定该块状物的细菌计数。

小鼠粪肠球菌(E.faecalis)模型定植化

使用特定的无致病菌的雄性CF-1小鼠(Harlan，USA)进行小鼠实验6～8周。每个笼中饲养总共5只小鼠，并用高压灭菌的食物和水自由饲喂。

利用钢饲喂管(Ecimed)通过口胃接种，小鼠接受含10⁹CFU的益生菌菌株的0.1ml的0.9％盐水溶液的日剂量。将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CNCM I-3690施用予Lr组，并且将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)I-3689施用予Lp组。对照组的动物以相同的方式接受0.1ml的0.9％盐水溶液。在益生菌治疗一周后，每天皮下施用剂量为1.4mg/天的克林霉素，持续三天。一天后，利用钢饲喂管(Ecimed)通过口胃接种，施用含10¹⁰菌落形成单位(CFU)的粪肠球菌(E.faecalis)(耐万古霉素性肠球菌，称为“VRE”)菌株V583的0.1ml的0.9％盐水溶液。

如下面的实验设计中所述，收集粪便样品。将粪便(50～100mg/小鼠)或盲肠保持在4℃，并且在取样后3小时内处理，且在室温下加工。从该阶段开始，所有的工作在PSMII的无菌条件下进行。称重样品并使该样品以10^-1的稀释度悬浮。根据重量，加入调节体积的蛋白胨水(例如，对于100mg，为900μl；对于50mg，为450μl)。使用100μl体积的悬浮液(稀释-1)，在蛋白胨水中进行数十倍稀释直到10^-8。通过将稀释的粪便样品铺板到BEA上并且将总乳酸菌铺板到MRS培养基上，然后在37℃厌氧条件(Gaz包装)下孵育48小时，来监测总肠球菌群落。为了使用粪肠球菌(E.faecalis)V583施用来进行研究，随后将V583铺板到补充有6μg/mL万古霉素的BEA上来示踪V583的群落水平。还收集了粪便样品用于全菌群的16S rRNA基因调查分析。在实验结束时，处死动物。收集盲肠内容物以通过测量短链脂肪酸的浓度来评估发酵模式。回收结肠并立即用于RNA提取(在液氮中冷冻)或组织学(多聚甲醛溶液4％)。

菌群分析

在第0天(基线)、第7天(益生菌治疗1周)、第10天(抗生素摄取3天)、第11天(粪肠球菌(E.faecalis)V583接种后1天)和第21天(处死)收集粪便样品。使用Godon等人方法提取DNA(Godon，1997)。对于焦磷酸测序，基于Sim等人(2012)的设计，使用密钥(key)标记的真细菌引物(Lifesquencing SL，Valencia，西班牙)扩增16S rRNA基因的V3-V5区域。使用20ng宏基因组DNA，每种200μM的四种脱氧核苷三磷酸，每种400nM的引物，2.5U的FastStart HiFi聚合酶以及由制造商(Roche，Mannheim，德国)提供的含有MgCl₂的合适缓冲液，4％的20μg/mLBSA(Sigma，Dorset，英国)和0.5M甜菜碱(Sigma)，来进行PCR反应。热循环由以下组成：在94℃下初始变性2分钟，接着进行94℃下变性20秒、50℃下退火30秒以及72℃下延伸5分钟的35次循环。将扩增子以等摩尔浓度合并在单管中。将合并的扩增子混合物纯化两次(AMPure XP试剂盒，Agencourt，Takeley，英国)，并使用PicoGreen测定(Quant-iT，PicoGreen DNA测定，Invitrogen)再次量化无污染的合并物。随后，扩增子提交给由Life Sequencing S.L.(Valencia，西班牙)提供的焦磷酸测序服务，其中进行EmPCR，随后按照Roche Amplicon Lib-L方案，在454Life Sciences GS FLX+仪器(Roche)上进行单向焦磷酸测序。使用QIIME v.1.6(Caporaso，2010)进行生物信息学分析。根据以下质量标准过滤后，将数据分为50个样本：大小在500nt和1000nt之间，50个碱基对窗口上的质量在25以上，引物和条形码序列中经核定没有错配，以及不存在大于6nt的聚合物。使用cd-hit(Li，2006)，将剩余的解读信息聚类成定义为97％一致性下的运算分类单位(OTU)，并且利用Greengenes v_13_08数据库，对每个OTU的代表性序列进行比对和分类学上的分配。对于α多样性和β多样性，将样品稀释到每个样品3000个序列。使用丰度(Chao1)和均匀度(Shannon指数)和观察的OUT的数目的稀疏曲线，来评估α-多样性(其测量样品内的多样性)。使用3500个解读信息，对加权和未加权Unifrac距离进行β多样性(其测量样品间的多样性)。

盲肠发酵终产物的测量

如前所述，使用500mg盲肠内容物上清液，在水提取酸化样品后，通过气相色谱法来测定短链脂肪酸(SCFA)的浓度，其中，所述短链脂肪酸包括乙酸盐/酯、丙酸盐/酯和丁酸盐/酯的浓度(Nelson 1020，Perkin-Elmer，St Quentin en Yvelines，法国)(Lan et al,2008)。使用D-L乳酸试剂盒(BioSenTeck)来测定乳酸盐/酯。

统计学分析

通过曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验(GraphPad)来分析细菌计数的差异、菌群多样性(丰度和均匀性)以及短链脂肪酸数据。当P<0.05时，认为差异是显著的。

结果：菌株鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)I-3690在粪肠球菌(E.faecalis)V583的存在下的生态失调后，促进菌群多样性的恢复，并增加粪便中的丁酸盐/酯与/乙酸盐/酯的比例

在粪肠球菌(E.faecalis)定植模型中，在克林霉素治疗时，伴随固有肠球菌的瞬时增加。在抗生素治疗停止后一天，肠球菌群落达到最高水平，然后在4至5天后逐渐降至初始水平。在接种后，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)VRE菌株与固有肠球菌并存，并且在管饲后至少长达11天内以可检测的水平持续存在(Rigottier-Gois等人提交)。在本项目中，使用细菌16S rRNA基因的454焦磷酸测序的菌群分析表明，固有肠球菌的过度生长与由抗生素治疗导致的菌群多样性降低相关。益生菌菌株的施用对肠球菌过度生长没有影响(图2)。

为了描述克林霉素治疗+VRE接种，以及鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)CNCM I-3690食用对菌群结构的影响，对在第0天(基线)、第7天(益生菌食用1周)、第10天(克林霉素治疗3天)、第11天(粪肠球菌E.faecalis V583接种)和第21天(“恢复”)从小鼠收集的粪便样品进行细菌16S rRNA基因V3-V5可变区的454焦磷酸测序。在第10天和第14天收集的粪便样品的菌群分析显示，克林霉素治疗导致微菌群组成的剧烈变化，同时丧失多样性(丰度(Chao指数)和均匀性(Shannon指数))(图2)。

此外，肠球菌(Enterococcus)属以及属于变形菌(Proteobacteria)的种系(特别是肠杆菌科(Enterobacteriaceae))的相对丰度急剧增加(图3)。

对第21天收集的样品的分析表明：每日食用鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)CNCM I-3690使得菌群多样性的损失程度较低(图2)。

此外，基于加权和未加权的Unifrac距离矩阵的多变量分析(主分量分析)表明，来自第0天至第7天的样品(基线+/-益生菌)和来自第10天至第21天的样品(克林霉素诱导的生态失调)之间存在明显的区别。值得注意的是，在第21天，与对照组相比，接受鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)的小鼠组与基线的区别较小(图4)。

对第21天的盲肠内容物的SCFA和乳酸盐/酯分析表明：与对照组相比，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)CNCM I-3690影响SCFA。在三次独立实验(运行)中，与对照相比，并且同时与等同物副干酪乳杆菌(L.paracasei)治疗组(下表)相比，在接受鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)菌株的小鼠中，盲肠丁酸盐/酯与乙酸盐/酯的比例显著增加。在两次运行中，丁酸盐/酯的绝对量显著增加。

运行1

运行2

运行3