本申请涉及磷酸钙-乳酸聚合物-纳米颗粒分别复合纳米颗粒，用于将活性成分递送至活的哺乳动物细胞。
技术背景
乳酸聚合物，例如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物(PLGA)，是生物可降解的聚合物并且是本领域公知的，例如根据EP1468035、US6706854、WO2007/009919A2、EP1907023A、EP2263707A、EP2147036、EP0427185或US5610266。
US 2005/0053590A1描述了用于逆转内皮功能障碍的内皮靶向纳米颗粒。用于改善细胞功能障碍的方法包括以下步骤：提供特异性靶向功能障碍内皮细胞的组合物，其包含特异性结合内皮细胞的靶向配体和核酸，和在增加细胞内四氢生物蝶呤浓度的条件下将组合物递送至细胞。所述组合物还可包含选自许多合适类型的纳米颗粒的纳米颗粒，包括磷酸钙纳米颗粒和由聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)配制的生物可降解的纳米颗粒或其中提及的不同纳米颗粒类型的组合。
WO 2007/048599描述了基于聚合物载体的颗粒药物递送系统，其特征在于包括用于运输通过生物屏障的至少一种信号物质和至少一种活性成分，其中载体、信号物质和活性成分显示没有彼此的共价键联。信号物质(细胞穿透肽(CPP))是乳铁蛋白或来源于乳铁蛋白的肽。
在特别优选的实施方案中，信号肽具有氨基酸序列
KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR(SEQ ID No.1(＝WO 2007/048599中的SEQ ID No.3))，
CFQWQRNMRKVRGPPVSC(SEQ ID No.2(＝WO 2007/048599中的SEQ ID No.4))，
FQWQRNMRKVRGPPVS(SEQ ID No.3(＝WO 2007/048599中的SEQ ID No.5))，
FQWQRNMRKVR(SEQ ID No.4(＝WO 2007/048599中的SEQ ID No.6))，
KCRRWQWRMKKLGAPSITCVRR(SEQ ID No.5(＝WO 2007/048599中的SEQ ID No.29))和
CRRWQWRMKKLGAPSITC(SEQ ID No.6(＝WO 2007/048599中的SEQ ID No.30))
或其衍生物。
在优选的实施方案中，WO 2007/048599的细胞穿透肽包含如WO 2007/048599中的SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.29或SEQ ID No.30所示的氨基酸序列或具有至少40％、优选至少50％的同一性、特别优选具有大于75％或更好大于90％的同一性的相应序列。
WO 2007/076904A1描述了具有包含人乳铁蛋白或牛乳铁蛋白的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列的肽，其中所述肽适合用作细胞穿透肽(CPP)。在WO 2007/076904A1和WO 2007/048599中提及的许多肽是相同的。
在实施例中具有最佳效果的最有前景的细胞穿透肽是KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR(SEQ ID No.1(＝WO 2007/048599和WO 2007/076904A1中的SEQ ID No.3))。
乳铁蛋白衍生的细胞穿透肽旨在允许货物分子通过生物膜的运输，并因此允许这些分子在人或动物生物体中的有效摄取，所述货物分子是活性药物成分，例如DNA、RNA、肽或用于疫苗接种的抗原，其可以通过口服摄取。
WO2014/141288A1(国际公开日期2014年9月18日)描述了显示多功能性质如放射性、拉曼散射、近红外(NIR)荧光、对-或超顺磁性和X射线吸收的纳米材料。多功能纳米造影剂可以具有球形或非球形形状和范围为1-200nm的尺寸，并且可以静脉内、肌内或口服递送。纳米材料基于磷酸钙纳米颗粒。纳米颗粒用作多功能纳米造影剂，其可以与药物分子例如二膦酸盐、化学药物、抗癌基因治疗剂、RNA片段(siRNA，mi-RNA)、光敏药物、小分子抑制剂、抗生素缀合或加载。磷酸钙纳米颗粒可以配制在含有药物的生物可降解的聚合物的聚合物壳中。生物可降解聚合物可以是，除其它以外，聚乳酸(PLA)，聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)，聚乙烯亚胺(PEI)，壳聚糖或羧甲基壳聚糖。纳米颗粒可以在其表面上与靶向配体缀合，所述靶向配体例如包括叶酸、抗体、肽、适体或碳水化合物。可以加入封端剂如柠檬酸盐、聚合物如PEG、聚乙烯亚胺、二膦酸盐。
Norihiro Watanabe等人描述了“Transgenic Expression of a Novel Immunosuppressive Signal Converter on T-cells”,Molecular Therapy,vol.21,2013-05-01,p.s153-S153,(XP055131645)。
Ping Zeng等人：“Chitosan-modified poly/,-lactide-co-glycolide)nanospheres for plasmid DNA delivery and HBV gene silencing”,International Journal of Pharmaceutics,Elsevier BV,NL,vol.415,2011-05-20,p.259-266(XP028099873,ISSN:0378-5173)。Ping Zeng等人描述了使用聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)配制的用于质粒DNA(pDNA)递送的纳米颗粒。Jie Tang等人在Acta Pharmaceutica Sinica 2013,48(2)：298-304中描述了包封在聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物(PLGA)中的磷酸钙-pDNA纳米颗粒(pDNA-CaPi)(核心/壳(CS)结构)的制备和体外评价。将核心/壳结构颗粒(CS-pDNA-CaPi-PLGA-NP)与嵌入的CaPi修饰的PLGA纳米颗粒(嵌入的pDNA-CaPi-PLGA-NP)进行比较。核心/壳结构纳米颗粒(CS-pDNA-CaPi-PLGA-NP)的形状为球形，平均粒径为155+/-4.5nm，ζ电位为-0.38+/-0.1mV，包封率为80.56+/-2.5％，以及负载率为1.16+/-0.04％。核心/壳结构颗粒在释放介质中是稳定的，并且可以保护pDNA免受核酸酶降解。它们还在体外表现出pDNA的持续释放。72h转染后CS-pDNA-CaPi-PLGA-NP的体外最高基因转染效率达到(24.66±0.46)％，明显高于游离pDNA[(0.33+/-0.04)％，P<0.01]和pDNA-PLGA-NP[(1.5+/-0.07)％，P<0.01]。转染持续的时间比嵌入pDNA-CaPi-PLGA-NP的时间更长，并且细胞毒性显著低于聚乙烯亚胺(PEI)的细胞毒性。因此，CS-pDNA-CaPi-PLGA-NP被认为是有前景的非病毒基因载体。
Jie Tang等人：“Calcium phosphate embedded PLGA nanoparticles:A promising gene delivery vector with high gene loading and transfection efficiency”,International Journal of Phramaceutics,Elsevier BV,NL,vol.431,2012-04-17,p.210-221(XP028503199,ISSN:0378-5173)。Jie Tang等人描述了包封在聚(乳酸-共-乙醇酸)-共聚物(PLGA)中的磷酸钙-pDNA纳米颗粒(pDNA-CaPi)的制备和体外评价。发现这些纳米颗粒在人胚肾细胞上的转染效率比加载有pDNA的PLGA纳米颗粒或比CaPi-pDNA包埋的PLGA微粒高得多。
Mingzehn Zang等人：Nano-structured composites based on calcium phosphatefor cellular delivery of therapeutic and diagnostic agents”,Nano today,vol.4,no.6,2009-12-01,p.508-517(XP055153407；ISSN:1748-0132)重点描述了特别用于核酸如siRNA的聚乙二醇化磷酸钙递送系统的纳米结构磷酸钙复合材料的用途。
目的和解决方案
Tang J.等人在Acta Pharmaceutica Sinica 2013,48(2)：298-304中描述了包封在聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物(PLGA)中的磷酸钙-pDNA纳米颗粒(pDNA-CaPi)(核心/壳(CS)结构)的制备和体外评价。CS-pDNA-CaPi-PLGA-纳米颗粒被认为是有前景的非病毒基因载体。
本发明的一个目的是改进CS-pDNA-CaPi-PLGA-NP的递送转移效率，以便获得用于增强活性成分特别是肽蛋白或核酸向活细胞的递送的载体。另一个目的是增强siRNA介导的基因沉默效率。同时，不应当增加递送载体的毒性。
该目的通过纳米颗粒解决，其中纳米颗粒由所请求保护的组分a)、b)、c)和d)组合，因此也可以称为“复合纳米颗粒”，其具有在10-300nm范围内的直径，所述直径是在纳米颗粒尺寸分布中的最大值，所述纳米颗粒包含
a)磷酸钙纳米颗粒核心a)，
b)在磷酸钙纳米颗粒核心a)上的活性成分包衣b)，
c)在活性成分包衣b)上的乳酸聚合物包衣c)，
d)在乳酸聚合物包衣c)上的阳离子聚合物包衣d)，其选自聚乙烯-亚胺、壳聚糖和长度为14至30个氨基酸的人乳铁蛋白衍生的肽。
详细描述
纳米颗粒(复合纳米颗粒)
本发明的纳米颗粒由所请求保护的组分a)、b)、c)和d)组合，因此也可以称为“复合纳米颗粒”。本发明的纳米颗粒可以是球形的。纳米颗粒可具有在10-600、20-500、50-250nm范围内的平均直径，其中平均直径优选通过动态光散射(DLS，强度％)测定。纳米颗粒可具有在10-300、20-250、80-150nm的范围内的直径，所述直径是在纳米颗粒尺寸分布中的最大值(峰值)，其中纳米颗粒尺寸分布中的最大值优选通过动态光散射(按数量计的DLS)测定。纳米颗粒的多分散指数(DLS)可以在0-0.8、0.05-0.7、0.1-0.7、0.3-0.7的范围内。
磷酸钙纳米颗粒核心a)
本发明的纳米颗粒包含在其上涂布有活性成分b)的磷酸钙纳米颗粒核心a)。在其上涂布有活性成分b)的磷酸钙纳米颗粒核心a)可以具有在10-400、20-300、50-200nm范围内的平均直径。平均直径优选通过动态光散射(DLS)测定。在其上涂布有活性成分b)的磷酸钙纳米颗粒核心a)的多分散性指数可以在0-0.7、0.05-0.7、0.1-0.7、0.3-0.7的范围内。
活性成分包衣b)
本发明的纳米颗粒包含活性成分包衣b)，其中活性成分涂布在磷酸钙纳米颗粒a)上。活性成分包衣是包含活性成分或由活性成分组成的包衣。“涂布在...上”还可以具有与磷酸钙纳米颗粒“缔合”或在磷酸钙纳米颗粒“的表面上缔合”的含义。磷酸钙纳米颗粒a)可优选通过活性成分的包衣层稳定，所述包衣层防止磷酸钙纳米颗粒的聚集或进一步生长。包衣或包衣层通过离子或静电相互作用附着至磷酸钙纳米颗粒的表面。
具有活性成分包衣b)的磷酸钙纳米颗粒核心a)可以通过将含有钙离子和磷酸根离子的水溶液与添加的活性成分(优选水溶液中的)混合至少1秒、优选1-5秒或1-60秒的停留(成核)时间来制备。在停留时间之后或期间，在沉淀过程中或之后形成其上涂布有活性成分的磷酸钙纳米颗粒。
在本申请意义上的活性成分是可以递送至哺乳动物或人体以实现治疗效果和/或治愈疾病的物质。优选地，活性成分是水溶性的。活性成分优选是肽、蛋白质或核酸。
活性成分可以优选是不同于人乳铁蛋白衍生的肽的肽，所述人乳铁蛋白衍生的肽可以用作阳离子聚合物包衣d)，并且其在本发明的意义上不被认为是活性成分。
合适的肽的实例是例如肽激素，例如人生长激素。
合适的蛋白质的实例是例如抗体、白细胞介素、干扰素、基于蛋白质的疫苗。
活性成分可以是核酸，例如双链或单链DNA或RNA、质粒DNA(pDNA)。
活性成分可以是siRNA(小干扰RNA)。
术语“siRNA”是本领域技术人员熟知的。典型的siRNA可以定义为约19-23个碱基对长度的双链RNA，其中单链可以在3'-末端重叠两个核苷酸。siRNA是来自大双链RNA(例如细胞mRNA或在病毒于活细胞中复制期间从该病毒产生的RNA)的裂解产物。这些类型的RNA可以例如通过酶“Dicer”切割减小为siRNA，Dicer是III型RNA酶。siRNA在转录后基因沉默过程中起重要作用。更长的siRNA(例如60个碱基对或更长)还可以通过表达载体来合成。因此，为了获得某些治疗效果和/或治愈某些疾病，将siRNA用作活性成分是令人高度感兴趣的。
乳酸聚合物包衣c)
本发明的纳米颗粒包含：在磷酸钙纳米颗粒核心a)上的活性成分包衣b)上的乳酸聚合物包衣c)，所述活性成分包衣b)涂布在磷酸钙纳米颗粒核心a)上。乳酸聚合物包衣是包含、主要包含或由乳酸聚合物组成的包衣。
具有活性成分的磷酸钙纳米颗粒核心a)可用作水包油包水(W1/O/W2)乳液的内水相(W1)，其中用于乳酸聚合物包衣c)的乳酸聚合物可以在有机溶液中在超声处理下加入到含有在其上具有活性成分b)的磷酸钙纳米颗粒核心a)的水相(W1)中，以得到油包水乳液(W1/O)，并且其中可以在超声处理下将油包水乳液(W1/O)加入到过量的另一水相(W2)中以得到水包油包水(W1/O/W2)乳液，其中可以除去有机溶剂以得到第一分散体，其中第一分散体的固体内容物可以通过离心或切向流过滤收集，其可以再分散在水中并且可经干燥以得到固体颗粒。
术语“乳酸聚合物”是指包含聚合的乳酸或丙交酯单元(优选至少10，至少20，至少30，至少40，至少50，至少60，至少70重量％或高达100％的聚合的乳酸或丙交酯单元)的聚合物或共聚物。丙交酯是乳酸的环状二酯。术语丙交酯应包括L-丙交酯、D-丙交酯或D,L-丙交酯。乳酸至聚乳酸聚合物的聚合可以通过在开环条件下的缩聚进行。可以分别与乳酸或丙交酯聚合的合适的共聚单体是乙交酯、ε-己内酯、三亚甲基碳酸酯或二噁烷酮。乳酸聚合物还可以包括含有选自乳酸聚合物的A-嵌段和选自聚乙二醇聚合物的B-嵌段的AB-或ABA-嵌段共聚物。
乳酸聚合物优选可以选自由选自a)至l)的单体组分或由所述单体组分的混合物合成的乳酸聚合物或共聚物：
a)D-和L-丙交酯，
b)L-丙交酯和乙交酯，
c)D,L-丙交酯和乙交酯，
d)L-丙交酯和ε-己内酯，
e)L-丙交酯和二噁烷酮，
f)L-丙交酯和三亚甲基碳酸酯，
g)L-丙交酯，D-丙交酯或D,L-丙交酯，
h)L-丙交酯，
i)DL-丙交酯，
j)L-丙交酯、D-丙交酯或D,L-丙交酯和ε-己内酯的统计分布的单体单元，
k)L-丙交酯、D-丙交酯或D,L-丙交酯和二噁烷酮的统计分布的单体单元，
l)L-丙交酯、D-丙交酯或DL-丙交酯和三亚甲基碳酸酯的统计分布的单体单元。
这些类型的“乳酸聚合物”是生物可降解的聚合物并且是本领域公知的，例如来自EP1468035,US6706854,WO2007/009919A2,EP1907023A,EP2263707A,EP2147036,EP0427185或US5610266。
优选地，乳酸聚合物是丙交酯-乙交酯共聚物。
优选地，乳酸聚合物是特性粘度IV为0.1-2.0、0.12-1.2、0.14-1.0、0.16-0.44、0.16-0.24[dL/g]的聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物。
优选的乳酸聚合物是聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物，其中聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物中D,L-丙交酯：乙交酯的比例为80:20至20:80、70:30至30:70、60:40至40:60或80:20至60:40重量份，其中D,L-丙交酯：乙交酯的份总计达100份(100％)。
优选的乳酸聚合物是RG 502(酯末端基团)或RG 502H(酸末端基团)类型，其是聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)-共聚物，其中D,L-丙交酯：乙交酯的比率为45:55至55:45(优选50:50)，并且特性粘度IV在0.16-0.44或0.16-0.24[dL/g]的范围内。
乳酸聚合物的分子量(Mw)可以在1.000-1000.000的范围内，优选在2.000-100.000的范围内，优选在3.000-25.000g/mol的范围内。测定分子量(Mw＝平均重量分子量)的分析方法是本领域技术人员公知的。通常，分子量Mw可以通过凝胶渗透色谱法或通过光散射法测定(参见例如H.F.Mark等人,Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,2nd Edition,Vol.10,pages 1ff.,J.Wiley,1989)。
乳酸聚合物可以通过约30至60、35至55℃的玻璃化转变温度Tg来表征。
乳酸聚合物通常是“生物可吸收的”，这意味着聚合物在植入或注射入人体或动物体内与体液接触后，在缓慢的水解反应中被分解成低聚物。水解终产物如乳酸或乙醇酸被代谢为二氧化碳和水。经常使用的术语“生物可吸收的聚酯”的其它可互换表述是“可吸收的聚酯”、“生物可降解聚酯”或“吸附聚酯”。
阳离子聚合物包衣d)
复合纳米颗粒包含在乳酸聚合物包衣c)上的阳离子聚合物包衣d)，其选自聚乙烯亚胺、壳聚糖和长度为14-30个氨基酸的人乳铁蛋白衍生的肽。因而在本发明的意义上“阳离子聚合物包衣”是指具有聚合物的包衣，所述聚合物含有一个或多个阳离子基团，分别地一个或多个阳离子侧基或可以至少在一定pH范围内(优选7.0或7.0以下的pH)成为阳离子(带正电)的一个或多个基团或一个或多个侧基。
包含其上涂布有活性成分b)的磷酸钙纳米颗粒核心a)和乳酸聚合物包衣c)的干燥固体颗粒可以再分散在水中，并且用于阳离子聚合物包衣d)的阳离子聚合物可以在搅拌下加入并孵育至少10或10-30分钟以得到包含作为固体内容物的复合纳米颗粒的第二分散体。可以通过离心收集第二分散体的固体内容物并将其再分散或干燥以得到包含复合纳米颗粒的水性分散体或干燥制剂。
聚乙烯亚胺
聚乙烯亚胺可以显示促进生物细胞摄取的功能，这意味着当与活性成分(活性药物成分(API))同时递送时，聚乙烯亚胺有利于和促进细胞中API的摄取。
较低分子量的聚乙烯亚胺似乎提供更好的转染效率，并且似乎对细胞具有较低的毒性。
优选的聚乙烯-亚胺可以具有在5.000至50.000、20.000至30.000g mol-1的范围内的分子量(Mw)。
测定分子量(Mw＝平均重量分子量)的分析方法是本领域技术人员公知的。通常，分子量Mw可以通过凝胶渗透色谱法或通过光散射法测定(参见例如H.F.Mark等人,Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,2nd Edition,Vol.10,pages 1ff.,J.Wiley,1989)。
壳聚糖
术语“壳聚糖”应包括所有不同类型的壳聚糖。壳聚糖是随机分布的β-(1-4)-连接的D-葡萄糖胺和N-乙酰基-D-葡萄糖胺的线性多糖。壳聚糖可以通过碱性氢氧化钠处理从虾或其它甲壳类动物的壳中获得。
合适的壳聚糖可以是低分子量壳聚糖，优选具有约20.000至250.000，更优选40.000至200.000道尔顿的分子量(Mw)。这具有的优势是所得纳米颗粒的尺寸可以为较小的尺寸。合适的壳聚糖可以被乙酰化至50至100，优选70至90％的程度。
人乳铁蛋白衍生的肽(HLf)
人乳铁蛋白衍生的肽可以显示生物细胞穿透功能(细胞穿透肽(CPP)，例如WO 2007/048599或WO 2007/076904A1)，这意味着当与活性药物成分(API)同时递送至人细胞时，人乳铁蛋白衍生的肽有利于和促进细胞中API的摄取。
人乳铁蛋白衍生的肽可以显示这样的氨基酸序列，其在编码其细胞穿透功能的序列区域内与天然人乳铁蛋白的氨基酸序列具有至少50、60、70、80、90或100％的相似性。
人乳铁蛋白衍生的肽是含有一个或多个氨基酸的阳离子聚合物，所述氨基酸具有可以至少在pH 7或低于pH 7时成为阳离子(在水性环境中带正电)的侧基(例如精氨酸(R)或赖氨酸K))。在本发明的意义上，人乳铁蛋白衍生的肽本身不被认为是活性成分。
人乳铁蛋白衍生的肽可以具有14至30、19至30、20至25、21至23或22个氨基酸的长度。优选地，人乳铁蛋白衍生的肽的氨基酸序列可以包括至少两个或两个半胱氨酸残基。优选地，人乳铁蛋白衍生的肽的氨基酸序列可以包括可以形成内部半胱氨酸-半胱氨酸桥(胱氨酸-桥)的至少两个或两个半胱氨酸残基。优选地，两个半胱氨酸残基以氧化形式存在，形成内部胱氨酸-桥。
合适的人乳铁蛋白衍生的肽可以具有14至30、19至30、20至25、21至23或22个氨基酸的长度，并且可以包含至少4，至少6，4至8，5至7或6个具有在pH 7或低于pH 7时带正电荷的侧链的氨基酸，优选精氨酸和/或赖氨酸。
合适的人乳铁蛋白衍生的肽可以具有14至30、19至30、20至25、21至23或22个氨基酸的长度，并且可以包括根据SEQ.ID.No.1KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR的氨基酸序列或与序列SEQ.ID.No.1在不超过8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸位置上不同的序列。
术语“氨基酸位置上不同”的含义应当理解为，与序列SEQ.ID.No.1相比，在某个位置存在不同的氨基酸或在某个位置没有氨基酸或在序列内存在额外的氨基酸或添加额外的氨基酸到序列中或这些情况的任何组合。
最优选地，人乳铁蛋白衍生的肽与序列SEQ.ID.No.1在不超过8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸位置上不同，其中存在至少两个半胱氨酸或两个半胱氨酸残基，优选存在根据SEQ ID.No.1的位置2和19的两个半胱氨酸。优选地，半胱氨酸残基以氧化形式存在，形成内部半胱氨酸-半胱氨酸桥(胱氨酸-桥)。
人乳铁蛋白衍生的肽可以优选是具有根据SEQ.ID.No.1KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR的氨基酸序列或与该序列至少80或90％同源的序列的肽。优选地，存在SEQ.ID.No.1的位置2和19或相似或相应位置上的半胱氨酸残基。
药物组合物
本申请还公开了包含纳米颗粒的药物组合物，所述纳米颗粒是如前所述的复合纳米颗粒。
制备复合纳米颗粒的方法
本申请还公开了用于分别制备本发明的纳米颗粒和复合纳米颗粒的方法。
制备复合纳米颗粒的方法可以优选如下进行：磷酸钙纳米颗粒核心a)通过将包含钙离子的水溶液与包含磷酸根离子的水溶液混合来制备，优选混合至少1或1-3、或1-60秒，其中在混合之前、期间或优选在混合后加入活性成分b)，以得到具有活性成分包衣b)的磷酸钙纳米颗粒核心a)。包含钙离子的水溶液可以是包含水溶性钙盐(例如氯化钙(CaCl2)，L-乳酸钙(Ca(CH3-HCOH-COO)2)或硝酸钙(Ca(NO3)2))的水溶液。包含磷酸根离子的水溶液可以是包含水溶性磷酸根(例如磷酸氢二钠(Na2HPO4)或磷酸氢二铵((NH4)2HPO4))的水溶液。
两种水溶液可以首先在Y型适配器(优选长度为5至20mm)中混合在一起，其中混合溶液在它们连续混合(例如通过)之前可具有至少1或1-3或1-60的停留(成核)时间，优选具有10至30μl/sec的流速。
优选地，包含钙离子的水溶液不包含磷酸根离子。优选地，包含磷酸根离子的水溶液不包含钙离子。
活性成分，优选水溶性活性成分，例如肽、蛋白质、DNA或RNA、siRNA(小干扰RNA)，可以已经添加到包含钙离子或磷酸根的水溶液中的一种或两种(在这些溶液混合之前、期间或之后)。
包含钙离子和磷酸根离子和活性成分的混合水溶液可以用作水包油包水(W1/O/W2)乳液的内水相1(W1＝水相1，O＝油相，W2＝水相2)，其中用于聚合物包衣c)的乳酸聚合物优选通过超声处理在有机溶液中加入至水相(W1)，以得到油包水乳液(W1/O)，并且其中将油包水乳液(W1/O)优选通过超声处理加入至另外的水相2(W2)，优选加入至过量(过量体积)的另外的水相2(W2)，以得到水包油包水(W1/O/W2)乳液，其中除去有机溶剂以得到第一分散体，其中优选通过离心收集第一分散体的固体内容物，将其再分散在水中并干燥以得到固体颗粒，其中将干燥的固体颗粒再分散在水中，并且在搅拌下优选以至少10分钟的孵育时间加入用于阳离子聚合物包衣d)的阳离子聚合物，以得到包含复合纳米颗粒作为固体内容物的第二分散体，其中第二分散体的固体内容物可通过离心收集并进行再分散或干燥，以得到包含复合纳米颗粒的水性分散体或干燥制剂。
用途
本申请还公开了本发明的纳米颗粒在制备药物组合物的方法中的用途，所述药物组合物适合用于包含在纳米颗粒中的活性成分的口服或胃肠外递送。
实施例
材料
PLGA＝聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)50:50(RG 502H,Mw＝7,000-17,000g mol-1,Evonik Industries AG(Darmstadt))。聚乙烯醇(PVA，Mw＝30,000-70,000g mol-1,87-90％水解)、壳聚糖(低分子量，75-85％脱乙酰化)和聚乙烯亚胺(PEI，Mw＝25,000g mol-1)购自Sigma-Aldrich。对于使用抗eGFP-siRNA(eGFP＝增强的绿色荧光蛋白)的基因沉默实验，使用来自Invitrogen,(Carlsbad,USA)的脱盐的双链siRNA，有义5′-GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU-3′(SEQ ID No.7)和反义5′-AUGAACUUCAGGGUCAGCUUGC-3′(SEQ ID No.8)(Mw＝14,019.5g mol-1)。对于使用质粒DNA的转染实验，使用Nucleobond不含内毒素的质粒DNA试剂盒(Macherey-Nagel,Dueren,Germany)从大肠杆菌(Echerichia coli)中分离编码增强的荧光蛋白(eGFP)的pcDNA3-eGFP。所有其它化学品均为分析纯，并且不经进一步纯化即可使用。
实施例中使用的人乳铁蛋白衍生的肽(HLf)是具有根据SEQ.ID.No.1KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR的氨基酸序列的合成肽。
仪器
对于油包水和水包油包水乳液的形成，用Hielscher UP50H仪器(超声波发生器MS2，70％振幅，脉冲0.7)进行声波处理(超声)20秒。使用Smoluchowski近似并且在没有进一步校正的情况下获取来自Malvern软件的数据，利用Zetasizer纳米系列仪器(Malvern Nano-ZS，激光：λ＝532nm)进行动态光散射和ζ电位测定。粒度数据是指散射强度分布(z均值)。使用具有63x水物镜的共聚焦激光扫描显微镜(SP5LCSM，Leica)进行共聚焦激光扫描显微镜检查。在4℃下使用Heraeus Fresco 21仪器(Thermo Scientific)进行离心。使用Carl Zeiss Axiovert 40CFL仪器通过透射光和荧光光谱测定转染和基因沉默效率。通过使用Multiscan FC仪器(ThermoFisher scientific，Vantaa，Finland)在λ＝570nm处的分光光度分析的MTT测试分析细胞的存活力。用Christ，Alpha 2-4LSC仪器进行冷冻干燥。
实施例概述
实施例1：磷酸钙(CaP)-活性成分纳米颗粒的合成
实施例1a：CaP-eGFP-DNA纳米颗粒的合成
实施例1b：CaP-抗eGFP-siRNA纳米颗粒的合成
实施例2：CaP-活性成分-PLGA-纳米颗粒的合成
实施例2a：CaP-(FITC-BSA)-PLGA纳米颗粒的合成
实施例2b：CaP-抗eGFP-siRNA纳米颗粒的合成
实施例2c：CaP-eGFP-DNA-PLGA纳米颗粒的合成
实施例3：CaP-抗eGFP-siRNA-PLGA-阳离子聚合物纳米颗粒的合成
实施例3a：CaP-抗eGFP-siRNA-PLGA-PEI纳米颗粒的合成
实施例3b：CaP-抗eGFP-siRNA-PLGA-壳聚糖纳米颗粒的合成
实施例3c：CaP-抗eGFP-siRNA-PLGA-HLf纳米颗粒的合成
实施例4：细胞摄取(HeLa细胞)
实施例5：基因沉默
实施例1：CaP-活性成分纳米颗粒的合成
使用快速沉淀法合成磷酸钙纳米颗粒。核酸吸附在磷酸钙纳米颗粒的表面上。因此，晶体生长被抑制，并且磷酸钙纳米颗粒是静电稳定的。在这种情况下，DNA或siRNA既作为活性成分，又作为保护分散体不聚集的稳定剂。
实施例1a：CaP-eGFP-DNA纳米颗粒的合成
在带有注射泵的管式反应器中通过Y型适配器将硝酸钙(6.25mM，105μL)和磷酸氢二氨(3.74mM，105μL)的水溶液混合，并在连续混合(Vortex)下泵至eGFP-DNA的水溶液(2.5mg/mL，40μL)中。溶液的流速为16.6μL s-1，在Y型适配器(7mm长)中的停留(成核)时间为1.3s。在完成沉淀后，用冰冷却纳米颗粒的分散体(核心：磷酸钙；壳：核酸)，并在孵育5分钟后用于封装入PLGA纳米颗粒。
实施例1b：CaP-抗eGFP-siRNA纳米颗粒的合成
在带有注射泵的管式反应器中通过Y型适配器将硝酸钙(6.25mM，105μL)和磷酸氢二氨(3.74mM，105μL)的水溶液混合，并在连续混合(Vortex)下泵至抗eGFP-siRNA的溶液(3.9mg/mL，40μL)中。两种溶液的流速为16.6μL s-1，在Y型适配器(7mm长)中的停留(成核)时间为1.3s。在完成沉淀后，用冰冷却纳米颗粒的分散体(核心：磷酸钙；壳：核酸)，并在孵育5分钟后用于封装入PLGA纳米颗粒。
实施例2：CaP-活性成分-PLGA纳米颗粒的合成
为了保护DNA或siRNA的外壳免于降解酶如DNA酶或RNA酶的影响并提供颗粒的持续释放特征谱，随后将磷酸钙-DNA或磷酸钙-siRNA纳米颗粒分别包封在实施例2b和2c中的PLGA基质中。水性的磷酸钙-DNA或磷酸钙-siRNA分散体用作乳液过程中的内水相(W1)。将聚合物溶于二氯甲烷(O)中。超声处理导致在油相中具有细小水滴(含有磷酸钙纳米颗粒)的初级W1/O乳液。至连续水相的添加(在水中的PVA)和随后的超声处理得到稳定的W1/O/W2乳液。在减压下蒸发有机溶剂得到几乎透明的分散体。
实施例2a：CaP-(FITC-BSA)-PLGA纳米颗粒的合成
应该用FITC-BSA(异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白)标记纳米颗粒，以便通过荧光显示纳米颗粒的细胞摄取。对于用标记分子FITC-BSA的官能化，磷酸钙因此在乳液过程中在初级W1/O-乳液中沉淀。这是必要的，因为FITC-BSA吸附至磷酸钙纳米颗粒，但不胶态稳定它们(除非是DNA或RNA)。
在第一步中制备两种W1/O-乳液(A和B)。乳液A含有内部水滴中的磷酸根溶液和生物分子并且PLGA溶解在有机相中。乳液B含有内水相中的钙盐溶液，并且PLGA溶于有机相中。在超声处理下混合两种乳液导致磷酸钙在内部水滴中的沉淀。将组合的W1/O-乳液加入连续水相(在水中的PVA)和超声处理得到稳定的W1/O/W2乳液。减压蒸发有机溶剂得到几乎透明的黄色分散体。使用该方法，通过有机溶剂中的小体积的水滴(微反应器)限制晶体生长。
通过W1/O/W2乳液溶剂蒸发法合成磷酸钙-FITC-BSA-PLGA纳米颗粒。首先，通过超声处理制备两种W/O乳液(A和B)。对于乳液A，将625μg FITC-BSA溶于125μL的10mM Na2HPO4溶液中。将其分散在二氯甲烷中的PLGA溶液(13.3mg mL-1，375μL)中。对于乳液B，将625μg FITC-BSA溶于125μL1.25M CaCl2溶液(1,25M，125μL)中。将其分散在二氯甲烷中的PLGA溶液(13.3mg mL-1，375μL)中。然后，通过超声处理(10秒)混合乳液A和B以形成乳液C。然后将该W1/O-乳液滴加到含有30mg PVA作为分散剂的连续水相(3mL)中，并再次超声处理(超声波发生器)以形成黄色的乳状的W1/O/W2乳液。在减压(200-600mbar)下除去二氯甲烷后，将磷酸钙-FITC-BSA纳米颗粒掺入PLGA颗粒中。通过离心(在14,800rpm下30分钟)和通过超声处理(超声波发生器)将颗粒在超纯水中再分散三次除去过量的PVA和FITC-BSA。为了确定FITC-BSA的包封效率，在用溶解的FITC-BSA进行先前的校准之后，通过UV/Vis光谱在460nm处分析上清液。将所得分散体在液氮中冲击冷冻，最后在0.31mbar和-10℃下冻干72小时。通过轻轻摇动，颗粒容易在水中再分散。
磷酸钙-PLGA纳米颗粒包含5％的磷酸钙，如通过原子吸收光谱法(由钙的含量计算)测定的。
实施例2b：CaP-抗eGFP-siRNA-PLGA纳米颗粒的合成
为了将抗eGFP-siRNA官能化的磷酸钙纳米颗粒包封到PLGA纳米颗粒中，应用水包油包水(W1/O/W2)双乳液溶剂蒸发法。向溶于750μL二氯甲烷中的10mg PLGA的溶液中加入250μL来自实施例1b的磷酸钙/核酸纳米颗粒的分散体。然后加入在40μL水中的200μg无RNA酶的乙酰化牛血清白蛋白(BSA)的溶液作为分散剂。将混合物超声处理(超声波发生器，15s)以形成初级乳白色W1/O-乳液。然后将W1/O-乳液立即倒入含有30mg聚乙烯醇(PVA)作为分散剂的连续水相(3mL)中，并再次超声处理(超声波发生器，15s)。
最后，在减压(200-600mbar)下在旋转蒸发器中除去二氯甲烷后，沉淀PLGA纳米颗粒。因此，将携带siRNA的磷酸钙纳米颗粒掺入PLGA的纳米颗粒基质中。通过离心(在14,800rpm下30分钟)和将颗粒在超纯水中再分散三次除去过量的PVA。为了确定核酸的包封效率，根据标准方案通过UV/Vis光谱在260nm处分析剩余的上清液。将所得分散体在液氮中冲击冷冻，最后在0.31mbar和-10℃下冻干72小时。通过轻轻摇动，颗粒容易在水中再分散。
实施例2c：CaP-eGFP-DNA-PLGA纳米颗粒的合成
为了将eGFP-DNA官能化的磷酸钙纳米颗粒包封到PLGA纳米颗粒中，应用水包油包水(W1/O/W2)双重乳液溶剂蒸发法。向溶于750μL二氯甲烷的10mg PLGA的溶液中加入250μL来自实施例1a的磷酸钙/核酸纳米颗粒的分散体。然后加入40μL 20mg/ml无RNA酶的乙酰化牛血清白蛋白(BSA)的水溶液作为分散剂。将混合物超声处理(超声波发生器，15s)以形成初级乳白色W1/O-乳液。然后将W1/O-乳液立即倒入含有30mg聚乙烯醇(PVA)作为分散剂的连续水相(3mL)中，再次超声处理(超声波发生器，15s)。
最后，在减压(200-600mbar)下在旋转蒸发器中除去二氯甲烷后，沉淀PLGA纳米颗粒。因此，将携带DNA的磷酸钙纳米颗粒掺入PLGA的纳米颗粒基质中。通过离心(在14,800rpm下30分钟)和将颗粒在超纯水中再分散三次来除去过量的PVA。为了确定核酸的包封效率，根据标准方案通过UV/Vis光谱在260nm处分析剩余的上清液。将所得分散体在液氮中冲击冷冻，最后在0.31mbar和-10℃下冻干72小时。通过轻轻摇动，颗粒容易在水中再分散。
实施例3：CaP-siRNA-PLGA-阳离子聚合物纳米颗粒的合成
为了增强磷酸钙-PLGA纳米颗粒的细胞摄取，可以通过逐层沉积阳离子聚合物如壳聚糖、PEI和HLf来逆转表面电荷。此外，聚合物(壳聚糖和PEI)能够诱导质子海绵效应。这导致纳米颗粒的增强的内体逃逸和增加的治疗效率。如ζ电位测量所示，磷酸钙-PLGA纳米颗粒的表面电荷可以容易地通过逐层沉积阳离子聚合物从约-24mV逆转至+50mV(壳聚糖)、至+31mV(PEI)或+10mV(HLf)。HLf修饰的CaP-siRNA-PLGA颗粒的SEM图像显示球形纳米颗粒。纳米颗粒的尺寸和形态没有显著变化。
实施例3a：CaP-siRNA-PLGA-PEI纳米颗粒的合成
将1.5mg来自实施例2b的冻干颗粒重悬于1mL超纯水中并在连续搅拌下滴加至PEI水溶液(1mL中的2mg)中。在室温下连续搅拌30分钟后，通过离心(在14,800rpm下30分钟)和在超纯水中再分散(摇动，无需超声处理)将分散体纯化三次。对于细胞培养实验，将颗粒最终再分散在细胞培养基中。
实施例3b：CaP-siRNA-PLGA-壳聚糖纳米颗粒的合成
将1.5mg来自实施例2b的冻干颗粒重悬于1mL超纯水中，并在连续搅拌下滴加到壳聚糖水溶液(1mL中的5mg，用乙酸调节pH至5)中。在室温下连续搅拌30分钟后，通过离心(在14,800rpm下30分钟)和在超纯水中再分散(摇动，无需超声处理)将分散体纯化三次。对于细胞培养实验，将颗粒最终再分散在细胞培养基中。
实施例3c：CaP-siRNA-PLGA-HLf纳米颗粒的合成
将3mg来自实施例2b的冻干颗粒重悬于3ml超纯水中并在连续搅拌下加入至3ml(2mg/ml)人乳铁蛋白溶液中2小时。将处理的颗粒冷冻干燥。对于细胞培养实验，将颗粒通过离心(在14,800rpm下30分钟)在超纯水中再分散和纯化，并最终再分散于细胞培养基中。
实施例4：细胞摄取(HeLa)
将HeLa细胞在补充有10％胎牛血清(FCS)、100U mL-1青霉素和100U mL-1链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中在37℃、5％CO2空气下培养。
用细胞进行细胞摄取实验，将细胞在使用前接种并培养在8孔板中24小时。将CaP-(FITC-BSA)-PLGA纳米颗粒溶液(未修饰的(实施例2b)，用壳聚糖、PEI或HLf修饰的(实施例3))加入至细胞1小时和3小时。对于荧光显微镜检查，细胞核用DAPI着色。荧光显微镜图像清楚地显示，修饰的CaP-(FITC-BSA)-PLGA纳米颗粒被HeLa细胞有效摄取。在1小时后PEI修饰的CaP-(FITC-BSA)-PLGA纳米颗粒有效累积，而在3小时后可有效地显示壳聚糖或HLf修饰的CaP-(FITC-BSA)-PLGA纳米颗粒的摄取。
对于共定位实验，将HeLa细胞接种在8孔板(Lab-Tek)中并培养24小时。然后，根据制造商的说明书，用50ng Lamp1-RFP质粒-DNA和0.3μl Lipofectamine 2000(Life technology)转染HeLa细胞。4小时后，更换细胞培养基，并用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞几次。在另外的16小时后，用纳米颗粒分散体(20μL，1mg纳米颗粒mL-1)处理细胞，并用共聚焦激光扫描显微镜在不同的时间点检查。
磷酸钙-(FITC-BSA)-PLGA纳米颗粒的细胞摄取研究和使用表达Lamp1-RFP的HeLa细胞的共定位实验显示纳米颗粒被细胞有效吸收。具有负表面电荷的纳米颗粒对细胞膜具有低亲和力，并且仅被适度摄取，而具有正表面电荷的纳米颗粒(壳聚糖-或PEI-官能化纳米颗粒)由于带负电荷的细胞膜与纳米颗粒的阳离子表面的静电相互作用在孵育1小时后覆盖细胞膜。此外，大多数带负电的磷酸钙-(FITC-BSA)-PLGA纳米颗粒终止在内体中，如通过Lamp1-RFP的共定位和FITC-BSA的绿色荧光所示。相比之下，壳聚糖-和PEI-官能化的磷酸钙-(FITC-BSA)-PLGA纳米颗粒(正的表面电荷)诱导质子海绵效应并逃逸出内体，如在孵育3小时后细胞质中的扩散绿色荧光所示。
实施例5：基因沉默
将HeLa-eGFP细胞(表达增强的绿色荧光蛋白eGFP的遗传修饰的HeLa细胞)在补充有10％FCS(胎牛血清)、100U mL-1青霉素、100U mL-1链霉素和50μg mL-1遗传霉素的DMEM中在37℃和5％CO2空气中培养。在添加纳米颗粒前12小时，将细胞胰蛋白酶化，并以每孔2.5×104个细胞的密度接种在24孔板中。
在转染前，将细胞培养基替换为再分散于新鲜细胞培养基(0.5mL中的0.1mg纳米颗粒，相当于每孔0.8μg-1μg siRNA)中的纳米颗粒。孵育7小时后，用新鲜细胞培养基替换转染培养基。在添加纳米颗粒后72小时通过光学显微术和荧光显微术测量基因沉默的效率。
作为对照，如制造商推荐的用LipofectamineTM 2000转染细胞。简言之，将50μL的DMEM(不含FCS)与1μL LipofectamineTM 2000混合，并在室温下孵育5分钟。将抗eGFP-siRNA(20pmol，0.28μg)加入至50μL DMEM(不含FCS)中。然后，将两种溶液混合并孵育20分钟，然后向每个孔中加入100μL的该溶液和另外400μL的DMEM。孵育7小时后，用新鲜细胞培养基替换转染培养基。
从荧光显微镜图像计算使用抗eGFP-siRNA功能化的磷酸钙-PLGA纳米颗粒的基因沉默实验的效率，按照如下计算：
(转染后不发荧光的细胞[％]-对照中不发荧光的细胞[％])/(对照中发荧光的细胞[％])*100
在相同条件下培养但没有任何处理的HeLa-eGFP细胞用作对照。
用抗eGFP-siRNA功能化的磷酸钙-PLGA纳米颗粒有效地敲低表达eGFP的HeLa细胞中的eGFP编码基因。用壳聚糖、PEI或HLf涂布的阳离子磷酸钙-PLGA-siRNA纳米颗粒分别显示出28、50或51％的基因沉默效率。根据转染实验，用磷酸钙-PLGA纳米颗粒处理后的细胞的活力在与脂质体转染试剂例如相比的范围内或甚至更高。用壳聚糖、PEI-或HLf涂布的阳离子磷酸钙-PLGA-siRNA纳米颗粒显示出良好的细胞活力，尽管已知PEI具有细胞毒性。结果总结在表1中。
表1
序列表
<110> Evonik Rohm GmbH
<120>纳米颗粒
<130> 2013P00376WO
<150> EPEP14170333
<151> 2014-05-28
<160> 8
<170> BiSSAP 1.2
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工合成
<220>
<223> WO 2007/048599中的相同SEQ ID No. 3
<400> 1
Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro
1 5 10 15
Val Ser Cys Ile Lys Arg
20
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工合成
<220>
<223> WO 2007/048599中的SEQ ID No. 4
<400> 2
Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val
1 5 10 15
Ser Cys
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<220>
<223> WO 2007/048599中的SEQ ID No. 5
<400> 3
Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工合成
<220>
<223> WO 2007/048599中的SEQ ID No. 6
<400> 4
Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工合成
<220>
<223> WO 2007/048599中的SEQ ID No. 29
<400> 5
Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser
1 5 10 15
Ile Thr Cys Val Arg Arg
20
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工合成
<220>
<223> WO 2007/048599中的SEQ ID No. 30
<400> 6
Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile
1 5 10 15
Thr Cys
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 来源
<222> 1..22
<223> /分子类型="其它 RNA"
/注释="抗-eGFP-siRNA, 有义"
/生物体="人工合成"
<400> 7
gcaagcugac ccugaaguuc au 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 来源
<222> 1..22
<223> /分子类型="其它RNA"
/注释="抗-eGFP-siRNA, 反义"
/生物体="人工合成"
<400> 8
augaacuuca gggucagcuu gc 22