发明背景生物骨替代品必需符合以下要求：具有高度多孔性，并提供用于细胞再生的微环境，例如支持细胞附着、增殖、分化，并以此启动和维持新组织产生。为制造用于组织工程的三维(3D)支架，已开发利用了各种金属。尽管金属具有有利的机械性能，但其缺点是不可生物降解。同步的是，无机/陶瓷材料，例如羟基磷灰石(HA)或磷酸钙已被开发展现出所需的骨传导性，但难以产生高度多孔的结构且是易碎的。最后，模拟生命系统结构的仿生人工设计支架，提供了生理性胞外基质的特性以在植入的生物材料中募集细胞。关于这点，源于壳质的壳聚糖尤其令人感兴趣。壳聚糖壳聚糖是衍生自通过β-(1-4)-连接的D-葡萄糖胺和N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元随机构建的壳质的多糖。壳聚糖显示出用于组织工程目的的合适特性。该聚合物是生物相容的和生物可降解的，并且既可作为凝胶和组织样单元用于3D-支架，也可作为膜和纤维用于2D-支架(CroisierF,C.Chitosan-basedbiomaterialsfortissueengineering.EuropPolymerJ2013；49:780-792)。壳聚糖已用作空间填充的植入物。然而，该天然聚合物必需与具有形态发生活性的组分(如硅石)一起加工，以成为用于骨再生的合适基质(ShirosakiY,TsuruK,HayakawaS,OsakaA,LopesMA,SantosJD,CostaMA,FernandesMH.Physical,chemicalandinvitrobiologicalprofileofchitosanhybridmembraneasafunctionoforganosiloxaneconcentration.ActaBiomater2009；5:346-355)。骨修复期间的必要阶段骨修复是可划分为能受“智能的”阶段特异性支架材料影响的多个阶段的过程。阶段1-血液凝固和polyP的作用：骨修复通过骨缺损位点的血液凝固来引发。密集的人血小板颗粒含有大量polyP，其链长为70-75个(RuizFA,LeaCR,OldfieldE,DocampoR.Humanplateletdensegranulescontainpolyphosphateandaresimilartoacidocalcisomesofbacteriaandunicellulareukaryotes.JBiolChem2004；279:44250-44257)，或60-100个磷酸盐单元(MüllerF,MutchNJ,SchenkWA,SmithSA,EsterlL,SpronkHM,SchmidbauerS,GahlWA,MorrisseyJH,RennéT.Plateletpolyphosphatesareproinflammatoryandprocoagulantmediatorsinvivo.Cell2009；139:1143-1156)，其在血小板激活后被释放(SmithSA,MutchNJ,BaskarD,RohloffP,DocampoR,MorrisseyJH.Polyphosphatemodulatesbloodcoagulationandfibrinolysis.ProcNatlAcadSciUSA2006；103:903-908)。血小板分泌的PolyP充当止血调节物；其为通过促进因子V活化和接触途径活化来加速血液凝固的促凝血剂(SmithSA,MorrisseyJH.Polyphosphateasageneralprocoagulantagent.JThrombHaemost2008；6:1750-1756)。另一方面，polyP通过增强凝血酶激活的纤维蛋白溶解抑制剂来延迟血块溶解(SmithSA,MutchNJ,BaskarD,RohloffP,DocampoR,MorrisseyJH.Polyphosphatemodulatesbloodcoagulationandfibrinolysis.ProcNatlAcadSciUSA2006；103:903-908)。血块中发现了一系列的生长因子，包括成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子β(TGF-b)和血管内皮生长因子(VEGF)。这些因子可增强骨生成的不同阶段。例如，成骨细胞祖细胞的增殖是由PDGF、EGF和FGF-2刺激的。阶段2–碳酸钙生物种子形成：可以证实生物方解石(biocalcite)(CaCO3)在引发骨HA形成期间发挥了关键作用。已证明CaCO3沉积物起磷酸钙沉淀至骨形成细胞上的生物种子的作用(MüllerWEG,HC,SchlossmacherU,GrebenjukVA,UshijimaH,WangXH.InductionofcarbonicanhydraseinSaOS-2cells,exposedtobicarbonateandconsequencesforcalciumphosphatecrystalformation.Biomaterials2013；34:8671-8680)。尤其是，通过磷酸钙沉积物的最初形成，碳酸酐酶不仅促进碳酸氢钙/碳酸钙生物矿物形成，而且还与polyP/焦磷酸盐-降解骨碱性磷酸酶(组织-非特异性ALP)一起发挥作用。阶段3–羟基磷灰石沉积：最初形成的磷酸钙沉积物随后通过所述ALP转化为磷酸钙/HA矿物，开启了骨疾病治疗干预新策略的进展，如具有形态发生活性的植入物材料的进展(WangXH,HC,MüllerWEG.Enzyme-basedbiosilicaandbiocalcite:biomaterialsforthefutureinregenerativemedicine.TrendsBiotechnol2014,inpress；doi:10.1016/j.tibtech.2014.05.004)。聚磷酸盐(polyP)此前本发明人公开了HA沉积于骨细胞的过程中的polyP的作用。PolyP是天然存在的含有两个至上百个磷酸盐残基的线性聚合物(HC,MüllerWEG,eds.InorganicPolyphosphates-Biochemistry,Biology,Biotechnology.ProgMolSubcellBiol1999；23:45-81)。可化学合成和酶促合成PolyP(KulaevIS,VagabovV,KulakovskayaT.TheBiochemistryofInorganicPolyphosphates.NewYork:JohnWiley&SonsInc；2004)。通过聚磷酸盐激酶来酶促合成PolyP，并且通过外切聚磷酸酶和内切聚磷酸酶来酶促降解PolyP(综述于:HC,LorenzB,KurzL,MüllerWEG.InorganicpolyPineukaryotes:enzymes,metabolismandfunction.InHC,MüllerWEG,eds,InorganicPolyphosphates-Biochemistry,Biology,Biotechnology.ProgMolSubcellBiol1999；23:45-81)。已知有多种降解polyP的酶(例如,LorenzB,MüllerWEG,KulaevIS,HC.PurificationandcharacterizationofanexopolyphosphataseactivityfromSaccharomycescerevisiae.JBiolChem1994；269:22198-22204)，其中有骨ALP(LorenzB,HC.Mammalianintestinalalkalinephosphataseactsashighlyactiveexopolyphosphatase.BiochimBiophysActa2001；1547:254-261)。骨ALP(组织非特异性ALP)是通过针对单体磷酸盐的过程型机制来降解polyP的外切聚磷酸酶(LorenzB,HC.Mammalianintestinalalkalinephosphataseactsashighlyactiveexopolyphosphatase.BiochimBiophysActa2001；1547:254-261)。PolyP存在于骨组织中(LeyhausenG,LorenzB,ZhuH,GeurtsenW,BohnensackR,MüllerWEG,HC.Inorganicpolyphosphateinhumanosteoblast-likecells.JBoneMineralRes1998；13:803-812；HC,KurzL,MüllerWEG,LorenzB.Polyphosphateinbone.Biochemistry(Moscow)2000；65:296-303)，并存在于血小板中(SmithSA,MutchNJ,BaskarD,RohloffP,DocampoR,MorrisseyJH.Polyphosphatemodulatesbloodcoagulationandfibrinolysis.ProcNatlAcadSciUSA2006；103:903-908)。PolyP在与Ca2+离子形成复合体后(polyP·Ca2+-复合体或polyP·Ca2+-盐)为具有形态发生活性的；所述polyP·Ca2+-复合体-诱导骨ALP(组织非特异性ALP)的表达并增强其活性(MüllerWEG,WangXH,Diehl-SeifertB,KropfK,SchloβmacherU,LieberwirthI,GlasserG,WiensM,HC.Inorganicpolymericphosphate/polyphosphateisaninducerofalkalinephosphataseandamodulatorofintracellularCa2+levelinosteoblasts(SaOS-2cells)invitro.ActaBiomater2011；7:2661-2671)；-增加成骨细胞中的细胞内Ca2+水平(MüllerWEG,WangXH,Diehl-SeifertB,KropfK,SchloβmacherU,LieberwirthI,GlasserG,WiensM,HC.Inorganicpolymericphosphate/polyphosphateisaninducerofalkalinephosphataseandamodulatorofintracellularCa2+levelinosteoblasts(SaOS-2cells)invitro.ActaBiomater2011；7:2661-2671)；-增强骨(HA)形成细胞中编码BMP-2的基因的表达(WangXH,HC,Diehl-SeifertB,KropfK,SchloβmacherU,WiensM,MüllerWEG.Dualeffectofinorganicpolymericphosphate/polyphosphateonosteoblastsandosteoclastsinvitro.JTissueEngRegenMed2013；7:767-776)；-诱导HA形成(WangXH,HC,Diehl-SeifertB,KropfK,SchloβmacherU,WiensM,MüllerWEG.Dualeffectofinorganicpolymericphosphate/polyphosphateonosteoblastsandosteoclastsinvitro.JTissueEngRegenMed2013；7:767-776)；以及-抑制破骨细胞的分化(WangXH,HC,Diehl-SeifertB,KropfK,SchloβmacherU,WiensM,MüllerWEG.Dualeffectofinorganicpolymericphosphate/polyphosphateonosteoblastsandosteoclastsinvitro.JTissueEngRegenMed2013；7:767-776)。下列涉及polyP或polyP·Ca2+-复合体的专利申请为相关的：GB1406840.7.用于生物打印生物人工组织的具有形态发生活性的水凝胶(Morphogeneticallyactivehydrogelforbioprintingofbioartificialtissue)。发明人：MüllerWEG,HC,WangXH。GB1403899.6.包含槲皮素和聚磷酸盐的用于治疗骨疾病的协同组合物(Synergisticcompositioncomprisingquercetinandpolyphosphatefortreatmentofbonedisorders)。发明人：MüllerWEG,HC,WangXH。GB1319416.2.基于聚磷酸盐/碳酸盐和碳酸酐酶激活剂的组合的骨矿化调节剂(Modulatorofbonemineralizationbasedonacombinationofpolyphosphate/carbonateandcarbonicanhydraseactivators)。发明人：MüllerWEG,HC,WangXH。在本发明中描述了polyP与壳聚糖的复合体，其可用作用于骨组织工程和修复的仿生材料，所述仿生材料特性为具有可控的形态并展示出形态发生活性。在生理条件下，壳聚糖不能与polyP形成复合体。因此，本发明人采用最新技术程序使壳聚糖衍生为N,O-羧甲基壳聚糖(N,O-CMC)(ChenSC,WuYC,MiFL,LinYH,YuLC,SungHW.AnovelpH-sensitivehydrogelcomposedofN,O-carboxymethylchitosanandalginatecross-linkedbygenipinforproteindrugdelivery.JControlRelease2004；96:285-300；AnithaA,DivyaRaniVV,KrishnaR,SreejaV,SelvamuruganN,NairSV,TamuraH,JayakumarR.Synthesis,characterization,cytotoxicityandantibacterialstudiesofchitosan,O-carboxymethylandN,O-carboxymethylchitosannanoparticles.CarbohydratePolymers2009；78:672-677)。N,O-CMC的两性特性为该聚合物提供了丰富的应用(MouryaV.K,InamdarNNandTiwariA.carboxymethylchitosananditsapplications.AdvMatLett2010；1:11-33)。生物矿化硅生物矿化硅是通过酶硅蛋白由正硅酸盐酶促形成的天然存在的聚合物(MüllerWEG,HC,BurghardZ,PisignanoD,WangXH.Silicateins:aparadigmshiftinbioinorganicchemistry.Enzymaticsynthesisofinorganicpolymericsilica.ChemEurJ2013；19:5790-5804)。生物矿化硅对骨形成细胞具有诱导性合成作用；其增加BMP-2的表达，并引起骨保护素:RANKL比例的变化，导致抑制破骨细胞前体分化为成熟的破骨细胞(综述于：WangXH,HC,WiensM,UshijimaH,MüllerWEG.Bio-silicaandbio-polyphosphate:applicationsinbiomedicine(boneformation).CurrOpinBiotechnol2012；23:570-578)。下列涉及生物矿化硅的专利或专利申请是相关的：EP1320624；US7169589B2；DE10037270；CN01813484.X；NZ523474；AU2001289713.硅蛋白介导的非晶形硅酸盐和硅氧烷的合成及其应用(Silicatein-mediatedsynthesisofamorphoussilicatesandsiloxanesandtheiruses)。发明人：MüllerWEG,LorenzA,KraskoA,HC。US6670438B1.体外合成二氧化硅、聚硅倍半氧烷、聚硅氧烷和聚金属氧烷的方法、组合物以及仿生催化剂(Methods,compositions,andbiomimeticcatalystsforinvitrosynthesisofsilica,polysilsequioxane,polysiloxane,andpolymetallo-oxanes)。发明人：MorseDE,StuckyGD,Deming,TD,ChaJ,ShimizuK,ZhouY。DE10246186.采用新的silicase酶，用于例如治疗矽肺或制备假体材料的二氧化硅和硅酮的体外和体内降解或合成(Invitroandinvivodegradationorsynthesisofsilicondioxideandsilicones,usefule.g.fortreatingsilicosisortoprepareprostheticmaterials,usinganewsilicaseenzyme)。发明人：MüllerWEG,KraskoA,HC。EP1546319.Silicase对硅酸盐和硅酮的分解和修饰以及这种可逆酶的用途(AbbauundModifizierungvonSilicatenundSiliconendurchSilicaseundVerwendungdesreversiblenEnzyms)。发明人：MüllerWEG,KraskoA,HC。EP1740707；US11579019；DE10352433.9；CA2565118；JP2007509991.由非有机硅化合物以及氨基硅烷和硅氮烷通过酶和模板控制的合成得到的二氧化硅及其用途(Enzym-undTemplate-gesteuerteSynthesevonSilicaausnicht-organischenSiliciumverbindungensowieAminosilanenundSilazanenundVerwendung)。发明人：SchwertnerH,MüllerWEG,HC。EP09005849.6.用于结构导向制造(纳米)复合材料的silintaphin在医学和(纳米)技术中的用途(Useofsilintaphinforthestructure-directedfabricationof(nano)compositematerialsinmedicineand(nano)technology)。发明人：WiensM,MüllerWEG,HC,WangX。DE102004021229.5；EP2005004738；US11579020；JP2007509992；CA2565121.用于制备具有生物活性的刺激成骨细胞表面的酶促方法及其用途(Enzymaticmethodforproducingbioactive,osteoblast-stimulatingsurfacesandusethereof)。发明人：MüllerWEG,SchwertnerH,HC。US60839601；EP2007007363.生物矿化硅-粘附蛋白纳米复合材料：合成和在牙医学中的应用(Biosilica-adhesiveproteinnano-compositematerials:synthesisandapplicationindentistry)。发明人：MüllerWEG,HC,GeurtsenWK。PCT/US2009/005302.组合物、口腔护理产品以及制备和使用它们的方法(Compositions,oralcareproductsandmethodsofmakingandusingthesame)。发明人：MillerJ,H,GeurtsenW,LückerP,WiensM,HC,MüllerWEG。GB1405994.3.用于治疗骨缺损的成骨材料(Osteogenicmaterialtobeusedfortreatmentofbonedefects)。发明人：MüllerWEG,HC,WangXH。生物玻璃生物玻璃(生物活性玻璃)是可打印的硬质模拟骨的支架材料。当前的最新技术综述于(HenchLL.Bioactivematerialsforgenecontrol.InHenchLL,JonesJR,FennMB,eds,NewMaterialsandTechnologiesforHealthcare.Singapore:WorldScientific,pp25-48,2011；JonesJR.Reviewofbioactiveglass:fromHenchtohybrids.ActaBiomater2013；9:4457-4486)。以下涉及生物玻璃的专利申请是相关的：GB1408402.4.通过与含有细胞的具有形态发生活性的藻酸盐/明胶水凝胶组合来3D细胞打印含生物玻璃的支架(3Dcellprintingofbioglass-containingscaffoldsbycombinationwithcell-containingmorphogenicallyactivealginate/gelatinhydrogels)。发明人：MüllerWEG,HC,WangXH。由于仿生材料可代表用于移植的收获组织的再生性替代物，其在组织工程方面的重要性逐渐增加。在三维模板中，广泛采用模拟生理性胞外基质、壳聚糖和N,O-羧甲基壳聚糖(N,O-CMC)。为了提供这些具有生物学功能的聚合物，必需添加其他组分。本发明人研发了制备由藻酸盐、N,O-CMC和Na-polyP组成的可生物打印的材料的配方。在将该材料打印为定制设计的/制造的层和植入物后，将这些结构暴露于Ca2+以使其硬化。在Ca2+暴露期间，polyP中的Na+阳离子被Ca2+交换，使得polyP与N,O-CMC桥接，并且使得该复合材料尤其稳定，而不丧失polyP的生物学活性。本发明人描述了基于N,O-CMC的polyP杂化材料的配制和制备。这两种聚合物通过Ca2+桥以稳定的方式连接在一起并提供多孔结构。该材料可打印为填充μCT分析的损伤的植入物。由于该材料保持其形态发生功能、引发SaOS-2骨样细胞上的生物矿化并加速血液凝固，所以N,O-CMC-polyP代表一种可用于骨缺损的组织工程中的富有前景的新材料。发明详述本发明涉及用于合成由N,O-CMC和天然聚合物聚磷酸盐(polyP)组成的新杂化材料的配方。通过Ca2+桥将这两种聚合物连接在一起。那些N,O-CMC-polyP材料在培养基中保持其形态，并且尤其可用于生物打印。N,O-CMC-polyP打印的层和组织单元也保持其生物功能，以诱导骨细胞进行生物矿化，并加速人血液的凝血过程，继而代表一种可用于组织工程学目的颇具前景的新材料。本发明的支架由羧甲基壳聚糖、聚磷酸盐(钠盐)和藻酸盐(钠盐)组成，通过所得水凝胶的3D打印(生物打印)来制造，并通过暴露于钙离子来进行随后的硬化。所述羧甲基壳聚糖可通过壳聚糖(N-羧甲基壳聚糖)的氨基、或壳聚糖(O-羧甲基壳聚糖)的羟基、或二者(N,O-羧甲基壳聚糖)的羧甲基化形成的。所述羧甲基壳聚糖的非羧甲基化的氨基和/或非羧甲基化的羟基可被乙酰化或部分乙酰化。本发明新的仿生3-阶段支架具有以下特性；其为：-生物相容的，-生物可降解的，以及-可打印的。该支架模拟骨修复中的三个必要阶段；其影响在骨修复的3个阶段期间具有活性的以下3个目标位点：阶段1:与从血小板释放生长因子/细胞因子有关的血块形成(初始阶段)阶段2:通过在羧甲基壳聚糖骨架提供成核中心形成碳酸钙生物种子(种子阶段)阶段3:骨碱性磷酸酶的表达/激活(羟基磷灰石–生物矿物形成阶段)以下发现为出人意料的：本发明的包含通过Ca2+连接至N,O-CMC聚合物的polyP的材料具有比已公开的壳聚糖+polyP-PEC复合体(MiFL,ShyuSS,WongTB,JangSF,LeeST,LuKT.Chitosan-polyelectrolytecomplexationforthepreparationofgelbeadsandcontrolledreleaseofanticancerdrug.II.EffectofpH-dependentioniccrosslinkingorinterpolymercomplexusingtripolyphosphateorpolyphosphateasreagent.JApplPolymerSci1999；74:1093-1107；OngSY,WuJ,MoochhalaSM,TanMH,LuJ.Developmentofachitosan-basedwounddressingwithimprovedhemostaticandantimicrobialproperties.Biomaterials2008；29:4323-4332)显著更强的效果，理由如下：(i)从公开的结果来看，可能的是polyP对于血块形成的效果不需要polyP与钙离子形成复合体或盐；相反，polyP对于凝固的效果甚至已经在对血浆进行预孵育后且在加入钙离子前观察到(SmithSA,MutchNJ,BaskarD,RohloffP,DocampoR,MorrisseyJH.Polyphosphatemodulatesbloodcoagulationandfibrinolysis.ProcNatlAcadSciUSA2006；103:903-908)。(ii)而且，令人惊奇的是，钙盐形式的polyP甚至在与N,O-CMC聚合物形成复合体后仍具有生物学活性。此外，令人惊奇的是本发明的配方：(i)是可打印的，以及(ii)3D打印后该打印的网状组织显示出足够的稳定性–相比基于单独的特定材料的特性的预测。所述藻酸盐可补充有明胶或另外的胶原蛋白衍生的产物。此外，本发明人显示本发明的藻酸盐-CMC-polyP水凝胶可补充有刺激骨形成细胞矿物化并且表达具有形态发生活性的细胞因子，例如BMP-2的硅石或生物矿化硅。可通过硅蛋白来酶促形成所述聚合的硅石或生物矿化硅。本发明的技术可应用于制造含细胞的支架/植入物，尤其是含骨形成细胞、或骨溶解细胞、或这些细胞的混合物的支架，以此将所述细胞悬浮于藻酸盐水凝胶中，使所得的含细胞的藻酸盐-CMC-polyP水凝胶经历3D打印(生物打印)，并通过暴露于钙离子来进行后续的硬化。采用3D打印技术，所述水凝胶可与生物玻璃(生物活性玻璃)(纳米)颗粒的悬浮液同时打印，所述生物玻璃(生物活性玻璃)(纳米)颗粒可由不同摩尔比的SiO2:CaO:P2O5或SiO2:Na2O:CaO:P2O5，例如摩尔比(mol.％)为55:40:5的SiO2:CaO:P2O5，或摩尔比(mol.％)为46.1:24.4:26.9:2.6的SiO2:Na2O:CaO:P2O5组成(45S5)。所述polyP分子的平均链长范围可为10个至高达100个磷酸盐单元。用平均链长为约40个磷酸盐单元的polyP分子获得最佳结果。。可作为额外组分添加的聚合硅酸可通过生物矿化硅(非晶形水合氧化硅)代谢中涉及的酶或蛋白，如硅蛋白、或硅蛋白融合蛋白来形成。所述硅蛋白多肽或硅蛋白融合蛋白可采用原核或真核表达系统产生，或者可通过合成产生。所述硅蛋白或硅蛋白融合蛋白可与合适的基底(硅石前体)一起存在，所述基底如水玻璃、原硅酸、原硅酸盐、单烷氧基硅烷三醇、二烷氧基硅烷二醇、三烷氧基硅烷醇(trialkoxysilanols)、四烷氧基硅烷、烷基-硅烷三醇、烷基-硅烷二醇、烷基-单烷氧基硅烷二醇、烷基-单烷氧基硅烷醇、烷基-二烷氧基硅烷醇或烷基-三烷氧基硅烷。本发明的另一方面涉及通过上述方法之一获得的被用作骨植入物或形成该植入物的部分的材料的3D-生物打印的支架。可以通过3D打印、3D细胞打印(生物打印)、或另外的快速成型程序制备用于治疗骨缺损的呈定制的植入物形式的骨植入材料。现在将在以下的优选实施例中进一步描述本发明，然而，本发明不限于此。为本发明的目的，将本文引用的所有文献通过引用整体并入本文中。在图中，图1显示了N,O-CMC-polyP膜和组织单元的形成。(A)将由D-葡萄糖胺(脱乙酰化)和N-乙酰基-D-葡萄糖胺(乙酰化)单元表征的壳聚糖，通过该聚合物的部分羧甲基化转化为N,O-CMC。(B至E)生物打印两层(B和C)至六层(D)的垫。(E)N,O-CMC-polyP组织样单元—根据猪下颌(uj)中的损伤形成的植入物(im)的打印。图2显示了由N,O-CMC形成的膜的EDX分析。在无polyP存在下(A和C)或在polyP存在下(B和D)制备膜。仅在N,O-CMC-polyP膜的EDX光谱中显示了磷和钙的信号。图3显示了N,O-CMC-polyP网状组织的完整性和稳定性。相比融合的由不含有polyP的N,O-CMC构建的支架网(A)，N,O-CMC-polyP网甚至浸没在培养基中还保持为完整的。(B和C)新制备的N,O-CMC-polyP网状组织。可以看出，打印的圆筒的融合仅在交叉点看到；形成了连续的交叉点。(D)甚至将N,O-CMC-polyP网于培养基中经历5d的孵育期后，所述圆筒还保持为分开的，从而允许细胞(c)在开放的空间增殖。图4显示了SaOS-2细胞在壳聚糖基质上矿化的效能。SaOS-2细胞在无OC(对照；-OC)或OC存在下生长。在后者的分析中，将细胞培养于此前公开的N,O-CMC水凝胶(N,O-CMChg)或在无polyP(N,O-CMC-polyP)或polyP存在(N,O-CMC+polyP)下的N,O-CMC层中。生物矿化的程度(茜素红S[AR])与该分析中的DNA含量有关。数值表示来自10个单独实验中各实验的平均值(±SD)。N,O-CMC-polyP基质显著增加了矿化作用；*P<0.01。图5显示了壳聚糖polyP复合体(“壳聚糖+polyP”)、N,O-CMC水凝胶(“N,O-CMChg”)和N,O-CMC层减去polyP(“N,O-CMC层-polyP”)和加上polyP(“N,O-CMC层+polyP”)对于血液凝固速率的影响。在对照中添加了未处理的壳聚糖。测定了来自细胞溶解的未凝固红细胞的血红蛋白的吸光度。与壳聚糖对照进行显著性比较；*p<0.05。实施例在以下实施例中，仅描述了采用N,O-CMC-polyP膜、层和组织样块的本发明的方法。然而，本发明方法也可采用O-羧甲基壳聚糖(O-CMC)和N-羧甲基壳聚糖(N-CMC)以及除40个磷酸盐单元链长以外的polyP分子进行应用，本领域技术人员应该能够根据相应的描述调整该方法。N,O-CMC-聚磷酸盐膜、层和组织样块的制备如在“方法”部分中所述制备N,O-CMC-polyP。将N,O-CMC与Na-polyP混合；然后将这两种聚合物通过Ca2+离子桥连接在一起。通过EDX光谱学针对磷的存在对所述膜、层或组织样块进行分析。作为示例，给出了无Na-polyP和有Na-polyP所制备的膜的EDX光谱(图2AandB)。分析该膜的表面。所述光谱显示，在Na-polyP存在下形成，然后通过Ca2+连接至N,O-CMC聚合物的膜显示了磷和钙的信号(图2D)，而在无polyP存在下形成的膜中没有那些信号(图2C)。N,O-CMC-聚磷酸盐层和组织样块的打印采用以上描述的设置，打印两层或六层并用于体外分析。在图1B和C中显示了用于体外研究的两层衬垫。该圆筒的网眼大小为≈0.5x0.5mm。可通过增加层数来增加这些层的厚度。图2D显示了六层的垫。进一步增加分层，形成了组织样块(图1E)。此处，通过μCT分析了该损伤后，本发明人打印了猪下颌中的颅骨缺损。在细胞培养中分析的N,O-CMC-polyP层打印的两层支架用于细胞培养实验。如果打印了来自无任何polyP的N,O-CMC层的样品，则该圆筒在培养基中融合(图3A)。相反，如果该待打印的材料补充有polyP，即N,O-CMC-polyP，则该圆筒保持为分离的(图1B和D)。甚至，在两层之间形成了连续的接触网眼下，该交叉的圆筒仅在贴近的最初交叉点融合(图3B和C)。该打印的圆筒之间明显的交叉点为细胞的渗透留出了空间(图3D)。甚至在该网状组织经历5天的孵育期后还保持完整(图3D)。N,O-CMC-polyP材料的机械性能利用硬度计压头装置并在玻璃箍顶部采用悬臂测量了N,O-CMC-polyP支架的硬度。测量了厚度为2mm的6层支架样品。将打印后立即获得的样品浸没于生理盐水中，并采用降低的杨氏模量[RedYM]作为参数测试其硬度。如果对那些样品即N,O-CMC-polyP进行分析，则测定出机械RedYM刚度为935±128kPa(n＝10)；相比之下，测定的不含polyP的支架样品的刚度仅为27±3kPa。相比之下，采用相同的设置，发现来自兔组织的松质骨的模量为2,300kPa。将该N,O-CMC-polyP支架样品浸没于模拟体液(KokuboT.Bioactiveglassceramics:propertiesandapplications.Biomaterials1991；12:155-163)中，在3周期间其RedYM刚度没有发生显著变化；数值为约900±115kPa；仅在6周后测得其显著降低为686±102kPa。SaOS-2细胞在N,O-CMC基质上的矿化测试本文制备的无polyP和含有polyP的N,O-CMC基质，以及(相比较的)此前已公开的被称为N,O-CMC水凝胶的壳聚糖制剂(ChenXG,ParkHJ.ChemicalcharacteristicsofO-carboxymethylchitosansrelatedtothepreparationconditions.CarbohydratePolymers2003；53:355-359；LuoY,TengZ,WangX,WangQ.Developmentofcarboxymethylchitosanhydrogelbeadsinalcohol-aqueousbinarysolventfornutrientdeliveryapplications.FoodHydrocolloids2013a；31:332-339)诱导SaOS-2细胞生物矿化的效能。在补充有OC的培养基/FCS中经历3天的初始孵育期后，转移所述细胞。如图4所示，相比不含polyP的N,O-CMC基质，含有结合N,O-CMC的聚合的polyP的N,O-CMC-polyP导致了显著更高的细胞矿化的诱导(第8天，0.93±0.09nmoles结合细胞的茜素红S[基于μgDNA])。这同样适用于已公开的N,O-CMC水凝胶基质(0.38±0.04nmoles/μg)，以及本文制备的基质(0.46±0.06nmoles/μg)。在没有任何壳聚糖基质下，矿化程度为0.38±0.07nmoles/μg(图4中未示出)。在没有OC下矿化水平低至约0.20±0.03nmoles/μg。N,O-CMC-polyP对血液凝固动力学的影响已知PolyP促进血块形成(SmithSA,MutchNJ,BaskarD,RohloffP,DocampoR,MorrisseyJH.Polyphosphatemodulatesbloodcoagulationandfibrinolysis.ProcNatlAcadSciUSA2006；103:903-908)，并也可逆转血友病患者中的抗凝作用和流血事件(SmithSA,MorrisseyJH.Polyphosphateasageneralprocoagulantagent.JThrombHaemost2008；6:1750-1756)。此处本发明人依次测量了不同基质对体外人血液凝固时间的影响。用全血与类似量的基质接触来进行测定，在接触10min的时段后，基于血红蛋白含量来测量悬浮液中剩余的红细胞(图5)。很明显，不含polyP的那些样品(“壳聚糖对照”、“N,O-CMC水凝胶”[ChenXG,ParkHJ.ChemicalcharacteristicsofO-carboxymethylchitosansrelatedtothepreparationconditions.CarbohydratePolymers2003；53:355-359；LuoY,TengZ,WangX,WangQ.Developmentofcarboxymethylchitosanhydrogelbeadsinalcohol-aqueousbinarysolventfornutrientdeliveryapplications.FoodHydrocolloids2013a；31:332-339]，以及本文制备的减去polyP的N,O-CMC层，即“N,O-CMC层-polyP”)没有显著改变作为游离红细胞数目的量度的血红蛋白浓度。然而，本发明制备的N,O-CMC层加上polyP“N,O-CMC层+polyP”，以及含有polyP的壳聚糖聚电解质复合物(PEC)“壳聚糖+polyP”显著降低了游离红细胞的数目，相反增加了结合基质的红细胞数目。比较这两种样品，相比壳聚糖+polyP-PEC样品，polyP通过Ca2+连接至N,O-CMC聚合物显著降低了游离红细胞的数目(0.43±0.07相对于0.85±0.12)(MiFL,ShyuSS,WongTB,JangSF,LeeST,LuKT.Chitosan-polyelectrolytecomplexationforthepreparationofgelbeadsandcontrolledreleaseofanticancerdrug.II.EffectofpH-dependentioniccrosslinkingorinterpolymercomplexusingtripolyphosphateorpolyphosphateasreagent.JApplPolymerSci1999；74:1093-1107；OngSY,WuJ,MoochhalaSM,TanMH,LuJ.Developmentofachitosan-basedwounddressingwithimprovedhemostaticandantimicrobialproperties.Biomaterials2008；29:4323-4332)。本发明人的发现：相比公开的壳聚糖+polyP-PEC复合体，polyP通过Ca2+连接至N,O-CMC聚合物导致明显更大地降低了红细胞数目(增加了凝固时间)(图5)是出人意料的，尤其是因为此前没有描述过polyP对于血液凝固的作用需要polyP与钙离子形成复合体或盐。polyP对于凝固时间的影响看来是由非钙依赖性机制介导的(SmithSA,MutchNJ,BaskarD,RohloffP,DocampoR,MorrisseyJH(2006)Polyphosphatemodulatesbloodcoagulationandfibrinolysis.ProcNatlAcadSciUSA103:903-908)。此外，令人惊奇的是，作为钙复合体/盐的polyP甚至在结合N,O-CMC聚合物后还具有生物学活性。以下实施例显示如果使用polyP通过Ca2+连接至N-羧甲基化的壳聚糖(N-CMC-polyP)或者polyP通过Ca2+连接至O-羧甲基化的壳聚糖(O-CMC-polyP)代替N,O-CMC-polyP，则也可以应用本发明所述的方法。N-CMC-polyP和O-CMC-polyP对SaOS-2细胞矿化的影响概述于表1。相比公开的壳聚糖polyP复合体，这两种制剂均显示出对矿化作用显著更高的影响(MiFL,ShyuSS,WongTB,JangSF,LeeST,LuKT.Chitosan-polyelectrolytecomplexationforthepreparationofgelbeadsandcontrolledreleaseofanticancerdrug.II.EffectofpH-dependentioniccrosslinkingorinterpolymercomplexusingtripolyphosphateorpolyphosphateasreagent.JApplPolymerSci1999；74:1093-1107)。然而，它们均不如N,O-CMC-polyP有效。这些数据出人意料地显示，相比其他连接，通过Ca2+-连接将polyP连接至N,O-CMC、N-CMC、或O-CMC具有显著更高的生物矿化效能。表1.壳聚糖polyP复合体(“壳聚糖+polyP”)，和N,O-CMC层减去polyP(“N,O-CMC层-polyP”)、N-CMC层减去polyP(“N-CMC层-polyP”)、O-CMC层减去polyP(“O-CMC层-polyP”)，以及N,O-CMC层加上polyP(“N,O-CMC层+polyP”)、N-CMC层加上polyP(“N-CMC层+polyP”),O-CMC层加上polyP(“O-CMC层+polyP”)对SaOS-2细胞矿化的影响。所述细胞在没有OC(对照)或含有OC(其他分析)下生长。生物矿化的程度(茜素红S[AR])与DNA含量有关。孵育期为8天。样品AR(nmoles/μgDNA)对照0.21±0.03壳聚糖+polyP0.38±0.04N,O-CMC层-polyP0.46±0.06N-CMC层-polyP0.42±0.10O-CMC层-polyP0.40±0.09N,O-CMC层+polyP0.93±0.09N-CMC层+polyP0.80±0.11O-CMC层+polyP0.77±0.10N-CMC-polyP和O-CMC-polyP对血液凝固动力学的影响概述于表2。相比公开的壳聚糖polyP复合体，这两种制剂，如N,O-CMC-polyP，均导致对血液凝固速率有显著更高的影响(MiFL,ShyuSS,WongTB,JangSF,LeeST,LuKT.Chitosan-polyelectrolytecomplexationforthepreparationofgelbeadsandcontrolledreleaseofanticancerdrug.II.EffectofpH-dependentioniccrosslinkingorinterpolymercomplexusingtripolyphosphateorpolyphosphateasreagent.JApplPolymerSci1999；74:1093-1107)，但都不如N,O-CMC-polyP有效。表2.壳聚糖polyP复合体(“壳聚糖+polyP”)，N,O-CMC水凝胶(“N,O-CMChg”)、N-CMC水凝胶(“N-CMChg”)、O-CMC水凝胶(“O-CMChg”)，和N,O-CMC层减去polyP(“N,O-CMC层-polyP”)、N-CMC层减去polyP(“N-CMC层-polyP”)、O-CMC层减去polyP(“O-CMC层-polyP”)，以及N,O-CMC层加上polyP(“N,O-CMC层+polyP”)、N-CMC层加上polyP(“N-CMC层+polyP”)、O-CMC层加上polyP(“O-CMC层+polyP”)对血液凝固速率的影响。对照中添加有未处理的壳聚糖。测定了来自细胞溶解的非凝集红细胞的血红蛋白吸光度。样品血红蛋白吸光度(OD540)对照1.42±0.13壳聚糖+polyP0.85±0.12N,O-CMChg1.29±0.15N-CMChg1.40±0.21O-CMChg1.33±0.17N,O-CMC层-polyP1.47±0.17N-CMC层-polyP1.51±0.20O-CMC层-polyP1.41±0.20N,O-CMC层+polyP0.43±0.07N-CMC层+polyP0.61±0.11O-CMC层+polyP0.58±0.08方法聚磷酸盐用于实施例中的聚磷酸钠(Na-polyP的平均链长为40个磷酸盐单元)获自ChemischeFabrikBudenheim(Budenheim；Germany)。N,O-羧甲基壳聚糖的制备可根据最新技术的程序，由壳聚糖制备N,O-羧甲基壳聚糖(N,O-CMC)(ChenXG,ParkHJ.ChemicalcharacteristicsofO-carboxymethylchitosansrelatedtothepreparationconditions.CarbohydratePolymers2003；53:355-359；ChenSC,WuYC,MiFL,LinYH,YuLC,SungHW.AnovelpH-sensitivehydrogelcomposedofN,O-carboxymethylchitosanandalginatecross-linkedbygenipinforproteindrugdelivery.JControlRelease2004；96:285-300；SakairiN,SuzukiS,UenoK,HanSM,NishiN,TokuraS.Biosynthesisofhetero-polysaccharidesbyAcetobacterxylinum-synthesisandcharacterizationofmetal-ionadsorptivepropertiesofpartiallycarboxmethylatedcellulose.CarbohydratePolymers1998；37:409-414)。简而言之，将10g壳聚糖(例如，来自虾壳，≥75％(脱乙酰化)[脱乙酰化甲壳质])添加至含有14.1gNaOH的水:异丙醇混合物(20ml:40ml)中，并在温和搅拌下于室温保持1小时。然后，将溶解于20ml异丙醇的15g一氯醋酸滴加至该混合物中。将该反应混合物加热至50℃，并持续搅拌4h。然后将该材料过滤，并用80％乙醇洗涤3次。于60℃烘箱中过夜干燥所得的固体以获得N,O-CMC的Na盐。为转变为N,O-CMC的H-形式，将所得的粉末悬浮于100ml的80％乙醇水溶液中。然后，加入10ml盐酸(37％)并搅拌30min。最后，过滤该悬浮液，并用乙醇洗涤直至获得中性pH；于60℃过夜干燥该材料(SakairiN,SuzukiS,UenoK,HanSM,NishiN,TokuraS.Biosynthesisofhetero-polysaccharidesbyAcetobacterxylinum-synthesisandcharacterizationofmetal-ionadsorptivepropertiesofpartiallycarboxmethylatedcellulose.CarbohydratePolymers1998；37:409-414)。图1A给出了该反应的示意图。在衰减全反射(ATR)模式中采用傅里叶变换红外(FTIR)光谱，以确保在壳聚糖的氨基以及伯羟基位点的羧甲基的置换(FTIR-ATR；配备有GoldenGateATR附件的Varian660-IR光谱仪)(ChenSC,WuYC,MiFL,LinYH,YuLC,SungHW.AnovelpH-sensitivehydrogelcomposedofN,O-carboxymethylchitosanandalginatecross-linkedbygenipinforproteindrugdelivery.JControlRelease2004；96:285-300)。将干燥的样品粉末直接放置于ATR晶体上。于4000-750cm-1波数以4cm-1分辨率获得该光谱。O-羧甲基壳聚糖的制备采用最新技术程序，可以在异丙醇/NaOH溶液中使一氯醋酸与壳聚糖反应来制备O-羧甲基壳聚糖(O-CMC)(例如UpadhyayaL,SinghJ,AgarwalV,TewariRP.Biomedicalapplicationsofcarboxymethylchitosans.CarbohydrPolym2013；91:452-466)。N-羧甲基壳聚糖的制备通过使壳聚糖的游离氨基与水合乙醛酸反应，随后用硼氢化钠还原所得的醛亚胺，可获得N-羧甲基壳聚糖(N-CMC)，如(例如，UpadhyayaL,SinghJ,AgarwalV,TewariRP.Biomedicalapplicationsofcarboxymethylchitosans.CarbohydrPolym2013；91:452-466)所描述的。N,O-CMC-聚磷酸盐层和组织样块的打印例如，通过紫外线照射(254nm)过夜来对N,O-CMC灭菌。然后在生理盐水中制备60mg/ml的N,O-CMC溶液。在搅拌至均匀后，向该凝胶中补充固体Na-polyP直至浓度达到20mg/ml。用60mg/ml海藻酸钠(例如，来自Sigma-Aldrich的W201502)完成该水凝胶制剂的形成，并于50℃搅拌至均匀。然后将该水凝胶灌注至无菌的打印盒中(例如，来自NordsonEFD的30ml打印盒)，以1500rpm离心3min从而去除剩余气泡。连接上0.25mm锥形聚乙烯打印头(NordsonEFD)后，将打印盒放入预热的(25℃)3D-bioplotter打印头中；例如，可使用来自Envisiontec的第4代支架(blotter)3D-Bioplotter。按所述程序进行生物打印(NeufurthM,WangXH,HC,FengQL,Diehl-SeifertB,ZiebartT,SteffenR,WangSFandMüllerWEG.Engineeringamorphogeneticallyactivehydrogelforbioprintingofbioartificialtissuederivedfromhumanosteoblast-likeSaOS-2cells.Biomaterials2014；DOI:10.1016/j.biomaterials.2014.07.002；inpress)。由60mg/mlN,O-CMC、60mg/ml藻酸盐和20mg/mlNa-polyP组成的打印溶液是在25℃采用1.4bar压力和18mm/s打印速度制备的。将预流量设置为0.15s，而后流量设置为-0.05s。如所描述，设计了测量为50x0.4mm的圆柱形支架，将其切成薄片并转移至打印机软件(NeufurthM,WangXH,HC,FengQL,Diehl-SeifertB,ZiebartT,SteffenR,WangSFandMüllerWEG.Engineeringamorphogeneticallyactivehydrogelforbioprintingofbioartificialtissuederivedfromhumanosteoblast-likeSaOS-2cells.Biomaterials2014；DOI:10.1016/j.biomaterials.2014.07.002；inpress)。打印的圆筒之间铸流间距(stranddistance)设置为1mm，产生了约0.5x0.5mm的打印的层/块的孔径。那些支架，层/块被直接打印到无菌的94mm皮氏培养皿中，其补充有1％[w/v]CaCl2作为交联溶液(SchloβmacherU,HC,WangXH,FengQ,Diehl-SeifertB,NeumannS,TrautweinA,MüllerWEG.Alginate/silicacompositehydrogelasapotentialmorphogeneticallyactivescaffoldforthree-dimensionaltissueengineering.RSCAdvances2013；3:11185-11194)。约2min孵育期后，沥干CaCl2-溶液，将产生的交联支架用蒸馏水洗涤两次，并用70％的乙醇洗涤一次。打印直径5cm的两层支架耗时约6min。用于细胞培养实验的支架样品的大小为20mm[直径]x0.4mm[厚度]。在实例中，通过微断层摄影[μCT]，分析颅骨缺损(在选择猪下颌的情况下)后打印了组织样块。采用BioplotterRP2.9CAD软件(Envisiontec)计算机程序预先确定待打印的植入物大小。采用相同的软件，将该圆筒随后切片为与打印针的直径相对应的单个层，随后转移至VisualMachines3.0.193打印机软件(Envisiontec)。N,O-CMC水凝胶层和N,O-CMC-polyP-PEC的制备如(ChenXG,ParkHJ.ChemicalcharacteristicsofO-carboxymethylchitosansrelatedtothepreparationconditions.CarbohydratePolymers2003；53:355-359；LuoY,TengZ,WangX,WangQ.Developmentofcarboxymethylchitosanhydrogelbeadsinalcohol-aqueousbinarysolventfornutrientdeliveryapplications.FoodHydrocolloids2013a；31:332-339；LuoY,WuC,LodeA,GelinskyM.Hierarchicalmesoporousbioactiveglass/alginatecompositescaffoldsfabricatedbythree-dimensionalplottingforbonetissueengineering.Biofabrication2013b；5:015005；doi:10.1088/1758-5082/5/1/015005)所描述的，制备N,O-CMC水凝胶。将制备的固体材料分层放置于皮氏培养皿(被称为“N,O-CMC水凝胶”)。如(OngSY,WuJ,MoochhalaSM,TanMH,LuJ.Developmentofachitosan-basedwounddressingwithimprovedhemostaticandantimicrobialproperties.Biomaterials2008；29:4323-4332)所描述的，由壳聚糖粉末(60mg/ml)和Na-polyP(20mg/ml)制备聚电解质复合物(PEC)(MiFL,ShyuSS,WongTB,JangSF,LeeST,LuKT.Chitosan-polyelectrolytecomplexationforthepreparationofgelbeadsandcontrolledreleaseofanticancerdrug.II.EffectofpH-dependentioniccrosslinkingorinterpolymercomplexusingtripolyphosphateorpolyphosphateasreagent.JApplPolymerSci1999；74:1093-107)。该样品被称为“壳聚糖-polyP”。扫描电子显微镜检查法和能量色散X-射线光谱学将扫描电子显微镜(SEM；HITACHISU8000)与XFlash5010检测器连接，所述XFlash5010检测器为允许同时进行基于能量色散的X-射线(EDX)元素分析的X-射线检测器。以4kV电压连接至用于元素分析的XFlash5010检测器。如所描述，收集HyperMap数据库(SalgeT,TerborgR.EDSmicroanalysiswiththesilicondriftdetector(CDD):innovativeanalysisoptionsformineralogicalandmaterialscienceapplication.AnadoluUnivJSciTechnol2009；10:45-55)。测定N,O-CMC-polyP支架的硬度如(ChavanD,AndresD,IannuzziD.Note:ferrule-topatomicforcemicroscope.II.Imagingintappingmodeandatlowtemperature.RevSciInstrum.Apr2011；82(4):046107；doi:10.1063/1.3579496；ChavanD,vandeWateringTC,GrucaG,RectorJH,HeeckK,SlamanM,IannuzziD.Ferrule-topnanoindenter:anoptomechanicalfibersensorfornanoindentation.RevSciInstrum2012；83:115110；doi:10.1063/1.4766959)所描述的，例如，通过基于箍状光纤的纳米压痕仪可测定支架硬度。缺口为深度可控的(10μm)，并将加载和卸载周期设置为2s。基于荷载位移曲线计算降低的杨氏模量[RedYM]。光学显微镜分析例如，可采用配备有VH-Z25变焦镜头的VHX-600数字显微镜(Keyence)，进行数字光学显微研究。体外细胞在壳聚糖基质上的矿化例如，可使用人成骨肉瘤细胞，即SaOS-2细胞。在潮湿培养箱中于37℃和5％CO2下将所述细胞培养于McCoy的培养基中(WiensM,WangXH,HC,KolbU,SchloβmacherU,UshijimaH,MüllerWEG.Theroleofbiosilicaintheosteoprotegerin/RANKLratioinhumanosteoblast-likecells.Biomaterials2010a；31:7716-7725)。每3d更换培养基/胎牛血清[FCS]。在提及的情况下，将所述细胞暴露于含10nM地塞米松、5mMβ-甘油磷酸盐/酯和50mM抗坏血酸的成骨混合物[OC]中。将支架样品20mm[直径]x0.4mm[厚度]放置于24–孔板底部。例如，可通过茜素红S分析和分光光度法测量矿化的程度(WiensM,WangXH,SchloβmacherU,LieberwirthI,GlasserG,UshijimaH,etal.Osteogenicpotentialofbio-silicaonhumanosteoblast-like(SaOS-2)cells.CalcifTissueIntern2010b；87:513-524)。测量之前，从40-孔板移除壳聚糖基质。结合的茜素红S的量以nmoles表示，并与所述样品中的总DNA有关。血液凝固时间的影响含有polyP和不含polyP的N,O-CMC基质对血液凝固时间的影响，例如，可通过如(ShihMF,ShauMD,ChangMY,ChiouSK,ChangJK,CherngJY.Plateletadsorptionandhemolyticpropertiesofliquidcrystal/compositepolymers.IntJPharm2006；327:117-125)所描述的分析来测定。将样品(100至150mg)浸没到置于37℃的恒温水浴中的瓶子中持续10min。然后，将300μl人血样品(含有20μl/ml100mMCaCl2的柠檬酸葡萄糖)滴加至所述基质的表面，直至将其完全覆盖。然后，该分析继续孵育(37℃)持续10min。接着，加入15ml蒸馏水但不干扰凝固的血液。随后，取出10ml小份，离心(100×g；30s)，收集上清液，并于542nm用分光光度法进行凝血测试。统计学分析结果可采用配对学生t-检测进行统计学评估。当前第1页1 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