产生具有皮肤附属器官的全厚皮肤的方法与流程

本发明涉及用于制造具有皮肤附属器官(皮膚付属器官)的全厚皮肤(全層皮膚)的方法以及制造的具有皮肤附属器官的全厚皮肤。

背景技术：

在化妆品或皮肤药品的开发中使用小鼠和大鼠等进行药理学/安全性试验。然而，近年来，考虑到动物福利，在世界范围内搜寻动物实验的替代方法的开发。

虽然已经开发了使用模拟动物的表皮或真皮的经培养细胞或细胞片层(細胞シ一ト)的替代测试方法作为动物实验的替代方法，但是这些替代皮肤不包括动物皮肤所具有的皮肤附属器官(例如毛囊、指/趾甲、皮脂腺、汗腺和乳腺)。因为没有皮脂或汗等的分泌，不具有皮肤附属器官的替代皮肤的皮肤屏障功能较差，并且难以获得接近活体中的那些测试结果的测试结果。此外，用不具有皮肤附属器官的替代皮肤也不能获得有关化妆品或药品对皮肤附属器官本身之影响的测试结果。

至于用于制造具有皮肤附属器官的人造皮肤的方法，已经尝试例如在裸鼠的皮肤切除部位共培养脂肪来源的干细胞、表皮角质形成细胞和成纤维细胞的方法(专利文献1)。

引用列表

[专利文献1]日本公开未经审查的专利申请公开No.2009-11588

技术实现要素：

本发明要解决的问题

例如，在如上述专利文献1中记载的方法中，虽然部分地包括皮肤附属器官，但是诱导的皮肤附属器官将与裸鼠皮肤成为一体并不可分离，因此难以获得包含皮肤附属器官的干细胞来源的全厚皮肤(即，至少包含表皮层、真皮层和皮下组织的皮肤组织)。本发明人专注该技术问题以尝试开发用于高效地制造完全源自目的个体的具有皮肤附属器官的全厚皮肤的方法。

解决问题的手段

作为解决上述问题反复研究的结果，本发明人发现通过用可激活Wnt途径的生物活性物质刺激胚状体，并使其与支架材料结合，然后将其移植到动物中，可高效地制造具有皮肤附属器官的全厚皮肤，从而完成本发明。

换言之，本发明提供了用于制造具有皮肤附属器官的全厚皮肤的方法，其特征在于：

所述“具有皮肤附属器官的全厚皮肤”至少包含以下(1)-(3)：

(1)包含表皮层和真皮层的皮肤，

(2)至少一种类型的皮肤附属器官，和

(3)皮下组织，

其中所述方法包括以下步骤：

(a)用可激活Wnt途径的生物活性物质刺激胚状体的步骤，

(b)制备包含以下(A)和(B)的缀合物的步骤：

(A)在步骤(a)中刺激的所述胚状体的全部或一部分，和

(B)支架材料

(c)将所述步骤(b)中制备的所述缀合物移植到动物中的步骤，以及

(d)在所述动物中制造源自所述缀合物的全厚皮肤的步骤。

此外，本发明的一个实施方案的特征在于所述动物是非人动物。

此外，本发明的一个实施方案的特征在于所述非人动物是非人免疫缺陷动物。

此外，本发明的一个实施方案的特征在于所述Wnt途径是经典Wnt途径。

此外，本发明的一个实施方案的特征在于所述“可激活Wnt途径的生物活性物质”选自：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt6、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10b和TGF-β。此外，所述“可激活Wnt途径的生物活性物质”可以是例如Wnt受体激动剂。

此外，本发明的一个实施方案的特征在于所述胚状体是由iPS或ES细胞产生的胚状体。

此外，本发明的一个实施方案的特征在于所述支架材料是胶原凝胶。

此外，本发明的一个实施方案的特征在于所述移植是移植到肾包膜下(腎皮膜下)。

在本发明的另一个实施方案中，提供了通过上述任何方法制造的具有皮肤附属器官的全厚皮肤。

毋庸置疑，上述本发明的一个或更多个特征的任何组合涵盖在本发明中。

发明的效果

根据本发明的制造全厚皮肤的方法，可在多能干细胞来源的畸胎瘤中以高发生率制造具有皮肤附属器官的全厚皮肤。由于通过本发明的方法制造的全厚皮肤具有与活的动物体类似的功能性皮肤附属器官，因此其可以例如有利地用于化妆品或药品的药理学或安全性测试。此外，例如，通过用来自不同个体(例如来自不同的种族、肤色、年龄、性别等的个体)的多能干细胞制造本发明的全厚皮肤，可根据化妆品或药品的目标进行适当的药理学或安全测试。

此外，通过本发明的方法制造的全厚皮肤通过移植到动物皮肤中而具有极低的引起肿瘤的风险，因此也可以有利地用于移植到活体中。

附图简述

图1示出了通过体内移植多个胚状体形成的畸胎瘤的HE染色图像，所述胚状体经受Wnt10b刺激。左图示出了包含外胚层囊肿毛囊的皮肤组织，右图示出了黏膜样组织。

图2A示出作为本发明之一个实施方案的用于形成包封多种器官的畸胎瘤的方法的示意图。在胶原凝胶中由iPS细胞形成三维排列的胚状体，然后在体内移植以形成畸胎瘤。此外，从胚状体形成的第7天开始进行持续24小时的Wnt10b刺激，然后进行三维排列。图2B示出了在畸胎瘤中形成的多种器官的分类。各个图中的a-d分别示出了以下的典型组织图像，a：皮肤样组织，b：黏膜样组织，c：由移行上皮组成的囊肿组织和d：由内胚层性上皮组成的囊肿组织。图中的各个符号分别表示Cyst：囊肿腔，Epi：上皮组织，Der：真皮组织，Ad：脂肪组织，LP：黏膜固有层，Sand M：平滑肌组织。c中的囊肿上皮组织由包含复层鳞状上皮(＊)和杯状细胞(箭头)的简单柱状上皮形成。图2C示出了将用源自经受Wnt10b刺激的胚状体的畸胎瘤诱导的器官的发生率(黑条)和用源自未经受Wnt10b刺激的胚状体的畸胎瘤诱导的器官的发生率(亮条)进行比较的图。图2D示出了将每1g源自经受Wnt10b刺激的多个胚状体的畸胎瘤所诱导的毛囊形成数目(黑条)与每1g源自未经受Wnt10b刺激的多个胚状体的畸胎瘤所诱导的毛囊形成数目(光条)进行比较的图。

图3示出了由源自经受Wnt10b刺激的胚状体的畸胎瘤诱导的分泌腺样结构的组织图像。左图示出了HE染色图像，中央的图示出了通过抗淀粉酶抗体的荧光免疫染色图像，右图示出了通过抗E钙黏蛋白抗体的免疫染色图像。图中的箭头示出了在腺泡样组织中细胞质中的颗粒淀粉酶。图中的虚线的范围示出了腺泡组织的范围，图中的“D”示出了近端血管样结构。

图4是示出了包含iPS诱导的毛囊的全厚皮肤移植到裸鼠后随时间推移的照片。分离包含由iPS细胞诱导的毛囊的皮肤囊肿，切成包含约20个毛囊的全厚皮肤并移植到裸鼠的背部皮肤中，随时间推移观察移植后的毛干生长。这些照片示出了从移植在3个位置的包含毛囊的全厚皮肤生长的毛干的追踪实例。

图5是示出了源自iPS诱导的毛囊的毛发之毛发周期的分析的图。随时间推移观察由iPS细胞诱导的毛囊的毛干生长。确定生长毛发的毛孔，并对毛发生长期以及第一至第三毛发周期的毛发生长静息和脱落期的天数进行计数。从追踪的毛发的最大生长期的放大照片将毛发类型(描述为Zigzag毛发、Awl/Guard头发以及对于不能通过体毛的形态学定义确定的毛发描述为“无法分型的毛发”)区分开。黑色圆圈示出了毛干生长期的天数，白色圆圈表示出了毛发生长静息和脱落期的天数。

图6示出了对从iPS诱导的毛囊的移植位点发育的组织进行Y染色体标记的荧光原位杂交(FISH)的结果。描述为“FISH”的图示出了移植到裸鼠的整个组织区域以及周围宿主皮肤的Y染色体FISH的低放大倍数图像。描述为“DIC”的图是FISH中示出的组织的微分干涉图像，箭头示出了具有黑色素色素沉着的iPS诱导的毛发。在FISH的低放大倍数图像中，组织区域由白色矩形示出，并且放大的照片示于a-d中。图中的白点是通过FISH检测的Y染色体。

图7是示出了从iPS诱导的毛囊的移植位点发育的组织中再生干细胞微环境(ニツチが)的免疫染色图像。图7a和7b示出了为毛囊上皮干细胞标志物的抗CK15和抗CD34抗体的双重免疫染色图像。图7a是包含iPS诱导的毛囊移植部位的全厚皮肤的低放大倍数图像，由虚线框住的区域示出了移植的组织。图7a中由白色矩形框住的区域的放大图像示于图7b中。图7b中的箭头示出了通过抗CK15和抗CD34抗体共染色的毛囊外根鞘。图7c和7d示出了针对皮脂腺祖细胞标志物Lrig1和上皮干细胞标志物CK15的免疫染色图像。图7c中的虚线区域表示移植的组织。图7c中由白色矩形框住的区域的放大照片示于图7d中，Lrig1阳性细胞用箭头指示，CK15阳性细胞用楔形指示。在图中，SG表示皮脂腺。图7e示出了使用抗Lgr6抗体的免疫染色图像。Lgr6在皮脂腺附着位点附近的外根鞘(箭头)处表达。图7f示出使用抗Lgr5抗体的免疫染色图像。认为Lgr5在生长期毛囊的可变区表达，特别是在毛发基质区(箭头)附近的上皮细胞中强烈表达。

图8是示出了iPS诱导的毛囊与从iPS诱导的毛囊的移植位点发育的组织中的竖毛肌和神经连接的图。将包含源自iPS的毛囊的全厚皮肤移植到裸鼠的背部，当iPS细胞来源的毛囊进入第三生长期时收集组织以产生厚度为100μm的组织切片。分别示出了通过识别平滑肌标志物钙调理蛋白(カルポニン)和神经纤维标志物神经丝H(neurofilament H，NF-H)的抗体的荧光免疫染色图像(图8a)以及通过透射光的同一切片的立体显微图像(图8b)。通过立体显微镜成像在毛囊中观察到其中毛干含有黑色素的毛囊(图8b，黑色箭头)示出其源自iPS细胞。在低放大倍数图像的白色矩形内，宿主毛囊的区域(图8c，宿主)和包含iPS细胞来源的毛囊区域(图8d，iPS1和图8e，iPS2)的放大图示于图c-e中。示出了与各个毛囊连接的钙调理蛋白阳性竖毛肌(白色箭头)和NF-H阳性神经纤维(白色箭头)。

具体实施方式

本文中使用的“多能干细胞”是指具有能够分化为活体的任何和所有的细胞类型的分化多样性以及甚至在经过增殖和分化后仍能保持分化多样性的自我复制能力二者的细胞，其实例包括ES细胞或iPS细胞。

本文使用的“ES细胞(胚胎干细胞)”是指由胚泡期(动物发育的早期)中属于胚胎的一部分的内细胞团产生的干细胞株，其具有能够分化为多种细胞的分化多样性以及甚至在经过分裂和增殖后保持分化多样性的自我复制能力。

可用于本发明的ES细胞的来源不受特别限制，可使用源自任何和所有动物的内细胞团的ES细胞。例如，作为ES细胞的来源，可使用源自人、小鼠、大鼠、猪或猴的内细胞团的ES细胞。

本文中使用的“iPS细胞(诱导多能干细胞)”是指通过将例如几种类型的基因和/或试剂引入体细胞中而被赋予能够分化成大量细胞的分化多样性以及甚至在经过分裂和增殖后保持分化多样性的自我复制能力的细胞，如同ES细胞。

可用于本发明的iPS细胞的来源不受特别限制，可使用源自任何和所有动物的iPS细胞。例如，作为iPS细胞的来源，可使用源自人、小鼠、大鼠、猪或猴的iPS细胞。此外，本发明中所使用的将成为iPS细胞之来源的体细胞也不受特别限制，可使用由源自任何和所有组织的细胞诱导的iPS细胞。另外，可用于本发明的诱导iPS细胞的方法也不受特别限制，可使用通过任何方法诱导的iPS细胞，只要该方法可从体细胞诱导iPS细胞即可。

在本发明中，用于培养多能干细胞而不使其分化的方法不受特别限制，可适当选择本领域技术人员已知的培养环境或培养基或与其一致的培养环境或培养基。例如，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)可用作培养多能干细胞的饲养细胞。此外，可使用通常用于培养多能干细胞的培养基作为用于培养多能干细胞的培养基，其组成不受特别限制。

本文使用的“畸胎瘤”是具有双胚层或三胚层成分的高度分化的生殖细胞肿瘤，也称为畸胎样瘤(奇形種)。本文使用的“畸胎瘤”包括组织学上类似于当多能干细胞移植到活体时可能产生的畸胎样瘤的结构。虽然畸胎瘤有时在体内自然产生，但是也可通过将多能干细胞移植到动物中来人工产生畸胎瘤。

在本发明中，将细胞移植到动物中的部位不受特别限制，例如，可以移植到动物的肾包膜下、皮下或睾丸。

在本发明中，用于将细胞移植到动物中的方法不受特别限制，例如，当移植到小鼠的肾包膜下时，在肾包膜中切开2-3mm的切口，肾小囊和肾实质分离，可在其间移植细胞。

在本发明中，用于确认在具有移植了多能干细胞的动物中形成畸胎瘤的方法不受特别限制，例如，可通过在移植后3至4周进行剖腹手术来进行确认，并且可通过外观目视确认肿瘤块形成。优选地，可通过对肿瘤块进行组织学分析来确认三胚层组织形成，其是畸胎瘤的特征。

如本文使用的“全厚皮肤”是指包含至少以下(1)-(3)的层状组织结构：

(1)包含表皮层和真皮层的皮肤，

(2)至少一种类型的皮肤附属器官，和

(3)皮下组织。

本文使用的“皮肤附属器官”是指(但不限于)经由构成皮肤的表皮层和上皮组织连接的并且具有固有功能的角质器官和外分泌腺。本文使用的皮肤附属器官是指(但不限于)例如分布在皮肤中的器官，例如毛囊、指/趾甲、皮脂腺、汗腺和乳腺。

本文使用的“皮下组织”是支持皮肤和皮肤附属器官并且将其与其他器官系统结合的组织，其实例包括但不限于：皮下脂肪组织、由平滑肌组织形成的肉膜(皮筋層)和由胶原纤维或弹性纤维形成的结缔组织。

如本文使用的“器官原基”是指被确定为随着体内发育阶段的进展而发育成特定器官的胚胎区域或胚胎结构，有时简称为“原基“。活体中几乎所有的器官都是如下发育而来：通过胎儿阶段的发育程序从上皮细胞系干细胞和间充质谱系干细胞诱导的器官原基发育至给定位置和给定数目。

在本发明中，用于确认在畸胎瘤中形成目的全厚皮肤的方法不受特别限制，例如，可通过解剖畸胎瘤以及从外观上查找被认为是具有皮肤附属器官(例如毛囊、指/趾甲、皮脂腺、汗腺和乳腺)的全厚皮肤来进行确认。优选地，产生畸胎瘤组织切片以及可从组织结构确认给定器官的鉴定。当要进行更详细的确认时，可通过原位杂交法分析在各个器官中表达的基因是否在适当的位点表达。

本文使用的“胚状体”是指当在悬浮液中培养多能干细胞例如ES细胞或iPS细胞时形成的细胞团。胚状体可呈现胚状体形式，并且可以由多种组织构成。可用于本发明的用于产生胚状体的方法不受特别限制，例如，可使用在低附着板中接种多能干细胞的方法、悬浮多能干细胞的细胞悬浮液滴的悬滴法，以及在振荡下培养悬浮液中多能干细胞的培养皿的方法。

例如，当通过在低附着板中接种iPS细胞的方法产生胚状体时，可通过在96孔低附着板中以1500个细胞至10000个细胞/200μl/孔，更优选2000个细胞至4000个细胞/200μl/孔接种和培养iPS细胞来产生胚状体。当接种的细胞小于1500个细胞/200μl/孔时，存在不能适当形成胚状体的风险，而当接种的细胞大于10000个细胞/200μl/孔时，存在由于胚状体中的营养不良引起的坏死的风险。

此外，从本发明中使用的胚状体的悬浮培养开始起的天数不受特别限制，例如可优选使用从悬浮培养开始起第5至9天的那些胚状体。

在本发明中，当胚状体用于移植时，可将胚状体的全部或一部分用于移植。胚状体可直接用于移植，或者也可仅将胚状体的一部分用于移植。当仅将胚状体的一部分用于移植时，优选使用胚状体的表面组织。由于胚状体的表面层是由上皮细胞系构成，因此通过使用胚状体的表面组织进行移植可以更高效地在畸胎瘤中制造全厚皮肤。

在本发明中，用于从胚状体仅分离表面组织的方法不受特别限制。例如，胚状体的表面组织可通过在立体显微镜下通过注射器以显微手术物理收集。

如本文使用的“支架材料”是指通常通过使细胞和材料在材料上或材料内部接触来表达和促进多种细胞功能例如细胞粘附、增殖、分化、活化、运动、迁移和形态变化的材料，并且不受特别限制，只要其在移植多能干细胞时是有利的即可。例如，可使用胶原凝胶作为支架材料，优选可使用I型胶原凝胶、III型胶原凝胶、IV型胶原凝胶和基质胶(Matrigel)。通过将多能干细胞包封在支架材料中，然后对其进行移植，防止多能干细胞在移植的组织中消失，并且用作组织存活的支架，因此可更有效地在畸胎瘤中制造全厚皮肤。此外，通过将多能干细胞包封在支架材料中，然后将其进行移植，可将胚状体移植到胶原凝胶中，同时保持所期望的构型。通过使用在胶原凝胶中表面组织彼此接触的各个胚状体进行移植，可更高效地在畸胎瘤中制造全厚皮肤。

在本发明中，产生包含“胚状体的全部或一部分”和支架材料的缀合物的方法不受特别限制。“胚状体的全部或一部分”和支架材料可以离体结合，然后用于移植，或者可通过首先在体内引入支架材料，然后注射待与其结合的“胚状体的全部或一部分”进行移植。此外，例如，当采用胶原凝胶用作支架材料并将其与胚状体的全部或一部分结合时，可通过将胚状体放在溶胶状态的胶原凝胶中然后固化来产生胶原凝胶与胚状体的全部或一部分的缀合物。

如本文使用的“可激活Wnt途径的生物活化物质”可以是例如可激活经典Wnt途径(也称为β联蛋白途径)的生物活化物质或可激活非经典Wnt途径(平面细胞极性途径；PCP途径，也称为Ca²⁺途径)的生物活化物质。可激活Wnt途径的典型的生物活化物质的实例可以是例如Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt6、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10b和TGF-β，可激活Wnt途径的非经典生物活性物质的实例可以是例如Wnt4、Wnt5a和Wnt11。在例如Maksim V.Plikus等(Science332，586(2011))中描述了Wnt10b可激活经典Wnt途径(β联蛋白途径)的事实。在Kemp等(Functional Development and Embryology 1(1)，1-13(2007))中描述了Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt6、Wnt7b、Wnt8a和Wnt8b可激活经典Wnt途径(β联蛋白途径)和Wnt4、Wnt5a和Wnt11可激活非经典Wnt途径的事实，以及在Sato(Acta Derm Venereol 2006；86：300-307)中描述了TGF-βb可稳定皮肤成纤维细胞中β联蛋白的表达的事实。

在本发明中，用于移植细胞的动物的类型不受特别限制，并且任何和所有的动物均可用于移植。优选地，通过使用非人动物例如猪、牛、猴、狒狒、狗、猫、大鼠或小鼠进行移植，可以避免将细胞移植到人中而产生的伦理问题。更优选地，通过使用非人免疫缺陷动物进行移植，可避免由于活体的免疫功能引起的排斥，并且可有效地产生畸胎瘤。此外，通过使用非人免疫缺陷动物进行移植，可在非人免疫缺陷动物的活体中产生源自另一种类型动物之细胞的畸胎瘤。例如，通过将人来源的多能干细胞移植到非人免疫缺陷动物中，可在非人免疫缺陷动物的活体中产生人细胞来源的畸胎瘤。

如本文使用的“免疫缺陷动物”是指缺乏活体的部分或全部免疫功能的动物。缺乏免疫功能的类型不受特别限制，但是所述动物优选是这样的缺乏免疫功能的动物，使得移植到该活体的来自另一种类型的动物的细胞或组织不被消除。例如，在免疫缺陷小鼠的情况下，可使用SCID小鼠、裸小鼠、NOD小鼠、NOD-SCID小鼠、IL-2Rg敲除小鼠、RAG2敲除小鼠、NOG小鼠或RAG2/IL-2Rg双敲除小鼠，优选可使用SCID小鼠。此外，例如，在免疫缺陷大鼠的情况下，可使用SCID大鼠。此外，在免疫缺陷猪的情况下，可使用IL-2rg敲除猪。

在本发明中，从畸胎瘤切除所期望的器官的方法不受特别限制，例如，可通过显微手术进行切除。

注意，本文使用的术语将用于描述特定实施方案，并且不旨在限制本发明。

此外，除非内容明确指示以其他方式理解，否则本文所使用的术语“包括/包含”意指存在所描述的项目(例如组分、步骤、要素和数字)，并且不排除其他项目(如组分、步骤、要素和数字)的存在。

除非另有定义，否则本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属技术领域的技术人员广泛认可的那些相同的含义。除非另有明确定义，否则本文使用的术语应被解释为具有与本文和相关技术领域中的含义一致的含义，并且不应被解释为具有理想化或过度形式化的含义。

有时使用例如第一和第二的术语来表达各种要素，并且应认识到，这些要素不受这些术语的限制。这些术语仅用于将一个要素与另一个要素区分开的目的，并且例如可以在不脱离本发明的范围的情况下将第一要素描述为第二要素，以及类似地，将第二要素描述为第一要素。

现在将通过实施例更具体地描述本发明。然而，本发明可通过多种实施方案来实现，不应被解释为限于本文所描述的实施例。

实施例

通过体内移植包含胚状体的缀合物形成全厚皮肤

1.材料和方法

(1)实验动物

C.B-17/lcr-scid/scidJcl小鼠购自CLEA(Tokyo，Japan)，scid/scid hr/hr(SHO)小鼠购自Charles River(Kanagawa，Japan)。小鼠的管理和操作符合NIH实验室动物指南。所有实验在东京理科大学的实验动物管理委员会的批准下进行。

(2)细胞培养

将小鼠iPS细胞(mGF-iPS-3F-3)与用丝裂霉素C(Nacalai Tesque)处理的SNLP 76.7-4饲养细胞共培养。对于培养用培养基，使用补充有15％胎牛血清(Japan Bio Serum)、50单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、1×10^-4M 2-巯基乙醇和1×10^-4M非必需氨基酸(均来自Invitrogen)的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(不含丙酮酸钠的DMEM；Nacalai Tesque)。每天更换培养基，在传代培养后第2天，用补充有0.25％胰蛋白酶-1mM EDTA(Invitrogen)的D-PBS(-)(Nacalai Tesque)溶液传代培养。

将SNLP 76.7-4饲养细胞在用0.1％明胶水溶液明胶包被的培养皿上在37℃下培养2小时或更长时间。对于培养用培养基，使用补充有7％胎牛血清、50单位/mL青霉素、50μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺(均来自Invitrogen)的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(不含丙酮酸钠的DMEM；Nacalai Tesque)。将丝裂霉素C添加到所述培养基中至终浓度为12μg/ml，使SNLP 76.7-4饲养细胞在37℃下反应2小时15分钟以对SNLP76.7-4饲养细胞进行丝裂霉素处理。然后，将经反应的细胞以2.5×10⁴细胞/cm²接种在明胶包被的皿中。将丝裂霉素处理后培养了24小时或更长时间的那些细胞用作与iPS细胞共培养的饲养细胞。

(3)胚状体的产生

通过酶处理将iPS细胞与饲养细胞一起从培养皿中分离，并通过温和吹吸使其成为单细胞。使用细胞分选仪(FACS AriaIII，BD)，通过SSC和FSC除去饲养细胞，仅分选出iPS细胞。将分选的iPS细胞悬浮在(2)中描述的iPS细胞培养基中至1.5x10⁴个细胞/ml，并进一步以3,000个细胞/200μL/孔接种在96-孔低附着板中(Lipidure，NOF)。

(4)胚状体的Wnt10b刺激

通过(2)和(3)中描述的方法将iPS细胞接种在低细胞粘附板中，然后用补充有10％胎牛血清(Japan Bio Scrum)、50单位/mL青霉素和50μg/ml链霉素的Iscove′s改良的Dulbecco′s培养基(IMDM；GIBCO)培养7天。在接种后第4天，更换一半培养基，在培养第7天，通过相差显微镜确认胚状体形成，并对没有形态缺陷的胚状体进行Wnt10b刺激。将在PBS中的0.1mg/mL Wnt10b(R&D)作为原液添加到iPS细胞的培养基中至1μg/mL。将形成有胚状体的孔中的一半培养基弃去，并将这一半用包含Wnt10b(终浓度500ng/mL)的用于iPS细胞的培养基更换。将在补充有Wnt10b培养基中的胚状体在CO₂培养箱中培养24小时。

(5)通过移植iPS细胞来源的胚状体形成畸胎瘤

在施加有薄硅脂(シリコングリ一ス)的无菌塑料皿上形成三十微升冷的I型胶原凝胶(Nitta明胶)滴，在凝胶形成之前快速并入32或48个胚状体，并将其在37℃下在CO₂培养箱中孵育10分钟以凝胶。将并入胚状体的胶原凝胶各自移植到在麻醉下的C.B-17/lcr-scid/scidJcl小鼠(7-10周龄)的两个肾的肾包膜下。在移植后第28或30天，处死移植有iPS细胞来源的胚状体的小鼠，并切除畸胎瘤。

(6)畸胎瘤中囊肿的组织学分析

为了对畸胎瘤中的囊性上皮进行分析并对诱导的器官进行组织学分析，测量了切除的畸胎瘤的重量并拍摄宏观照片，然后将上面提到的畸胎瘤浸入Mildform 10N固定液(Wako)中并在室温下固定过夜。根据常规方法将固定的畸胎瘤组织石蜡包埋或冷冻包埋，并产生厚度为10μm的连续切片。将全部或部分的连续切片用Mayer′s苏木精HE染色以进行畸胎瘤中囊肿的组织学分析。为了分析畸胎瘤中毛囊形成发生率，对从块表面起3mm的厚度进行组织化学分析，并用直立显微镜Axioimager A1(Carl Zeiss)和AxioCAM MRc5(Carl Zeiss)对已形成的毛囊的数目进行计数。对在连续切片上其中毛球部变得最大的毛囊进行计数。此外，用直立显微镜Axioimager A1(Carl Zeiss)和AxioCAM MRc5(Carl Zeiss)拍摄组织图像。

2.结果

(7)通过体内移植包含胚状体的缀合物形成全厚皮肤和黏膜样组织

(7-1)包含胚状体的缀合物的体内移植的组织学分析

对于通过体内移植包含胚状体的缀合物形成的畸胎瘤中的囊肿，观察连续切片的HE染色图像以分析组织学特征。结果，具有皮脂腺的毛囊与皮肤样囊肿连接，并且以皮脂腺的连接点为边界，分散有成纤维细胞的嗜酸性真皮层定位于囊肿上皮的方向，并脂肪组织分布到毛球部的方向。囊肿的表皮层具有规则排列的基底细胞层、极性细胞层、颗粒层和角质层，并且显示角质层为典型的皮肤表皮组织，因为其以清楚的层状状态朝向囊腔的内部分离。显示毛干从毛囊的开口朝向囊肿内腔生长(图1，黑色箭头)。皮脂腺和毛囊的连接部位是毛囊漏斗形部分或毛孔(毛穴)的开口(图1，左，白色楔形)，并且认为皮脂可通过毛孔分泌到上皮的外层。这种结构与天然皮肤的组织学特征完全匹配，并且显示以囊腔为中心诱导的全厚皮肤。另一方面，在黏膜样囊肿中未观察到外胚层器官例如毛囊，有些模糊的单层角质化上皮层被为松散结缔组织的黏膜固有层和黏膜下层包围，平滑肌层和分泌腺样组织排列在黏膜下层，并且显示其与黏膜等在组织学上类似(图1，右)。

(7-2)通过在胚状体形成期间添加Wnt10b诱导上皮组织区域

对通过(3)-(5)中所描述的方法在小鼠肾包膜下形成的畸胎瘤的组织切片进行HE染色(图2A)，根据形成的囊肿的上皮组织和周围间质组织的组织学特征将其类为皮肤样(复层鳞状角质化上皮层/真皮层/脂肪或横纹肌)、黏膜样(复层鳞状角质化上皮/黏膜固有层/横纹肌)、移行上皮(复层鳞状角质化上皮和单层柱状上皮的移行形式)或内胚层上皮样(单层柱状上皮/黏膜固有层/横纹肌)，并测量其构造比(图2B)。结果，与通过未经Wnt10b刺激的胚状体的移植相比，当移植经受Wnt10b刺激的胚状体时，内胚层上皮样中囊肿减少，并且皮肤样和黏膜样的发生率提高(图2C)。

(7-3)通过添加Wnt10b提高毛囊形成发生率

与未经Wnt10b处理的组(39±21，n＝8)相比，源自经Wnt10b刺激所刺激的胚状体(285±128，n＝4)的1g畸胎瘤中包含的诱导毛囊的数目显著提高(图2D)。此外，当测量胚状体移植到肾囊后第28至30天畸胎瘤中诱导的从毛干中生长的毛囊的长度时，Wnt10b添加组中的长度是未处理组的两倍。

(7-4)通过添加Wnt10b诱导外分泌腺组织

在源自经Wnt10b刺激的胚状体的畸胎瘤的HE组织分析中，观察到其中外分泌腺的许多腺泡结构已聚集的结构(图1，右)。因此，当使用针对仅由唾液腺和胰腺外分泌腺分泌的淀粉酶的抗体对与外分泌腺的腺泡相似的组织进行免疫染色时，在针对上皮细胞标志物E钙黏蛋白阳性的细胞的细胞质中显示出分泌囊泡的颗粒阳性图像特征。根据该结果，表明不仅毛囊而且外分泌腺(例如唾液腺)也被Wnt10b刺激诱导(图3)。

(8)评估iPS细胞来源的毛囊和全厚皮肤的质量和功能

(8-1)由于移植到皮肤中的iPS诱导的毛发的生长能力

为了研究畸胎瘤中诱导的全厚皮肤中包含的毛囊器官是否是完全功能性的和可移植的，切除包含通过体内移植iPS细胞诱导的毛囊的全厚皮肤，切成毛发组，并移植到裸鼠皮肤中。很明显，移植的毛发组在移植到皮肤中后第7天脱落，此后，毛发在第14天以66％的发生率(117例中有77例)生长(图4)。显示iPS细胞来源的毛囊和皮肤组织再生了可移植到活体皮肤的功能。

(8-2)iPS诱导的毛发的毛发周期分析

为了研究畸胎瘤中诱导的全厚皮肤中包含的毛囊器官是否重复毛发周期并且是永久功能性的，切除包含通过体内移植iPS细胞诱导的毛囊的全厚皮肤，切成毛发组并移植到裸鼠皮肤中(在本说明书中，通过本发明的方法由iPS细胞诱导的毛囊被称为“iPS诱导的毛囊”，通过移植iPS诱导的毛囊而诱导的毛发称为“iPS诱导的毛发”)。对从经历所述移植的组生长的毛干的毛发类型进行区分，发现包含作为体毛包括的Zigzag、Awl和Guard毛发。因此，当将根据毛发类型追踪毛干生长到第三毛发周期并分析毛干生长期以及毛干生长静息和脱落期的长度时，显示它们重复与成人体毛类似的周期性(图5)。从这些结果，表明iPS诱导的毛发再生了活体的干细胞微环境，并永久重复头发周期。

(8-3)iPS诱导的毛发的起源分析

为了证明(8-2)中描述的方法中移植的全厚皮肤和生长的毛发源自iPS细胞，标记Y染色体并进行荧光原位杂交(FISH)。因为本实验中使用的iPS细胞是来自雄性小鼠的细胞，并且移植的Balb/c nu/nu小鼠是雌性小鼠，所以核中的Y染色体被绿色荧光染料标记，并分析从移植物产生的器官(生长的全厚皮肤和毛囊)的起源。结果，很明显，包含皮肤附属器官(例如毛囊)的全厚皮肤由Y染色体阳性细胞(即由iPS细胞诱导的细胞)组成(图6)。此外，虽然与毛囊连接的上皮层是Y染色体阳性，但在宿主组织中未检测到Y染色体。

(8-4)iPS诱导毛发的微环境分析

为了阐明由iPS细胞诱导的包含在全厚皮肤中的诱导毛发是否形成干细胞微环境，用上皮干细胞标志物CD34和CK15进行免疫染色。此外，为了阐明上皮干细胞微环境是否属于可变区或者皮脂腺和皮肤表皮是否可再生，分析了Lgr5、Lgr6和Lrig1阳性细胞的行为。由于在组织学上被定义为在皮脂腺下侧上的凸起外根鞘的凸起区域作为干细胞微环境，其中对CD34和CK15均为阳性的毛囊上皮干细胞是局部的，并且对于维持毛囊稳态是必需的，通过用这些作为标志物进行免疫染色来分析iPS诱导的毛囊。结果，当用红色荧光标记CD34并且用绿色荧光标记CK15时，组织学上对应于iPS诱导的毛囊的凸起区域的外根鞘被染为黄色(图7b，箭头)。由此，显示共表达CD34和CK15的上皮干细胞储存在凸起区域中。因此，显示iPS诱导的毛发构建上皮干细胞微环境。已知在生长期毛囊，作为毛发基质祖细胞的Lgr5阳性细胞分布在毛囊可变区的外根鞘细胞下方和毛发基质的Auber的临界线中，以及在静止期毛囊，Lgr5阳性细胞定位在次级毛芽(二次毛芽)中。此外，Lgr6和Lrig1阳性细胞从位于皮脂腺附着位点附近的凸起的上部定位。当在iPS诱导的毛囊的生长期和静息期中分析Lgr5、Lgr6和Lrig1阳性细胞的行为时，在与天然毛发相同的位点处确认Lgr5、Lgr6和Lrig1各自的表达(图7)。

(8-5)iPS诱导的毛囊和周围组织之间的连接

为了确定iPS诱导的毛囊是否与竖毛肌和神经连接，产生厚度为100μm的切片，用针对神经纤维标志物神经丝、平滑肌标志物钙调理蛋白和横纹肌标志物肌钙蛋白的抗体进行免疫染色，并用共聚焦激光显微镜分析。在自然体毛中，由钙调理蛋白阳性平滑肌构成的竖毛肌与凸起区域连接。为此，自深丛(plexus)延伸的交感神经布置成围绕竖毛肌，从而形成神经肌肉连接部位以接受神经控制。由于iPS诱导的毛囊是有色毛发，并且可以与宿主毛囊区分开，将iPS诱导的毛囊与宿主毛囊区分开，然后通过免疫染色分析神经纤维和竖毛肌的连接。结果，与自然体毛类似，钙调理蛋白阳性竖毛肌与凸起区域连接(图8，箭头)，并且神经纤维与其连接(图8，楔形)。此外，神经毛囊连接部位不仅见于毛囊和竖毛肌之间的连接，而且也见于亚凸上皮(サブバルジの上皮)(图8)。在凸起区域周围观察到神经纤维连接，神经末梢分布在凸起区域的ORS最外层，并且可见神经毛囊连接部位(图8)。

(8-6)通过裸鼠皮下移植单个iPS细胞和包含iPS诱导的毛囊的全厚皮肤的致瘤性测定(造腫瘍アツセイ)

为了测试由iPS细胞诱导的全厚皮肤的移植是否会形成肿瘤，将包含对应于20个毛囊的全厚皮肤移植到裸鼠的背部皮肤，在三个月内追踪由于肿瘤细胞增殖引起的肿瘤块形成。作为比较组，创建从相同iPS细胞系制成单细胞的iPS细胞，以1×10⁴、1×10⁵和1×10⁶个细胞进行皮内移植，并追踪相同的持续时间。结果，在单细胞移植中，在任何数目的细胞中可见由于肿瘤形成而引起的肿瘤块增加，在移植后20至40天可见肿瘤形成，并且肿瘤形成倾向于依赖移植细胞的数目更快(表1)。相反，在iPS诱导的毛囊的移植中，在移植后直到90天的追踪中没有观察到由于肿瘤形成而引起的肿瘤块增加(表1)。

[表1]

表1.通过裸鼠皮内移植iPS诱导的毛囊和单个iPS细胞的致瘤性

从上述结果，根据本发明的方法，可高效地人工制造具有皮肤附属器官的全厚皮肤。此外，表明通过本发明的方法制造的全厚皮肤具有极低的通过移植引起肿瘤的风险，并且还非常有希望作为预期移植到活体的器官形成技术。