用于诊断和治疗应用的微气泡系链的制作方法

文档序号:11526204阅读:370来源:国知局
用于诊断和治疗应用的微气泡系链的制造方法与工艺

背景

本文公开的主题涉及微气泡组合物在诊断或治疗应用中的用途。

多种治疗剂或药物由于一种或多种不利副作用、在血液中溶解性差或高成本而在商业或医学上不是可行的。为了解决某些这样的失败,已开发了递送系统例如超声微气泡(usmb)介导的递送系统。在这样的系统中,充气微气泡与感兴趣的治疗剂缔合。在治疗条件下,响应于在感兴趣的靶位点(即,解剖区域)施加超声能量,充气微气泡经历空穴作用。这种空穴事件导致微气泡破坏(惯性空穴作用)并且推测伴随有导致在周围组织和细胞的膜中瞬态孔隙形成的冲击波。瞬态孔隙允许治疗剂进入待治疗的组织。在其他情况下,超声导致稳定的空穴作用而不是惯性空穴作用,这也可导致药物向组织或细胞的递送增加。以可能的未来应用对这样的方法进行了研究,所述应用包括将小分子药物、寡核苷酸和质粒dna(pdna)靶向递送至例如患者。

在微气泡的存在下,当施加超声时,可显著提高治疗剂的递送。通常,药物的药代动力学性质和清除机制是递送至组织和细胞的背后的关键驱动因素。微气泡和感兴趣的药物之间的结合可通过例如,提高体内稳定性,操纵药物的生物分布特性,或其它机制影响药物递送至感兴趣的位点的效率。然而,这样的结合关系的性质和程度,和它们对递送的作用,通常没有得到深入研究并且了解甚少。因此,开发一种更适合的usmb介导的药物递送系统和相关的递送剂可能是合乎需要的。

简要描述

在一个实施方案中,提供了一种组合物。所述组合物包含含有白蛋白壳的微气泡,和结合于微气泡的部分。所述部分相对于天然白蛋白优先结合于微气泡。

在一个另外的实施方案中,提供了一种组合物。所述组合物包含含有白蛋白壳的白蛋白微气泡。所述组合物还包含治疗剂或诊断剂,和连接白蛋白微气泡和治疗剂或诊断剂的花青5衍生物。

在一个进一步的实施方案中,提供了一种方法。该方法包括于室温下混合白蛋白微气泡组合物和药物或部分-结合的药物,其中药物或部分-结合的药物相对于天然白蛋白优先结合于微气泡。

在又一个进一步的实施方案中,提供基于超声的治疗方法。该方法包括将白蛋白微气泡组合物引入患者中的行动。白蛋白微气泡组合物包含:白蛋白壳、感兴趣的分子和使感兴趣的分子结合于白蛋白壳的部分。所述部分相对于游离的、天然人血清白蛋白优先结合于白蛋白壳。然后该方法的进一步行动是使超声能量对准感兴趣的解剖区域,以引起在感兴趣的解剖区域的白蛋白微气泡的空穴作用。

附图简述

当参考附图阅读以下的详细描述时,本发明的这些和其它特征、方面和优点将变得更易理解,其中在整个附图中,同样的字符代表同样的部件,其中:

图1描述依据本公开内容的各方面的一种适用于超声微气泡介导的药物递送系统的超声系统;

图2描述依据本公开内容的一个方面的样品制备流程;

图3描述依据本公开内容的各方面的正在研究中的分子化学结构;

图4描述用来产生图3的某些分子的化学反应;

图5描述依据本公开内容的一个方面的一个另外的样品制备流程;

图6描述依据本公开内容的各方面的第一组合物的亮视野和荧光显微术结果的灰度表示;

图7描述依据本公开内容的各方面的第二组合物的亮视野和荧光显微术结果的灰度表示;

图8描述依据本公开内容的各方面的第三组合物的亮视野和荧光显微术结果的灰度表示;

图9描述依据本公开内容的各方面的第四组合物的亮视野和荧光显微术结果的灰度表示;

图10描述依据本公开内容的各方面的第五组合物的亮视野和荧光显微术结果的灰度表示;

图11描述依据本公开内容的各方面的荧光显微术结果的图解表示;

图12描述依据本公开内容的各方面的流式细胞术结果的图解表示;

图13描述依据本公开内容的各方面的一个进一步的样品制备流程;

图14描述依据本公开内容的各方面,作为天然hsa浓度的函数和作为微气泡白蛋白浓度的函数的染料结合分数概况的图解表示;和

图15说明依据本公开内容的各方面,可被用来制备治疗组合物的另一个样品制备流程。

详细描述

本公开内容的某些方面涉及一种诊断或治疗微气泡组合物,其包含作为对白蛋白微气泡的结合系链起作用的部分。所述部分可附接于药物或诊断剂,例如可促进在靶位置成像或其它诊断程序的治疗剂或诊断组合物。此外,在某些实施方案中,所述部分也可作为光学示踪剂起作用(例如,可以发出荧光),并且在这样的实施方案中,光学示踪可以作为用于诊断目的的工具,例如,作为光学探针。因此,用这样的组合物介导的适合于体内使用的药物递送系统包含:1)白蛋白微气泡,2)一个或多个显示出相对于游离天然人血清白蛋白的对白蛋白微气泡(其中白蛋白微气泡可以是例如,optison™)的结合偏好的部分,和3)靶向递送治疗或诊断组合物的超声能量。在一些实施方案中,一个或多个部分可以是用来使感兴趣的治疗或诊断组合物官能化的分子。在其它实施方案中,所述部分可以是感兴趣的治疗或诊断组合物的内在基团,以致组合物本身表现出相对于游离天然人血清白蛋白的对白蛋白微气泡的结合偏好。

关于白蛋白微气泡,这些微气泡可源自人血清白蛋白(hsa)或其它合适的生物可相容的白蛋白源,包括人造或合成的白蛋白。一个这样的白蛋白微气泡源的实例是optison™白蛋白壳微球(通常也称为optisontm“微气泡”)。optison™,或其它合适的微气泡形成介质,可源自hsa,但可能不同于身体内发现的游离的、天然hsa。举例来说,在optison™微气泡的情况下,这些微气泡具有围绕全氟丙烷核心的hsa壳。在一些实施方案中,合适的微气泡可具有在约3-4.5μm(例如,在约1μm和约10μm之间)的范围内的平均直径。因为一个或多个以下原因,在充气的、白蛋白微气泡组合物例如optisontm或其它合适的组合物中存在的白蛋白可能不同于体内发现的hsa:它可能是部分变性的,它可能是部分交联的,或白蛋白可能以相对于天然hsa的不同比例的一个或多个蛋白质构象存在。

如上面所述,在某些实施方案中,一个或多个附接于微气泡的部分可表现出相对于游离天然人血清白蛋白的对白蛋白微气泡的结合偏好。如本文所讨论的,在某些实施方案中,显示出相对于游离的、天然hsa的对白蛋白微气泡的结合偏好的分子可作为药物上的官能团提供,所述官能团能使它们结合于微气泡并能够在施加超声能量时使有效药物体内递送成为可能。在某些情况下,所述部分可内在地存在于感兴趣的药物上,因此不需要在一个单独的步骤中添加。在一个实施方案中,所述部分成分可以是可用来将治疗剂或诊断剂“系链”于微气泡的聚乙二醇化或非-聚乙二醇化花青5(cy5)衍生物。例如,用作对微气泡的系链的cy5衍生物可用治疗剂例如小分子药物、寡核苷酸(例如sirna)或大分子(例如质粒dna)官能化。

如先前所考虑的,本方法可被用来解决与不利副作用、在血液中溶解性差或高成本有关的药物递送问题。在一个实施中,通过使治疗剂结合于微气泡(例如使用系链),形成复合物,当它在体内循环时减少药物的生物利用度,直至它在超声处理时在靶位点释放。这具有减少不利副作用的效果。复合物形成也可提高溶解性,因为微气泡可以携带否则可表现出差的溶解性的药物的多个拷贝。由于通过增加在超声递送部位的局部药物浓度,在结合于气泡时原则上可以显著提高药物的递送效率,因此减少了总成本。

而且,如上面所述,在某些实施方案中,所述部分(例如,cy5衍生物)对它们附接的微气泡进行荧光标记。在这样的实施方案中,cy5衍生物可备选地或另外地用作光学示踪剂,允许通过本领域技术人员熟知的非-侵入性光学成像程序而使微气泡局部化或可视化。

如先前所考虑的,并转到图1,可存在于usmb介导的药物递送系统100中的超声系统组件的实例被描述。如应被理解的,这样的组件可对应于传统的超声成像系统中发现的那些,并且该系统实际上可用于成像靶组织,连同治疗剂的介导递送。在描述的实例中,超声系统包含超声探针102和适合于经由探针102生成和接收超声信号的超声控制台104。在某些实施方案中,超声控制台104可包含波束-形成仪和图像重建和处理电路,用来将超声能量106引向患者的组织108和重建在探针102测量的返回信号。例如,超声控制台104可控制由超声探针102传播的超声信号的强度、波束聚焦或形成、持续时间、相位和频率,并可将多个来自组织的反射超声信号中包含的信息解码为多个可识别的电和电子信号。在usmb实施方案中,超声能量106可在靶组织108内促进治疗剂或诊断剂在感兴趣的解剖位置的释放。返回信号可在控制台104处理以生成根据探针102的感兴趣的解剖区域的图像。

超声系统100也可包含允许用户与控制台104交互并控制控制台104的操作员界面110。操作员界面110可包含键盘、鼠标和其它用户交互装置。操作员界面110可被用来自定义用于usmb程序的多个设置,以实现系统水平配置更改,并允许操作员激活和操作超声系统100。

在描述的实例中,操作员界面110连接至超声控制台104、显示器模块112和打印机模块114,其中的一些或全部可作为超声工作站提供。显示器模块112接收来自超声控制台104的图像信息并呈现根据超声探针102的对象图像。打印机模块114被用来产生硬拷贝的灰度或者彩色的超声图像。一般来说,反射的超声信号和对应的图像传送关于与传播的超声信号有关的各种组织、器官、肿瘤和解剖结构的厚度、大小和位置的信息。

如先前所考虑的,某些与本主题有关的研究在下文讨论。关于具有相对于游离的、天然hsa的对白蛋白微气泡的结合偏好的部分的存在,一项研究被进行以表征apoa-ipdna和白蛋白微气泡(例如,optisontm气泡)之间的结合亲和力。图2说明用于这项研究的样品制备方法。在这个实例中,显示了三个不同的操作。在第一个操作(步骤200)中,进行气泡分离和洗涤以除去游离白蛋白。在第二个操作(步骤218)中,洗涤的气泡与pdna/染料结合溶液混合。在第三个操作(步骤202)中,进行两次盐水或两次天然人血清白蛋白洗涤,接着盐水重构以提供用于分析的最终组合物。

关于第一个操作,在这个实例中,optisontm被用作微气泡组合物,且其用盐水洗涤一次(步骤212)以除去商业产品中存在的游离hsa。特别是,在描述的实例中,微气泡产品206经初步离心(步骤208),除去底层(步骤210),加入盐水并混合(步骤212),接着另外离心(步骤214)。离心后,再次除去底层,并向剩余的白蛋白微气泡中混合dna/染料组合物(步骤218)。

关于dna/染料组合物,在这项研究中,首先使pdna与碘化丙啶(pi)混合,后者在插入dna结构中时会发出荧光,但由于与微气泡(应该不存在)的任何相互作用而不发出荧光。如上面所述,使pdna/染料溶液与白蛋白微气泡混合(步骤218)并将产物离心(步骤220)。生成的微气泡/dna/染料产物用9.5mg/ml天然hsa溶液洗涤两次(步骤224和226),接着盐水重构(步骤228),得到最终的分析产物230。在其它实验运行中,采用不同的洗涤顺序。

在这个研究中,pdna对微气泡的亲和力(作为气泡洗涤的函数)使用荧光显微术和流式细胞术评价。未观察到pdna和白蛋白微气泡之间的统计学相关的结合的证据。特别是,pdna和微气泡之间的任何结合相互作用十分微弱,以致简单的微气泡分离及随后的盐水洗涤足以除去pdna。

相比之下,进行了其它研究,其中提及的药物被发现结合于微气泡。例如,在一组研究中,调查的模型药物是花青5(cy5)的衍生物,例如聚乙二醇化cy5染料。通常,包含疏水性cy5部分的聚乙二醇化和非-聚乙二醇化药物被观察到是白蛋白微气泡的良好结合剂,而包含高度磺化cy5基团(cy5**)的药物被观察到是白蛋白微气泡的差结合剂。

转到图3,被调查的分子的实例被示出。调查的分子包括cy5和cy5**游离酸(称为cy5cooh和cy5**cooh)以及用具有550g/摩尔和20,000g/摩尔的平均分子量的聚乙二醇(peg)(以修改靶的大小)取代的衍生物。cy5cooh是可市售获得的,而cy5**cooh由gehealthcare合成。聚乙二醇化分子从各自的游离酸合成,如在图4的反应式1和2中所示。这两类cy5染料的吸收最大值经测定是不同的。研究指出,达到最大荧光强度的最佳激发波长对于未磺化的cy5是640nm(在655nm发射)和对于cy5**是650nm(在670nm发射)。未磺化的cy5的量子产率经测定为cy5**的量子产率的1.6倍。

在该研究中,使用cy5的染料/气泡混合物如在图5中所示制备。在描述的过程中,显示了3个操作。在第一个操作(步骤200)中,进行气泡分离和洗涤以除去游离白蛋白。在第二个操作(步骤240)中,洗涤的气泡与染料结合溶液混合。在第三个操作(步骤242)中,进行一系列洗涤步骤,接着盐水重构(步骤250)以获得供分析的最终组合物。

关于第一个操作,在这个实例中,optisontm被用作微气泡组合物206,且其用盐水洗涤一次(步骤212)以除去商业产品中存在的游离hsa。特别是,在描述的实例中,微气泡产品206经初步离心(步骤208),除去底层(步骤210),加入盐水并混合(步骤212),接着另外离心(步骤214)。离心后,再次除去底层,和向剩余的白蛋白微气泡中混合cy5染料组合物(步骤240)。在测试的情况下,感兴趣的cy5衍生物和白蛋白微气泡制剂于室温下混合。将从混合染料溶液和微气泡得到的产物离心(步骤220)。

用一种或多种洗涤溶液洗涤生成的微气泡/染料产物(步骤244、246、248)。测试各种洗涤情况。在第一种情况中,进行3次盐水洗涤。在第二种情况中,进行两次变性hsa洗涤和一次盐水洗涤。在第三种情况中,进行两次天然hsa洗涤和一次盐水洗涤。蛋白质洗涤液含有9.5mg/mlhsa。用于这些实验的变性hsa是从商业optisontm产品分离的可溶性的均质hsa。洗涤的产物在盐水中重构(步骤250),得到最终的分析产物252。

生成的分析产物252被用来评价cy5衍生物和白蛋白微气泡之间的结合亲和力。特别是,在某些研究中,以下两种基于荧光的互补方法被用来表征最终的染料/微气泡混合物的结合:荧光显微术和流式细胞术。

在荧光显微术方法中,从多个视野获得图像并分割,减去背景强度,并计算剩余特征的数量、大小和亮度。认为这些测量值对应于结合至成像的微气泡的cy5染料。

在流式细胞术方法中,由于水动力聚焦,微气泡一次一个通过激光拦截。微气泡散射激光,其被登记为事件。任何与给定的微气泡缔合的荧光分子(例如,cy5染料衍生物)吸收激光,测定生成的荧光。荧光仅当存在相应的散射事件时进行测量。在本研究中,所用的激发波长是633nm,并且cy5分子和cy5**化合物之间的量子产率的差异被考虑在内。

图6-10描述白蛋白微气泡和cy5染料混合物的生成的亮视野和荧光图像。荧光图像(底排图像)在减去背景信号后捕获,如上面所述。图6描述使用20kpegcy5部分获得的图像;图7描述使用550pegcy5部分获得的图像;图8描述使用cy5cooh部分获得的图像;图9描述使用20kpegcy5**部分获得的图像;和图10描述使用550pegcy5**部分获得的图像。

如所示的那样,每个荧光图像在与其上对应的亮视野图像相同的视野中捕获。使用在多个视野中捕获的图像,对每个混合/洗涤情况计算在减去背景信号后,每个气泡的平均荧光强度。计算值的图解总结显示与图11中。在图解总结中,各自的误差棒对应于±1个标准偏差。如可在复制的图像中所见的,cy5衍生物表现出持续的结合。相反地,较弱的结合cy5**化合物容易从气泡洗脱。

关于流式细胞术结果,流式细胞术被用来表征在如上所述的各种洗涤程序前后,白蛋白微气泡和cy5染料衍生物二者的混合物的结合。流式细胞术研究的结果在图12中图解总结,其中微气泡/染料混合物的特征显示为洗涤周期的函数且其中“nhsa”对应于天然人血清白蛋白,而“dhsa”对应于变性人血清白蛋白。

与荧光显微术研究一致,流式细胞术结果表明,包含疏水性cy5的衍生物显示结合于微气泡,其通过盐水和蛋白质洗涤继续存在。相反,亲水性cy5**衍生物以更低得多的浓度存在于洗涤样品中。特别是,在流式细胞术结果中,在所有洗涤条件下,最小的最疏水性染料,cy5cooh,显示出最高的气泡结合水平。与荧光显微术的结果一致,20kpegcy5在盐水洗涤后显示出比550pegcy5更大的结合,但它们在蛋白质洗涤后基本上等同。

如应该意识到的,在所有描述的荧光显微术和流式细胞术研究中,染料/微气泡洗涤用盐水溶液或者hsa溶液进行。通常地,通过不仅使用盐水,而且还使用天然和变性hsa的洗涤周期,观察到cy5衍生物持续结合于气泡。而且,当使用人血清或全血(大鼠)进行洗涤时,观察到cy5衍生物的持续结合。特别是,从总体观察到未磺化的cy5明显和持久结合于白蛋白微气泡。

在本文描述的实例中,白蛋白结合部分在微气泡制备后与白蛋白微气泡混合。然而,如应该意识到的,白蛋白结合部分可存在于或包含在微气泡制备过程中,以便存在于微气泡产品中或结合于微气泡产品。即是说,这些步骤不需要分开和分立,尽管它们在本文件中如此论述,以简化解释。因此,其中白蛋白结合部分结合到气泡制备过程中的实施也被考虑在本公开内容的范围内。

为获得对cy5和cy5**衍生物结合于白蛋白微气泡的程度的另外的洞察,进行了一系列的平衡研究。这些研究的方面帮助:(1)在与体内实验更相关的条件下,即在过量的天然hsa的存在下表征系统行为,和(2)表征感兴趣的荧光剂具有的对微气泡中hsa的相对亲和力(与天然hsa比较)。在这些实验中,不同的白蛋白浓度(天然或存在于微气泡中)用固定浓度的染料(即,cy5衍生物)处理。对白蛋白/染料混合物离心过滤以分离结合的染料与未结合的染料,而未结合的染料的荧光使用读板仪测量。

使用气泡的实验的样品制备方法在图13中概述。关于样品制备步骤,进行气泡分离和洗涤以除去游离白蛋白(步骤200)。在这个实例中,微气泡产物206经初步离心(步骤208),除去底层(步骤210),加入盐水并混合(步骤212),接着另外离心(步骤214)。离心后,再次除去底层(步骤280),得到微气泡产物282。为执行平衡计算,在加入(步骤290)正在调查中的各自的cy5衍生物之前,在微气泡产物282上进行定量步骤284。然后将生成的微气泡/染料组合物292离心、过滤,并在读板仪上分析(步骤294)。

关于染料和微气泡之间的结合平衡,采用平衡方程:

(1)x=n*[hsa]/(kd+[hsa])

其中x是结合的配体的分数(基于观察的荧光),和n是每个hsa的结合位点的数目。在平衡表达式中,n(例如,cy5或cy5**结合位点的数目)假定是1。

如先前所考虑的,对一系列白蛋白浓度测定结合于天然hsa的20kpegcy5染料的分数并与在染料与白蛋白微气泡的混合物中测定的结合分数比较。结果图示显示于图14,其描述了作为天然hsa浓度的函数(在左侧)和作为微气泡白蛋白浓度的函数(在右侧)的染料(如cy5)结合分数概况。对应的计算的平衡常数显示于下表1中,其中比率是微气泡白蛋白对比游离天然hsa的结合常数的比率,其中hsa(微气泡)指组成白蛋白微气泡的白蛋白。kd表示离解常数,和ka表示缔合常数。

表1

如可在图14和表1二者中所见到的,[在微气泡壳中的染料/白蛋白]的结合常数是20kpegcy5和较弱的结合剂20kpegcy5**二者的[染料/天然hsa]的结合常数的4.0倍以上。这是令人吃惊的结果,即在两种情况下的结合底物是白蛋白,而唯一的区别是呈微气泡壳形式的白蛋白相对于游离的、天然hsa被优先地结合。这将可能影响在血流中的气泡和游离白蛋白之间染料的平衡分布或分配。如应该意识到的,结合偏好的其它程度(例如,大于2.0或大于3.0)也可具有意义,并且可用于使治疗剂或诊断剂优先地结合白蛋白微气泡。如提出的数据显示的,虽然20kpegcy5和20kpegcy5**二者显示对白蛋白微气泡(对比游离天然白蛋白)的结合偏好,但它们不显示结合微气泡的相同持续性,例如,在洗涤后(图6-10)。在一些实施方案中,较强的结合未磺化的cy5衍生物可能是优选的。在其它实施方案中,较弱的结合高度磺化的cy5**衍生物可能是优选的。

基于这些结果的计算提示,在可接受的体内试验条件下(例如,1ml2.5µm染料与1ml白蛋白微气泡产品混合),当染料是20kpegcy5时,每个微气泡含有平均约420,000个结合的染料分子。平均来说,约5.5%的所有气泡白蛋白分子具有结合于它们的20kpegcy5。作为对比,在相同的条件下,当染料是20kpegcy5**时,有平均约160,000个染料分子结合于每个气泡,其中约2.2%的所有气泡白蛋白与染料缔合。

鉴于这些结果,不同大小的治疗和/或诊断剂可使用表现出相对于游离的、天然hsa,优先结合白蛋白微气泡(例如,非-天然hsa或部分变性和部分交联的hsa)的部分(如,“系链”分子),附接于白蛋白微气泡。不受理论的束缚,气泡壳中白蛋白分子的长范围结构,其受分子内和分子间排列以及气泡表面形状的驱动,也可在观察到的结合偏好中起作用。在某些实施方案中,部分(例如,cy5或cy5衍生物)可作为在感兴趣的治疗剂或诊断剂上的官能团,或者作为添加的基团或内在地存在于感兴趣的药物上的基团提供。在其它实施方案中,治疗剂或诊断剂包含不是cy5或cy5衍生物,但具有对微气泡中的白蛋白(对比游离天然白蛋白)的结合偏好的部分,作为其化学结构的一部分。白蛋白微气泡、结合部分(内在的或添加的)和药物的任何这些组合可被用于超声微气泡(usmb)介导的药物递送系统。

制备这样的治疗组合物的一个实施方案显示于图15中。在该描述的实例中,可执行任选的洗涤步骤200,以在药物/结合剂加入(步骤260)之前除去游离白蛋白。产物随后任选用其它组合物,例如盐水溶液洗涤(步骤262),以在给予受试者之前基本除去未结合的药物/结合剂(例如,洗涤步骤264和分离步骤266)。在其它实施方案中,进行另外的洗涤。在还有的其它实施方案中,未进行洗涤。在其中洗涤在加入药物/结合剂之后进行的实施方案中,组合物可然后例如使用盐水重构(步骤268),以生成用于给予患者的治疗产品270。

如本文所讨论的,在某些实施方案中,表现出结合偏好的部分可用作光学示踪剂(如,荧光标签)。在这样的实施方案中,所述部分的光学或荧光特性可被用于诊断应用,例如监测结合的微气泡相对于感兴趣的解剖区域的位置或使之可视化,例如在usmb程序期间。表现出优先结合白蛋白微气泡(相对于游离的、天然hsa)的部分的实例包括,但不限于cy5衍生物。

本发明的技术效果包括结合一个或多个部分的白蛋白微气泡的组合物,所述部分显示出相对于游离的、天然hsa的对白蛋白微气泡的结合偏好。一个或多个部分可用治疗剂或诊断剂官能化。其它技术效果包括使用与所述部分结合的白蛋白微气泡,进行超声微气泡介导的药物递送。

本书面描述使用实例公开本发明,包括最佳方式,并且也使本领域技术人员能够实施本发明,包括制造和使用任何装置或系统并执行任何合并的方法。本发明的可专利范围由权利要求书限定,并可包括对本领域技术人员而言想到的其它实例。这样的其它实例,如果它们具有不同于权利要求书的文字语言的结构要素,或如果它们包含与权利要求书的文字语言没有显著差异的等效结构要素,则打算落入权利要求书的范围内。

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