布罗莫结构域抑制剂作为癌症免疫治疗的补充剂的制作方法
相关申请的交叉引用
本申请主张获得2014年12月5日提交的编号为62/088,327的美国临时申请和2015年1月23日提交的序列号为62/106,885的申请之权益，上述两项申请的全部内容通过引用并入本文。
发明信息
免疫治疗对于癌症患者而言已经成为越来越具吸引力的治疗策略，许多晚期临床试验证明其在黑素瘤和去势抵抗性前列腺癌中的整体存活期(os)优势。最近，非小细胞肺癌(nsclc)已经成为下一代基于免疫的治疗策略的重点。免疫治疗(特别是使用阻断抑制性免疫检查点分子并因此增强对肿瘤的免疫反应的单克隆抗体)已经在晚期实体瘤中显示出良好的临床前景。
免疫检查点是指从固有线路接入免疫系统的大量抑制路径，它对维持自身耐受性和为了减少周围组织损伤而调节外周组织中生理免疫反应的持续时间和幅度至关重要。目前已清楚的是，肿瘤将某些免疫检查点路径作为免疫抵抗性的主要机制，特别是针对肿瘤抗原特异性的t细胞。
程序性死亡受体-1(pd-1)与其配体pd-l1和pd-l2的相互作用是许多肿瘤用于逃避免疫监视的重要策略之一。当pd-ls与pd-1结合时，t细胞受体(tcr)信号传导受阻，导致增殖遭到抑制，细胞因子生成减少、无反应和/或凋亡。因此，肿瘤细胞pd-ls的表达作为一种保护机制，导致肿瘤微环境中肿瘤浸润淋巴细胞的抑制。
技术实现要素：
用布罗莫结构域抑制剂处理的抗原递呈细胞在本文中显示出更具炎症性，显示出免疫抑制分子pdl1的较低表达，并且能够恢复耐受性t细胞的反应性。因此，本文公开的是在受试者的癌症免疫治疗期间促进t细胞活化的方法，涉及向接受癌症免疫治疗的受试者施用包含布罗莫结构域抑制剂的组合物。在部分实施例中，布罗莫结构域抑制剂是布罗莫结构域和末端(“bet”)抑制剂。例如，bet抑制剂为(s)-叔丁基2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6h-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮杂
另外本文还公开了一种用于治疗受试者癌症的方法，包括向受试者共同施用布罗莫结构域抑制剂和免疫刺激剂。例如，免疫刺激剂可以是抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体或其组合。该方法还包括向受试者施用免疫原性剂。
另外还公开了抗原特异性的t细胞进行继承性细胞转移(act)的体外激活和扩张方法。该方法包括于存在布罗莫结构域抑制剂的情况下将抗原递呈细胞群体(apc)暴露于t淋巴细胞群体。例如，t淋巴细胞可从由自体肿瘤浸润淋巴细胞(til)、使用高亲和力t细胞受体(tcr)转导的t细胞及使用嵌合抗原受体(car)转导的t细胞组成的一组细胞中选定。另外作为示例，可使用的apc包括自体树突状细胞、巨噬细胞或其组合。在某些情况下，apc是人造抗原递呈细胞(aapc)。
下文附图和描述中详尽地说明了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其他特征、目的和优势将通过说明与附图以及权利要求予以阐明。
图示说明
图1按jq1浓度(纳米)函数显示pem细胞活力(％)。
图2通过含有和不含lps的jq1(100、200或400纳米)处理后的腹腔巨噬细胞(pem)显示il-10产生(皮克/毫升)。
图3通过含有和不含lps的jq1(400或800纳米)处理后的pem显示il-6产生(皮克/毫升)。
图4显示用jq1、lps或jq1和lps处理后，pem中的il-6和il10mrna表达(校正折叠表达)。
图5显示使用抗pd-l1(左)或抗-pd-l2(右)抗体时，以同种型、无物质、jq1、lps或jq1和lps处理的pem流式细胞术结果。
图6显示用无物质、jq1、lps或jq1和lps处理的pem中的pd-l1和pd-l2mrna表达。
图7显示在处理后1、2和6小时，用无物质、jq1、lps或jq1和lps处理的pem中的pd-l1mrna表达。
图8显示用jq1、lps或jq1和lps处理24小时，然后用含有或不含ova肽的初始cd4t细胞再培养48小时后的pem的il-2产生(皮克/毫升)。
图9显示用jq1、lps或jq1和lps处理24小时，然后用含有或不含ova肽的初始cd4t细胞再培养48小时后的pem的inf-γ产生(皮克/毫升)。
图10显示用jq1、lps或jq1和lps处理24小时，然后用含有或不含ova肽的耐受cd4t细胞再培养48小时后的pem的inf-γ产生(皮克/毫升)。
详细描述
在部分实施例中，所公开的方法包括使用布罗莫结构域抑制剂在体内治疗受试者，抑制癌性肿瘤的生长。可以单独使用布罗莫结构域抑制剂来抑制癌性肿瘤的生长。或者，布罗莫结构域抑制剂可以与其它免疫原性试剂、标准癌症治疗剂或免疫刺激剂组合使用。
还有几种其他治疗方案涉及抗原特异性t细胞的体外激活和扩增，并将这些细胞过继性转移到受体中以促进抗原特异性t细胞对抗肿瘤(greenberg,r.&riddell,s.(1999)science285:546-51)。这些方法也可用于激活t细胞对cmv等感染因子的反应。存在布罗莫结构域抑制剂的情况下，体外激活可以预期增加过继性转移的t细胞的频率和活性。
“受试者”一词指作为施用或治疗目标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人或兽患者。“患者”一词指临床医生(例如医师)治疗下的受试者。
“治疗”一词是指旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症的患者医疗管理。该词包括主动治疗，即专门针对改善疾病、病理状况或病症的治疗，还包括病因治疗，即针对去除相关疾病的病因、病理状况或病症的治疗。此外，该词包括姑息治疗，即旨在缓解症状而非治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即旨在最大限度减少或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症发展的治疗；以及支持治疗，即用于补充针对改善相关疾病，病理状态或病症的另一种特定疗法的治疗。
“抑制”一词是指活性、反应、病症、疾病或其他生物学参数的降低。其中包括但不限于活性、反应、病症或疾病的完全消除。其中还包括(例如)与本地或对照水平相比，活性、反应、病症或疾病减少10％。因此，减幅可以是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％或与天然或对照水平相比任何幅度的减少。
可以通过公开方法抑制其生长的癌症包括通常对免疫治疗有反应的癌症。所治疗的癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素抵抗性前列腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。可以使用公开方法治疗的其它癌症实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌症、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉引起的癌症)，以及所述癌症的组合。公开方法也可用于治疗转移性癌症，特别是表达pd-l1的转移性癌症。
在部分实施例中，布罗莫结构域抑制剂可以与免疫原性剂组合，比如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)或通过编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞。可使用的肿瘤疫苗非限制性实例包括黑素瘤抗原肽，例如gp100、mage抗原、trp-2、mart1和/或酪氨酸酶的肽，或转染以表达细胞因子gm-csf的肿瘤细胞。
公开的布罗莫结构域抑制剂可以与疫苗接种方案组合。已经设计了许多针对肿瘤疫苗的实验策略(参见rosenberg,s.,2000,developmentofcancervaccines,ascoeducationalbookspring:60-62；logothetis,c.,2000,ascoeducationalbookspring:300-302；khayat,d.2000,ascoeducationalbookspring:414-428；foon,k.2000,ascoeducationalbookspring:730-738；亦可参见restifo,n.andsznol,m.,cancervaccines,ch.61,pp.3023-3043indevita,v.etal.(eds.),1997,cancer:principlesandpracticeofoncology.fifthedition)。在其中一种策略中，疫苗使用自体或同种异体肿瘤细胞进行制备。当肿瘤细胞被转导以表达gm-csf时，这些细胞疫苗被证明最为有效。gm-csf已被证明是用于肿瘤疫苗接种的强效抗原递呈激活剂(dranoffetal(1993)proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:3539-43)。
公开的布罗莫结构域抑制剂可以与在肿瘤中表达的重组蛋白质和/或肽结合使用，以对这些蛋白质产生免疫反应。这些蛋白质通常被免疫系统视为自身抗原，因此对其形成耐受。肿瘤抗原还包括蛋白质端粒酶，为合成染色体端粒所需物质，并且其在超过85％的人类癌症中和有限数量的体细胞组织中表达。肿瘤抗原也可能是癌细胞中表达的“新抗原”，因为体细胞突变会改变蛋白质序列，或在b细胞肿瘤的两个不相关序列或独特型之间产生融合蛋白。
其他肿瘤疫苗包括来自涉及人类癌症的病毒(人乳头瘤病毒(hpv)、肝炎病毒(hbv和hcv)和卡波西氏疱疹肉瘤病毒(khsv))的蛋白质。可与pd-1阻滞联合使用的另一种形式的肿瘤特异性抗原是从肿瘤组织本身分离的纯化热休克蛋白(hsp)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白质片段，且这些热休克蛋白可高效递送到抗原递呈细胞引发肿瘤免疫。
树突状细胞(dc)是可用于引发抗原特异性反应的高效抗原递呈细胞。树突状细胞可以体外制备并用各种蛋白质和多肽抗原以及肿瘤细胞提取物加载。树突状细胞也可以通过遗传方式转导以表达这些肿瘤抗原。就免疫而言，树突状细胞也可直接与肿瘤细胞融合。作为免疫接种的方法，树突状细胞免疫可与布罗莫结构域抑制剂有效结合以激活更高效的抗肿瘤反应。
公开的布罗莫结构域抑制剂也可与标准癌症治疗结合，例如化疗方案。在这些情况下，可以减少所用化学试剂的剂量。此类结合的一个实例是将布罗莫结构域抑制剂与氨烯咪胺组合用于治疗黑素瘤。此类组合的另一个实例是将布罗莫结构域抑制剂与白细胞介素-2(il-2)组合用于治疗黑素瘤。可能致使与布罗莫结构域抑制剂协同作用的其他联合疗法是放射性疗法、手术和内分泌治疗。每个方案都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管发生抑制剂也可与布罗莫结构域抑制剂结合。血管发生的抑制导致肿瘤细胞死亡，其可以提供肿瘤抗原进入宿主抗原递呈途径。
布罗莫结构域抑制剂是本领域已知试剂。布罗莫结构域抑制剂是可以部分或全部阻止或抑制至少一个布罗莫结构域与蛋白质的乙酰赖氨酸残基(例如组蛋白的乙酰赖氨酸残基)结合的任何分子或化合物。布罗莫结构域抑制剂可能是上述抑制布罗莫结构域的任何分子或化合物，包括核酸(例如dna和rna核酸适体)、反义寡核苷酸、小干扰rna和短发夹rna、短肽、抗体或抗体片段和小分子物质(例如小分子化合物)。应当理解，布罗莫结构域抑制剂可以仅抑制一个含布罗莫结构域的蛋白质，或者它可以抑制多种或所有含布罗莫结构域的蛋白质。
布罗莫结构域的实例描述于jp2009028043、jp2009183291、wo2011054843、wo2011054848、wo2009/084693a1、wo2009084693、wo2011054844、wo2011054846、us2012028912,filippakopoulosetal.bioorgmedchem.20(6):1878-1886,2012；chungetal.jmedchem.54(11):3827-38,2011；和chungetal.jbiomolscreen.16(10):1170-85,2011，通过引用将其并入本文。
在部分实施例中，布罗莫结构域抑制剂是bet抑制剂。bet抑制剂是可以防止或抑制至少一个bet族群的布罗莫结构域与蛋白质的乙酰赖氨酸残基结合的任何分子或化合物。bet抑制剂可能是上述抑制bet的任何分子或化合物，包括核酸(例如dna和rna核酸适体)、反义寡核苷酸、小干扰rna和短发夹rna、短肽、抗体或抗体片段和小分子物质(例如小分子化合物)。
bet的实例描述于wo2011/143651、wo2009/084693、wo2011/143669、wo2011/143660、wo2011/054851和jp2008156311中，通过引用将其并入本文。应当理解，bet抑制剂可以仅抑制一个bet族群或它可以抑制多个或所有的bet族群。本领域已知的bet抑制剂的实例包括但不限于rvx-208(resverlogix)、pfi-1(结构基因组学联盟)、otx015(田边三菱制药株式会社)、bzt-glaxosmithkline)。
在某些方面，bet抑制剂是式i的化合物：
其中
x为n或cr5；
r5为h、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；各项被任选取代；
rb为h、烷基、羟烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基或-coo-r3，各项被任选取代；
环a为芳基或杂芳基；
每个ra都是独立的烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代；或任意两个ra与每个连接的原子一起可形成稠合芳基或杂芳基基团；
r为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；各项被任选取代；
r1为-(ch2)n-l，其中n为0-3、l为h、-coo-r3、-co-r3、-co-n(r3r4)、-s(o)2-r3、-s(o)2-n(r3r4)、n(r3r4)、n(r4)c(o)r3、任选经取代芳基或任选经取代杂芳基；
r2为h、d(氘)、卤素或任选经取代烷基；
r3分别独立地选自由下列基团组成的一组基团：
(i)h、芳基、经取代芳基、杂芳基或经取代杂芳基；
(ii)杂环烷基或经取代杂环烷基；
(iii)-c1-c8烷基、-c2-c8烯基或-c2-c8炔基，分别含有从o、s或n中选取的0、1、2或3杂原子；-c3-c12环烷基、经取代-c3-c12环烷基、-c3-c12环烯基或经取代-c3-c12环烯基，各项可被任选取代；及
(iv)nh2，n＝cr4r6；
每个r4分别为h、烷基、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代；
或者r3和r4与其附着的氮原子结合形成4-10元环；
r6为烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代；或者r4和r6与其附着的碳原子结合形成4-10元环；
m为0、1、2或3；
前提是：
(a)若环a为噻吩基，x为n，r为苯基或经取代苯基，r2为h，rb为甲基，r1为-(ch2)n-l，其中，n为1，l为-co-n(r3r4)，则r3和r4不会与其附着的氮原子结合形成吗啉环；
(b)若环a为噻吩基，x为n，r为经取代苯基，r2为h，rb为甲基，r1为-(ch2)n-l，其中，n为1，l为-co-n(r3r4)，且r3和r4其中一个为h，则另一个r3和r不是甲基、羟乙基、烷氧基、苯基、经取代苯基、吡啶基或经取代吡啶基；及
(c)若环a为噻吩基，x为n，r为经取代苯基，r2为h，rb为甲基，r1为-(ch2)n-l，其中，n为1，l为-coo-r3，则r3不是甲基或乙基；或其盐、溶剂化物或水合物。
在部分实施例中，r为芳基或杂芳基，各项被任选取代。
在部分实施例中，l为h、-coo-r3、-co-n(r3r4)、-s(o)2-r3、-s(o)2-n(r3r4)、n(r3r4)、n(r4)c(o)r3或任选经取代芳基。在部分实施例中，r3分别独立地选自由下列基团组成的一组基团：h、-c1-c8烷基，含有从o、s或n中选取的0、1、2或3杂原子；或nh2、n＝cr4r6。
在部分实施例中，r1为-(ch2)n-l，其中，n为1，l为-co-n(r3r4)，r3和r4其中一个为h，另一个为(ch2)p-y，其中p为1-3范围内的数值(例如，p为2)，y为含氮环(可能为芳环或非芳环)。
在部分实施例中，r2为h、d、卤素或甲基。
在部分实施例中，rb为烷基、羟烷基、卤代烷基或烷氧基；各项被任选取代。
在部分实施例中，rb为甲基、乙基、羟甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、cooh、coome、cooet或cooch2oc(o)ch3。
在部分实施例中，环a为5或6元芳基或杂芳基。在部分实施例中，环a为硫代呋喃基、苯基、萘基、联苯、四氢萘基、二氢茚基、吡啶基、呋喃基、吲哚基、嘧啶基、吡地嗪基、吡嗪基、咪唑基、氧氮茂基、噻吩基、噻唑基、三唑基、异恶唑基、喹啉基、吡咯基、吡唑基或5、6、7、8-四氢异喹啉。
在部分实施例中，环a为苯基或噻吩基。
在部分实施例中，m为1或2，且至少有一个ra为甲基。
在部分实施例中，每个ra分别为h、任选经取代烷基，或任意两个ra与其各自附着的原子结合，可形成芳基。
在某些方面，bet抑制剂是式ii的化合物：
其中
x为n或cr5；
r5为h、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代；
rb为h、烷基、羟烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基或-coo-r3，各项被任选取代；
每个ra分别为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代；或任意两个ra与其各自附着的原子结合，可形成稠合芳基或杂芳基基团；
r为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代；
r'1为h、-coo-r3、-co-r3，任选经取代芳基或任选经取代杂芳基；
r3分别独立地选自由下列基团组成的一组基团：
(i)h、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基；
(ii)杂环烷基或经取代杂环烷基；
(iii)-c1-c8烷基、-c2-c8烯基或-c2-c8炔基，分别含有从o、s或n中选取的0、1、2或3杂原子；-c3-c12环烷基、经取代-c3-c12环烷基、-c3-c12环烯基或经取代-c3-c12环烯基，各项可被任选取代；
m为0、1、2或3；
前提是，若r'1为-coo-r3，x为n，r为经取代苯基，rb为甲基，则
r3不是甲基或乙基；
或其盐、溶剂化物或水合物。
在部分实施例中，r为芳基或杂芳基，各项被任选取代。在部分实施例中，r为苯基或吡啶基，各项被任选取代。在部分实施例中，r为p-cl-苯基、o-cl-苯基、m-cl-苯基、p-f-苯基、o-f-苯基、m-f-苯基或吡啶基。
在部分实施例中，r'1为-coo-r3，任选经取代芳基或任选经取代杂芳基；r3为-c1-c8烷基，包含了从o、s或n中选取的0、1、2或3杂原子，可被任选取代。在部分实施例中，r'1为-coo-r3，r3为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基或叔丁基；或r'1为h或任选经取代苯基。
在部分实施例中，rb为甲基、乙基、羟甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、cooh、coome、cooet、cooch2oc(o)ch3。
在部分实施例中，rb为甲基、乙基、羟甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、cooh、coome、cooet或cooch2oc(o)ch3。在部分实施例下，每个ra分别为任选经取代烷基，或任意两个ra与其各自附着的原子结合，可形成稠合芳基。
在部分实施例中，每个ra为甲基。
在某些方面，bet抑制剂是式iii的化合物：
其中
x为n或cr5；
r5为h、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代；
rb为h、烷基、羟烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基或-coo-r3，各项被任选取代；
环a为芳基或杂芳基；
每个ra分别为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代；或任意两个ra与其各自附着的原子结合，可形成稠合芳基或杂芳基基团；
r为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代；
r3分别独立地选自由下列基团组成的一组基团：
(i)h、芳基、经取代芳基、杂芳基或经取代杂芳基；
(ii)杂环烷基或经取代杂环烷基；
(iii)-c1-c8烷基、-c2-c8烯基或-c2-c8炔基，分别含有从o、s或n中选取的0、1、2或3杂原子；-c3-c12环烷基、经取代-c3-c12环烷基、-c3-c12环烯基或经取代-c3-c12环烯基，各项可被任选取代；及
(iv)nh2，n＝cr4r6；
每个r4分别为h、烷基、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代；
或者r3和r4与其附着的氮原子结合形成4-10元环；
r6为烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代；或者r4和r6与其附着的碳原子结合形成4-10元环；
m为0、1、2或3；
前提是：
(a)若环a为噻吩基，x为n，r为苯基或经取代苯基，rb为甲基，则r3和r4不与其附着的氮原子结合形成吗啉环；及
(b)若环a为噻吩基，x为n，r为经取代苯基，r2为h，rb为甲基，且r3和r4其中一个为h，则另一个不是甲基、羟乙基、烷氧基、苯基、经取代苯基、吡啶基或经取代吡啶基；及
或其盐、溶剂化物或水合物。
在部分实施例中，r为芳基或杂芳基，各项被任选取代。在部分实施例中，r为苯基或吡啶基，各项被任选取代。
在部分实施例中，r是p-cl-苯基、o-cl-苯基、m-cl-苯基、p-f-苯基、o-f-苯基、m-f-苯基或吡啶基。在部分实施例中，r3为h、nh2或n＝cr4r6。
在部分实施例中，每个r4分别为h、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基；各项被任选取代。
在部分实施例中，为烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代。
在某些方面，bet抑制剂是式iv的化合物：
其中
x为n或cr5；
r5为h、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代；
rb为h、烷基、羟烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基或-coo-r3，各项被任选取代；
环a为芳基或杂芳基；
每个ra分别为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代；或任意两个ra与其各自附着的原子结合，可形成稠合芳基或杂芳基基团；
r1为-(ch2)n-l，其中n为0-3、l为h、-coo-r3、-co-r3、-co-n(r3r4)、-s(o)2-r3、-s(o)2-n(r3r4)、n(r3r4)、n(r4)c(o)r3、任选经取代芳基或任选经取代杂芳基；
r2为h、d、卤素或任选经取代烷基；
r3分别独立地选自由下列基团组成的一组基团：
(i)h、芳基、经取代芳基、杂芳基或经取代杂芳基；
(ii)杂环烷基或经取代杂环烷基；
(iii)-c1-c8烷基、-c2-c8烯基或-c2-c8炔基，分别含有从o、s或n中选取的0、1、2或3杂原子；-c3-c12环烷基、经取代-c3-c12环烷基、-c3-c12环烯基或经取代-c3-c12环烯基，各项可被任选取代；及
(iv)nh2，n＝cr4r6；
每个r4分别为h、烷基、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代；
或者r3和r4与其附着的氮原子结合形成4-10元环；
r6为烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基或杂芳基，各项被任选取代；或者r4和r6与其附着的碳原子结合形成4-10元环；
m为0、1、2或3；
前提是：
(a)若环a为噻吩基，x为n，r2为h，rb为甲基，r1为-(ch2)n-l，其中，n为0，l为-co-n(rar4)，则r3和r4不会与其附着的氮原子结合形成吗啉环；
(a)若环a为噻吩基，x为n，r2为h，rb为甲基，r1为-(ch2)n-l，其中，n为0，l为-co-n(r3r4)，且r3和r4其中一个为h，则另一个不是甲基、羟乙基、烷氧基、苯基、经取代苯基、吡啶基或经取代吡啶基；及
(c)若环a为噻吩基，x为n，r2为h，rb为甲基，r1为-(ch2)n-l，其中，n为0，l为-coo-r3，则r3不是甲基或乙基；或
其盐、溶剂化物或水合物。
在部分实施例中，r1为-(ch2)n-l，其中n为0-3，l为-coo-r3，任选经取代芳基或任选经取代杂芳基；r3为-c1-c8烷基，包含了从o、s或n中选取的0、1、2或3杂原子，可被任选取代。在部分实施例中，n为1或2，l为烷基或-coo-r3，r3为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基或叔丁基；或n为1或2，l为h或任选经取代苯基。
在部分实施例中，r2为h或甲基。
在部分实施例中，rb为甲基、乙基、羟甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、cooh、coome、cooet、cooch2oc(o)ch3。
在部分实施例中，环a为苯基、萘基、联苯、四氢萘基、二氢茚基、吡啶基、呋喃基、吲哚基、嘧啶基、吡地嗪基、吡嗪基、咪唑基、氧氮茂基、噻吩基、噻唑基、三唑基、异恶唑基、喹啉基、吡咯基、吡唑基或5、6、7、8-四氢异喹啉。
在部分实施例下，每个ra分别为任选经取代烷基，或任意两个ra与其各自附着的原子结合，可形成芳基。
本发明的方法也与式v-xxii的化合物以及下述的任何化合物相关。
另一方面，该化合物由下列公式表示：
或其盐、溶剂化物或水合物。
在部分实施例中，该化合物为(+)-jql：
或其盐、溶剂化物或水合物。
另一方面，该化合物由下列公式表示：
或其盐、溶剂化物或水合物。
另一方面，该化合物由下列公式表示：
或其盐、溶剂化物或水合物。
另一方面，该化合物由下列任一公式表示：
或其盐、溶剂化物或水合物。
另一方面，该化合物由下列任一公式表示：
或其盐、溶剂化物或水合物。
另一方面，该化合物由下列任一公式表示：
或其盐、溶剂化物或水合物。
在部分实施例中，本发明的化合物由下列任一结构表示：
或其盐、溶剂化物或水合物。
在一则实施例中，该化合物由下列结构表示：
或其盐、溶剂化物或水合物。在另一则实施例中，该化合物由下列结构表示：
或其盐、溶剂化物或水合物。
在另一则实施例中，该化合物由下列结构表示：
或其盐、溶剂化物或水合物。
在部分实施例中，本发明的化合物可具有与下述任何化合物相反的手性。
在部分实施例中，该化合物由式(v)，(vi)或(vii)表示：
r中，rl、r2和rb与式(i)中的意义相同；y为o、n、s或cr5，其中r5与式(i)中的意义相同；n为0或1；式(vii)中的虚线圆指芳环或非芳环；或其盐、溶剂化物或水合物。
在式i-iv及vi(或下列任何公式)的部分实施例中，r6表示下表所述醛的非羰基部分(如式r6cho的醛，r6为其非羰基部分)。在部分实施例中，r4与r6一同表示下述酮的非羰基部分(如式r6c(o)r4的酮，r4与r6为其非羰基部分)。
表格a
在一则实施例中，该化合物由下列公式表示：(viii)或其盐、溶剂化物或水合物。
在部分实施例中，该化合物为(外消旋)jql；在部分实施例中，该化合物为(+)-jql。在部分实施例中，该化合物为选自由下列物质组成的一组基团的化合物：
或其盐、溶剂化物或水合物。
化合物的其他例子包括下列任何公式所对应的化合物：
或其盐、溶剂化物或水合物。
在公式ix-xxιι中，r和r'可以是，例如h、芳基、经取代芳基、杂芳基、杂环烷基、-c1-c8烷基、-c2-c8烯基、-c2-c8炔基、-c3-c12环烷基、经取代-c3-c12环烷基、-c3-c12环烯基或经取代-c3-c12环烯基，以上各项可被任选取代。在公式xiv中，x可以是本文中所述芳基基团的任何取代基。
在某些方面，bet抑制剂是下列公式的化合物：
其中
r1是碳数为1-4的烷基，
r2为氢原子；卤素原子或被卤素原子或醇羟基任选取代的碳数为1-4的烷基，
r3为卤素原子；被卤素原子任选取代的苯基、碳数为1-4的烷基、碳数为1-4的烷氧基或氰基；—nrs—(ch2)m—r6，其中r5为氢原子或碳数为1-4的烷基，m为0-4的整数，r6为被卤素原子任选取代的苯基或吡啶基；或—nr7—co—(ch2)n—r8，其中r7为氢原子或碳数为1-4的烷基，n为0-2的整数，r8为被卤素原子任选取代的苯基或吡啶基，且
r4为—(ch2)a—co—nh—r9，其中a为1-4的整数，r9为碳数为1-4的烷基；碳数为1-4的羟烷基；碳数为1-4的烷氧基；被碳数为1-4的烷基、碳数为1-4的烷氧基、氨基或醇羟基任选取代的苯基或吡啶基或—(ch2)b—coor10，其中b为1-4的整数，r10为碳数为1-4的烷基，
或其药用盐或其水合物或溶剂化物。
在部分示例中，r1为甲基。
在部分示例中，r2为卤素原子(如氯)、甲基或羟甲基。
在部分示例中，r3为卤素原子、甲氧基苯基、苯腈、—nr5′—(ch2)m′—r6′，其中r5′为氢原子或甲基，m′为0或1，r6′为苯基、吡啶基或被氟原子取代的苯基及—nr7′—co—(ch2)n′—r8′，其中r7′为氢原子，n′为2，r8′为苯基以及更多更可取的例子，包括氯原子、苯腈、苯胺基和苯乙基羰基氨基。最可取的例子包括氯原子和3-苯腈。
在部分示例中，r4为—(ch2)8′—co—nh—r9′，其中a′为1，r9为甲基、羟乙基、甲氧基、氨基苯基、羟苯基、吡啶基或甲氧基吡啶及，—(ch2)b′—coor10，其中b′为1，r10′为甲基或乙基，如羟基苯基氨基羰基甲基和甲氧羰基。其他例子包括4-羟基苯基氨基羰基甲基和甲氧羰基。此外，与r4键结的碳原子是不对称碳原子。其空间构型可以是s构型、r构型和混合构型中任意一种，s构型较为合适。
在某些方面，bet抑制剂包括(s)-2-[4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6h-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑[4,3-a][1,4]二氮杂
在某些方面，bet抑制剂为甲基(s)-{4-(3′-氰基联苯-4-基)-2,3,9-三甲基-6h-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑[4,3-a][1,4]二氮杂
在某些方面，bet抑制剂为甲基(s)-{2,3,9-三甲基l-4-(4-苯基氨基苯基-6h-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑[4,3-a][1,4]二氮杂
在某些方面，bet抑制剂为甲基(s)-{2,3,9-三甲基-4-[4-(3-苯基丙酰氨基)苯基]-6h-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑[4,3-a][1,4]二氮杂
在某些方面，bet抑制剂为(s)-2-[4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6h-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑[4,3-a][1,4]二氮杂
在某些方面，bet抑制剂是下列公式的化合物：
在某些方面，bet抑制剂是下列公式的化合物：
在某些方面，bet抑制剂是下列公式的化合物：
在某些方面，bet抑制剂是下列公式的化合物：
在某些方面，bet抑制剂是下列公式的化合物：
在部分实施例中，bet抑制剂是键结至bet族成员(如brd1、brd2、brd3、brd4、brd7、brdt；参见wo2011143669)首个布罗莫结构域的结合口袋的小型分子化合物。在部分重要的实施例中，bet抑制剂是jq1，具有以下公式：
公开的布罗莫结构域抑制剂可以与癌症免疫疗法结合使用。有两种不同的免疫疗法：被动的免疫疗法利用免疫系统的部件指挥对抗癌细胞的靶向细胞毒素活动，而无需启动患者体内的免疫反应，而主动的免疫疗法则会触发内生的免疫反应。被动策略包括使用b细胞产生应对特定抗原的单克隆抗体(mabs)。二十世纪70年代杂交瘤技术的开发及识别肿瘤特异性抗原促使专门针对肿瘤细胞，以使免疫系统对肿瘤细胞进行毁灭的mabs得以研发成功。迄今为止，mabs一直是免疫疗法领域取得的最大成就，是2012年三种最畅销的抗癌药物之一。其中一种药物是利妥昔单抗(美罗华、基因泰克)，这种药物与在b细胞恶性肿瘤(如非何杰金氏淋巴瘤(nhl))表面表达高度活跃的cd20蛋白键结。利妥昔单抗获美国食品和药物管理局批准，与化疗结合用于治疗非何杰金氏淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病(cll)。另一种重要的单克隆抗体是曲妥单抗(赫塞汀；基因泰克)，该种抗体通过指向人类表皮生长因子受体2(her2)的表达而彻底改革了her2阳性乳腺癌的治疗方法。
为积极促进抗肿瘤免疫反应，癌症治疗性疫苗已研发成功。与用于预防传染疾病的预防疫苗不同的是，治疗性疫苗旨在通过刺激针对特定肿瘤相关抗原的免疫反应治疗已确定的癌症。2010年，sipuleucel-t(普罗文奇；dendreoncorporation)获美国食品和药物管理局批准，根据impact(免疫疗法前列腺癌治疗)的试验结果用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌，该药物使整体存活率提高4.1个月，且与安慰剂效应相比将死亡风险降低22％。积极免疫疗法的优势在于它们可同时调动先天性和适应性免疫反应，从而提供长期可持续的抗癌活性。尽管mabs通常被视作被动免疫疗法，但越来越多的证据表明，它们还可通过“类疫苗”效应诱导适应性免疫反应。
两种已知的抑制性检查点途径包括通过细胞毒t淋巴细胞抗原-4(ctla-4)和程序性死亡受体1(pd-1)发出信号。这些蛋白属于协同信号分子cd28-b7族群，该族群在t细胞功能的所有阶段均扮演重要角色。pd-1受体(也称为cd279)在激活的t细胞表面表达。其配体pd-l1(b7-h1；cd274)和pd-l2(b7-dc；cd273)在抗原呈递细胞(如树突细胞或巨噬细胞)表面表达。pd-l1是主要配体，但pd-l2的表达模式更加有限。当配体键结至pd-1时，会向t细胞传输抑制信号，从而减少细胞因子产生并抑制t细胞扩散。表1载列临床试验中的免疫检查点靶向抗体清单。
编号为8,008,449的美国专利中描述了程序性死亡1(pd-1)的人单克隆抗体和单独使用抗pd-1抗体或与其它免疫治疗剂组合治疗癌症的方法，通过引用将其纳入本文。编号为8,552,154的美国专利中描述了抗pd-l1抗体及其用途，通过引用这些抗体将其纳入本文。编号为8,617,546的美国专利中描述了包含抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体的抗癌剂，通过引用这些抗体将其纳入本文。
本文还公开了一种组合物，例如含有与药学上可接受的载体一起配制的布罗莫结构域抑制剂的药物组合物。药物组合物可以联合治疗，即与其它试剂组合施用。例如，组合疗法包括与至少一种其它抗炎或免疫抑制剂组合的布罗莫结构域抑制剂抗体。
本文所用的“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。最佳情况下，载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮给药(例如通过注射或输注)。根据给药途径，可以在材料中涂覆活性化合物(即抗体、免疫偶联物或双特异性分子)，以保护化合物免受可能使其失活的酸和其它天然条件的作用。
公开的药物组合物包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”指保留母体化合物的所需生物活性并且不会产生任何不期望的毒理作用的盐。
所公开的药物组合物包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的示例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、酸盐半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(bha)、二丁基羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可用于药物组合物的合适水性和非水性载体示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。例如，通过使用卵磷脂等包衣材料、在分散体的情况下维持所需的粒径以及使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
这些组合物还包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌程序(同上)和通过包含各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)以避免微生物的存在。还可以在组合物中纳入等渗剂(例如糖、氯化钠等)。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过纳入延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。将这种介质和试剂用于药物活性物质是本领域已知做法。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容之外，预期将在本发明的药物组合物中使用以上物质。亦可在组合物中纳入补充活性化合物。
治疗组合物通常在制造和储存的情况下必须无菌且稳定。该组合物可以配制成适合高药物浓度的溶液、微乳液、脂质体或其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，及其合适的混合物。例如，通过使用卵磷脂等包衣、在分散体的情况下维持所需的粒径以及使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在许多情况下，首选在组合物中纳入等渗剂(例如糖)、多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠)。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中纳入延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现。
无菌可注射溶液可以通过在适当的溶剂中加入所需量的活性化合物与上述所列成分的一种或其组合，根据需要并进行杀菌微滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入含有碱性分散介质的无菌载体和上述所列的其他必要成分来制备分散体。就制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，首选制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，以产生活性成分的粉末加上任何预先无菌过滤的溶液中的额外所需成分。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分含量将根据所治疗的受试者和具体的给药方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分含量通常是产生治疗效果的组合物含量。一般而言，在百分之百范围内，该含量介于约0.01％至约99％的活性成分，较优范围介于约0.1％至约70％的活性成分，最优范围介于约1％至约30％的活性成分与药学上可接受的载体组合。
调整剂量方案以提供最佳预期的反应(例如治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间分开施用多个剂量，或者依据治疗情况的紧急程度指示按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制非消化道组合物尤其有利于给药和剂量均匀。本文所用的剂量单位形式是指适合于待治疗受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有经计算的预定量活性化合物，以产生与所需药物载体相关联的预期治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格遵循并直接依赖于(a)活性化合物的独特特征和将要实现的特定治疗效果，和(b)复合此类化合物以治疗个体敏感性的领域中固有的限制。
就布罗莫结构域抑制剂的给药而言，每千克宿主体重的给药剂量范围从0.0001至100毫克不等，0.01至5毫克之间较为常见。例如，剂量可能为0.3毫克/千克体重、1毫克/千克体重、3毫克/千克体重、5毫克/千克体重或10毫克/千克体重，或者在1-10毫克/千克的范围之内。一项示范性治疗方案所需的给药频率为每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每三至六个月一次。通过静脉注射给药的布罗莫结构域抑制剂首选剂量包括1毫克/千克体重或3毫克/千克体重，同时按照以下给药方案之一使用布罗莫结构域抑制剂：(i)每四周给药六剂，随后每三个月给药六剂；(ii)每三周；(iii)每三周给药1毫克/千克体重后，一次性给药3毫克/千克体重。
可改变药物组合中活性成分的实际剂量水平，从而获取一定量的活性成分，能在对患者无毒性的情况下，有效达到针对某一特定患者、组合和给药方式的理想治疗疗效。选定的剂量水平将取决于各种药物动力学因素，包括所采用的现行发明特定组合的活性或其酯、盐或酰胺化物、给药途径、给药时间、所采用特定化合物的排泄率、治疗的持续时间、与所采用的特定组合结合使用的其他药物、化合物及/或物质、接受治疗患者的年龄、性别、体重、疾病、一般健康状况和先前的病史，以及医学领域中众所周知的类似因素。
“治疗有效剂量”的最好结果是病症的严重程度降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者预防感染疾病引起的损伤或障碍。例如，就肿瘤的治疗而言，“治疗有效剂量”最好能抑制至少约20％的细胞生长或肿瘤生长，更好的情况是抑制至少约40％，甚至能抑制至少约60％，而相对于未经治疗的受试者，仍能达到抑制至少约80％的较好情况。化合物抑制肿瘤生长的能力可在能预测对人类肿瘤疗效的动物模型系统中进行评估。或者，组合的这一特性可通过测定化合物的抑制能力进行评估，该抑制作用通过技术熟练的专家了解的化验在体外进行。具疗效化合物的治疗有效剂量可缩减肿瘤大小或以其他方式改善受试者的症状。该领域中的一项普通技能是可基于受试者的大小、受试者症状的严重程度及选定的特定组合或给药途径等种种因素，确定该等剂量。
本文公开的组合可通过一种或多种给药途径，使用一种或多种该领域已知的各种方法进行给药。本领域技术人员可以理解，给药的途径及/或方式将视乎预期效果而异。对本发明抗体的首选给药方式包括静脉注射、肌肉注射、皮内注射、腹腔注射、皮下注射、骨髓注射或其他非消化道给药方式，例如注射或输液。本文中使用的短语“非消化道给药”指消化道给药和局部给药以外的给药方式，通常采用注射方式，包括但不限于静脉、肌肉、动脉、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔、经气管、皮下注射、表皮注射、关节内注射、囊膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射及输液。此外，该组合还可通过非消化道以外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如鼻腔内、口服、阴道内、直肠、舌下或局部给药。
活性化合物可使用能防止化合物迅速释放的载体制备，如控释制剂，包括植入体、透皮贴剂及微胶囊输送系统。可使用生物可降解、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。制备该制剂的许多方法均受专利保护，或普遍为本领域的技术人员所知。
t细胞激活可经自体树突状细胞或人工抗原递呈细胞(aapcs)，或者通过转基因输送t细胞受体(tcrs)进行t细胞工程在体外或体内诱导。体外激活的自体t细胞可继承性地转移到患者体内，从而专门杀死癌症细胞。因此，还公开了抗原特异性t细胞进行继承性细胞转移(act)的体外激活和扩张方法。该方法包括在适合激活和扩张抗原特异性t细胞的条件下存在布罗莫结构域抑制剂时，将抗原递呈细胞(apc)群体暴露于大量t淋巴细胞群体。例如，t淋巴细胞可从由自体肿瘤浸润淋巴细胞(til)、使用高亲和力t细胞受体(tcr)转导的t细胞及使用嵌合抗原受体(car)转导的t细胞组成的一组细胞中选定。
此外，注射抗原递呈细胞可在无需自体细胞培养的情况下促成体内免疫疗法。因此，还公开了提高抗原递呈细胞体外机能以进行体内免疫疗法的方法。此方法包括使大量抗原递呈细胞与布罗莫结构域抑制剂接触。
可在公开疗法中使用的抗原递呈细胞包括自体树突状细胞、巨噬细胞或两者的结合体。
本发明的若干实施方式已作说明。尽管如此，需要理解的是，在不脱离本发明精神和范围的情况下作出了多项修改。因此，其他实施方式也属以下权利要求的范围。
示例
示例1：jq1，一种选择性的布罗莫结构域抑制剂，减少了耐受性分子pdl1在抗原递呈细胞(apcs)中的表达以及修复了无应变性的cd4+t细胞的反应性。
布罗莫结构域和额外的末端结构域(bet)为可识别乙酰化赖氨酸残基的蛋白质结构域，如组蛋白的n-端尾部上的乙酰化赖氨酸残基。这种识别通常是蛋白质-组蛋白联合、染色体重塑和基因转录的先决条件。对bet蛋白质在通过组蛋白的转译标记调控炎性细胞因子基因的反应中的作用缺乏认识。
鉴于抗原递呈细胞的炎症状态对于确定相对于t细胞耐受性的t细胞激活至关重要，以及抗原递呈细胞中特定基因的表观遗传修改在这一过程中发挥关键作用，从而确定在抗原递呈细胞中抑制bet的功能性结果。
材料和方法
为确定jq1在pem中的最佳作用浓度，对培养板上的pem(96孔培养板)使用浓度增加的jq1进行24小时的处理，随后确定细胞的存活力。确定可接受的阀值为100至800纳摩尔浓度。
分别在存在和不存在lps(巨噬细胞兴奋剂)的情况下，对巨噬细胞(pem)使用不同的jq1浓度进行处理。24小时过后，收集上清液，通过elisa测定为il-10及il-6的产物。呈剂量依赖性的il-10及il-6的产物均有所减少，使用lps或jq1处理的il-10及il-6的mrna表达以及两者的结合均由实时的pcr决定。
分别在存在和不存在lps的情况下，对pem使用不同的jq1浓度进行处理。对在存在和不存在lps的情况下接受不同浓度的jq1处理的pem采用流式细胞术，并使用抗pd-l1和抗pd-l2以及同种型作为对照标准。使用jq1和lps对pem的综合处理结果表明，pd-l1和pd-l2的表达相对于单独使用lps有所减少。经过lps或jq1处理及两者结合处理的pd-l1和pd-l2的mrna表达同样由实时的pcr决定。使用lps+jq1对pem的综合处理降低了pdl1mrna的表达。
分别在存在和不存在lps的情况下，对pem使用不同的jq1浓度进行处理。24小时过后，使用温热的rpmi清洗pem两次。将初始cd4t细胞或耐受型t细胞添加到培养板上含有或不含ova肽的巨噬细胞上，共同培养48小时。通过elisa测定il-2和ifn-γ产物。在不含ova肽的情况下，均无il-2或ifn-γ产物。cd4t细胞产生的il-2和ifn-γ剂量依赖性产物均有增加。对pem的综合处理(jq1+lps)引起了耐受型t细胞ifn-γ产物的增加。
因此，不仅初始cd4t细胞中的抗原递呈能力有所增长，更重要的是，经jq1处理后的耐受型t细胞功能得到修复。因此，使用bdr特定抑制剂jq1处理的抗原递呈细胞更具炎症性，并显示出免疫抑制分子pd-l1的表达降低。jq1之类的bet抑制剂从而能够修复耐受型t细胞的反应性，具备有前景的治疗应用，并拓宽了临床范围。
结果
首先，评估了jq1(一种选择性小分子bet布罗莫结构域抑制剂)对抗原递呈细胞的机能及其对抗原特异性cd4+t细胞反应的调节作用。对腹腔巨噬细胞(pem)或骨髓源树突状细胞(dc)进行提高jq1浓度的体外处理后，抗炎性细胞因子il-10和il-6在lps刺激下减少了表达及蛋白质产生(图2至图4)。在所用的浓度下，jq1并未影响被处理抗原递呈细胞的活力(图1)。其次，经分析主要组织相容性复合体(mhc)家族分子和共刺激分子的表达，发现致耐受性分子pdl1在经jq1处理的抗原递呈细胞中的表达与未经处理的抗原递呈细胞相比有所减少(图5至图7)。第三，评估了经jq1处理的抗原递呈细胞将同族抗原递呈给初始或耐受型抗原特异性cd4+t细胞的能力。使用jq1处理pem或dc均提高了其抗原递呈能力，由此导致初始cd4+t细胞的有效促发，il-2(图8)和ifn-γ(图9)在同族抗原作用下产量增加可证实这一点。更重要的是，经jq1处理的抗原递呈细胞能够恢复从带淋巴瘤宿主身上分离的耐受性cd4+t细胞的反应性(图10)。
综上所述，用布罗莫结构域特定抑制剂jq1处理的抗原递呈细胞更具炎症性，显示出免疫抑制分子pdl1的较低表达，更重要的是，其能够恢复耐受性t细胞的反应性。上述结果揭示了bet抑制剂具有先前不为人知的免疫作用，并拓宽了其临床范围，即有望作为癌症免疫治疗的补充剂。
除非另有指明，本文中使用的所有科学和技术术语，与本发明所涉领域的专业人士通常理解的涵义相同。本文中引用的著作及就此引用的材料均列为参考文献。
相关领域的专业人员将确认或能够保证，仅将本文所述发明中具体实施例的许多等价物用于常规实验。此类等价物应包括下列权利要求。
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