吡咯并苯并二氮杂*‑抗体缀合物的制作方法

本公开涉及呈至结合至cd25的抗体的接头的形式的具有不稳定性c2或n10保护基的吡咯并苯并二氮杂(pbd)的特定用途。

背景

吡咯并苯并二氮杂

一些吡咯并苯并二氮杂(pbd)具有识别和结合至dna的特定序列的能力；优选的序列是pugpu。在1965年发现第一种pbd抗肿瘤抗生素，氨茴霉素(leimgruber,等,j.am.chem.soc.,87,5793-5795(1965)；leimgruber,等,j.am.chem.soc.,87,5791-5793(1965))。自此以后，报道了许多天然存在的pbd，并且已开发了多种类似物的超过10个合成途径(thurston,等,chem.rev.1994,433-465(1994)；antonow,d.和thurston,d.e.,chem.rev.2011111(4),2815-2864)。家族成员包括赤霉素(hochlowski,等,j.antibiotics,40,145-148(1987))、奇卡霉素(konishi,等,j.antibiotics,37,200-206(1984))、dc-81(日本专利58-180487；thurston,等,chem.brit.,26,767-772(1990)；bose,等,tetrahedron,48,751-758(1992))、甲基氨茴霉素(kuminoto,等,j.antibiotics,33,665-667(1980))、新茴霉素a和b(takeuchi,等,j.antibiotics,29,93-96(1976))、泊罗霉素(tsunakawa,等,j.antibiotics,41,1366-1373(1988))、普拉卡素(shimizu,等,j.antibiotics,29,2492-2503(1982)；langley和thurston,j.org.chem.,52,91-97(1987))、柴野霉素(dc-102)(hara,等,j.antibiotics,41,702-704(1988)；itoh,等,j.antibiotics,41,1281-1284(1988))、西伯利亚霉素(leber,等,j.am.chem.soc.,110,2992-2993(1988))和托马霉素(arima,等,j.antibiotics,25,437-444(1972))。pbd具有一般结构：

它们的不同之处在于取代基的数目、类型和位置，它们的芳香族a环和吡咯并c环两者以及c环饱和度。在b-环中，在为负责烷基化dna的亲电子中心的n10-c11位置处存在亚胺(n＝c)、甲醇胺(nh-ch(oh))或甲醇胺甲醚(nh-ch(ome))。所有已知的天然产物在手性c11a位置处具有(s)-构型，当从c环朝向a环观察时，其为它们提供右手扭曲。这给予它们适用于与b型dna的小沟具有相同螺旋(isohelicity)的三维形状，导致在结合位点处的密配合(snugfit)(kohn,在antibioticsiii.springer-verlag,newyork,第3-11页(1975)；hurley和needham-vandevanter,acc.chem.res.,19,230-237(1986)中)。它们在小沟中形成加成物的能力使得它们能够干扰dna加工，因此它们用作抗癌剂。

特别有利的吡咯并苯并二氮杂化合物由gregson等(chem.commun.1999,797-798)描述为化合物1，并且由gregson等(j.med.chem.2001,44,1161-1174)描述为化合物4a。该化合物，也被称为sg2000，在下文中显示：

wo2007/085930描述了具有用于连接至细胞结合剂(诸如抗体)的接头基团的二聚体pbd化合物的制备。接头存在于二聚体的连接单体pbd单元的桥中。

具有用于连接至细胞结合剂(诸如抗体)的接头基团的二聚体pbd化合物描述于wo2011/130613和wo2011/130616中。将在这些化合物中的接头经由c2位置连接至pbd核，并且通常通过接头基团上的酶的作用裂解。在wo2011/130598中，将这些化合物中的接头连接至pbd核上可用的n10位置之一，并且通常通过接头基团上的酶的作用裂解。

抗体-药物缀合物

已经建立抗体疗法用于靶向治疗患有癌症、免疫病症和血管生成病症的患者(carter,p.(2006)naturereviewsimmunology6:343-357)。使用抗体-药物缀合物(adc)(即免疫缀合物)局部递送细胞毒性剂或细胞抑制剂(即，在癌症治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物)靶向药物部分递送至肿瘤并在其中胞内累积，而全身施用这些未缀合的药剂可导致对正常细胞不可接受水平的毒性(xie等(2006)expert.opin.biol.ther.6(3):281-291；kovtun等(2006)cancerres.66(6):3214-3121；law等(2006)cancerres.66(4):2328-2337；wu等(2005)naturebiotech.23(9):1137-1145；lambertj.(2005)currentopin.inpharmacol.5:543-549；hamannp.(2005)expertopin.ther.patents15(9):1087-1103；payne,g.(2003)cancercell3:207-212；trail等(2003)cancelimmunol.immunother.52:328-337；syrigos和epenetos(1999)anticancerresearch19:605-614)。

在此寻求具有最小毒性的最大功效。设计和精制adc的努力集中于单克隆抗体(mab)的选择性以及药物作用机制、药物-连接、药物/抗体比(载量)和药物释放性质(junutula,等,2008bnaturebiotech.,26(8):925-932；dornan等(2009)blood114(13):2721-2729；us7521541；us7723485；w02009/052249；mcdonagh(2006)proteineng.design&sel.19(7):299-307；doronina等(2006)bioconj.chem.17:114-124；erickson等(2006)cancerres.66(8):1-8；sanderson等(2005)clin.cancerres.11:843-852；jeffrey等(2005)j.med.chem.48:1344-1358；hamblett等(2004)clin.cancerres.10:7063-7070)。

wo2014/57119公开了缀合至抗-cd25抗体的pbd二聚体。

公开内容

如下文更详细地描述，本发明人已证明如本文所定义的adc当靶向cd-25阳性细胞时，另外地具有针对cd25-阴性细胞的强有力的旁观者效应。

这一发现结果提供用于此类adc的另外的用途，从而暗示了新的治疗背景，例如涉及存在cd25+ve和cd25-ve细胞两者的肿瘤或其它赘生物时，所述肿瘤或其它赘生物(作为非限制性实例)可为其中赘生性cd-25阳性细胞群是异质的淋巴瘤或者缺乏cd25但被cd-25阳性激活的t-细胞浸润的赘生物。

因此，本公开的优选的第一方面提供治疗受试者中的增生性疾病的方法，所述疾病的特征在于存在包含cd25+ve和cd25-ve细胞两者的赘生物，

所述方法包括向受试者施用式l-(d^l)p的缀合物，其中d^l具有式i或ii：

其中：

l是结合至cd25的抗体(ab)；

p是1至20的整数；

当在c2’与c3’之间存在双键时，r¹²选自由以下组成的组：

(ia)c5-10芳基基团，被选自包括以下的基团的一个或多个取代基任选地取代：卤基、硝基、氰基、醚、羧基、酯、c1-7烷基、c3-7杂环基和双-氧基-c1-3亚烷基；

(ib)c1-5饱和脂肪族烷基；

(ic)c3-6饱和环烷基；

(id)其中r²¹、r²²和r²³的每一个独立地选自h、c1-3饱和烷基、c2-3烯基、c2-3炔基和环丙基，其中r¹²基团中的碳原子总数不超过5；

(ie)其中r^25a和r^25b之一是h且另一个选自：苯基，所述苯基被选自以下的基团任选地取代：卤基、甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基，和

(if)其中r²⁴选自：h；c1-3饱和烷基；c2-3烯基；c2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基被选自以下的基团任选地取代：卤基、甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基；

当在c2’与c3’之间存在单键时，

r¹²是其中r^26a和r^26b独立地选自h、f、c1-4饱和烷基、c2-3烯基，所述烷基和烯基基团被选自c1-4烷基酰氨基和c1-4烷基酯的基团任选地取代；或者，当r^26a和r^26b之一是h时，另一个选自腈和c1-4烷基酯；

r⁶和r⁹独立地选自h、r、oh、or、sh、sr、nh2、nhr、nrr’、硝基、me3sn和卤基；

其中r和r’独立地选自任选取代的c1-12烷基、c3-20杂环基和c5-20芳基基团；

r⁷选自h、r、oh、or、sh、sr、nh2、nhr、nhrr’、硝基、me3sn和卤基；

r"是c3-12亚烷基基团，其链可被一个或多个杂原子(如o、s、nrⁿ²(其中rⁿ²是h或c1-4烷基)和/或芳香族环(如苯或吡啶))中断；

y和y’选自o、s或nh；

r^6'、r^7'、r^9'选自分别与r⁶、r⁷和r⁹相同的基团；

[式i]

r^l1’是用于连接至抗体(ab)的接头；

r^11a选自oh、or^a(其中r^a是c1-4烷基)和sozm(其中z是2或3且m是单价药学上可接受的阳离子)；

r²⁰和r²¹在它们结合的氮与碳原子之间一起形成双键；或

r²⁰选自h和r^c，其中r^c是封端基团；

r²¹选自oh、or^a和sozm；

当在c2与c3之间存在双键时，r²选自由以下组成的组：

(ia)c5-10芳基基团，被选自包括以下的基团的一个或多个取代基任选地取代：卤基、硝基、氰基、醚、羧基、酯、c1-7烷基、c3-7杂环基和双-氧基-c1-3亚烷基；

(ib)c1-5饱和脂肪族烷基；

(ic)c3-6饱和环烷基；

(id)其中r¹¹、r¹²和r¹³的每一个独立地选自h、c1-3饱和烷基、c2-3烯基、c2-3炔基和环丙基，其中r²基团中碳原子的总数不超过5；

(ie)其中r^15a和r^15b之一是h且另一个选自：苯基，所述苯基被选自以下的基团任选地取代：卤基、甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基；和

(if)其中r¹⁴选自：h；c1-3饱和烷基；c2-3烯基；c2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基被选自以下的基团任选地取代：卤基、甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基；

当在c2与c3之间存在单键时，

r²是其中r^16a和r^16b独立地选自h、f、c1-4饱和烷基、c2-3烯基，所述烷基和烯基基团被选自c1-4烷基酰氨基和c1-4烷基酯的基团任选地取代；或者，当r^16a和r^16b之一是h时，另一个选自腈和c1-4烷基酯；

[式ii]

r²²具有式iiia、式iiib或式iiic：

(a)

其中a是c5-7芳基基团，且

(i)q¹是单键，且q²选自单键和-z-(ch2)n-，其中z选自单键、o、s和nh且n为1至3；或

(ii)q¹是-ch＝ch-且q²是单键；

(b)

其中；

r^c1、r^c2和r^c3独立地选自h和未取代的c1-2烷基；

(c)

其中q选自o-r^l2’、s-r^l2’和nrⁿ-r^l2’，且rⁿ选自h、甲基和乙基

x选自包括以下的基团：o-r^l2’、s-r^l2’、co2-r^l2’、co-r^l2’、nh-c(＝o)-r^l2’、nhnh-r^l2'、conhnh-r^l2'、nrⁿr^l2'，其中rⁿ选自包括h和c1-4烷基的基团；

r^l2'是用于连接至抗体(ab)的接头；

r¹⁰和r¹¹在它们结合的氮与碳原子之间一起形成双键；或

r¹⁰是h且r¹¹选自oh、or^a和sozm；

r³⁰和r³¹在它们结合的氮与碳原子之间一起形成双键；或

r³⁰是h且r³¹选自oh、or^a和sozm。

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

在本公开的另一方面，提供治疗受试者中的增生性疾病的方法，所述疾病的特征在于存在包含cd25+ve和cd25-ve细胞两者的赘生物，

所述方法包括向受试者施用式a的缀合物：

其中：

d表示基团d1或d2：

虚线指示在c2与c3之间任选存在双键；

当在c2与c3之间存在双键时，r²选自由以下组成的组：

(ia)c5-10芳基基团，被选自包括以下的基团的一个或多个取代基任选地取代：卤基、硝基、氰基、醚、羧基、酯、c1-7烷基、c3-7杂环基和双-氧基-c1-3亚烷基；

(ib)c1-5饱和脂肪族烷基；

(ic)c3-6饱和环烷基；

(id)其中r³¹、r³²和r³³的每一个独立地选自h、c1-3饱和烷基、c2-3烯基、c2-3炔基和环丙基，其中r²基团中碳原子的总数不超过5；

(ie)其中r^35a和r^35b之一是h且另一个选自：苯基，所述苯基被选自以下的基团任选地取代：卤基、甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基；和

(if)其中r³⁴选自：h；c1-3饱和烷基；c2-3烯基；c2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基被选自以下的基团任选地取代：卤基、甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基；

(ig)卤基；

当在c2与c3之间存在单键时，

r²是其中r^36a和r^36b独立地选自h、f、c1-4饱和烷基、c2-3烯基，所述烷基和烯基基团被选自c1-4烷基酰氨基和c1-4烷基酯的基团任选地取代；或者，当r^16a和r^16b之一是h时，另一个选自腈和c1-4烷基酯；

d’表示基团d’1或d’2：

其中虚线指示在c2’与c3’之间任选存在双键；

r⁶和r⁹独立地选自h、r、oh、or、sh、sr、nh2、nhr、nrr’、no2、me3sn和卤基；

r⁷独立地选自h、r、oh、or、sh、sr、nh2、nhr、nrr’、no2、me3sn和卤基；

y选自式a1、a2、a3、a4、a5和a6：

l是连接至细胞结合剂的接头；

cba是结合至cd25的抗体(ab)；

n是选自于0至48范围内的整数；

r^a4是c1-6亚烷基基团；

(a)r¹⁰是h且r¹¹是oh、or^a，其中r^a是c1-4烷基；或

(b)r¹⁰和r¹¹在它们结合的氮与碳原子之间形成氮-碳双键；或

(c)r¹⁰是h且r¹¹是osozm，其中z是2或3且m是单价药学上可接受的阳离子；

r和r’各自独立地选自任选取代的c1-12烷基、c3-20杂环基和c5-20芳基基团，并且任选地涉及基团nrr’时，r和r’连同它们连接的氮原子一起形成任选取代的4-、5-、6-或7-元杂环环；

其中r¹⁶、r¹⁷、r¹⁹、r²⁰、r²¹和r²²分别如针对r⁶、r⁷、r⁹、r¹⁰、r¹¹和r²那样定义；

其中z是ch或n；

其中t和t’^'独立地选自单键或c1-9亚烷基，其链可被一个或多个杂原子(如o、s、n(h)、nme)中断，前提是x与x’之间最短的原子链中原子数是3至12个原子；

x和x’独立地选自o、s和n(h)。

a的其它结构(其当cba是结合至cd25的抗体(ab)时可与本公开内容一起使用)描述于wo2014/140862和wo2014/159981中。

在本公开的该可替代方面的优选实施方案中，l具有式：

-l^a-(ch2)m-，其中m是0至6(l1)；

-l^a-(ch2)m-o-，其中m是0至6(l2)；或

-l^a-(ch2)q-o-c(＝o)-nh-(ch2)p-，其中q是1至3，且p是1至3(l3)；

其中l^a选自：

其中ar表示c5-6亚芳基基团，如亚苯基。

其它可用作连接y基团的剩余部分与细胞结合剂的l的基团描述于wo2014/140862和wo2014/159981中。

实施方案

在一些实施方案中，本公开提供治疗受试者中增生性疾病的方法，所述疾病的特征在于存在包含cd25+ve和cd25-ve细胞两者的赘生物，所述方法包括向受试者施用具有选自包括以下的组的式的缀合物：

缀合物f

缀合物g

缀合物h

和缀合物i

其中cba是结合至cd25的抗体(ab)。

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因此，缀合物包含结合至通过接头单元共价连接至至少一个药物单元的cd25的抗体(ab)。

载药量由p(每抗体的药物分子数)表示。载药量的范围可为每抗体1至20个药物单位(d^l)。对于组合物，p表示组合物中缀合物的平均载药量，且p在1至20的范围内。

在本公开的实践中，药物部分可在由所述cd25+ve细胞内化之前或之后体内裂解诸如以释放pbd，其中所述pbd渗透所述cd25+ve和cd25-ve细胞两者，从而引起对其的细胞毒性。

优选地，细胞毒性引起细胞死亡。

在本公开的另一方面，提供引起对cd25+ve细胞附近的赘生性cd25-ve细胞的细胞毒性(更优选地，cd25+ve细胞附近的赘生性cd25-ve细胞的细胞死亡)的方法，所述方法包括使用如本公开的第一方面所定义的缀合物。该第二方面的方法可根据第一方面进行。所述方法可包括确认对cd25-ve细胞的细胞毒性的步骤。cd25+ve和cd25-ve细胞均可为赘生性细胞，例如共定位于淋巴瘤中。

cd25+ve细胞可为肿瘤浸润性淋巴细胞(til)且cd25-ve细胞可为赘生性细胞，例如共定位于淋巴瘤或非血液癌中。

在本公开的另一方面，提供选择受试者用于用如本公开的第一方面所定义的缀合物治疗的方法，所述方法包括筛选所述受试者以鉴定包含cd25+ve和cd25-ve细胞两者的赘生物的存在。选择其中存在此类赘生物的患者。

如上，cd25+ve细胞可在组织学上由赘生物构成，或可为浸润性细胞诸如til。

在本公开的另一方面，提供治疗受试者中的增生性疾病的方法，所述方法包括：

(i)鉴定受试者中包含cd25+ve和cd25-ve细胞两者的赘生物的存在；

(ii)向受试者施用如本公开的第一方面所定义的缀合物。

还提供用于本公开的任一种方法的本文所述的任何缀合物和此类缀合物用于制备本公开的任一种方法所用的药剂的此类缀合物的用途。

适用于本公开的实践的疾病、赘生物和抗体的非限制性实例在下文更详细地描述。

详述

在本公开中，pbd二聚体与抗体之间的特定连接优选地在胞外稳定。在转运或递送至细胞中之前，抗体-药物缀合物(adc)优选地是稳定的且保持完整，即抗体保持连接至药物部分。接头在靶细胞之外是稳定的，且可以某个有效速率在细胞内裂解。有效接头将：(i)维持抗体的特异性结合性质；(ii)允许胞内递送缀合物或药物部分；(iii)保持稳定和完整，即未裂解，直到缀合物已被递送或转运至其靶向位点；和(iv)维持pbd药物部分的细胞毒性、细胞杀伤作用或细胞抑制作用。adc的稳定性可通过标准分析技术(诸如质谱、hplc和分离/分析技术lc/ms)测量。

结合至cd25的抗体

cd25也被称为：il2ra、rp11-536k7.1、iddm10、il2r、tcgfr、fil-2受体亚基α；il-2-ra；il-2r亚基α；il2-ra；tac抗原；白细胞介素-2受体亚基α；p55

cd25多肽对应于genbank登录号np_000408，版本号np_000408.1gi:4557667，记录更新日期：2012年9月09日，04:59pm。在一个实施方案中，编码cd25多肽的核酸对应于genbank登录号nm_000417，版本号nm_000417.2gi:269973860，记录更新日期：2012年9月09日，04:59pm。在一些实施方案中，cd25多肽对应于uniprot/swiss-prot登录号p01589。

结合cd25的抗体描述于：

us6,383,487(novartis/ucl：巴利昔单抗(baxilisimab)[simulect])

us6,521,230(novartis/ucl：巴利昔单抗[simulect])

例如，具有抗原结合位点的抗体包含至少一个结构域，所述结构域包含具有seq.id.no:7中的氨基酸序列的cdr1，具有seq.id.no:8中的氨基酸序列的cdr2和具有seq.id.no:9中的氨基酸序列的cdr3；或收进序列中作为整体的所述cdr1、cdr2和cdr3包含与收进序列中作为整体的seq.id.no:7、8和9至少90％相同的氨基酸序列。

达利珠单抗-rechaj.,等annnyacadsci.2009年9月；1174:99-106(roche)

用于区别cd25+ve细胞与cd25-ve细胞的方法是本领域熟知的。示例性技术包括通过对患者免疫组织化学(strauchen等,am.jpathol.126:506-512,1987、facs(gaikwad等,int.j.clin.exppathol.7:6225-6230,2014)或成像(使用spect/pet，然后施用对cd25具有特异性的放射标记的探针)(vandort等,curr.comput.aideddrugdes.4:46-53,2008)。此类类似的方法可用于鉴定具有适用于通过本公开的方法靶向的赘生物的患者。

在一方面，抗体是结合至cd25的抗体，所述抗体包含：vh结构域，其包含具有seqidno.3的氨基酸序列的vhcdr1、具有seqidno.4的氨基酸序列的vhcdr2和具有seqidno.5的氨基酸序列的vhcdr3。在一些实施方案中，抗体包含具有根据seqidno.1的序列的vh结构域。

抗体还可包含：vl结构域，其包含具有seqidno.6的氨基酸序列的vlcdr1、具有seqidno.7的氨基酸序列的vlcdr2和具有seqidno.8的氨基酸序列的vlcdr3。在一些实施方案中，抗体还包含具有根据seqidno.2的序列的vl结构域。

在一些实施方案中，抗体包含vh结构域和vl结构域，所述vh和vl结构域具有与seqidno.2配对的seqidno.1的序列。

vh和vl结构域可配对以形成结合cd25的抗体抗原结合位点。

在一些实施方案中，抗体是包含vh结构域和vl结构域的完整抗体，所述vh和vl结构域具有seqidno.1和seqidno.2的序列。

在一些实施方案中，抗体是完全人单克隆igg1抗体，优选igg1,κ。

在一些实施方案中，抗体是wo2004/045512(genmaba/s)中所述的ab12抗体，另外被称为humax-tac。

在另一方面，抗体是如本文所述的如下所述修饰(或进一步修饰)的抗体。在一些实施方案中，抗体是如本文公开的抗体的人源化、去免疫化或表面重塑形式。

术语

本文的术语“抗体”以最广泛意义使用且特别涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)、完整抗体(也被称为“全长”抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性，所述所需生物活性是结合cd25的能力(miller等(2003)jour,ofimmunology170:4854-4861)。抗体可为鼠、人、人源化、嵌合或源自其它物种。抗体是由能够识别和结合至特异性抗原的免疫系统产生的蛋白质。(janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)immunobiology,第5版,garlandpublishing,newyork)。靶抗原通常具有数个结合位点，也被称为表位，由多个抗体上的cdr识别。特异性结合至不同表位的每个抗体具有不同的结构。因此，一个抗原可具有超过一个相应的抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合感兴趣的靶的抗原或其部分的抗原结合位点的分子，此类靶包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞。免疫球蛋白可为免疫球蛋白分子的任何类型(如igg、ige、igm、igd和iga)、类别(如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类，或同种异型(如人g1m1、g1m2、g1m3、非-g1m1[即除g1m1之外的任何同种异型]、g1m17、g2m23、g3m21、g3m28、g3m11、g3m5、g3m13、g3m14、g3m10、g3m15、g3m16、g3m6、g3m24、g3m26、g3m27、a2m1、a2m2、km1、km2和km3)。免疫球蛋白可源自任何物种，包括人、鼠或兔来源。

如本文所用，“结合cd25”用于意指抗体以比非特异性伴侣(诸如牛血清白蛋白(bsa，genbank登录号caa76847，版本号caa76847.1gi:3336842，记录更新日期：2011年1月7日，02:30pm))高的亲和力结合cd25。在一些实施方案中，当在生理条件下测量时，抗体以比抗体对bsa的缔合常数高至少2、3、4、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10⁴、10⁵或10⁶-倍的缔合常数(ka)结合cd25。本公开的抗体可以高亲和力结合cd25。例如，在一些实施方案中，抗体可以等于或小于约10^-6m，诸如1x10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12、10^-13或10^-14的kd结合cd25。

“抗体片段”包含一部分的全长抗体，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和scfv片段；双链抗体；直链抗体；由fab表达文库产生的片段、抗-独特性(抗-id)抗体、cdr(互补决定区)和免疫特异性结合至癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的任何以上抗体的表位-结合片段、单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即包含群体的各个抗体是相同的除了可以小量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，定向针对单一抗原位点。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每个单克隆抗体定向针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体有利之处在于它们可未被其它抗体污染地合成。修饰语“单克隆”指示抗体的特征为从基本上同质的抗体群体获得，并且不被理解为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，待根据本公开使用的单克隆抗体可通过首先由kohler等(1975)nature256:495描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组dna方法制备(参见us4816567)。单克隆抗体还可从噬菌体抗体文库使用clackson等(1991)nature,352:624-628；marks等(1991)j.mol.biol.,222:581-597中所述的技术分离，或者从携带完全人免疫球蛋白系统的转基因小鼠分离(lonberg(2008)curr.opinion20(4):450-459)。

本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的相应的序列相同或同源，而所述链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类抗体中的相应序列以及此类抗体的片段相同或同源，只要它们展现出所需的生物活性(us4816567；和morrison等(1984)proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855)。嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其包含源自非人灵长类动物(如旧大陆猴或猿)的可变结构域抗原-结合序列和人恒定区序列。

本文的“完整抗体”是包含vl和vh结构域以及轻链恒定结构域(cl)和重链恒定结构域ch1、ch2和ch3的抗体。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可具有一种或多种“效应子功能”，其是指归因于抗体的fc区域(天然序列fc区域或氨基酸序列变体fc区域)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括c1q结合；补体依赖性细胞毒性；fc受体结合；抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬；和下调细胞表面受体诸如b细胞受体和bcr。

根据它们重链的恒定结构域的氨基酸序列，可将完整抗体指定为不同“类别”。存在五种主要类别的完整抗体：iga、igd、ige、igg和igm，并且这些中若干种可被进一步分为“亚类”(同种型)，如igg1、igg2、igg3、igg4、iga和iga2。对应于不同类别的抗体的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。

抗体的修饰

可修饰本文公开的抗体，例如以使它们对人受试者更不具有免疫原性。这可使用本领域的技术人员熟悉的多种技术中任一种实现。这些技术中的一些在下文中更详述。

人源化

减少非人抗体或抗体片段的体内免疫原性的技术包括被称为“人源化”的那些。

“人源化抗体”是指包含人抗体的经修饰的可变区的至少一部分的多肽，其中可变区的一部分、优选基本上小于完整人可变结构域的一部分已经被来自非人物种的相应的序列取代且其中经修饰的可变区连接至至少另一部分的另一蛋白质、优选人抗体的恒定区。表达“人源化抗体”包括人抗体，其中一个或多个互补决定区(“cdr”)氨基酸残基和/或一个或多个框架区(“fw”或“fr”)氨基酸残基被来自啮齿类动物或其它非人抗体中的类似位点的氨基酸残基取代。表达"人源化抗体"还包括免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段，所述变体或其片段包含基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的fr和基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列的cdr。

非人(如鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。或者，以另一种方式看，人源化抗体是还含有来自非人(如鼠)抗体的所选序列来替换人序列的人抗体。人源化抗体可包含不显著改变其结合和/或生物活性的来自相同或不同物种的保守的氨基酸取代或非天然残基。此类抗体是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。

存在一系列人源化技术，包括‘cdr接枝’、‘导向选择’、‘去免疫化’、‘表面重塑’(也称为‘镶饰’)、‘复合抗体’、‘人字符串含量优化(humanstringcontentoptimisation)’和框架改组。

cdr接枝

在该技术中，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者抗体的互补决定区(cdr)的残基被来自具有所需性质的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、骆驼、牛科动物、山羊或兔)的cdr的残基替代(实际上，非人cdr被‘接枝’至人框架上)。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(fr)残基被相应的非人残基替代(这可当例如特定fr残基对抗原结合具有显著影响时发生)。

此外，人源化抗体可包含既不在接受者抗体中存在也不在导入的cdr或框架序列中存在的残基。进行这些修饰以进一步改善和最大化抗体性能。因此，通常，人源化抗体都将包含至少一个且在一方面两个可变结构域中的所有，其中所有或所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环并且所有或基本上所有fr区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，或人免疫球蛋白的至少一部分。

导向选择

该方法由合并对特定表位有特异性的给定的非人抗体的vh或vl结构域与人vh或vl文库组成，并且针对感兴趣的抗原选择特异性人v结构域。然后将该选择的人vh与vl文库合并以产生完全人vhxvl组合。该方法描述于naturebiotechnology(n.y.)12,(1994)899-903中。

复合抗体

在该方法中，将来自人抗体的氨基酸序列的两个或更多个区段合并在最终抗体分子内。它们通过将多个人vh和vl序列区段合并在组合中来构建，其限制或避免最终复合抗体v区中的人t细胞表位。当需要时，t细胞表位通过交换有助于t细胞表位或编码t细胞表位的v区区段与避免t细胞表位的可替代的区段来限制或避免。该方法描述于us2008/0206239a1中。

去免疫化

该方法涉及从治疗性抗体(或其它分子)的v区去除人(或其它第二物种)t-细胞表位。例如，通过与mhc-结合基序的数据库(诸如“基序”数据库，托管于www.wehi.edu.au)比较，来分析治疗性抗体v-区序列中mhcii类-结合基序的存在。可替换地，可以使用计算线程方法诸如由altuvia等(j.mol.biol.249244-250(1995))所设计的那些方法，来鉴定mhcii类-结合基序；在这些方法中，测试来自v-区序列的连续重叠肽的与mhcii类蛋白质的结合能。然后可将该数据与关于其它序列特征的信息结合，所述其它序列特征涉及成功呈现的肽，诸如两亲性、rothbard基序和用于组织蛋白酶b和其它加工酶的切割位点。

一旦已鉴定潜在的第二物种(如人)t细胞表位，通过改变一个或多个氨基酸来消除它们。修饰的氨基酸通常是在t细胞表位本身内，但就蛋白质的一级或二级结构而言也可以是相邻于表位(因此，在一级结构中，可能并不是相邻的)。最典型地，改变是通过取代的方式，但在一些情况下，氨基酸添加或缺失将是更合适的。

可以通过重组dna技术来完成所有改变，使得通过使用充分确立的方法(诸如定向诱变)从重组宿主表达，来制备最终分子。然而，使用蛋白质化学或分子改变的任何其它方式也是可能的。

表面重塑

该方法涉及：

(a)通过构建非人抗体可变区的三维模型，确定非人(如啮齿类动物)抗体(或其片段)的可变区的构象结构；

(b)使用来自足够数量的非人和人抗体可变区重链和轻链的x-射线结晶学结构的相对可达性分布，产生序列比对，以产生一组重链和轻链框架位置，其中在98％的足够数量的非人抗体重链和轻链中比对位置是相同的；

(c)使用在步骤(b)中产生的一组框架位置，将非人抗体定义为人源化的、一组重链和轻链表面暴露的氨基酸残基；

(d)根据人抗体氨基酸序列鉴定一组重链和轻链表面暴露的氨基酸残基，其与在步骤(c)中定义的表面暴露的氨基酸残基的组最密切相同，其中来自人抗体的重链和轻链是或不是天然配对的；

(e)在待人源化的非人抗体的氨基酸序列中，用在步骤(d)中鉴定的重链和轻链表面暴露的氨基酸残基组取代在步骤(c)中定义的重链和轻链表面暴露的氨基酸残基组；

(f)构建产生自在步骤(e)中指定的取代的非人抗体的可变区的三维模型；

(g)通过比较在步骤(a)和(f)中构建的三维模型，根据在步骤(c)或(d)中鉴定的组，鉴定在待人源化的非人抗体的互补决定区的任何残基的任何原子的5埃内的任何氨基酸残基；以及

(h)将在步骤(g)中鉴定的任何残基从人改变到原来非人氨基酸残基，从而定义表面暴露的氨基酸残基的非人抗体人源化组；前提条件是，无需首先进行步骤(a)，但必须在步骤(g)以前进行。

超人源化

该方法比较非人序列与功能性人种系基因库。选择了编码与非人序列相同或密切相关的规范结构(canonicalstructure)的那些人基因。在cdr内具有最高同源性的那些选择的人基因被选作fr供体。最后，将非人cdr接枝到这些人fr上。这种方法描述于专利wo2005/079479a2。

人字符串含量优化

这种方法比较了非人(如小鼠)序列与人种系基因库并且差异被评定为人字符串含量(hsc)，其在潜在的mhc/t-细胞表位的水平上量化序列。然后通过最大化它的hsc而不是使用全局同一性措施来人源化靶序列以产生多种不同的人源化变体(描述于molecularimmunology,44,(2007)1986-1998)。

框架改组

将非人抗体的cdr框内稠合于涵盖所有已知的重链和轻链人种系基因框构的cdna汇集物。然后通过如淘选噬菌体展示抗体库来选择人源化抗体。这描述于methods36,43-60(2005)中。

定义

药学上可接受的阳离子

药学上可接受的单价和二价阳离子的实例讨论于berge,等,j.pharm.sci.,66,1-19(1977)中，其通过引用并入本文。

药学上可接受的阳离子可为无机的或有机的。

药学上可接受的单价无机阳离子的实例包括但不限于碱金属离子，诸如na⁺和k⁺。药学上可接受的二价无机阳离子的实例包括但不限于碱土阳离子，诸如ca²⁺和mg²⁺。药学上可接受的有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即nh4⁺)和取代的铵离子(如nh3r⁺、nh2r2⁺、nhr3⁺、nr4⁺)。一些适合取代的铵离子的实例是源自以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，诸如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的实例是n(ch3)4⁺。

取代基

如本文所用的短语“任选取代的”涉及母体基团，其可以是未取代的或其可以是取代的。

除非另外说明，否则如本文所用的术语“取代的”涉及母体基团，其携带一个或多个取代基。术语“取代基”在本文中在常规意义上使用并且是指化学部分，其共价连接于或者(如果适当)稠合于母体基团。各种各样的取代基是熟知的，以及它们的形成和引入各种母体基团的方法也是熟知的。

取代基的实例更详细地描述于下文中。

c1-12烷基：如本文所用的术语“c1-12烷基”涉及通过从具有1至12个碳原子的烃化合物的碳原子去除氢原子所获得的单价部分，其可以是脂肪族或脂环族的并且其可以是饱和或不饱和的(如部分不饱和的，完全不饱和的)。如本文所用的术语“c1-4烷基”涉及通过从具有1至4个碳原子的烃化合物的碳原子去除氢原子所获得的单价部分，其可以是脂肪族或脂环族的并且其可以是饱和或不饱和的(如部分不饱和，完全不饱和的)。因此，术语“烷基”包括下文所讨论的亚类烯基、炔基、环烷基等。

饱和烷基基团的实例包括但不限于甲基(c1)、乙基(c2)、丙基(c3)、丁基(c4)、戊基(c5)、己基(c6)和庚基(c7)。

饱和直链烷基基团的实例包括但不限于甲基(c1)、乙基(c2)、正丙基(c3)、正丁基(c4)、正戊基(戊基)(c5)、正己基(c6)和正庚基(c7)。

饱和支链烷基基团的实例包括异丙基(c3)、异丁基(c4)、仲丁基(c4)、叔丁基(c4)、异戊基(c5)和新戊基(c5)。

c2-12烯基：如本文所用的术语“c2-12烯基”涉及具有一个或多个碳-碳双键的烷基基团。

不饱和的烯基基团的实例包括但不限于乙烯基(乙烯基)(乙烯基(vinyl)，-ch＝ch2)、1-丙烯基(-ch＝ch-ch3)、2-丙烯基(烯丙基，-ch-ch＝ch2)、异丙烯基(1-甲基乙烯基，-c(ch3)＝ch2)、丁烯基(c4)、戊烯基(c5)和己烯基(c6)。

c2-12炔基：如本文所用的术语“c2-12炔基”涉及具有一个或多个碳-碳三键的烷基基团。

不饱和的炔基基团的实例包括但不限于乙炔基(-c≡ch)和2-丙炔基(炔丙基，-ch2-c≡ch)。

c3-12环烷基：如本文所用的术语“c3-12环烷基”涉及也是环基基团的烷基基团；即，通过从环烃(碳环)化合物的脂环族环原子去除氢原子所获得的单价部分，该部分具有3至7个碳原子，包括3至7个环原子。

环烷基基团的实例包括但不限于来源于以下的那些：

饱和的单环烃化合物：

环丙烷(c3)、环丁烷(c4)、环戊烷(c5)、环己烷(c6)、环庚烷(c7)、甲基环丙烷(c4)、二甲基环丙烷(c5)、甲基环丁烷(c5)、二甲基环丁烷(c6)、甲基环戊烷(c6)、二甲基环戊烷(c7)和甲基环己烷(c7)；

不饱和的单环烃化合物：

环丙烯(c3)、环丁烯(c4)、环戊烯(c5)、环己烯(c6)、甲基环丙烯(c4)、二甲基环丙烯(c5)、甲基环丁烯(c5)、二甲基环丁烯(c6)、甲基环戊烯(c6)、二甲基环戊烯(c7)和甲基环己烯(c7)；和

饱和多环烃化合物：

降蒈烷(c7)、降蒎烷(c7)、降冰片烷(c7)。

c3-20杂环基：如本文所用的术语“c3-20杂环基”涉及通过从杂环化合物的环原子去除氢原子所获得的单价部分，所述部分具有3至20个环原子，其中1至10个是环杂原子。优选地，每个环具有3至7个环原子，其中1至4个是环杂原子。

在这种情况下，前缀(如c3-20、c3-7、c5-6等)表示环原子的数目或环原子的数目范围，无论是碳原子还是杂原子。例如，如本文所用的术语“c5-6杂环基”涉及具有5或6个环原子的杂环基基团。

单环杂环基基团的实例包括但不限于源自以下的那些：

n1：氮杂环丙烷(c3)、氮杂环丁烷(c4)、吡咯烷(四氢吡咯)(c5)、吡咯啉(如3-吡咯啉、2,5-二氢吡咯)(c5)、2h-吡咯或3h-吡咯(异吡咯、异唑)(c5)、哌啶(c6)、二氢吡啶(c6)、四氢吡啶(c6)、氮杂(c7)；

o1：环氧乙烷(c3)、氧杂环丁烷(c4)、氧杂环戊烷(四氢呋喃)(c5)、氧杂环戊二烯(二氢呋喃)(c5)、噁烷(四氢吡喃)(c6)、二氢吡喃(c6)、吡喃(c6)、氧杂(c7)；

s1：硫杂环丙烷(c3)、硫杂环丁烷(c4)、硫杂环戊烷(四氢噻吩)(c5)、硫杂环己烷(四氢硫代吡喃)(c6)、硫杂环庚烷(c7)；

o2：二氧杂环戊烷(c5)、二噁烷(c6)和二氧杂环庚烷(c7)；

o3：三噁烷(c6)；

n2：咪唑烷(c5)、吡唑烷(二唑烷)(c5)、咪唑啉(c5)、吡唑啉(二氢吡唑)(c5)、哌嗪(c6)；

n1o1：四氢噁唑(c5)、二氢噁唑(c5)、四氢异噁唑(c5)、二氢异噁唑(c5)、吗啉(c6)、四氢噁嗪(c6)、二氢噁嗪(c6)、噁嗪(c6)；

n1s1：噻唑啉(c5)、噻唑烷(c5)、硫代吗啉(c6)；

n2o1：噁二嗪(c6)；

o1s1：氧硫杂环戊二烯(c5)和氧硫杂环己烷(噻噁烷)(c6)；和，

n1o1s1：噁噻嗪(c6)。

取代的单环杂环基基团的实例包括源自以下的呈环状形式的那些：例如，呋喃糖(c5)，诸如阿拉伯呋喃糖、来苏呋喃糖、呋喃核糖和呋喃木糖，以及吡喃糖(c6)，诸如别吡喃糖(allopyranose)、吡喃阿草糖(altropyranose)、吡喃葡萄糖、吡喃甘露糖、吡喃古洛糖(gulopyranose)、吡喃艾杜糖(idopyranose)、吡喃半乳糖和吡喃塔罗糖(talopyranose)。

c5-20芳基：如本文所使用的术语“c5-20芳基”涉及通过从芳香族化合物的芳香族环原子去除氢原子所获得的单价部分，该部分具有3至20个环原子。如本文所用的术语“c5-7芳基”涉及通过从芳香族化合物的芳香族环原子去除氢原子所获得的单价部分，该部分具有5至7个环原子，并且如本文所用的术语“c5-10芳基”涉及通过从芳香族化合物的芳香族环原子去除氢原子所获得的单价部分，该部分具有5至10个环原子。

优选地，每个环具有5至7个环原子。

在这种情况下，前缀(如c3-20、c5-7、c5-6、c5-10等)表示环原子数或环原子数的范围，无论是碳原子还是杂原子。例如，如本文所用的术语“c5-6芳基”涉及具有5或6个环原子的芳基基团。

环原子可为如在“碳芳基基团”中的所有碳原子。

碳芳基基团的实例包括但不限于源自以下的那些：苯(即苯基)(c6)、萘(c10)、甘菊环(c10)、蒽(c14)、菲(c14)、并四苯(c18)和芘(c16)。

包含稠环(其中至少一个稠环是芳香族环)的芳基基团的实例包括但不限于源自以下的基团：二氢化茚(如2,3-二氢-1h-茚)(c9)、茚(c9)、异茚(c9)、四氢萘(1,2,3,4-四氢萘(c10)、苊(c12)、芴(c13)、非那烯(c13)、醋菲(c15)和醋蒽(c16)。

可替代地，环原子可包括如在“杂芳基基团”中的一个或多个杂原子。单环杂芳基基团的实例包括但不限于源自以下的那些：

n1：吡咯(唑)(c5)、吡啶(嗪)(c6)；

o1：呋喃(氧杂环戊二烯)(c5)；

s1：噻吩(硫杂环戊二烯)(c5)；

n1o1：噁唑(c5)、异噁唑(c5)、异噁嗪(c6)；

n2o1：噁二唑(呋咱)(c5)；

n3o1：噁三唑(c5)；

n1s1：噻唑(c5)、异噻唑(c5)；

n2：咪唑(1,3-二唑)(c5)、吡唑(1,2-二唑)(c5)、哒嗪(1,2-二嗪)(c6)、嘧啶(1,3-二嗪)(c6)(如胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4-二嗪)(c6)；

n3：三唑(c5)、三嗪(c6)；和，

n4：四唑(c5)。

包含稠环的杂芳基的实例包括但不限于：

c9(具有2个稠环)源自苯并呋喃(o1)、异苯并呋喃(o1)、吲哚(n1)、异吲哚(n1)、吲嗪(n1)、二氢吲哚(n1)、二氢异吲哚(n1)、嘌呤(n4)(如腺嘌呤、鸟嘌呤)、苯并咪唑(n2)、吲唑(n2)、苯并噁唑(n1o1)、苯并异噁唑(n1o1)、苯并二氧杂环戊二烯(o2)、苯并呋咱(n2o1)、苯并三唑(n3)、苯并噻吩(s1)、苯并噻唑(n1s1)、苯并噻二唑(n2s)；

c10(具有2个稠环)源自色烯(o1)、异色烯(o1)、色满(o1)、异色满(o1)、苯并二噁烷(o2)、喹啉(n1)、异喹啉(n1)、喹嗪(n1)、苯并噁嗪(n1o1)、苯并二嗪(n2)、吡啶并吡啶(n2)、喹喔啉(n2)、喹唑啉(n2)、噌啉(n2)、酞嗪(n2)、萘啶(n2)、蝶啶(n4)；

c11(具有2个稠环)源自苯并二氮杂(n2)；

c13(具有3个稠环)源自咔唑(n1)、二苯并呋喃(o1)、二苯并噻吩(s1)、咔啉(n2)、呸啶(n2)、吡啶并吲哚(n2)；和

c14(具有3个稠环)源自吖啶(n1)、呫吨(o1)、噻吨(s1)、噁蒽烯(o2)、吩氧硫杂环己二烯(o1s1)、吩嗪(n2)、吩噁嗪(n1o1)、吩噻嗪(n1s1)、噻蒽烯(s2)、菲啶(n1)、邻二氮杂菲(n2)、吩嗪(n2)。

上述基团，无论是单独地还是另一取代基的一部分，可以本身任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自本身和以下列出的另外的取代基。

卤基：-f、-cl、-br和-i。

羟基：-oh。

醚：-or，其中r是醚取代基，例如c1-7烷基基团(也被称为下文讨论的c1-7烷氧基基团)、c3-20杂环基基团(也被称为c3-20杂环基氧基基团)或c5-20芳基基团(也被称为c5-20芳氧基基团)，优选c1-7烷基基团。

烷氧基：-or，其中r是烷基基团，例如c1-7烷基基团。c1-7烷氧基基团的实例包括但不限于-ome(甲氧基)、-oet(乙氧基)、-o(npr)(正丙氧基)、-o(ipr)(异丙氧基)、-o(nbu)(正丁氧基)、-o(sbu)(仲丁氧基)、-o(ibu)(异丁氧基)和-o(tbu)(叔丁氧基)。

缩醛：-ch(or¹)(or²)，其中r¹和r²独立地为缩醛取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团，或者在“环状”缩醛基团的情况下，r¹和r²连同它们所连接的两个氧原子和它们所连接的碳原子一起形成具有4至8个环原子的杂环环。缩醛基团的实例包括但不限于-ch(ome)2、-ch(oet)2和-ch(ome)(oet)。

半缩醛：-ch(oh)(or¹)，其中r¹是半缩醛取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团。半缩醛基团的实例包括但不限于-ch(oh)(ome)和-ch(oh)(oet)。

缩酮：-cr(or¹)(or²)，其中r¹和r²如针对缩醛所定义，且r是除氢以外的缩酮取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团。示例性缩酮基团包括但不限于-c(me)(ome)2、-c(me)(oet)2、-c(me)(ome)(oet)、-c(et)(ome)2、-c(et)(oet)2和-c(et)(ome)(oet)。

半缩酮：-cr(oh)(or¹)，其中r¹如针对半缩醛所定义，且r是除氢以外的半缩酮取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团。半缩醛基团的实例包括但不限于-c(me)(oh)(ome)、-c(et)(oh)(ome)、-c(me)(oh)(oet)和-c(et)(oh)(oet)。

氧基(酮基，-酮)：＝o。

硫酮(thione)(硫酮(thioketone))：＝s。

亚氨基(亚胺)：＝nr，其中r是亚氨基取代基，例如氢、c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选氢或c1-7烷基基团。酯基团的实例包括但不限于＝nh、＝nme、＝net和＝nph。

甲酰基(甲醛(carbaldehyde)、甲醛(carboxaldehyde))：-c(＝o)h。

酰基(酮基)：-c(＝o)r，其中r是酰基取代基，例如c1-7烷基基团(也被称为c1-7烷基酰基或c1-7烷酰基)、c3-20杂环基基团(也被称为c3-20杂环基酰基)或c5-20芳基基团(也被称为c5-20芳基酰基)，优选c1-7烷基基团。酰基基团的实例包括但不限于-c(＝o)ch3(乙酰基)、-c(＝o)ch2ch3(丙酰基)、-c(＝o)c(ch3)3(叔丁酰基)和-c(＝o)ph(苯甲酰基，苯酮)。

羧基(羧酸)：-c(＝o)oh。

硫代羧基(硫代羧酸)：-c(＝s)sh。

硫羟羧基(硫羟羧酸)：-c(＝o)sh。

硫酮代羧基(硫酮代羧酸)：-c(＝s)oh。

亚胺酸：-c(＝nh)oh。

异羟肟酸：-c(＝noh)oh。

酯(羧酸酯(carboxylate)、羧酸酯(carboxylicacidester)、氧基羰基)：-c(＝o)or,其中r是酯取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团。酯基团的实例包括但不限于-c(＝o)och3、-c(＝o)och2ch3、-c(＝o)oc(ch3)3和-c(＝o)oph。

酰氧基(反向酯)：-oc(＝o)r，其中r是酰氧基取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团。

酰氧基的实例包括但不限于-oc(＝o)ch3(乙酰氧基)、-oc(＝o)ch2ch3、-oc(＝o)c(ch3)3、-oc(＝o)ph和-oc(＝o)ch2ph。

氧基羰氧基(oxycarboyloxy)：-oc(＝o)or，其中r是酯取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团。酯基团的实例包括但不限于-oc(＝o)och3、-oc(＝o)och2ch3、-oc(＝o)oc(ch3)3和-oc(＝o)oph。

氨基：-nr¹r²，其中r¹和r²独立地是氨基取代基，例如氢、c1-7烷基基团(也被称为c1-7烷基氨基或二-c1-7烷基氨基)、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选h或c1-7烷基基团，或者，在“环状”氨基基团的情况下，r¹和r²连同它们所连接的氮原子一起形成具有4至8个环原子的杂环环。氨基基团可以是伯(-nh2)、仲(-nhr¹)或叔(-nhr¹r²)，以及在阳离子形式中，可以是季(-⁺nr¹r²r³)。氨基基团的实例包括但不限于-nh2、-nhch3、-nhc(ch3)2、-n(ch3)2、-n(ch2ch3)2和-nhph。环状氨基基团的实例包括但不限于氮丙啶基(aziridino)、氮杂环丁烷基(azetidino)、吡咯烷子基(pyrrolidino)、哌啶子基(piperidino)、哌嗪子基(piperazino)、吗啉代和硫代吗啉代。

酰氨基(氨基甲酰基、氨基甲酰、氨基羰基、甲酰胺)：-c(＝o)nr¹r²，其中r¹和r²独立地是氨基取代基，如针对氨基基团所定义的。酰氨基基团的实例包括但不限于-c(＝o)nh2、-c(＝o)nhch3、-c(＝o)n(ch3)2、-c(＝o)nhch2ch3和-c(＝o)n(ch2ch3)2以及酰氨基基团，其中r¹和r²连同它们所连接的氮原子一起形成杂环结构，如在例如哌啶子基羰基(piperidinocarbonyl)、吗啉代羰基、硫代吗啉代羰基和哌嗪子基羰基中。

硫代酰氨基(硫代氨基甲酰基)：-c(＝s)nr¹r²，其中r¹和r²独立地是氨基取代基，如针对氨基基团所定义的。酰氨基基团的实例包括但不限于-c(＝s)nh2、-c(＝s)nhch3、-c(＝s)n(ch3)2和-c(＝s)nhch2ch3。

酰氨基(acylamido)(酰基氨基(acylamino))：-nr¹c(＝o)r²，其中r¹是酰胺取代基，例如氢、c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选氢或c1-7烷基基团，且r²是酰基取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选氢或c1-7烷基基团。酰基酰胺基基团的实例包括但不限于-nhc(＝o)ch3、-nhc(＝o)ch2ch3和-nhc(＝o)ph。r¹和r²可以一起形成环状结构如在例如，琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基和邻苯二甲酰亚胺基中：

氨基羰氧基：-oc(＝o)nr¹r²，其中r¹和r²独立地是氨基取代基，如针对氨基基团所定义。氨基羰氧基基团的实例包括但不限于-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nhme、-oc(＝o)nme2和-oc(＝o)net2。

脲基：-n(r¹)conr²r³，其中r²和r³独立地是氨基取代基，如针对氨基基团所定义的，且r¹是脲基取代基，例如氢、c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选氢或c1-7烷基基团。脲基基团的实例包括但不限于-nhconh2、-nhconhme、-nhconhet、-nhconme2、-nhconet2、-nmeconh2、-nmeconhme、-nmeconhet、-nmeconme2和-nmeconet2。

胍基：-nh-c(＝nh)nh2。

四唑基：具有四个氮原子和一个碳原子的五元芳香族环，

亚氨基：＝nr，其中r是亚氨基取代基，例如，如氢、c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选h或c1-7烷基基团。亚氨基基团的实例包括但不限于＝nh、＝nme和＝net。

脒(脒基)：-c(＝nr)nr2，其中每个r是脒取代基，例如氢、c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选h或c1-7烷基基团。脒基团的实例包括但不限于-c(＝nh)nh2、-c(＝nh)nme2和-c(＝nme)nme2。

硝基：-no2。

亚硝基：-no。

叠氮基：-n3。

氰基(腈，甲腈)：-cn。

异氰基：-nc。

氰氧基：-ocn。

异氰氧基：-nco。

硫代氰基(硫代氰氧基)：-scn。

异硫代氰基(异硫代氰氧基)：-ncs。

巯基(sulfhydryl)(硫醇、巯基(mercapto))：-sh。

硫醚(硫化物)：-sr，其中r是硫醚取代基，例如c1-7烷基基团(也被称为c1-7烷基硫基基团)、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团。c1-7烷基硫基基团的实例包括但不限于-sch3和-sch2ch3。

二硫化物：-ss-r，其中r是二硫化物取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团(在本文中被称为c1-7烷基二硫化物)。c1-7烷基二硫化物基团的实例包括但不限于-ssch3和-ssch2ch3。

亚磺酰(sulfine)(亚磺酰基(sulfinyl)、亚砜)：-s(＝o)r，其中r是亚磺酰取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团。亚磺酰基团的实例包括但不限于-s(＝o)ch3和-s(＝o)ch2ch3。

砜(sulfone)(磺酰基)：-s(＝o)2r，其中r为砜取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团，包括例如氟化或全氟化的c1-7烷基基团。砜基团的实例包括但不限于-s(＝o)2ch3(甲磺酰基，甲磺酰基)、-s(＝o)2cf3(三氟甲磺酰基)、-s(＝o)2ch2ch3(乙磺酰基)、-s(＝o)2c4f9(九氟甲磺酰基(nonaflyl))、-s(＝o)2ch2cf3(三氟乙基磺酰基)、-s(＝o)2ch2ch2nh2(牛磺酰基)、-s(＝o)2ph(苯磺酰基(phenylsulfonyl)，苯磺酰基(besyl))、4-甲基苯基磺酰基(甲苯磺酰基)、4-氯苯基磺酰基(氯苯磺酰基(closyl))、4-溴苯基磺酰基(对溴苯磺酰基)、4-硝基苯基(硝基苯磺酰基(nosyl))、2-萘磺酸酯(萘磺酰基(napsyl))和5-二甲基氨基-萘-1-基磺酸酯(丹磺酰基(dansyl))。

亚磺酸(亚磺基)：-s(＝o)oh、-so2h。

磺酸(磺基)：-s(＝o)2oh、-so3h。

亚磺酸酯(sulfinate)(亚磺酸酯(sulfinicacidester))：-s(＝o)or；其中r是亚磺酸酯取代基，例如，c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团。亚磺酸酯基团的实例包括但不限于-s(＝o)och3(甲氧基亚硫酰基；亚磺酸甲酯)和-s(＝o)och2ch3(乙氧基亚硫酰基；亚磺酸乙酯)。

磺酸酯(sulfonate)(磺酸酯(sulfonicacidester))：-s(＝o)2or，其中r是磺酸酯取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团。磺酸酯基团的实例包括但不限于-s(＝o)2och3(甲氧基磺酰基；磺酸甲酯)和-s(＝o)2och2ch3(乙氧基磺酰基；磺酸乙酯)。

亚磺酰基氧基：-os(＝o)r，其中r为亚磺酰基氧基取代基，例如，c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团。亚磺酰基氧基基团的实例包括但不限于-os(＝o)ch3和-os(＝o)ch2ch3。

磺酰基氧基：-os(＝o)2r，其中r是磺酰基氧基取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选地c1-7烷基基团。磺酰基氧基基团的实例包括但不限于-os(＝o)2ch3(甲磺酸酯)和-os(＝o)2ch2ch3(乙磺酸酯)。

硫酸酯：-os(＝o)2or；其中r是硫酸酯取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团。硫酸酯基团的实例包括但不限于-os(＝o)2och3和-so(＝o)2och2ch3。

氨磺酰基(sulfamyl)(氨磺酰基(sulfamoyl)；亚磺酸酰胺；亚磺酰胺)：-s(＝o)nr¹r²，其中r¹和r²独立地为如对氨基基团所定义的氨基取代基。氨磺酰基的实例包括但不限于-s(＝o)nh2、-s(＝o)nh(ch3)、-s(＝o)n(ch3)2、-s(＝o)nh(ch2ch3)、-s(＝o)n(ch2ch3)2和-s(＝o)nhph。

磺酰胺基(胺亚磺酰基(sulfinamoyl)；磺酸酰胺；磺酰胺)：-s(＝o)2nr¹r²，其中r¹和r²独立地为如对氨基基团所定义的氨基取代基。磺酰胺基基团的实例包括但不限于-s(＝o)2nh2、-s(＝o)2nh(ch3)、-s(＝o)2n(ch3)2、-s(＝o)2nh(ch2ch3)、-s(＝o)2n(ch2ch3)2和-s(＝o)2nhph。

磺氨基(sulfamino)：-nr¹s(＝o)2oh，其中r¹为如对氨基基团所定义的氨基取代基。磺氨基基团的实例包括但不限于-nhs(＝o)2oh和-n(ch3)s(＝o)2oh。

磺酰氨基(sulfonamino)：-nr¹s(＝o)2r，其中r¹是如对氨基基团所定义的氨基取代基，并且r为磺酰氨基取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团。磺酰氨基基团的实例包括但不限于-nhs(＝o)2ch3和-n(ch3)s(＝o)2c6h5。

亚磺酰氨基(sulfinamino)：-nr¹s(＝o)r，其中r¹是如对氨基基团所定义的氨基取代基，并且r是亚磺酰氨基取代基，例如c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团。亚磺酰氨基基团的实例包括但不限于-nhs(＝o)ch3和-n(ch3)s(＝o)c6h5。

膦基(膦)：-pr2，其中r为膦基取代基，例如-h、c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选-h、c1-7烷基基团或c5-20芳基基团。膦基基团的实例包括但不限于-ph2、-p(ch3)2、-p(ch2ch3)2、-p(t-bu)2和-p(ph)2。

磷基：-p(＝o)2。

氧膦基(氧化膦)：-p(＝o)r2，其中r为氧膦基取代基，例如，c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选c1-7烷基基团或c5-20芳基基团。氧膦基基团的实例包括但不限于-p(＝o)(ch3)2、-p(＝o)(ch2ch3)2、-p(＝o)(t-bu)2和-p(＝o)(ph)2。

膦酸(膦酰基)：-p(＝o)(oh)2。

膦酸酯(膦酰酯)：-p(＝o)(or)2，其中r为膦酸酯取代基，例如-h、c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选-h、c1-7烷基基团或c5-20芳基基团。膦酸酯基团的实例包括但不限于-p(＝o)(och3)2、-p(＝o)(och2ch3)2、-p(＝o)(o-t-bu)2和-p(＝o)(oph)2。

磷酸(膦酰氧基)：-op(＝o)(oh)2。

磷酸酯(膦酰氧基酯)：-op(＝o)(or)2，其中r是磷酸酯取代基，例如，-h、c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选-h、c1-7烷基基团或c5-20芳基基团。磷酸酯基团的实例包括但不限于-op(＝o)(och3)2、-op(＝o)(och2ch3)2、-op(＝o)(o-t-bu)2和-op(＝o)(oph)2。

亚磷酸：-op(oh)2。

亚磷酸酯：-op(or)2，其中r是亚磷酸酯取代基，例如-h、c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选-h、c1-7烷基基团或c5-20芳基基团。亚磷酸酯基团的实例包括但不限于-op(och3)2、-op(och2ch3)2、-op(o-t-bu)2和-op(oph)2。

亚磷酰胺：-op(or¹)-nr²2，其中r¹和r²为亚磷酰胺取代基，例如-h、(任选取代的)c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选-h、c1-7烷基基团或c5-20芳基基团。亚磷酰胺基团的实例包括但不限于-op(och2ch3)-n(ch3)2、-op(och2ch3)-n(i-pr)2和-op(och2ch2cn)-n(i-pr)2。

氨基磷酸酯：-op(＝o)(or¹)-nr²2，其中r¹和r²是氨基磷酸酯取代基，例如-h、(任选取代的)c1-7烷基基团、c3-20杂环基基团或c5-20芳基基团，优选-h、c1-7烷基基团或c5-20芳基基团。氨基磷酸酯基团的实例包括但不限于-op(＝o)(och2ch3)-n(ch3)2、-op(＝o)(och2ch3)-n(i-pr)2和-op(＝o)(och2ch2cn)-n(i-pr)2。

亚烷基

c3-12亚烷基：如本文所用的术语“c3-12亚烷基”涉及通过从具有3至12个碳原子(除非另外指明)的烃化合物上除去两个氢原子(两个氢原子均来自相同碳原子或一个氢原子来自两个不同碳原子的每一个)而获得的二齿部分，所述烃化合物为脂肪族或脂环族的，并且其可为饱和、部分不饱和或完全不饱和。因此，术语“亚烷基”包括下文讨论的亚类亚烯基、亚炔基、亚环烷基等。

直链饱和c3-12亚烷基基团的实例包括但不限于-(ch2)n-，其中n是3至12的整数，例如，-ch2ch2ch2-(亚丙基)、-ch2ch2ch2ch2-(亚丁基)、-ch2ch2ch2ch2ch2-(亚戊基)和-ch2ch2ch2ch-2ch2ch2ch2-(亚庚基)。

支链饱和c3-12亚烷基基团的实例包括但不限于-ch(ch3)ch2-、-ch(ch3)ch2ch2-、-ch(ch3)ch2ch2ch2-、-ch2ch(ch3)ch2-、-ch2ch(ch3)ch2ch2-、-ch(ch2ch3)-、-ch(ch2ch3)ch2-和-ch2ch(ch2ch3)ch2-。

直链部分不饱和c3-12亚烷基基团(c3-12亚烯基和亚炔基基团)的实例包括但不限于-ch＝ch-ch2-、-ch2-ch＝ch2-、-ch＝ch-ch2-ch2-、-ch＝ch-ch2-ch2-ch2-、-ch＝ch-ch＝ch-、-ch＝ch-ch＝ch-ch2-、-ch＝ch-ch＝ch-ch2-ch2-、-ch＝ch-ch2-ch＝ch-、-ch＝ch-ch2-ch2-ch＝ch-和-ch2-c≡c-ch2-。

支链部分不饱和c3-12亚烷基基团(c3-12亚烯基和亚炔基基团)的实例包括但不限于-c(ch3)＝ch-、-c(ch3)＝ch-ch2-、-ch＝ch-ch(ch3)-和-c≡c-ch(ch3)-。

脂环族饱和c3-12亚烷基基团(c3-12亚环烷基)的实例包括但不限于亚环戊基(如环戊-1,3-亚基)和亚环己基(如环己-1,4-亚基)。

脂环族部分不饱和c3-12亚烷基基团(c3-12亚环烷基)的实例包括但不限于亚环戊烯基(如4-环戊烯-1,3-亚基)、亚环己烯基(如2-环己烯-1,4-亚基；3-环己烯-1,2-亚基；2,5-环己二烯-1,4-亚基)。

氨基甲酸酯氮保护基：术语“氨基甲酸酯氮保护基”涉及掩盖亚胺键中的氮的部分，并且这些是本领域熟知的。这些基团具有以下结构：

其中r^’10是如上所定义的r。大量的适合的基团描述于greene,t.w.和wuts,g.m.,protectivegroupsinorganicsynthesis,第3版,johnwiley&sons,inc.,1999的第503页至第549页(其通过参考并入本文)。

缩醛胺氮保护基：术语“缩醛胺氮保护基”涉及具有以下结构的基团：

其中r^’10是如上所定义的r。大量的适合的基团于greene,t.w.和wuts,g.m.,protectivegroupsinorganicsynthesis,第3版,johnwiley&sons,inc.,1999的第633页至第647页描述为酰胺保护基(其通过参考并入本文)。

基团氨基甲酸酯氮保护基和缩醛胺氮保护基可共同被称为“用于合成的氮保护基”。

缀合物

本公开涉及包含经由接头单元连接至抗体的pbd化合物的缀合物。

在本公开的优选的第一方面，接头是如本文所述的可裂解的接头。例如，可裂解的接头可为胞外稳定的，但以某个有效速率在细胞内裂解。

在本公开的另一方面，接头是不可裂解的接头。不可裂解的接头通常在胞外是稳定的，并且在胞内是稳定的。示例性不可裂解的接头包括本公开的另一方面所述的那些，诸如具有接头l1、l2或l3的那些。不可裂解的的接头通常对由酶作用导致的裂解耐受，并且还可对的ph(如酸或碱不稳定)、温度、辐射(如光不稳定)或者还原或氧化条件的变化耐受。

在一个实施方案中，缀合物包含连接至间隔连接基团的抗体，连接至触发剂的间隔子、连接至自分解性接头的触发剂及连接至pbd化合物的n10位置的自分解性接头。此类缀合物在下文说明:

其中ab是如上所定义的抗体且pbd是如上所述的吡咯并苯并二氮杂化合物(d)。该说明显示在本公开的某些实施方案中对应于r^l’、a、l¹和l²的部分。r^l’可为r^l1’或r^l2'。d是去除r^l1’或r^l2’的d^l。

在优选的实施方案中，缀合物允许释放不保留接头的任何部分的活性pbd化合物。不存在可影响pbd化合物的反应性的短突。

接头通过共价键连接抗体至pbd药物部分d。接头是可用于连接一个或多个药物部分(d)和抗体单元(ab)以形成抗体-药物缀合物(adc)的双官能或多官能部分。接头(r^l’)在细胞外即胞外可能是稳定的，或其可通过酶促活性、水解或其它代谢条件可裂解。抗体-药物缀合物(adc)可使用具有反应官能团的接头用于结合至药物部分和抗体来方便地制备。抗体(ab)的半胱氨酸硫醇或胺，如n-端或氨基酸侧链诸如赖氨酸，可与接头或间隔子试剂、pbd药物部分(d)或药物-接头试剂(d^l、d-r^l)的官能团形成键，其中r^l可为r^l1或r^l2。

adc的接头优选地防止adc分子的聚集并使adc保持易溶于水性介质中并呈单体状态。

优选地，adc的接头在胞外是稳定的。在转运或递送至细胞中之前，抗体-药物缀合物(adc)优选地是稳定的，并且保持完整，即抗体保持连接至药物部分。接头在靶细胞外是稳定的，且可以某个有效速率在细胞内裂解。有效接头将：(i)维持抗体的特异性结合性质；(ii)允许胞内递送缀合物或药物部分；(iii)保持稳定和完整，即不裂解，直到缀合物已被递送或转运至其靶向位点；和(iv)维持pbd药物部分的细胞毒性、细胞杀伤作用或细胞抑制作用。adc的稳定性可通过标准分析技术(诸如质谱、hplc和分离/分析技术lc/ms)测量。

抗体和药物部分的共价连接需要接头具有两个反应性官能团，即在反应性意义上是二价。可用于连接两个或更多个官能部分或生物活性部分(诸如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原和报道基团)的二价接头试剂是已知的，并且方法已描述了它们所得的缀合物(hermanson,g.t.(1996)bioconjugatetechniques；academicpress:newyork,第234-242页)。

在另一个实施方案中，接头可被调节聚集、溶解性或反应性的基团取代。例如，磺酸酯取代基可增加试剂的水溶性并促进接头试剂与抗体或药物部分偶联反应，或促进ab-l与d^l的偶联反应或者d^l-l与ab的偶联反应，这取决于制备adc所采用的合成途径。

在一个实施方案中，l-r^l'是基团：

其中星号指示药物单元(d)的连接点，ab是抗体(l)，l¹是接头，a是连接l¹至抗体的连接基团、l²是共价键或与-oc(＝o)-一起形成自分解性接头，并且l¹或l²是可裂解的接头。

l¹优选地是可裂解的接头，并且可被称为用于激活接头以裂解的触发剂。

l¹和l²的性质当存在时可变化很大。基于它们的裂解特征选择这些基团，其可根据递送缀合物的位点处的条件指示。通过酶的作用裂解的那些接头是优选的，尽管还可使用可通过ph(如酸或碱不稳定)变化、温度变化、辐射(如光不稳定)后裂解的接头。可在还原或氧化条件下裂解的接头还可用于本公开中。

l¹可包含氨基酸的连续序列。氨基酸序列可为用于酶促裂解的靶底物，从而允许从n10位置释放l-r^l'。

在一个实施方案中，l¹可通过酶作用裂解。在一个实施方案中，酶是酯酶或肽酶。

在一个实施方案中，l²是存在的且与-c(＝o)o-一起形成自分解性接头。在一个实施方案中，l²是用于酶促活性的底物，从而允许从n10位置释放l-r^l'。

在一个实施方案中，其中l¹可通过酶作用裂解且l²是存在的，酶裂解l¹与l²之间的键。

l¹和l²当存在时可通过选自以下的键连接：

-c(＝o)nh-、

-c(＝o)o-、

-nhc(＝o)-、

-oc(＝o)-、

-oc(＝o)o-、

-nhc(＝o)o-、

-oc(＝o)nh-和

-nhc(＝o)nh-。

连接至l²的l¹的氨基基团可为氨基酸的n-端，或可源自氨基酸侧链(如赖氨酸氨基酸侧链)的氨基基团。

连接至l²的l¹的羧基基团可为氨基酸的c-端或可源自氨基酸侧链(如谷氨酸氨基酸侧链)的羧基基团。

连接至l²的l¹的羟基基团可源自氨基酸侧链(如丝氨酸氨基酸侧链)的羟基基团。

术语“氨基酸侧链”包括存在于以下的那些基团：(i)天然存在的氨基酸，诸如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；(ii)次要氨基酸，诸如鸟氨酸和瓜氨酸；(iii)非天然氨基酸、β-氨基酸、天然存在的氨基酸的合成类似物和衍生物；和(iv)所有对映异构体、非对映异构体、同分异构富含的、同位素标记的(如²h、³h、¹⁴c、¹⁵n)、保护形式和其外消旋混合物。

在一个实施方案中，-c(＝o)o-和l²一起形成基团：

其中星号指示与n10位置的连接点，波浪线指示与接头l¹的连接点，y是-n(h)-、-o-、-c(＝o)n(h)-或-c(＝o)o-且n是0至3。亚苯基环被如本文所述的一个、两个或三个取代基任选地取代。在一个实施方案中，亚苯基基团被卤基、no2、r或or任选地取代。

在一个实施方案中，y是nh。

在一个实施方案中，n是0或1。优选地，n是0。

其中y是nh且n是0，自分解性接头可被称为对氨基苄基羰基接头(pabc)。

当激活远端位点时，自分解性接头将允许释放经保护的化合物，沿着下文显示的线前进(对于n＝0)：

其中l^*是接头的剩余部分的激活形式。这些基团具有分离激活位点与被保护的化合物的优势。如上所述，亚苯基基团可被任选地取代。

在本文所述的一个实施方案中，基团l^*是如本文所述的接头l¹，其可包括二肽基团。

在另一个实施方案中，-c(＝o)o-和l²一起形成选自以下的基团：

其中星号、波浪线、y和n如上所定义。每个亚苯基环被如上所述的一个、两个或三个取代基任选地取代。在一个实施方案中，具有y取代基的亚苯基环被任选地取代且未具有y取代基的亚苯基环未被取代。在一个实施方案中，具有y取代基的亚苯基环是未取代的且不具有y取代基的亚苯基环被任选地取代。

在另一个实施方案中，-c(＝o)o-和l²一起形成选自以下的基团：

其中星号、波浪线、y和n如上所定义，e是o、s或nr，d是n、ch或cr，且f是n、ch或cr。

在一个实施方案中，d是n。

在一个实施方案中，d是ch。

在一个实施方案中，e是o或s。

在一个实施方案中，f是ch。

在一个优选的实施方案中，接头是组织蛋白酶不稳定性接头。

在一个实施方案中，l¹包含二肽。二肽可表示为-nh-x1-x2-co-，其中-nh-和-co-分别表示氨基酸基团x1和x2的n-和c-末端。二肽中的氨基酸可为天然氨基酸的任何组合。当接头是组织蛋白酶不稳定性接头时，二肽可为用于组织蛋白酶-介导的裂解的作用位点。

此外，对于具有羧基或氨基侧链官能团的那些氨基酸基团(如分别是glu和lys)，co和nh可表示此侧链官能团。

在一个实施方案中，二肽-nh-x1-x2-co-中的基团-x1-x2-选自：

-phe-lys-、

-val-ala-、

-val-lys-、

-ala-lys-、

-val-cit-、

-phe-cit-、

-leu-cit-、

-ile-cit-、

-phe-arg-、

-trp-cit，其中

cit是瓜氨酸。

优选地，二肽-nh-x1-x2-co-中的基团-x1-x2-选自：

-phe-lys-、

-val-ala-、

-val-lys-、

-ala-lys-、

-val-cit-。

最优选地，二肽-nh-x1-x2-co-中的基团-x1-x2-是-phe-lys-或-val-ala-。

可使用其它二肽组合，包括由dubowchik等,bioconjugatechemistry,2002,13,855-869(其通过引用并入本文)描述的那些，其通过引用并入本文。

在一个实施方案中，在适当时氨基酸侧链被衍生化。例如，氨基酸侧链的氨基基团或羧基基团可被衍生化。在一个实施方案中，侧链氨基酸(诸如赖氨酸)的氨基基团nh2是选自由nhr和nrr’组成的组的衍生化形式。

在一个实施方案中，侧链氨基酸(诸如天冬氨酸)的羧基基团cooh是选自由coor、conh2、conhr和conrr’组成的组的衍生化形式。

在一个实施方案中，在适当时氨基酸侧链被化学保护。侧链保护基可为如下就基团r^l而言讨论的基团。本发明人已经确定经保护的氨基酸序列可由酶裂解。例如，已经确定包含boc侧链-保护的lys残基的二肽序列可由组织蛋白酶裂解。

氨基酸侧链的保护基是本领域熟知的且描述于novabiochemcatalog中。另外的保护基策略在protectivegroupsinorganicsynthesis,greene和wuts中阐述。

以下示出了具有反应性侧链官能团的那些氨基酸的可能的侧链保护基：

arg：z，mtr，tos；

asn：trt，xan；

asp：bzl，t-bu；

cys：acm，bzl，bzl-ome，bzl-me，trt；

glu：bzl，t-bu；

gln：trt，xan；

his：boc，dnp，tos，trt；

lys：boc，z-cl，fmoc，z，alloc；

ser：bzl，tbdms，tbdps；

thr：bz；

trp：boc；

tyr：bzl，z，z-br。

在一个实施方案中，选择侧链保护与基团正交，所述基团作为封端基团或封端基团的一部分(当存在时)提供。因此，去除侧链保护基不去除封端基团或为封端基团的一部分的任何保护基官能团。

在本公开的其它实施方案中，所选的氨基酸是不具有反应性侧链官能团的那些。例如，氨基酸可选自：ala、gly、ile、leu、met、phe、pro和val。

在一个实施方案中，与自分解性接头组合使用二肽。自分解性接头可连接至-x2-。

其中自分解性接头存在，-x2-直接连接至自分解性接头。优选地，基团-x2-co-连接至y，其中y是nh，从而形成基团-x2-co-nh-。

-nh-x1-直接连接至a。a可包含官能团-co-从而与-x1-形成酰胺连接。

在一个实施方案中，与-oc(＝o)-一起的l¹和l²包含基团nh-x1-x2-co-pabc-。pabc基团直接连接至n10位置。

优选地，自分解性接头和二肽一起形成基团-nh-phe-lys-co-nh-pabc-，其在下文中示出：

其中星号指示与n10位置的连接点且波浪线指示与接头l¹的剩余部分的连接点或与a的连接点。优选地，波浪线指示与a的连接点。lys氨基酸的侧链可例如用如上所述的boc、fmoc或alloc保护。

可替代地，自分解性接头和二肽一起形成基团-nh-val-ala-co-nh-pabc-，其在下文中示出：

其中星号和波浪线如上所定义。

可替代地，自分解性接头和二肽一起形成基团-nh-val-cit-co-nh-pabc-，其在下文中示出：

其中星号和波浪线如上所定义。

在一个实施方案中，a是二价键。因此，l¹和抗体直接连接。例如，其中l¹包含连续氨基酸序列，该序列的n-端可直接连接至抗体。

因此，其中a是共价键，抗体与l¹之间的连接可选自：

-c(＝o)nh-、

-c(＝o)o-、

-nhc(＝o)-、

-oc(＝o)-、

-oc(＝o)o-、

-nhc(＝o)o-、

-oc(＝o)nh-、

-nhc(＝o)nh-、

-c(＝o)nhc(＝o)-、

-s-、

-s-s-、

-ch2c(＝o)-和

＝n-nh-。

连接至抗体的l¹的氨基基团可为氨基酸的n-端或可源自氨基酸侧链(如赖氨酸氨基酸侧链)的氨基基团。

连接至抗体的l¹的羧基基团可为氨基酸的c-端或可源自氨基酸侧链(如谷氨酸氨基酸侧链)的羧基基团。

连接至抗体的l¹的羟基基团可源自氨基酸侧链(如丝氨酸氨基酸侧链)的羟基基团。

连接至抗体的l¹的硫醇基团可源自氨基酸侧链(如丝氨酸氨基酸侧链)的硫醇基团。

就l¹的氨基、羧基、羟基和硫醇基团而言的以上评论也适用于抗体。

在一个实施方案中，l²与-oc(＝o)-一起表示：

其中星号指示与n10位置的连接点，波浪线指示与l¹的连接点，n是0至3，y是共价键或官能团，且e是例如通过酶促作用或光可活化的基团，从而产生自分解性单元。亚苯基环被如本文所述的一个、两个或三个取代基进一步任选地取代。在一个实施方案中，亚苯基基团被卤基、no2、r或or进一步任选地取代。优选地，n是0或1，最优选0。

选择e使得基团易受通过光或通过酶作用激活。e可为-no2或葡萄糖醛酸。前者可易受硝基还原酶的作用，后者可易受β-葡萄糖醛酸酶的作用。

在该实施方案中，当激活e时，自分解性接头将允许释放经保护的化合物，沿着下文显示的线前进(对于n＝0)：

其中星号指示与n10位置的连接点，e^*是e的激活形式且y如上所述。这些基团具有分离激活位点与经保护的化合物优势。如上所述，亚苯基基团可被任选地进一步取代。

基团y可共价键合至l¹。

基团y可为选自以下的官能团：

-c(＝o)-

-nh-

-o-

-c(＝o)nh-、

-c(＝o)o-、

-nhc(＝o)-、

-oc(＝o)-、

-oc(＝o)o-、

-nhc(＝o)o-、

-oc(＝o)nh-、

-nhc(＝o)nh-、

-nhc(＝o)nh、

-c(＝o)nhc(＝o)-和

-s-。

其中l¹是二肽，优选的是y是-nh-或-c(＝o)-，从而在l¹与y之间形成酰胺键。在该实施方案中，二肽序列不需要用于酶促活性的底物。

在另一个实施方案中，a是间隔子基团。因此，l¹和抗体间接连接。

l¹和a可通过选自以下的键连接：

-c(＝o)nh-、

-c(＝o)o-、

-nhc(＝o)-、

-oc(＝o)-、

-oc(＝o)o-、

-nhc(＝o)o-、

-oc(＝o)nh-和

-nhc(＝o)nh-。

在一个实施方案中，基团a是：

其中星号指示与l¹的连接点，波浪线指示与抗体的连接点，且n是0至6。在一个实施方案中，n是5。

在一个实施方案中，基团a是：

其中星号指示与l¹的连接点，波浪线指示与抗体的连接点，且n是0至6。在一个实施方案中，n是5。

在一个实施方案中，基团a是：

其中星号指示与l¹的连接点，波浪线指示与抗体的连接点，n是0或1，且m是0至30。在一个优选的实施方案中，n是1，并且m是0至10、1至8，优选4至8，且最优选4或8。在另一个实施方案中，m是10至30且优选为20至30。可替代地，m是0至50。在该实施方案中，m优选为10-40且n是1。

在一个实施方案中，基团a是：

其中星号指示与l¹的连接点，波浪线指示与抗体的连接点，n是0或1，且m是0至30。在一个优选的实施方案中，n是1，并且m是0至10、1至8，优选4至8，且最优选4或8。在另一个实施方案中，m是10至30且优选为20至30。可替代地，m是0至50。在该实施方案中，m优选为10-40且n是1。

在一个实施方案中，抗体与a之间的连接是通过抗体的硫醇残基与a的马来酰亚胺基团。

在一个实施方案中，抗体与a之间的连接是：

其中星号指示与a的剩余部分的连接点且波浪线指示与抗体的剩余部分的连接点。在该实施方案中，s原子通常源自抗体。

在以上的每个实施方案中，可替代的官能团可用于替代以下显示的马来酰亚胺来源的基团：

其中波浪线指示与如前的抗体的连接点，并且星号指示与a基团的剩余部分的键。

在一个实施方案中，马来酰亚胺来源的基团被以下基团替代：

其中波浪线指示与抗体的连接点，并且星号指示与a基团的剩余部分的键。

在一个实施方案中，马来酰亚胺来源的基团被任选地与抗体一起选自以下的基团取代：

-c(＝o)nh-、

-c(＝o)o-、

-nhc(＝o)-、

-oc(＝o)-、

-oc(＝o)o-、

-nhc(＝o)o-、

-oc(＝o)nh-、

-nhc(＝o)nh-、

-nhc(＝o)nh、

-c(＝o)nhc(＝o)-、

-s-、

-s-s-、

-ch2c(＝o)-

-c(＝o)ch2-、

＝n-nh-和

-nh-n＝。

在一个实施方案中，马来酰亚胺来源的基团被任选地与抗体一起选自以下的基团取代：

其中波浪线指示与抗体的连接点或与a基团的剩余部分的键，并且星号指示与抗体的另一个连接点或与a基团的剩余部分的键。

其它适用于连接l¹至抗体的基团描述于wo2005/082023中。

在一个实施方案中，连接基团a存在，触发剂l¹存在且自分解性接头l²不存在。因此，l¹和药物单元经由键直接连接。等效地，在该实施方案中，l²是键。当d^l具有式ii时，这可能特别相关。

l¹和d可通过选自以下的键连接：

-c(＝o)n<、

-c(＝o)o-、

-nhc(＝o)-、

-oc(＝o)-、

-oc(＝o)o-、

-nhc(＝o)o-、

-oc(＝o)n<和

-nhc(＝o)n<，

其中n<或o-是d的一部分。

在一个实施方案中，l¹和d优选地通过选自以下的键连接：

-c(＝o)n<，和

-nhc(＝o)-。

在一个实施方案中，l¹包含二肽且二肽的一端连接至d。如上所述，二肽中的氨基酸可为天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施方案中，二肽包含天然氨基酸。当接头是组织蛋白酶不稳定性接头时，二肽是用于组织蛋白酶-介导的裂解的作用位点。然后，二肽是组织蛋白酶的识别位点。

在一个实施方案中，二肽-nh-x1-x2-co-中的基团-x1-x2-选自：

-phe-lys-、

-val-ala-、

-val-lys-、

-ala-lys-、

-val-cit-、

-phe-cit-、

-leu-cit-、

-ile-cit-、

-phe-arg-和

-trp-cit-；

其中cit是瓜氨酸。在此类二肽中，-nh-是x1的氨基基团且co是x2的羰基基团。

优选地，二肽-nh-x1-x2-co-中的基团-x1-x2-选自：

-phe-lys-、

-val-ala-、

-val-lys-、

-ala-lys-和

-val-cit-。

最优选地，二肽-nh-x1-x2-co-中的基团-x1-x2-是-phe-lys-或-val-ala-。

其它感兴趣的二肽组合包括：

-gly-gly-、

-pro-pro-和

-val-giu-。

可使用其它二肽组合，包括上述的那些。

在一个实施方案中，l¹-d是：

其中-nh-x1-x2-co是二肽，-n<是药物单元的一部分，星号指示与药物单元的剩余部分的连接点，且波浪线指示与l¹的剩余部分的连接点或与a的连接点。优选地，波浪线指示与a的连接点。

在一个实施方案中，二肽是缬氨酸-丙氨酸且l¹-d是：

其中星号、-n<和波浪线如上所定义。

在一个实施方案中，二肽是苯丙氨酸-赖氨酸且l¹-d是：

其中星号、-n<和波浪线如上所定义。

在一个实施方案中，二肽是缬氨酸-瓜氨酸。

在一个实施方案中，基团a-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，波浪线指示与配体单元的连接点且n是0至6。在一个实施方案中，n是5。

在一个实施方案中，基团a-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，波浪线指示与配体单元的连接点且n是0至6。在一个实施方案中，n是5。

在一个实施方案中，基团a-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，波浪线指示与配体单元的连接点，n是0或1，且m是0至30。在一个优选的实施方案中，n是1且m是0至10、1至8，优选为4至8，最优选为4或8。

在一个实施方案中，基团a-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，波浪线指示与配体单元的连接点，n是0或1，且m是0至30。在一个优选的实施方案中，n是1且m是0至10、1至7，优选为3至7，最优选为3或7。

在一个实施方案中，基团a-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，波浪线指示与配体单元的连接点，且n是0至6。在一个实施方案中，n是5。

在一个实施方案中，基团a-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，波浪线指示与配体单元的连接点，且n是0至6。在一个实施方案中，n是5。

在一个实施方案中，基团a-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，波浪线指示与配体单元的连接点，n是0或1，且m是0至30。在一个优选的实施方案中，n是1且m是0至10、1至8，优选为4至8，最优选为4或8。

在一个实施方案中，基团a-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，波浪线指示与配体单元的连接点，n是0或1，且m是0至30。在一个优选的实施方案中，n是1且m是0至10、1至8，优选为4至8，最优选为4或8。

在一个实施方案中，基团a-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，s是配体单元的硫基团，波浪线指示与配体单元的剩余部分的连接点且n是0至6。在一个实施方案中，n是5。

在一个实施方案中，基团a-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，s是配体单元的硫基团，波浪线指示与配体单元的剩余部分的连接点且n是0至6。在一个实施方案中，n是5。

在一个实施方案中，基团a¹-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，s是配体单元的硫基团，波浪线指示与配体单元的剩余部分的连接点，n是0或1，且m是0至30。在一个优选的实施方案中，n是1且m是0至10、1至8，优选为4至8，最优选为4或8。

在一个实施方案中，基团a¹-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，波浪线指示配体单元的连接点，n是0或1，且m是0至30。在一个优选的实施方案中，n是1且m是0至10、1至7，优选为4至8，最优选为4或8。

在一个实施方案中，基团a¹-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，波浪线指示与配体单元的剩余部分的连接点，且n是0至6。在一个优选的实施方案中，n是5。

在一个实施方案中，基团a¹-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，波浪线指示与配体单元的剩余部分的连接点，且n是0至6。在一个优选的实施方案中，n是5。

在一个实施方案中，基团a¹-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，波浪线指示与配体单元的剩余部分的连接点，n是0或1，且m是0至30。在一个优选的实施方案中，n是1且m是0至10、1至8，优选为4至8，最优选为4或8。

在一个实施方案中，基团a¹-l¹是：

其中星号指示与l²或d的连接点，波浪线指示与配体单元的剩余部分的连接点，n是0或1，且m是0至30。在一个优选的实施方案中，n是1且m是0至10、1至8，优选为4至8，最优选为4或8。

基团r^l'可源自基团r^l。基团r^l可通过连接抗体至r^l的官能团转化为基团r^l'。可采取其它步骤以转化r^l为r^l'。这些步骤可包括去除保护基(在存在时)或安装适当的官能团。

r^l

接头可包含含一个或多个氨基酸单元的蛋白酶-可裂解的肽部分。肽接头试剂可通过肽化学领域熟知的固相或液相合成方法在自动化合成仪(诸如raininsymphony肽合成仪(raininsymphonypeptidesynthesizer)(proteintechnologies,inc.,tucson,az)或模型433(appliedbiosystems,fostercity,ca))上制备(e.和k.lübke,thepeptides,第1卷,第76-136页(1965)academicpress)，所述方法包括t-boc化学(geiser等"automationofsolid-phasepeptidesynthesis"macromolecularsequencingandsynthesis,alanr.liss,inc.,1988,第199-218页)和fmoc/hbtu化学(fields,g.和noble,r.(1990)"solidphasepeptidesynthesisutilizing9-fluoroenylmethoxycarbonylaminoacids",int.j.peptideproteinres.35:161-214)。

示例性氨基酸接头包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯基丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸接头组分的氨基酸残基包括天然存在的那些，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物(诸如瓜氨酸)。氨基酸接头组分可针对特定酶(如，肿瘤相关的蛋白酶，组织蛋白酶b、c和d或纤维蛋白溶酶蛋白酶)进行酶促裂解的选择性设计和优化。

氨基酸侧链包括天然存在的那些，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物(诸如瓜氨酸)。氨基酸侧链包括氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、对羟基苄基、-ch2oh、-ch(oh)ch3、-ch2ch2sch3、-ch2conh2、-ch2cooh、-ch2ch2conh2、-ch2ch2cooh、-(ch2)3nhc(＝nh)nh2、-(ch2)3nh2、-(ch2)3nhcoch3、-(ch2)3nhcho、-(ch2)4nhc(＝nh)nh2、-(ch2)4nh2、-(ch2)4nhcoch3、-(ch2)4nhcho、-(ch2)3nhconh2、-(ch2)4nhconh2、-ch2ch2ch(oh)ch2nh2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基以及以下结构：

当氨基酸侧链包含除了氢之外的(甘氨酸)时，连接氨基酸侧链的碳原子是手性的。氨基酸侧链连接的每个碳原子独立地呈(s)或(r)构型或者外消旋混合物。药物-接头试剂可因此为对映异构体纯的、外消旋的或非对映异构体的。

在示例性实施方案中，氨基酸侧链选自天然或非天然氨基酸的那些，包括丙氨酸、2-氨基-2-环己基乙酸、2-氨基-2-苯基乙酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、γ-氨基丁酸、α,α-二甲基γ-氨基丁酸、β,β-二甲基γ-氨基丁酸、鸟氨酸和瓜氨酸(cit)。

可用于构建具有对-氨基苄基氨基甲酰基(pab)自分解性间隔子的接头-pbd药物部分中间体以缀合至抗体的示例性缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接头试剂具有结构：

其中q是c1-c8烷基、-o-(c1-c8烷基)、-卤素、-no2或-cn；且m是在0-4范围内的整数。

具有对氨基苄基基团的示例性phe-lys(mtr)二肽接头试剂可根据dubowchik,等(1997)tetrahedronletters,38:5257-60制备，且具有结构：

其中mtr是单-4-甲氧基三苯甲基，q是c1-c8烷基、-o-(c1-c8烷基)、-卤素、-no2或-cn；且m是在0-4范围内的整数。

“自分解性接头”pab(对氨基苄基氧基羰基)连接药物部分至抗体药物缀合物中的抗体(carl等(1981)j.med.chem.24:479-480；chakravarty等(1983)j.med.chem.26:638-644；us6214345；us20030130189；us20030096743；us6759509；us20040052793；us6218519；us6835807；us6268488；us20040018194；wo98/13059；us20040052793；us6677435；us5621002；us20040121940；wo2004/032828)。除了pab之外的自分解性间隔子的其它实例包括但不限于：(i)芳香族化合物，其在电子上类似于pab基团，诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(hay等(1999)bioorg.med.chem.lett.9:2237)、噻唑(us7375078)、多个延长的pab单元(degroot等(2001)j.org.chem.66:8815-8830)；和邻或对-氨基苄基缩醛；和(ii)同系的(homologated)苯乙烯基pab类似物(us7223837)。可使用在酰胺键水解后经历环化的间隔子，诸如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(rodrigues等(1995)chemistrybiology2:223)、适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系统(storm等(1972)j.amer.chem.soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(amsberry,等(1990)j.org.chem.55:5867)。消除在甘氨酸处被取代的含胺药物(kingsbury等(1984)j.med.chem.27:1447)也是可用于adc中的自分解性间隔子的实例。

在一个实施方案中，缬氨酸-瓜氨酸二肽pab类似物试剂具有2,6二甲基苯基基团，并具有结构：

可用于本公开的抗体药物缀合物的接头试剂包括但不限于：bmpeo、bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基-emcs、磺基-gmbs、磺基-kmus、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc和磺基-smpb，及svsb(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)和双-马来酰亚胺试剂：dtme、bmb、bmdb、bmh、bmoe、1,8-双-马来酰亚胺二乙二醇(bm(peo)2)和1,11-双-马来酰亚胺三乙二醇(bm(peo)3)，其可从piercebiotechnology,inc.、thermoscientific、rockford,il和其它试剂供应商商购获得。双-马来酰亚胺试剂允许以连续或同时的方式连接抗体的半胱氨酸残基的游离硫醇基团至含硫醇的药物部分、标签或接头中间体。除了马来酰亚胺之外的与抗体、pbd药物部分或接头中间体的硫醇基团反应的其它官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。

接头试剂的其它实施方案是：n-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫)戊酸酯(spp)、n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(spdp,carlsson等(1978)biochem.j.173:723-737)、琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基酯(smcc)、亚氨基硫杂环戊烷(it)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如二亚胺代己二酸二甲酯hcl)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-二氮鎓衍生物(诸如双-(对二氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。有用的接头试剂还可经由其它商业来源(诸如molecularbiosciencesinc.(boulder,co))获得或根据toki等(2002)j.org.chem.67:1866-1872；us6214345；wo02/088172；us2003130189；us2003096743；wo03/026577；wo03/043583；和wo04/032828中所述的程序合成。

接头可为用于通过分支的多官能接头部分共价连接超过一个药物部分至抗体的树枝状类型接头(us2006/116422；us2005/271615；degroot等(2003)angew.chem.int.ed.42:4490-4494；amir等(2003)angew.chem.int.ed.42:4494-4499；shamis等(2004)j.am.chem.soc.126:1726-1731；sun等(2002)bioorganic&medicinalchemistryletters12:2213-2215；sun等(2003)bioorganic&medicinalchemistry11:1761-1768；king等(2002)tetrahedronletters43:1987-1990)。树枝状接头可增加药物与抗体的摩尔比，即负载，其与adc的效力相关。因此，当抗体仅携带一个反应性半胱氨酸硫醇基团时，大量的药物部分可通过树枝状或支链接头连接。

树枝状类型接头的一个示例性实施方案具有结构：

其中星号指示与pbd部分的n10位置的连接点。

r^c，封端基团

本公开的第一方面的缀合物可在n10位置(r²⁰)处具有封端基团r^c。

基团r^c可从pbd部分的n10位置去除以留下n10-c11亚胺键、甲醇胺、经取代的甲醇胺，其中qr¹¹是oso3m、亚硫酸氢盐加合物、硫代甲醇胺、经取代的硫代甲醇胺或经取代的甲醇胺(carbinalamine)。

在一个实施方案中，r^c可为保护基，其可去除以留下n10-c11亚胺键、甲醇胺、经取代的甲醇胺，或者其中qr¹¹是oso3m、亚硫酸氢盐加合物。在一个实施方案中，r^c是可移除以留下n10-c11亚胺键的保护基。

基团r^c预期在与去除基团r¹⁰所需的那些条件相同的条件下可去除，例如以产生n10-c11亚胺键、甲醇胺等。封端基团用作n10位置处的预期官能团的保护基。封端基团预期针对抗体不具有反应性。例如，r^c与r^l1’不同。

在一个实施方案中，基团r^c在裂解接头r^l1’的条件下可去除。因此，在一个实施方案中，封端基团可通过酶作用裂解。

r^c可为n10保护基，诸如本发明人的早期申请wo00/12507中所述的那些基团。在一个实施方案中，r^c是治疗上可去除的氮保护基，如本发明人的早期申请wo00/12507中所定义。

在一个实施方案中，r^c是氨基甲酸酯保护基。

在一个实施方案中，氨基甲酸酯保护基选自：

alloc、fmoc、boc、troc、teoc、psec、cbz和pnz。

任选地，氨基甲酸酯保护基另外选自moc。

在一个实施方案中，r^c是缺乏用于连接至抗体的官能团的接头基团r^l1’。

本申请特别涉及那些为氨基甲酸酯的r^c基团。

在一个实施方案中，r^c是基团：

其中星号指示与n10位置的连接点，g²是终止基团，l³是共价键或可裂解的接头l¹，l²是共价键或与oc(＝o)一起形成自分解性接头。

当l³和l²均为共价键时，g²和oc(＝o)一起形成如上所定义的氨基甲酸酯保护基。

l²就r^l1’而言如上所定义。

各种终止基团在下文中描述，包括基于熟知的保护基的那些。

在一个实施方案中，l³是可裂解的接头l¹，且l²与oc(＝o)一起形成自分解性接头。在该实施方案中，g²是ac(乙酰基)或moc，或选自以下的氨基甲酸酯保护基：

alloc、fmoc、boc、troc、teoc、psec、cbz和pnz。

任选地，氨基甲酸酯保护基另外选自moc。

在另一个实施方案中，g²是酰基基团-c(＝o)g³，其中g³选自烷基(包括环烷基、烯基和炔基)、杂烷基、杂环基和芳基(包括杂芳基和碳芳基)。这些基团可被任选地取代。在适当时，酰基基团与l³或l²的氨基基团一起可形成酰胺键。在适当时，酰基基团与l³或l²的羟基基团一起可形成酯键。

在一个实施方案中，g³是杂烷基。杂烷基基团可包含聚乙二醇。杂烷基基团可具有与酰基基团相邻的杂原子诸如o或n，从而在适当时与基团l³或l²中存在的杂原子在适当时形成氨基甲酸酯或碳酸酯基团。

在一个实施方案中，g³选自nh2、nhr和nrr’。优选地，g³是nrr’。

在一个实施方案中，g²是基团：

其中星号指示与l³的连接点，n是0至6且g⁴选自oh、or、sh、sr、coor、conh2、conhr、conrr’、nh2、nhr、nrr’、no2和卤基。基团oh、sh、nh2和nhr经保护。在一个实施方案中，n是1至6，且优选地，n是5。在一个实施方案中，g⁴是or、sr、coor、conh2、conhr、conrr’和nrr’。在一个实施方案中，g⁴是or、sr和nrr’。优选地，g⁴选自or和nrr’，最优选地，g⁴是or。最优选地，g⁴是ome。

在一个实施方案中，基团g²是：

其中星号指示与l³的连接点，并且n和g⁴如上所定义。

在一个实施方案中，基团g²是：

其中星号指示与l³的连接点，n是0或1，m是0至50且g⁴选自oh、or、sh、sr、coor、conh2、conhr、conrr’、nh2、nhr、nrr’、no2和卤基。在一个优选的实施方案中，n是1且m是0至10、1至2，优选4至8，且最优选4或8。在另一个实施方案中，n是1且m是10至50，优选20至40。基团oh、sh、nh2和nhr经保护。在一个实施方案中，g⁴是or、sr、coor、conh2、conhr、conrr’和nrr’。在一个实施方案中，g⁴是or、sr和nrr’。优选地，g⁴选自or和nrr’，最优选地，g⁴是or。

优选地，g⁴是ome。

在一个实施方案中，基团g²是：

其中星号指示与l³的连接点，且n、m和g⁴如上所定义。

在一个实施方案中，基团g²是：

其中n是1-20，m是0-6且g⁴选自oh、or、sh、sr、coor、conh2、conhr、conrr’、nh2、nhr、nrr’、no2和卤基。在一个实施方案中，n是1-10。在另一个实施方案中，n是10至50，优选20至40。在一个实施方案中，n是1。在一个实施方案中，m是1。基团oh、sh、nh2和nhr经保护。在一个实施方案中，g⁴是or、sr、coor、conh2、conhr、conrr’和nrr’。在一个实施方案中，g⁴是or、sr和nrr’。优选地，g⁴选自or和nrr’，最优选地，g⁴是or。

优选地，g⁴是ome。

在一个实施方案中，基团g²是：

其中星号指示与l³的连接点，且n、m和g⁴如上所定义。

在以上的每一个实施方案中，g⁴可为oh、sh、nh2和nhr。这些基团优选地经保护。

在一个实施方案中，oh用bzl、tbdms或tbdps保护。

在一个实施方案中，sh用acm、bzl、bzl-ome、bzl-me或trt保护。

在一个实施方案中，nh2或nhr用boc、moc、z-ci、fmoc、z或alloc保护。

在一个实施方案中，基团g²与基团l³组合存在，所述基团是二肽。

封端基团并非预期连接至抗体。因此，二聚体中存在的另一种单体用作经由接头与抗体的连接点。

因此，优选的是封端基团中存在的官能团不可用于与抗体反应。因此，反应性官能团诸如oh、sh、nh2、cooh优选地被避免。然而，如上所述，此类官能团可存在于封端基团(如果经保护)中。

实施方案

在一些实施方案中，d^l选自包括以下的组：

缀合物a

缀合物b

缀合物c:

缀合物d

和

缀合物e:

载药量

载药量是每抗体的pbd药物的平均数，如抗体。当本公开的化合物结合至半胱氨酸时，载药量的范围可为每抗体1至8个药物(d^l)，即其中1、2、3、4、5、6、7和8个药物部分共价连接至抗体。缀合物的组合物包括与多种(1至8种)药物缀合的抗体的集合。当本公开的化合物结合至赖氨酸时，载药量的范围可为每抗体1至20个药物(d^l)，尽管可能优选10或8个的上限。缀合物的组合物包括与多种(1至20种、1至10种或1至8种)药物缀合的抗体的集合。

在从缀合物反应制备adc中每抗体药物的平均数可能特征在于常规方法，诸如uv、反相hplc、hic、质谱、elisa测定和电泳。也可以根据p确定adc的数量分布。通过elisa，可确定adc的特定制备中p的平均值(hamblett等(2004)clin.cancerres.10:7063-7070；sanderson等(2005)clin.cancerres.11:843-852)。然而，p(药物)值的分布不可通过抗体-抗原结合和elisa的检测限辨别。此外，用于检测抗体-药物缀合物的elisa测定不确定在何处药物部分连接至抗体，诸如重链或轻链片段或特定的氨基酸残基。在一些情况下，同质adc(其中p是来自具有其它载药量的adc的某一个值)的分离、纯化和表征可通过诸如反相hplc或电泳的方法实现。此类技术也可适用于其它类型的缀合物。

对于一些抗体-药物缀合物，p可受到抗体上多个连接位点的限制。例如，抗体仅可具有一个或若干个半胱氨酸硫醇基团，或仅可具有一个或多个具有足够反应性的硫醇基团，通过所述基团可连接接头。较高载药量(如p>5)可能导致聚集、不溶性、毒性或丧失某些抗体-药物缀合物的细胞渗透性。

通常，在缀合反应期间少于理论最大值的药物部分缀合至抗体。抗体可含有例如不与药物-接头中间体(d-l)或接头试剂反应的许多赖氨酸残基。仅最具有反应性的赖氨酸基团可与胺-反应性接头试剂反应。此外，仅最具有反应性的半胱氨酸硫醇基团可与硫醇-反应性接头试剂反应。通常，抗体不含许多(如果存在)可连接至药物部分的游离且具有反应性的半胱氨酸硫醇基团。该化合物的抗体中的大部分半胱氨酸硫醇残基作为二硫桥存在且必须在部分或完全还原条件下用还原剂(诸如二硫苏糖醇(dtt)或tcep)还原。adc的载量(药物/抗体比)可以若干种不同的方式控制，包括：(i)限制药物-接头中间体(d-l)或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，和(iii)部分或限制半胱氨酸硫醇修饰的还原条件。

某些抗体具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。抗体可通过用诸如dtt(二硫苏糖醇)的还原剂处理制备为对于与接头试剂缀合有反应性。理论上，每个半胱氨酸桥将因此形成两个反应性硫醇亲核体。可以通过使赖氨酸与2-亚胺硫杂环戊烷(特劳特试剂(traut’sreagent))反应，将另外的亲核基团引入抗体，导致胺转化为硫醇。也可以通过工程化一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(如，制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体抗体)将反应性硫醇基团引入抗体(或其片段)。us7521541教导通过引入反应性半胱氨酸氨基酸来工程化抗体。

半胱氨酸氨基酸可在抗体中的反应性位点处工程且不形成链内或分子间二硫键(junutula,等,2008bnaturebiotech.,26(8):925-932；dornan等(2009)blood114(13):2721-2729；us7521541；us7723485；wo2009/052249)。经工程化的半胱氨酸硫醇可与本公开的含具有硫醇反应性亲电基团(诸如马来酰亚胺或α-卤代酰胺)的接头试剂或药物-接头试剂反应以形成具有半胱氨酸工程化的抗体和pbd药物部分的adc。药物部分的位置可因此经设计、控制并知晓。可控制载药量，因为经工程化的半胱氨酸硫醇基团通常与高产率的硫醇-反应性接头试剂或药物-接头试剂反应。工程化igg抗体以通过重链或轻链上的单个位点处取代引入半胱氨酸氨基酸，得到在对称抗体上的两个新的半胱氨酸。接近2的载药量可用缀合产物adc的近乎同质实现。

可替代地，如axup等((2012),procnatlacadsciusa.109(40)：16101-16116)所述，位点特异性缀合可通过工程化抗体以在它们的重链和/或轻链中含有非天然氨基酸实现。非天然氨基酸提供另外的优势：正交化学物质可经设计以连接接头试剂和药物。

如果抗体的不止一个亲核基团或亲电基团与药物-接头中间体或接头试剂、之后与药物部分试剂反应，那么所得产物是adc化合物与连接至抗体的药物部分的分布(抗体,如1、2、3等)的混合物。液相色谱法诸如聚合反相(plrp)和疏水相互作用(hic)可通过载药量值分离混合物中的化合物。可分离具有单一载药量值(p)的adc的制剂，然而这些单一载量值adc可能仍为异质混合物，因为药物部分可经由接头连接在抗体上的不同位点处。

因此，本公开的抗体-药物缀合物组合物包括抗体-药物缀合物化合物的混合物，其中抗体具有一个或多个pbd药物部分且其中药物部分可在各个氨基酸残基处连接至抗体。

在一个实施方案中，每抗体的二聚体吡咯并苯并二氮杂基团的平均数在1至20的范围内。在一些实施方案中，范围选自1至8、2至8、2至6、2至4和4至8。

在一些实施方案中，每抗体存在一个二聚体吡咯并苯并二氮杂基团。

包括其它形式

除非另外说明，否则上文包括这些取代基的熟知的离子、盐、溶剂合物和受保护形式。例如，提到羟酸(-cooh)还包括其阴离子(羧酸根)形式(-coo^-)、盐或溶剂合物以及常规受保护形式。类似地，提到氨基基团包括氨基基团的质子化形式(-n⁺hr¹r²)、盐或溶剂合物，例如盐酸盐，以及氨基基团的常规受保护形式。类似地，提到羧基基团还包括其阴离子形式(-o^-)、盐或溶剂合物，以及常规受保护形式。

盐

制备、纯化和/或处理活性化合物的相应盐，例如药学上可接受的盐可能是方便或理想的。药学上可接受的盐的实例讨论于berge,等,j.pharm.sci.,66,1-19(1977)中。

例如，如果化合物为阴离子或具有可为阴离子的官能团(如，-cooh可为-coo^-)，那么盐可用合适的阳离子形成。适合的无机阳离子的实例包括但不限于碱金属离子诸如na⁺和k⁺、碱土阳离子诸如ca²⁺和mg²⁺以及其它阳离子如al⁺³。适合的有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即，nh4⁺)和取代的铵离子(如nh3r⁺、nh2r2⁺、nhr3⁺、nr4⁺)。一些适合的取代铵离子的实例为源自以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨基丁三醇以及氨基酸诸如赖氨酸和精氨酸。常见季铵离子的实例为n(ch3)4⁺。

如果化合物为阳离子或具有可为阳离子的官能团(如，-nh2可为-nh3⁺)，那么盐可用适合的阴离子形成。适合的无机阴离子的实例包括但不限于源自以下无机酸的那些：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。

适合的有机阴离子的实例包括但不限于源自以下有机酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、依地酸、乙二磺酸、乙磺酸、富马酸、葡萄庚酸、葡萄糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基马来酸、羟基萘羧基、羟基乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、泛酸、苯基乙酸、苯基磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸、三氟乙酸和戊酸。

适合的聚合有机阴离子的实例包括但不限于源自以下聚合酸的那些：鞣酸、羧甲基纤维素。

溶剂合物

可方便或可期望制备、纯化和/或处理活性化合物的相应溶剂合物。本文在常规意义上使用的术语“溶剂合物”是指溶质(如活性化合物、活性化合物的盐)和溶剂的复合物。如果溶剂为水，那么溶剂合物可合宜地指水合物，例如一水合物、二水合物、三水合物等。

本公开包括其中溶剂添加跨越pbd部分的亚胺键的化合物，其在下文中说明，其中溶剂是水或醇(r^aoh，其中r^a是c1-4烷基)：

这些形式可被称为pbd的甲醇胺和甲醇胺醚形式(如在涉及上述的r¹⁰的章节中描述)。这些平衡状态的平衡取决于化合物存在的条件以及部分本身的性质。

这些特定的化合物可例如通过冻干以固体形式分离。

异构体

本公开的某些化合物可以一种或多种特定的几何形式、光学形式、对映异构形式、非对映异构形式、差向异构形式、阿托异构(atropic)形式、立体异构形式、互变异构形式、构象形式或异头形式存在，包括但不限于顺式(cis)形式和反式(trans)形式；e-形式和z-形式；c-形式、t-形式和r-形式；内向形式和外向形式；r-形式、s-形式和内消旋形式；d-形式和l-形式；d-形式和l-形式；(+)形式和(-)形式；酮基形式、烯醇形式和烯醇化物形式；顺(syn)形式和反(anti)形式；向斜形式和背斜形式；α-形式和β-形式；轴向形式和平伏形式；船式、椅式、扭转式、信封式和半椅式；及其组合，在下文中总称为“异构体”(“异构体形式”)。

术语“手性”是指具有镜像伴侣的不可重叠(non-superimposability)特性的分子，而术语“非手性”是指在其镜像伴侣上可重叠的分子。

术语“立体异构体”是指具有相同化学组成，但是关于原子或基团在空间上的排列不同的化合物。

“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心并且其分子不是彼此的镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理特性，如熔点、沸点、光谱特性和反应性。可在高分辨率分析程序(诸如电泳和色谱)下可分离非对映异构体的混合物。

“对映异构体”是指化合物的彼此为不可重叠的镜像的两个立体异构体。

本文使用的立体化学定义和惯例一般遵循s.p.parker,编辑,mcgraw-hilldictionaryofchemicalterms(1984)mcgraw-hillbookcompany,newyork；及eliel,e.和wilen,s.,“stereochemistryoforganiccompounds”,johnwiley&sons,inc.,newyork,1994。本公开的化合物可含有不对称中心或手性中心，且因此以不同的立体异构形式存在。预期包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体以及其混合物例如外消旋混合物的本公开的化合物的所有立体异构形式，形成本公开的一部分。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们能够旋转平面偏振光的平面。在描述光学活性化合物时，前缀d和l，或r和s，用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)用于表示化合物的平面偏振光的旋转标记，其中用(-)或l表示化合物是左旋的。具有(+)或d前缀的化合物是右旋的。对于给定的化学结构，这些立体异构体是相同的，不同之处在于它们为彼此的镜像。还可以将特定的立体异构体称为对映异构体，以及此类异构体的混合物经常被称为对映异构体混合物。50:50的对映异构体混合物被称为外消旋混合物或外消旋物，其可以出现在化学反应或过程中一直没有立体选择性或立体特异性的情况下。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”是指两种没有光学活性的对映异构体种类的等摩尔混合物。

应注意，除了如下对于互变异构体形式所讨论，确切地从如本文所使用的术语“异构体”中排除的是结构(或构成)异构体(即原子之间的连接不同的异构体，而不是仅原子在空间中的位置不同)。例如，提到甲氧基-och3不被解释为提到其结构异构体羟甲基基团-ch2oh。类似地，提到邻-氯苯基不被解释为提到其结构异构体间-氯苯基。然而，提到一类结构很可能包括在所述种类内的结构异构体形式(如c1-7烷基包括正丙基和异丙基；丁基包括正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基；甲氧基苯基包括邻-甲氧基苯基、间-甲氧基苯基和对-甲氧基苯基)。

以上排除不涉及互变异构体形式，例如酮基形式、烯醇形式和烯醇化物形式，例如如在以下互变异构体对中：酮/烯醇(以下说明)、亚胺/烯胺、酰胺/亚氨基醇、脒/脒、亚硝基/肟、硫酮/烯硫醇、n-亚硝基/羟基偶氮基和硝基/异硝基。

术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指可经由低能量屏障来互相转化的不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称为质子移变互变异构体)包括经由质子迁移的互相转化，诸如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。原子价互变异构体包括通过使一些键合电子重组来互相转化。

注意，确切地包括在术语“异构体”中的是具有一个或多个同位素取代的化合物。例如，h可处于任何同位素形式，包括¹h、²h(d)和³h(t)；c可处于任何同位素形式，包括¹²c、¹³c和¹⁴c；o可处于任何同位素形式，包括¹⁶o和¹⁸o；等。

可以并入本公开的化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，诸如但不限于²h(氘，d)、³h(氚)、¹¹c、¹³c、¹⁴c、¹⁵n、¹⁸f、³¹p、³²p、³⁵s、³⁶cl和¹²⁵i。本公开的各种同位素标记的化合物，例如掺入放射性同位素(诸如3h、13c和14c)的那些。此类经同位素标记的化合物可用于代谢研究、反应动力学研究、检测或成像技术，诸如正电子发射断层扫描(pet)或单光子发射计算机断层扫描(spect)，包括药物或物质组织分布测定，或患者的放射性治疗中。本公开的氘标记或取代的治疗性化合物可具有与分布、代谢和分泌(adme)相关的改善的dmpk(药物代谢和药代动力学)性质。用更重的同位素诸如氘取代可提供由更佳的代谢稳定性产生的某些治疗优势(如体内半衰期增加或剂量需求减少)。18f标记的化合物可用于pet或spect研究。本公开的同位素标记的化合物及其前药可通常通过进行方案或实施例中公开的程序制备，和如下所述通过取代容易获得的同位素标记的试剂非同位素标记的试剂制备。此外，用更重的同位素(特别是氘(即2h或d))取代可提供由更佳的代谢稳定性产生的某些治疗优势，例如体内半衰期增加或剂量需求减少或治疗指数改善。应理解，在该背景中，氘被认为是取代基。此类更重的同位素(特别是氘)的浓度可被同位素浓集系数定义。在本公开的化合物，不特别指定为特定同位素的任何原子意在表示此原子的任何稳定的同位素。

除非另外说明，否则提到具体化合物包括所有所述异构体形式，包括(全部或部分)其外消旋混合物和其它混合物。用于制备(如不对称合成)和分离(如分级结晶和色谱手段)此类异构体形式的方法为本领域中已知的或通过以已知的方式调整本文所教导的方法或已知的方法而容易获得。

生物活性

体外细胞增殖测定

通常，抗体-药物缀合物(adc)的细胞毒性或细胞抑制活性可通过以下测量或确认：在细胞培养基中暴露哺乳动物细胞(包括具有和缺乏受体蛋白质的那两个)至adc的抗体；培养细胞持续约6个小时至约5天的时间段；并且测量细胞活力。基于细胞的体外测定用于测量本公开的adc的活力(增殖)、细胞毒性和诱导凋亡(半胱天冬酶活化)。

抗体-药物缀合物的体外效力可通过细胞增殖测定测量。celltiter-发光细胞存活力测定(celltiter-luminescentcellviabilityassay)可商购获得(promegacorp.,madison,wi)，基于鞘翅目(coleoptera)荧光素酶的重组表达的同质测定方法(美国专利no.5583024；5674713和5700670)。该细胞增殖测定基于存在的atp的定量(代谢活性细胞的指标)测定了培养中的活细胞的数目(crouch等(1993)j.immunol.meth.160:81-88；us6602677)。以96孔格式进行celltiter-测定，使得其适用于自动高通量筛选(hts)(cree等(1995)anticancerdrugs6:398-404)。同质测定程序涉及向于补充有血清的培养基中培养的细胞直接添加单一试剂(celltiter-试剂)。不需要细胞洗涤、去除培养基和多次吹打步骤。该系统在10分钟内在添加试剂和混合后以384-孔形式检测少至15个细胞/孔。可用adc连续处理细胞，或可处理它们并与adc分离。通常，经简单处理(即3小时)的细胞相似与连续处理的细胞相同的效力作用。

同质“加入-混合-测量(add-mix-measure)”模式导致细胞裂解并产生与存在的atp的量成比例的荧光信号。atp的量与在培养物中存在的细胞数成正比。celltiter-测定产生“辉光型”荧光信号(由荧光素酶反应产生)，其具有通常大于五小时的半衰期，这取决于细胞类型和所使用的培养基。活细胞以相对荧光单位(rlu)反映。底物，甲虫荧光素，通过重组的萤火虫荧光素酶氧化地脱羧，伴随的是atp转化为amp并且产生光子。

抗体-药物缀合物的体外效力还可通过细胞毒性测定测量。将培养的粘附细胞用pbs洗涤、用胰蛋白酶脱附、在含10％fcs的完全培养基中稀释、离心、重悬浮于新鲜培养基中并用血球计计数。将悬浮液培养物直接计数。适用于计数的单分散细胞悬浮液可需要通过重复吸取搅动悬浮液以打碎细胞团。

将细胞悬浮液稀释至所需的接种密度，并分配(100μl/孔)至黑色96孔板中。将粘附的细胞系的板孵育过夜以允许粘附。悬浮细胞培养可以在接种当天使用。

在适当的细胞培养基中制备adc(20μg/ml)的原液(1ml)。通过连续转移100μl至900μl的细胞培养基在15ml离心管中制备连续10倍稀释的储存adc。

将每个adc稀释液(100μl)的四个重复孔分配在预先铺有细胞悬浮液(100μl)的96孔黑板中，导致终体积为200μl。对照孔接受细胞培养基(100μl)。

如果细胞系的倍增时间大于30小时，则adc孵育5天，否则进行四天孵育。

在孵育期结束时，用阿拉玛蓝(alamarblue)测定评估细胞活力。将阿拉玛蓝(invitrogen)分配在整个板上(每孔20μl)并孵育4小时。在570nm激发下在585nm发射下在varioskan闪光读板仪上测量阿拉玛蓝荧光。百分比细胞存活率是由adc处理的孔中的平均荧光与对照孔中的平均荧光相比计算出的。

用途

本公开的缀合物可用于在靶位置处提供pbd化合物。

靶位置优选为增殖细胞群。抗体是增殖细胞群上存在的抗原(本文，cd25)的抗体。然而，如本文所解释，在本公开的实践中，在至少一些细胞中，在靶位置(通常赘生物)处，抗原不存在或以显著量存在于细胞表面上。例如，在靶赘生物中，仅如少于80、70、60、50、30、20％、10％或5％的细胞可为阳性的。

靶赘生物或赘生性细胞可为实体肿瘤的所有或一部分。

本文的“实体瘤”将被理解为包括实体血液学癌症，诸如淋巴瘤(霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin’slymphoma)或非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin’slymphoma))，其在下文中更详细地讨论。

其它实体瘤可为赘生物，包括被cd-25阳性t-细胞浸润的非-血液学癌症。

靶赘生物或赘生性细胞可为恶性的。

靶赘生物或赘生性细胞可为转移性的。

在靶位置处，接头可经裂解以释放化合物rela、relb、relc、reld或rele。因此，缀合物可用于选择性提供化合物rela、relb、relc、reld或rele至靶位置。

接头可被存在于靶位置的酶裂解。

靶位置可为体外、体内或离体。

本公开的抗体-药物缀合物(adc)化合物包括具有抗癌活性用途的那些。特别地，该化合物包括缀合至(即由接头共价连接)至pbd药物部分(即毒素)的抗体。当药物不缀合至抗体时，pbd药物具有细胞毒性作用。pbd药物部分的生物活性因此通过缀合至抗体调节。公开的抗体-药物缀合物(adc)选择性递送有效剂量的细胞毒性剂至肿瘤组织，从而可获得更佳的选择性，即更低的有效剂量。

本领域普通技术人员容易地能够确定候选缀合物是否治疗任何特定细胞类型的增生性疾患。例如，可以方便地用于评估由特定化合物提供的活性的测定在下面的实施例中描述。

术语“增生性疾病”涉及不需要的或不受控制的过量或异常细胞的细胞增殖，其是不期望的，诸如赘生性或过度生长，无论是体外还是体内。

增生性疾患的实例包括但不限于良性、恶性前和恶性细胞增殖，包括但不限于赘生物和肿瘤(如组织细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨瘤)、癌症(如肺癌、小细胞肺癌、胃肠癌、肠癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西肉瘤(kaposi'ssarcoma)、黑素瘤)、淋巴瘤、白血病、银屑病、骨病、(如结缔组织的)纤维增生性病症和动脉粥样硬化。特别感兴趣的癌症包括但不限于白血病和卵巢癌。

可以治疗任何类型的细胞，包括但不限于肺、胃肠(包括，如肠、结肠)、乳房(乳腺)、卵巢、前列腺、肝(肝的)、肾(肾的)、膀胱、胰腺、脑和皮肤。

特别感兴趣的病症包括但不限于霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤，包括弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡淋巴瘤(fl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、慢性淋巴细胞性淋巴瘤(cll)和白血病，诸如毛细胞性白血病(hcl)、毛细胞性白血病变体(hcl-v)、急性骨髓性白血病(aml)和急性成淋巴细胞性白血病(all)，诸如费城染色体阳性all(ph+all)或费城染色体阴性all(ph-all)[fieldinga.,haematologica.2010年1月；95(1):8-12]，

优选的血液学靶包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤，后者选自外周t细胞淋巴瘤；皮肤t细胞淋巴瘤；滤泡淋巴瘤(fl)、dlblc、套细胞淋巴瘤(mcl)和cll，

如上所述，其他实体瘤可以是被cd-25阳性t-细胞浸润的赘生物，包括非-血液学癌症。

预期本公开的抗体-药物缀合物(adc)可用于治疗各种疾病或病症，如特征在于肿瘤抗原的过表达。示例性疾患或过度增生性病症包括良性或恶性肿瘤；白血病、血液学恶性肿瘤和淋巴样恶性肿瘤。其它包括神经元、胶质细胞、星形胶质细胞、下丘脑、腺体、巨噬细胞、上皮、基质、囊胚腔、炎性、血管生成和免疫学，包括自身免疫病症和移植物抗宿主病(gvhd)。

通常，待治疗的疾病或病症是过度增生性疾病，诸如癌症。本文中待治疗的癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌)、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃癌(gastricorstomachcancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾癌(kidneyorrenalcancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。

adc化合物可用于治疗的自身免疫性疾病包括风湿病(诸如，例如类风湿关节炎、舍格伦综合征(syndrome)、硬皮病、狼疮(诸如sle合狼疮性肾炎)、多发性肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征和银屑病性关节炎)、骨关节炎、自身免疫性胃肠和肝脏病症(诸如，例如炎性肠病(如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(crohn'sdisease))、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎和乳糜泻)、血管炎(诸如，例如，anca相关的血管炎，包括丘-施二氏血管炎(churg-straussvasculitis)，韦格纳肉芽肿病(wegener'sgranulomatosis)和多发性动脉炎)、自身免疫性神经障碍(诸如，例如，多发性硬化症、囊性肌阵挛综合征、重症肌无力、眼神经性脊髓炎、帕金森病(parkinson’sdisease)、阿尔茨海默氏病(alzheimer’sdisease)和自身免疫性多发性神经病)、肾脏病症(诸如，例如肾小球性肾炎、古德帕斯特综合征(goodpasture’ssyndrome)和伯杰氏病(berger’sdisease))、自身免疫性皮肤病(诸如，例如，银屑病、荨麻疹、麻疹、寻常天疱疮、大疱性类天疱疮和天皮肤红斑狼疮(诸如，例如血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜和自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听力疾病(诸如，例如，内耳疾病和听力损失)、贝切特氏病(behcet'sdisease)、雷诺综合征(raynaud'ssyndrome)、器官移植、移植物抗宿主病(gvhd)和自身免疫性内分泌障碍(诸如，例如糖尿病相关的自身免疫疾病，诸如胰岛素依赖性糖尿病(iddm)、爱迪生病(addison’sdisease)和自身免疫性甲状腺疾病(如，格雷夫斯病(graves’disease)和甲状腺炎))。更优选地，此类疾病包括例如类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、anca相关的血管炎、狼疮、多发性硬化、舍格伦综合征、格雷夫斯病、iddm、恶性贫血、甲状腺炎和肾小球性肾炎。

治疗方法

本公开的缀合物可用于治疗方法中。还提供了治疗方法，其包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的本公开的缀合物化合物。术语“治疗有效量”是足以显示对患者的益处的量。此类益处可能至少改善至少一种症状。施用的实际量，以及施用的速度和时程将取决于所治疗的性质和严重程度。治疗处方，如剂量的决定，由全科医生和其它医师负责。

本公开的化合物可以单独施用或与其它治疗组合同时或依序施用，着取决于待治疗的疾患。治疗和疗法的实例包括但不限于化疗(包括药物、诸如化疗药物的活性物质的施用)；手术；和放射疗法。

“化疗剂”是用于治疗癌症的化合物，不论其作用机理如何。化疗剂的类别包括但不限于：烷基化剂、抗代谢物、纺锤毒植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂和激酶抑制剂。化疗剂包括用于“靶向疗法”和常规化疗的化合物。

化学治疗剂的实例包括：厄洛替尼(genentech/osipharm.)、多西他赛(sanofi-aventis)、5-fu(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，cas号51-21-8)，吉西他滨lilly)、pd-0325901(cas号391210-10-9,pfizer)、顺铂(顺式二胺，二氯铂(ii)，cas号15663-27-1)、卡铂(cas号41575-94-4)、紫杉醇(bristol-myerssquibboncology,princeton,n.j.)、曲妥珠单抗(genentech)、替莫唑胺(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺，cas号85622-93-1,scheringplough)、他莫昔芬((z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-n,n-二甲基乙胺、)和多柔比星akti-1/2、hppd和雷帕霉素。

化疗剂的更多实例包括：奥沙利铂(sanofi)、硼替佐米(millenniumpharm.)、索坦(su11248,pfizer)、来曲唑(novartis)、甲磺酸伊马替尼(novartis)、xl-518(mek抑制剂，exelixis,wo2007/044515)、arry-886(mek抑制剂，azd6244,arraybiopharma,astrazeneca)、sf-1126(pi3k抑制剂，semaforepharmaceuticals)、bez-235(pi3k抑制剂，novartis)、xl-147(pi3k抑制剂，exelixis)、ptk787/zk222584(novartis)、氟维司群(astrazeneca)、甲酰四氢叶酸(亚叶酸)，雷帕霉素(西罗莫司，wyeth)、拉帕替尼(gsk572016,glaxosmithkline)、洛那法尼(sarasar^tm,sch66336,scheringplough)、索拉非尼(bay43-9006,bayerlabs)、吉非替尼(astrazeneca)、伊立替康(cpt-11,pfizer)、替吡法尼(zarnestra^tm，johnson&johnson)，abraxane^tm(不含cremophor)、紫杉醇白蛋白工程纳米粒子制剂(americanpharmaceuticalpartners,schaumberg,ii)、凡德他尼(rinn,zd6474,astrazeneca)、瘤可宁、ag1478、ag1571(su5271；sugen)、替西罗莫司(wyeth)、帕唑帕尼(glaxosmithkline)、莰佛胺(telik)、噻替派和环磷酰胺)；烷基磺酸盐诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶诸如苯并多巴、卡泊酮、美妥多巴和脲多巴；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙烯磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三轻甲蜜胺；多聚乙酰(特别是牛油菌素和泡番枝辛)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；海绵他汀；cc-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物，kw-2189和cb1-tm1)；五加素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑素；氮芥，诸如氯氮芥、氯萘嗪、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲二氯二乙胺、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼昔维汀、曲洛磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、氟托西汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷尼司他啶；抗生素，诸如烯二炔抗生素(如卡里奇霉素、卡里奇霉素gamma1l、卡里奇霉素omegal1(angewchem.intl.ed.engl.(1994)33:183-186)；达内霉素、达内霉素a；二膦酸盐，诸如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素发色团和相关的发色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、奈莫柔比星、麻西罗霉素、丝裂霉素(诸如丝裂霉素c)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、卟霉素、泊非霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链球菌素、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、睾丸醇、前列腺素、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，诸如氨鲁米特、米托坦、三氟烷；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；倍他布群(bestrabucil)；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；类美登素，诸如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；多糖复合物(jhsnaturalproducts,eugene,or)；雷佐生；利索新；西索菲兰；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢菌烯(特别是t-2毒素、弗纳库林a、杆孢菌素a和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“ara-c”)；环磷酰胺；噻替派；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春花碱；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；卡培他滨(roche)；伊班膦酸盐；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类视色素，诸如视黄酸；及以上任一种的药学上可接受的盐、酸和衍生物。

“化疗剂”的定义中还包括了：(i)用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(serm)，包括例如他莫昔芬(包括柠檬酸他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、ly117018、奥那司酮和(柠檬酸托瑞米芬)；(ii)抑制酶芳香化酶的芳香化酶抑制剂，其调节肾上腺中雌激素产生，诸如，例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特、(醋酸甲地孕酮)、(依西美坦；pfizer)、福美坦、法倔唑、(伏氯唑)、(来曲唑；novartis)和(阿那曲唑；astrazeneca)；(iii)抗雄激素，诸如氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白质激酶抑制剂，诸如mek抑制剂(wo2007/044515)；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制异常细胞增殖中涉及的信号传导途径中的基因表达的那些，例如，pkc-α、raf和h-ras，诸如奥利默森(gentainc.)；(vii)核酸代酶，诸如vegf表达抑制剂(如)和her2表达抑制剂；(viii)疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如，和ril-2；拓扑异构酶1抑制剂，诸如rmrh；(ix)抗血管生成剂，诸如贝伐单抗(genentech)；及以上任一种的药学上可接受的盐、酸和衍生物。

“化疗剂”的定义中还包括了治疗性抗体，诸如阿仑单抗(campath)、贝伐单抗(genentech)；西妥昔单抗(imclone)；帕尼单抗(amgen)、利妥昔单抗(genentech/biogenidec)、奥法木单抗(gsk)、帕妥珠单抗(perjeta^tm,omnitarg^tm,2c4,genentech)、曲妥珠单抗(genentech)、托西莫单抗(bexxar,corixia)和抗体药物缀合物吉妥珠单抗奥唑米星(wyeth)。

具有于本公开的化合物组合作为化疗剂潜力的人源化单克隆抗体包括：阿仑单抗、阿泊珠单抗、阿塞珠单抗、阿利珠单抗、巴匹珠单抗、贝伐单抗、比伐珠单抗美登素(bivatuzumabmertansine)、莫坎妥珠单抗美登素(cantuzumabmertansine)、西赖珠单抗、聚乙二醇化赛妥珠单抗、cidfusituzumab、西妥珠单抗、达利珠单抗、依库丽单抗、依法利珠单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗、非维珠单抗、芳妥珠单抗、吉妥珠单抗奥佐米星、奥英妥珠单抗奥佐米星、伊匹单抗、拉贝珠单抗、林妥珠单抗、马妥珠单抗、美泊利单抗、莫维珠单抗、莫妥维珠单抗、那他珠单抗、尼妥珠单抗、诺洛维珠单抗、努马维珠单抗、奥美珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕考珠单抗、帕氟珠单抗、帕妥珠单抗、帕妥珠单抗、培克珠单抗、ralivizumab、兰尼单抗、瑞利珠单抗、瑞利珠单抗、热西维珠单抗、罗维珠单抗、鲁利珠单抗、西罗珠单抗、希普利珠单抗、索土珠单抗、他珠单抗替坦司(tacatuzumabtetraxetan)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗、替非珠单抗、托珠单抗、托利珠单抗、曲妥珠单抗、图考珠单抗西莫白介素、图库斯珠单抗、乌吗维珠单抗、乌珠单抗和维西珠单抗。

根据本公开的药物组合物和根据本公开的用途，除了活性成分(即缀合物化合物)之外还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它物质。此类材料应无毒，且不应干扰活性成分的功效。载体或其它材料的精确性质将取决于施用途径，其可以是经口，或通过注射，如皮肤、皮下或静脉内。

用于经口施用的药物组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂或液体形式。片剂可包含固体载体或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，诸如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇(诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)。胶囊剂可以包括固体载体，诸如明胶。

对于静脉内、皮肤或皮下注射或在痛苦部位注射，活性成分将呈胃肠外可接受的无热原且具有适合的ph、等渗性和稳定性的水溶液形式。本领域的相关技术人员完全能够使用例如等渗媒介物(氯化钠注射液、林格氏注射液(ringer'sinjection)、乳酸化林格氏注射液等)制备适合的溶液。根据需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。

制剂

尽管可能单独使用(如施用)缀合物化合物，但通常优选将其呈现为组合物或制剂。

在一个实施方案中，该组合物是包含如本文所述的缀合物化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物(如制剂、制备物、药剂)。

在一个实施方案中，该组合物是包含如本文所述的至少一种缀合物化合物连同本领域技术人员熟知的一种或多种其它药学上可接受的成分的药物组合物，所述药学上可接受的成分包括但不限于药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(如润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、调味剂和甜味剂。

在一个实施方案中，该组合物还包含其它活性剂，例如其它治疗剂或预防剂。

适合的载体、稀释剂、赋形剂等可见于标准药物文本中。参见，例如，handbookofpharmaceuticaladditives.第2版(编辑m.ash和i.ash),2001(synapseinformationresources,inc.,endicott,newyork,usa).remington'spharmaceuticalsciences.第20版,pub.lippincott,williams&wilkins,2000；和handbookofpharmaceuticalexcipients.第2版,1994。

如本文所用的术语“药学上可接受的”涉及化合物、成分、材料、组合物、剂型等，其在合理的医学判断范围内，适用于与正在考虑的受试者(如人)的组织接触而没有过多的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称。在与制剂的其它成分相容的意义上，每种载体、稀释剂、赋形剂等也必须是“可接受的”。

制剂可以通过药学领域熟知的任何方法制备。此类方法包括使活性化合物与构成一种或多种辅助成分的载体缔合的步骤。通常，制剂通过将活性化合物与载体(如液体载体、细分散固体载体等)均匀且紧密地缔合且然后如果有必要将产物成型来制备。

可制备制剂以提供快速或缓慢释放；立即、延迟、定时或持续释放；或其组合。

适用于胃肠外施用(如通过注射)的制剂包括水性或非水性、等渗、无热原的无菌液体(如溶液，悬浮液)，其中活性成分溶解、悬浮或以其他方式提供(如，在脂质体或其它微粒中)。此类液体可另外含有其它药学上可接受的成分，诸如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、助悬剂、增稠剂和使制剂与预期接受者的血液(或其它相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等。用于此类制剂的适合的等渗载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸化林格氏溶液。通常，液体中活性成分的浓度为约1ng/ml至约10μg/ml，例如约10ng/ml至约1μg/ml。制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器(如，安瓿和小瓶)中，并且可以储存在(冻干)条件下冷冻干燥，仅需要在使用之前立即加入无菌液体载体(如注射用水)。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。

剂型

本领域技术人员将理解，缀合物化合物和包含缀合物化合物的组合物的适当剂量可以随患者而变化。确定最佳剂量通常将涉及平衡治疗益处的水平与任何风险或有害副作用。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性，施用途径，施用时间，化合物排泄速率，治疗持续时间，其它组合使用的药物、化合物和/或材料，疾患的严重程度，以及患者的物种、性别、年龄、体重、情况、一般健康情况和先前的病史。化合物的量和施用途径最终将由医师、兽医或临床医生决定，尽管通常将选择剂量以在实现所需效果的位点获得局部浓度而不引起实质性的有害或不利的副作用。

在整个治疗过程中，可以以一个剂量连续或间歇地(如以适当间隔分开的剂量)实现施用。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随着用于治疗的制剂、治疗目的、被治疗的靶细胞和待治疗的受试者。单次或多次施用可以由治疗医师、兽医或临床医生选择的剂量水平和模式进行。

通常，适合的剂量的活性化合物的范围为每天每千克体重受试者约100ng至约25mg(更典型地约1μg至约10mg)。当活性化合物为盐、酯、酰胺、前药等时，所施用的量基于母体化合物计算，因此所使用的实际重量按比例增加。

在一个实施方案中，根据以下剂量方案向人患者施用活性化合物：约100mg，每天3次。

在一个实施方案中，根据以下剂量方案向人患者施用活性化合物：约150mg，每天2次。

在一个实施方案中，根据以下剂量方案向人患者施用活性化合物：约200mg，每天2次。

然而，在一个实施方案中，根据以下剂量方案向人患者施用缀合物化合物：约50或约75mg，每天3次或4次。

在一个实施方案中，根据以下剂量方案向人患者施用缀合物化合物：约100或约125mg，每天2次。

上述剂量量可以适用于缀合物(包括pbd部分和抗体的接头)或所提供的pbd化合物的有效量，例如在接头裂解后可释放的化合物的量。

为了预防或治疗疾病，本公开的adc的适当剂量将取决于如上定义的待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和过程、是否施用分子用于预防或治疗目的、以前的疗法、患者的临床史和对抗体的响应，以及主治医师的决定。该分子一次性或经一系列治疗适合地施用给患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(如0.1-20mg/kg)分子是施用给患者的初始候选剂量，无论例如通过一次或多次单独施用，或通过连续输注。根据上述因素，典型的日剂量可在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围内。待施用的患者的adc的示例性剂量在约0.1至约10mg/kg患者体重的范围内。对于数天或更久期间的反复施用，根据情况，治疗持续直至发生疾病症状的所需抑制。示例性的给药方案包括施用约4mg/kg的初始载量剂量，然后每周、每两周、每三周的额外剂量的adc的疗程。其它剂量方案可能是有用的。这种疗法的进展可以通过常规技术和测定来容易地监测。

治疗

如本文中在治疗疾患的情况下使用的术语“治疗”通常涉及治疗和疗法，无论是人还是动物(如在兽医应用中)，其中实现了一些期望的治疗效果，例如抑制病情进展，并且包括进展速度的下降、进展速度的停止、疾患的消退、疾患的改善和疾患的治愈。还包括作为预防措施(即预防、防止)的治疗。

如本文所用的术语“治疗有效量”涉及当根据期望的治疗方案施用时活性化合物或物质、包含活性化合物的组合物或剂型的可有效产生与合理的效益/风险比相称的一些期望的治疗效果的量。

类似地，如本文所用的术语“预防有效量”涉及当根据期望的治疗方案施用时活性化合物或物质、包含活性化合物的组合物或剂型的可有效产生与合理的效益/风险比相称的一些期望的预防效果的量。

受试者/患者

受试者/患者可以是动物、哺乳动物、胎盘哺乳动物、有袋类动物(如袋鼠、袋熊)、单孔类动物(如鸭嘴兽)、啮齿类动物(如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠类动物(如小鼠)、兔类动物(如兔子)、禽类(如鸟)、犬科动物(如狗)、猫科动物(如猫)、马科动物(如马)、猪科动物(如猪)、绵羊科动物(如绵羊)、牛科动物(如牛)、灵长类动物、类人猿(如猴或猿)、猴(如狨猴、狒狒)、猿(如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人。

此外，受试者/患者可以是其发育形式的任一种，例如胎儿。在一个优选的实施方案中，受试者/患者是人。

另外的偏好

以下偏好可以适用于如上所述的本公开的所有方面，或者可以涉及单个方面。偏好可以以任何组合组合在一起。

在一些实施方案中，r⁶’、r⁷’、r⁹’和y’优选地分别与r⁶、r⁷、r⁹和y相同。

二聚体连接

y和y’优选为o。

r”优选为无取代基的c3-7亚烷基基团。更优选地，r”是c3、c5或c7亚烷基。最优选地，r”是c3或c5亚烷基。

r⁶至r⁹

r⁹优选为h。

r⁶优选选自h、oh、or、sh、nh2、硝基和卤基，且更优选h或卤基，且最优选h。

r⁷优选选自h、oh、or、sh、sr、nh2、nhr、nrr’和卤基，且更优选地独立地选自h、oh和or，其中r优选选自经任选取代的c1-7烷基、c3-10杂环基和c5-10芳基基团。r可更优选为可经取代或可不经取代的c1-4烷基基团。感兴趣的取代基是c5-6芳基基团(如苯基)。在7-位处特别优选的取代基是ome和och2ph。其它特别感兴趣的取代基是二甲基氨基(即-nme2)；-(oc2h4)qome，其中q是0至2；含氮c6杂环基，包括吗啉代、哌啶基和n-甲基-哌嗪基。

这些偏好分别适用于r^9'、r^6'和r^7'。

r¹²

当在c2’与c3’之间存在双键时，r¹²选自：

(a)c5-10芳基基团，其被选自包括以下的基团的一个或多个取代基任选地取代：卤基、硝基、氰基、醚、c1-7烷基、c3-7杂环基和双-氧基-c1-3亚烷基；

(b)c1-5饱和脂肪族烷基；

(c)c3-6饱和环烷基；

(d)其中r²¹、r²²和r²³的每一个独立地选自h、c1-3饱和烷基、c2-3烯基、c2-3炔基和环丙基，其中r¹²基团中的碳原子的总数不超过5；

(e)其中r^25a和r^25b之一是h且另一个选自：苯基，所述苯基被选自以下的基团任选地取代：卤代甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基；和

(f)其中r²⁴选自：h；c1-3饱和烷基；c2-3烯基；c2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基被选自以下的基团任选地取代：卤代甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基。

当r¹²是c5-10芳基基团时，其可为c5-7芳基基团。c5-7芳基基团可为苯基基团或c5-7杂芳基基团，例如呋喃基、噻吩基和吡啶基。在一些实施方案中，r¹²优选为苯基。在其它实施方案中，r¹²优选为噻吩基，例如噻吩-2-基和噻吩-3-基。

当r¹²是c5-10芳基基团时，其可为c8-10芳基，例如喹啉基或异喹啉基基团。喹啉基或异喹啉基基团可以通过任何可用的环位结合到pbd核上。例如，喹啉基可以是喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4-基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基和喹啉-8-基。在这些中，喹啉-3-基和喹啉-6-基可以是优选的。异喹啉基可以是异喹啉-1-基、异喹啉-3-基、异喹啉-4-基、异喹啉-5-基、异喹啉-6-基、异喹啉-7-基和异喹啉-8-基。在这些中，可优选异喹啉-3-基和异喹啉-6-基。

当r¹²是c5-10芳基基团时，它可携带任何数量的取代基基团。优选地，它携带1至3个取代基基团，更优选1个和2个，且最优选单取代的基团。取代基可以是任何位置。

当r¹²是c5-7芳基基团时，单一取代基优选在不与化合物其余部分的键相邻的环原子上，即其优选为化合物其余部分的键的β或γ。因此，当c5-7芳基基团是苯基时，取代基优选在间位或对位，且更优选在对位。

当r¹²是c8-10芳基基团例如喹啉基或异喹啉基时，其可以在喹啉环或异喹啉环的任何位置处携带任何数目的取代基。在一些实施方案中，其携带一个、两个或三个取代基，并且这些取代基可以在近端和远环或两者上(如果多于一个取代基)。

r¹²取代基，当r¹²是c5-10芳基基团时

如果当r¹²是c5-10芳基基团时r¹²上的取代基是卤基，其优选为f或cl，更优选cl。

如果当r¹²是c5-10芳基基团时r¹²上的取代基是醚，其在一些实施方案中可为烷氧基基团，例如c1-7烷氧基基团(如甲氧基、乙氧基)，或者其在一些实施方案中可为c5-7芳氧基基团(如苯氧基、吡啶基氧基、呋喃基氧基)。烷氧基基团本身可例如被氨基基团(如二甲基氨基)进一步取代。

如果当r¹²是c5-10芳基基团时r¹²上的取代基是c1-7烷基，其可优选为c1-4烷基基团(如甲基、乙基、丙基、丁基)。

如果当r¹²是c5-10芳基基团时r¹²上的取代基是c3-7杂环基，其在一些实施方案中可为c6含氮杂环基基团，如吗啉代、硫代吗啉代、哌啶基、哌嗪基。这些基团可经由氮原子结合至pbd部分的剩余部分。这些基团可被例如c1-4烷基基团进一步取代。如果c6含氮杂环基基团是哌嗪基，所述另外的取代基可在第二氮环原子上。

如果当r¹²是c5-10芳基基团时r¹²上的取代基是双-氧基-c1-3亚烷基，这优选为双-氧基-亚甲基或双-氧基-亚乙基。

如果当r¹²是c5-10芳基基团时r¹²上的取代基是酯，这优选为甲酯或乙酯。

当r¹²是c5-10芳基基团时，特别优选的取代基包括甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、双-氧基-亚甲基、甲基-哌嗪基、吗啉代和甲基-噻吩基。r¹²的其它特别优选的取代基是二氨基丙基氧基和羧基。

当r¹²是c5-10芳基基团时，特别优选的经取代的r¹²基团包括但不限于4-甲氧基-苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-双氧基亚甲基-苯基、4-甲基噻吩基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基和喹啉-6-基、异喹啉-3-基和异喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基和萘基。另一个可能的经取代的r¹²基团是4-硝基苯基。特别感兴趣的r¹²基团包括4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基和3,4-双氧基亚甲基-苯基。

当r¹²是c1-5饱和脂肪族烷基时，其可为甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。在一些实施方案中，其可为甲基、乙基或丙基(正戊基或异丙基)。在这些实施方案的一些中，其可为甲基。在其它实施方案中，其可为丁基或戊基，其可为直链或支链。

当r¹²是c3-6饱和环烷基时，其可为环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在一些实施方案中，其可为环丙基。

当r¹²是时，r²¹、r²²和r²³的每一个独立地选自h、c1-3饱和烷基、c2-3烯基、c2-3炔基和环丙基，其中r¹²基团中的碳原子的总数不超过5。在一些实施方案中，r¹²基团中的碳原子的总数不超过4或不超过3。

在一些实施方案中，r²¹、r²²和r²³之一是h，且另两个基团选自h、c1-3饱和烷基、c2-3烯基、c2-3炔基和环丙基。

在其它实施方案中，r²¹、r²²和r²³中的两者是h，且另一个基团选自h、c1-3饱和烷基、c2-3烯基、c2-3炔基和环丙基。

在一些实施方案中，并非为h的基团选自甲基和乙基。在这些实施方案的一些中，并非为h的基团是甲基。

在一些实施方案中，r²¹是h。

在一些实施方案中，r²²是h。

在一些实施方案中，r²³是h。

在一些实施方案中，r²¹和r²²是h。

在一些实施方案中，r²¹和r²³是h。

在一些实施方案中，r²²和r²³是h。

特别感兴趣的r¹²基团是：

当r¹²是时，r^25a和r^25b之一是h且另一个选自：苯基，所述苯基被选自以下的基团任选地取代：卤基、甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基。在一些实施方案中，并非为h的基团为经任选取代的苯基。如果苯基任选的取代基是卤基，其优选为氟。在一些实施方中，苯基基团未经取代。

当r¹²是时，r²⁴选自：h；c1-3饱和烷基；c2-3烯基；c2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基被选自以下的基团任选地取代：卤代甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基。如果苯基任选的取代基是卤基，其优选为氟。在一些实施方中，苯基基团未经取代。

在一些实施方案中，r²⁴选自h、甲基、乙基、乙烯基和乙炔基。在这些实施方案的一些中，r²⁴选自h和甲基。

当在c2’与c3’之间存在单键时，

r¹²是其中r^26a和r^26b独立地选自h、f、c1-4饱和烷基、c2-3烯基，所述烷基和烯基基团被选自c1-4烷基酰氨基和c1-4烷基酯的基团任选地取代；或者，当r^26a和r^26b之一是h时，另一个选自腈和c1-4烷基酯。

在一些实施方案中，优选地r^26a和r^26b都是h。

在其它实施方案中，优选地r^26a和r^26b都是甲基。

在另外的实施方案中，优选地r^26a和r^26b之一是h且另一个选自c1-4饱和烷基、c2-3烯基，所述烷基和烯基基团经任选地取代。在这些另外的实施方案中，可能进一步优选的是并非为h的基团选自甲基和乙基。

r²

r¹²的以上偏好同样适用于r²。

r²²

在一些实施方案中，r²²具有式iia。

当其具有式iia时，r²²中的a可为苯基基团或c5-7杂芳基基团，例如呋喃基、噻吩基和吡啶基。在一些实施方案中，a优选为苯基。

q²-x可在c5-7芳基基团的任何可用环原子上，但优选在不与化合物剩余部分的键相邻的环原子上，即其优选为与化合物的剩余部分的键的β或γ。因此，当c5-7芳基基团(a)是苯基时，取代基(q²-x)优选在间位或对位，且更优选在对位。

在一些实施方案中，q¹是单键。在这些实施方案中，q²选自单键和-z-(ch2)n-，其中z选自单键、o、s和nh且为1至3。在这些实施方案的一些中，q²是单键。在其它实施方案中，q²是-z-(ch2)n-。在这些实施方案中，z可为o或s且n可为1或n可为2。在这些实施方案的其它中，z可为单键且n可为1。

在其它实施方案中，q¹是-ch＝ch-。

在其它实施方案中，r²²具有式iib。在这些实施方案中，r^c1、r^c2和r^c3独立地选自h和未取代的c1-2烷基。在一些优选的实施方案中，r^c1、r^c2和r^c3都为h。在其它实施方案中，r^c1、r^c2和r^c3都为甲基。在某些实施方案中，r^c1、r^c2和r^c3独立地选自h和甲基。

x是选自包括以下的列表的基团：o-r^l2’、s-r^l2’、co2-r^l-2’、co-r^l2’、nh-c(＝o)-r^l2'、nhnh-r^l2'、conhnh-r^l2'、nrⁿr^l2'，其中rⁿ选自包括h和c1-4烷基的基团。x可优选为：oh、sh、co2h、-n＝c＝o或nhrⁿ，且可更优选：o-r^l2'、s-r^l2'、co2-r^l2'、-nh-c(＝o)-r^l2'或nh-r^l2'。特别优选的基团包括：o-r^l2’、s-r^l2’和nh-r^l2'，且nh-r^l2'为最优选的基团。

在一些实施方案中、r²²具有式iic。在这些实施方案中，优选地q是nrn-r^l2’。在其它实施方案中，q是o-r^l2’。在另外的实施方案中，q是s-r^l2’。rⁿ优选选自h和甲基。在一些实施方中，rⁿ是h。在其它实施方案中，rⁿ是甲基。

在一些实施方案中，r²²可为-a-ch2-x和-a-x。在这些实施方案中，x可为o-r^l2'、s-r^l2’、co2-r^l2’、co-r^l2’和nh-r^l2’。在特别优选的实施方案中，x可为nh-r^l2’。

r¹⁰、r¹¹

在一些实施方案中，r¹⁰和r¹¹在它们结合的氮与碳原子之间一起形成双键。

在一些实施方案中，r¹¹是oh。

在一些实施方案中，r¹¹是ome。

在一些实施方案中，r¹¹是sozm，其中z是2或3且m是单价药学上可接受的阳离子。

r^11a

在一些实施方案中，r^11a是oh。

在一些实施方案中，r^11a是ome。

在一些实施方案中，r^11a是sozm，其中z是2或3且m是单价药学上可接受的阳离子。

r²⁰、r²¹

在一些实施方案中，r²⁰和r²¹在它们结合的氮与碳原子之间一起形成双键。

在一些实施方案中，r²⁰是h。

在一些实施方案中，r²⁰是r^c。

在一些实施方案中，r²¹是oh。

在一些实施方案中，r²¹是ome。

在一些实施方案中，r²¹是sozm，其中z是2或3且m是单价药学上可接受的阳离子。

r³⁰、r³¹

在一些实施方案中，r³⁰和r³¹在它们结合的氮与碳原子之间一起形成双键。

在一些实施方案中，r³¹是oh。

在一些实施方案中，r³¹是ome。

在一些实施方案中，r³¹是sozm，其中z是2或3且m是单价药学上可接受的阳离子。

m和z

优选地m是单价药学上可接受的阳离子且更优选na⁺。

z优选为3。

本公开的第一方面的优选的缀合物可具有式ia的d^l：

其中

r^l1’、r²⁰和r²¹如上所定义；

n是1或3；

r^1a是甲基或苯基；且

r^2a选自：

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)和

(h)

本公开的第一方面的优选的缀合物可具有式ib的d^l：

其中

r^l1’、r²⁰和r²¹如上所定义；

n是1或3；且

r^1a是甲基或苯基。

本公开的第一方面的优选的缀合物可具有式ic的d^l：

其中r^l2’、r¹⁰、r¹¹、r³⁰和r³¹如上所定义

n是1或3；

r^12a选自：

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)和

(h)

氨基基团处于苯基基团的间位或对位。

本公开的第一方面的优选的缀合物可具有式id的d^l：

其中r^l2’、r¹⁰、r¹¹、r³⁰和r³¹如上所定义

n是1或3；

r^1a是甲基或苯基；

r^12a选自：

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)和

(h)

本公开的第一方面的优选的缀合物可具有式ie的d^l：

其中r^l2’、r¹⁰、r¹¹、r³⁰和r³¹如上所定义

n是1或3；

r^1a是甲基或苯基；

r^12a选自：

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)和

(h)

附图

图1.通过流式细胞术在伴刀豆球蛋白-a激活的cd25阳性人pbmc上测定adct-301对人cd25的亲和力。通过在通道fl1h中测量中值荧光强度(mfi)，在整个稀释系列的cd25-pe(藻红蛋白)门中评估adct-301-fitc结合。同型非靶向adc-fitc用作非结合adc对照。ec50为≈0.03μg/ml(180pm)。

图2.如通过mts细胞增殖测定测量，在六个淋巴瘤细胞系上adct-301的体外细胞毒性。将细胞用增加浓度的adct-301孵育96小时。数据表示为平均值±sd

图3.用1或10ng/ml的adct-301处理cd25阴性伯基特淋巴瘤(burkittlymphoma)ramos细胞和cd25阳性karpas299细胞的单一培养物和共培养物96小时。直方图描述了如通过流式细胞术测量的活细胞类群的百分比。

图4.描绘用1或10ng/ml的adct-301(图4a)或非结合adc(图4b)处理的cd25-阴性伯基特淋巴瘤ramos细胞和cd25阳性karpas299的单一培养物和共培养物孔中活细胞％的直方图。

图5.通过体外条件培养基转移证实cd25-ve旁观者细胞毒性。如通过mts细胞增殖测定测定adct-301对cd25阴性伯基特淋巴瘤ramos细胞和cd25阳性karpas299细胞的体外细胞毒性。数据表示为平均值±sd。图5a显示adct-301的细胞毒性或者与ramos或karpas细胞的非结合性adc。图5b显示转移adct-301条件培养基后cd25阴性伯基特淋巴瘤ramos细胞的细胞毒性。图5c显示转移非结合性adc条件培养基后cd25-阴性伯基特淋巴瘤ramos细胞的细胞毒性。

图6.通过体外条件培养基转移用可裂解的接头对比不可裂解的接头观察的cd25-ve旁观者细胞毒性的比较。发现cd25阳性sudhl-1细胞对用adct-301(可裂解的接头)和nc-1(具有不可裂解的接头的ant-cd25adc)治疗同样敏感。图6显示转移adct-301条件培养基后cd25阴性伯基特淋巴瘤ramos细胞的细胞毒性，但不是nc-1条件培养基转移后的细胞毒性。误差条表示3个独立重复的细胞活力％±sd

实施例

实施例1：adc的旁观者效应

血液学恶性肿瘤中的il2r-a

白细胞介素-2受体-α(il2r-α,cd25)是组成il2r的异三聚体之一。它在自身免疫性和移植排斥的发病中涉及的信号转导途径中起关键作用(burchill等immunollett2007)。

cd25在许多血液学恶性肿瘤(srivastava等leuklymphoma1994)中表达，包括b和t细胞淋巴瘤、atll和毛细胞白血病。

在整个肿瘤细胞群体中，恶性肿瘤中cd25的表达通常不同质。其中已知cd25表达异质的赘生性疾病的非限制性实例包括外周t细胞淋巴瘤；皮肤t细胞淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤；弥漫性大b细胞淋巴瘤和滤泡淋巴瘤；急性骨髓性白血病(aml)；慢性淋巴细胞性白血病等。(参见cerny,jan,等"expressionofcd25independentlypredictsearlytreatmentfailureofacutemyeloidleukaemia(aml)."britishjournalofhaematology160.2(2013):262-266；fujiwara,shin-ichiro,等"clinicalfeaturesofdenovocd25-positivefollicularlymphoma."leukemia&lymphoma55.2(2014):307-313；intlekofer,andrewm.和anasyounes."fromempirictomechanism-basedtherapyforperipheraltcelllymphoma."internationaljournalofhematology99.3(2014):249-262；olsen,elise,等"pivotalphaseiiitrialoftwodoselevelsofdenileukindiftitoxforthetreatmentofcutaneoust-celllymphoma."journalofclinicaloncology19.2(2001):376-388；shvidel,lev,等"cellsurfaceexpressionofcd25antigen(surfaceil-2receptoralpha-chain)isnotaprognosticmarkerinchroniclymphocyticleukemia:resultsofaretrospectivestudyof281patients."annalsofhematology91.10(2012):1597-1602；strauchen,j.a.和basbreakstone."il-2receptorexpressioninhumanlymphoidlesions.immunohistochemicalstudyof166cases."theamericanjournalofpathology126.3(1987):506。

cd25表达增加与不良预后之间的关系(yoshida等plosone2013)已得到明确，并且提出了使用抗cd25抗体将细胞毒素递送给患者中的这些细胞的可能性。cd25阳性恶性肿瘤治疗概念的临床证据以前使用利用抗体巴利昔单抗和达利珠单抗的放射免疫缀合物(dancey等clincancerres2009)和免疫毒素(kreitman等jclinoncol2000)确认。

此外，已知在许多类型的肿瘤(包括非血液学来源的肿瘤)中，存在激活的t细胞，包括cd25+vet细胞(参见，通过非限制性实例来说，galon,等"type,density,andlocationofimmunecellswithinhumancolorectaltumorspredictclinicaloutcome."science313.5795(2006):1960-1964.；zhang,lin,等"intratumoraltcells,recurrence,andsurvivalinepithelialovariancancer."newenglandjournalofmedicine348.3(2003):203-213)。在至少一些情况下，据信这些所谓的“肿瘤浸润性淋巴细胞”(til)影响预后，但是无论如何，本申请的发现证明公开的化合物在这些适应症中的用途。

在该实施例中，我们表征了由重组人igg1组成的“adct-301”、针对连接至吡咯并苯并二氮杂pbd弹头的人cd25的-tac的体外作用机制及体内功效和耐受性。药物-抗体比为2.3±0.3。adct-301是wo2014/57119的humax-tac-e

通过对伴刀豆球蛋白a-激活的cd25阳性淋巴细胞的流式细胞术，测量adct-301的相对结合亲和力。表面等离子体共振(spr,biacore)用于测量-tac和adct-301对连接到金表面的重组scd25胞外域的结合亲和力和结合动力学。

通过流式细胞术测定测定各种淋巴瘤细胞系的cd25和cd30的细胞表面蛋白质拷贝数。通过细胞增殖测定(mts)测定这些细胞系上adct-301的细胞毒性，以确定cd25拷贝数与体外细胞毒性效应之间是否存在相关性。

为了确定adct-301是否具有对非cd25表达细胞的旁观者效应，在存在或不存在adct-301或非靶向对照adc的情况下，将cd25阳性karpas299细胞与pkh26标记的cd25阴性ramos细胞共培养96小时。读出是karpas299和ramos细胞数和这些细胞的活力，这两者都是通过流式细胞术测定的。

使用adct-301和自由弹头进行单细胞凝胶电泳(comet)测定，以确认adct-301的作用模式并确定dna交联的动力学。将细胞暴露2小时，洗涤，然后在新鲜培养基中培养一段时间。可替代地，为了评价剂量响应，将细胞用adct-301或游离弹头处理2小时，洗涤并在新鲜培养基中再培养24小时。

在体内，证实的adct-301作为单次剂量在su-dhl-1和karpas299异种移植物及转移模型中作为单剂量施用，并与单次和重复的adcetris^tm给药方案进行比较。在未携带肿瘤的scid小鼠中测定mtd。

结果

adct-301对人cd25的亲和力

来自流式细胞术和spr的数据表明激活的人pbmc和人重组cd25胞外域对裸体抗体及其相应的adc具有高亲和力(图1)

表1.在整个具有固定在其表面上的可溶性cd25胞外域的cm3芯片上运行数次adct-301和-tac的稀释系列数次。使用软件计算两种分子的平衡解离常数kd。adct-301显示对scd25胞外域具有极其高的(皮摩尔)亲和力

adct-301的靶向细胞毒性

adct-301针对cd25表达的间变性大细胞淋巴瘤系和霍奇金氏淋巴瘤细胞系具有有效的细胞毒性。虽然cd25表达为对adct-301的敏感性所必需的，但gi50与拷贝数仅弱负相关(皮尔森相关系数(pearson’scorrelationcoefficient)r＝-0.37)(图2)。

表2.对六个细胞系的adct-301的gi50及其与拷贝数的关系。

旁观者效应

当与对单独培养的ramos相同的暴露相比时，cd25阳性karpas299和cd25阴性细胞ramos共培养物的96小时adct-301暴露证明了特异性旁路杀伤ramos细胞(图3；图4)。ramos细胞是伯基特淋巴瘤的人b淋巴细胞。

旁观者细胞毒性也在条件培养基转移实验中观察到。在这些实验中，进行(a)cd25阴性细胞ramos细胞或(b)cd25阳性karpas299与adct-301的前48小时培养。当该第一次培养完成时，将培养物离心并将50μl上清液培养基转移到50μl新鲜制备的(a)cd25阴性细胞ramos细胞或(b)c025-阳性karpas299的培养物中。该第二次培养进行96小时，然后通过mts测定评估细胞毒性。

图5b显示对通过用adct-301培养cd25+vekarpas299细胞调节的培养基的cd25-veramos细胞的有效细胞毒性；通过用adct-301培养cd25-veramos细胞调节的培养基不导致任何可观察到的细胞毒性增加高于图5a所示的细胞毒性。

接头可裂解性的影响

在条件培养基转移实验中研究了接头可裂解性的影响。在这些实验中，使用(1)adct-301(可裂解的接头)或(2)nc-1(由重组人lgg1、针对连接至吡咯并苯并二氮杂pbd弹头的人cd25的-tac与根据本公开的可替代方面的不可裂解的的接头组成)进行cd25-阳性sudhl-1细胞的前48小时培养。

当第一次培养完成后，将培养物离心并将50μl上清液培养基转移到50μl新鲜制备的cd25阴性细胞ramos细胞培养物中。进行该第二次培养96小时，然后通过mts测定评估细胞毒性。

图6显示转移adct-301(可裂解的接头)条件培养基后cd25-阴性伯基特淋巴瘤ramos细胞的细胞毒性，但不是在nc-1(不可裂解的接头)条件培养基转移后的细胞毒性。误差条表示3个独立重复的细胞活力％±sd

序列

seqidno.1(ab12vh):

qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfsryiinvwrqapgqglewmgriipilgvenya

qkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarkdwfdywgqgtlvtvssastkgpsvfpla

seqidno.2(ab12vl):

eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrf

sgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspltfgggtkveikrtvaapsvfifp

seqidno.3(vhcdr1):

ryiin

seqidno.4(vhcdr2):

riipilgvenyaqkfqg

seqidno.5(vhcdr3):

kdwfdy

seqidno.6(vlcdr1):

rasqsvssyla

seqidno.7(vlcdr2):

gassrat

seqidno.8(vlcdr3):

qqygssplt

sequencelisting

<110>adctherapeuticssarl

medimmunelimited

<120>吡咯并苯并二氮杂卓-抗体缀合物

<130>rka/fp7164163

<150>gb1420910.0

<151>2014-11-25

<160>8

<170>patentin版本3.3

<210>1

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<212>prt

<213>智人

<400>1

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser

151015

servallysvalsercyslysalaserglyglythrpheserargtyr

202530

ileileasntrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet

354045

glyargileileproileleuglyvalgluasntyralaglnlysphe

505560

glnglyargvalthrilethralaasplysserthrserthralatyr

65707580

metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaarglysasptrppheasptyrtrpglyglnglythrleuvalthr

100105110

valserseralaserthrlysglyproservalpheproleuala

115120125

<210>2

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<212>prt

<213>智人

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gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaserglnservalsersertyr

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354045

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505560

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65707580

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<213>智人

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gly

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glnglntyrglyserserproleuthr

15