本发明涉及含有两亲性聚合物的自组装颗粒，其制备方法及其治疗和/或诊断用途。本发明还涉及所述两亲性聚合物及其制备方法。
背景技术：
近年来基于靶-特异性聚合载体的药物输送和诊断系统已经越来越引人关注。
靶向药物递送涉及许多优势，所述靶向药物递送即将治疗药物递送至特定组织或疾病细胞。通过靶向途径，可降低或避免系统性毒性；还可降低药物剂量。还可以克服另外有效的候选药物的溶解性差的问题。聚合物药物输送系统的使用还在以下方面具有优势：它们可保留并流通更长的时间，由此避免活性药剂通常从身体内快速的清除。关于诊断剂的靶向递送，将显像剂定位于特定器官或组织类型进行改良可实现更加确定的诊断。
基于peg(聚乙二醇)聚合物的药物输送是聚合物药物输送系统中的一个实例。已经研发出peg-聚合物-缀合的小分子药物或生物药物具有许多改良的特性，例如药物溶解性的提高、半衰期的延长、细胞毒性低以及免疫原性的降低。虽然在一定程度上peg仍然是基于聚合物的生物医药应用的金标准，但是这种聚合物具有一些缺点和限制。例如，在多个实例中已观察到过敏症和peg抗体的形成。尤其是，peg具有有限可供正常末端官能化修饰或正交官能化修饰的官能团。
对其它聚合物系统也已进行过研究，例如基于聚-2-噁唑啉(也简称pox)的那些聚合物系统。可将这种类型的聚合物用于生物医药应用，因为发现它们总体上是生物兼容的，并且此外，趋向具有免疫学‘隐形作用’(即非特异结合性)，由此避免免疫防御系统识别和快速清除。
目前，含有聚-2-噁唑啉结构元素的两亲性聚合系统已经得到研发。
例如，us2008/0305149描述了两亲性三嵌段共聚物的制备及其在制备具有粘膜粘附性外表面的囊泡中的用途，所述共聚物包括聚-2-甲基噁唑啉和聚二甲基硅氧烷片段(即聚(2-甲基噁唑啉)-嵌段-聚(二甲基硅氧烷)-嵌段-聚(2-甲基噁唑啉)三嵌段聚合物，或简称为pmoxa-pdms-pmoxa)。该专利文献描述这种囊泡可用于输送封装在该囊泡中的活性试剂。但是这种囊泡不易被改良成用于靶向的药物输送。另外，用于制备所述囊泡的两亲性聚合物在进一步官能团化的选择方面受到限制。
broz等(j.control.release2005(102)475-488)描述了同样基于pmoxa-pdms-pmoxa两亲性聚合物的纳米容器。在该实例中，两亲性聚合物的末端被生物素官能团化。使用生物素配体将纳米容器连到受体特异性配体(用链霉亲和素作为轴销)，所述受体特异性配体即同样生物素化的聚鸟苷酸(polyg)寡核苷酸。虽然生物素-链霉亲和素结合较强，但该结合不是不可逆的；对于体内应用而言这种连接也并不是最合适的。
因此，本发明的目的在于引入新型聚-2-噁唑啉两亲性聚合物和共聚物以用于自组装颗粒的制备，并克服现有聚合物系统的限制和缺陷。另一目的是可用于靶向治疗药物或诊断试剂输送的自组装颗粒的研发。
技术实现要素：
一方面，本发明涉及包括通式(i)两亲性聚合物的自组装
颗粒，通式(i)为：
b-(l0-a-z)n
其中，n为1或2；
b为疏水性聚硅氧烷片段；
l0为二价连接片段；
a为亲水性聚-2-噁唑啉共聚物片段；并且
其中，z为末端基团或缀合至配体的连接基团。
具体而言，本发明提供了自组装颗粒，例如包括通式(i)两亲性聚合物的胶束，所述胶束可用于靶向输送治疗药物或诊断剂。一方面，所述自组装颗粒可包括通式(i)两亲性聚合物，通式(i)两亲性聚合物包括可用于靶向特异细胞和组织的受体-特异性配体。另一方面，所述自组装颗粒包括通式(i)两亲性聚合物，通式(i)两亲性聚合物与治疗剂或诊断剂缀合。又一方面，自组装颗粒适合用于基因输送和基因治疗，并包括通式(i)的两亲性聚合物，此通式(i)的两亲性聚合物含有基于胺的官能团。
本发明还涉及包含与通式(ii)的两亲性聚合物组合的通式(i)的两亲性聚合物的自组装颗粒，通式(ii)为：
b-(l0-c-z)n
其中，n为1或2；
b为疏水性聚硅氧烷片段；
l0为二价连接片段；
c为亲水性聚-2-噁唑啉同聚物片段；
并且其中，z为末端基团或与配体缀合的连接基团。一方面，本发明的自组装颗粒还可包括至少一种其中z为末端基团的通式(ii)的两亲性聚合物和至少一种其中z为与连接基团缀合的配体的通式(ii)的两亲性聚合物。
另一方面，本发明涉及胶束或囊泡形式的自组装颗粒。
在还有的一个方面，本发明涉及通式(i)的两亲性聚合物和其制备的方法。
具体实施方式
在第一方面，本发明涉及包括通式(i)的两亲性聚合物的自组装颗粒，通式(i)为：
b-(l0-a-z)n
其中，n为1或2；
b为疏水性聚硅氧烷片段；
l0为二价连接片段；
a为亲水性聚-2-噁唑啉共聚物片段；并且
其中，z为末端基团或缀合至配体的连接基团。
如本文所理解的自组装颗粒是指包括一种或一种以上双亲性聚合物的结构，并且所述自组装颗粒是由于所述聚合物和水性主体溶液之间的吸引力和排斥力平衡而形成的。自组装是指这种聚合物聚集以最小化并优化疏水界面效应。由于聚集在一起，并且由于亲水性组分自身之间分子相互作用(例如，位阻排斥)，因而可形成可定义结构的颗粒。一般而言，从自由溶解状态到聚集为颗粒需要最低浓度双亲分子(通常称为最低聚集浓度)。如本文所理解的，术语颗粒是指由双亲分子聚集形成的任何类型的可定义结构，包括但不限于胶束和囊泡，及其形态学变体中的任何一种。特别优选的是胶束形式的自组装颗粒。
本文使用的术语两亲性聚合物是指包括对水或水性环境具有亲和力的结构元素以及对非极性、疏水或脂类环境具有亲和力的结构元素的聚合物。一般而言，两亲性聚合物或两亲性化合物包括至少一个亲水基团和至少一个疏水(或亲脂)基团。该疏水片段更易溶于非极性溶剂(与水相比)或更易被非极性溶剂(与水相比)润湿，所述非极性溶剂例如烃类。另一方面，亲水性片段的特性对极性较强的环境具有更高的亲和力，并且一般更易被水润湿或溶于水。
此外，聚合物为通过两个或两个以上重复单元或单体化学结合形成的化合物。如本文使用的，共聚物是指由两个或两个以上不同单体衍生得到的聚合物，而同聚物是指由单个重复单体单元组成的聚合物。术语嵌段共聚物或嵌段聚合物是指由至少两个不同共聚物片段组成，其中每一聚合物片段一般包含两个或两个以上相邻的同类单元或单体的聚合物。
在一种实施方式中，通式(i)的两亲性共聚物包括一个疏水聚硅氧烷片段b和一个亲水共聚物片段a；换言之，n为整数1。更优选地，n为整数2，由此通式(i)的两亲性共聚物包括一个疏水聚硅氧烷片段b和两个亲水共聚物a片段，即(z-a-l0)-b-(l0-a-z)。
更具体地，所述疏水聚硅氧烷片段b可为通式(iii)的聚硅氧烷，通式(iii)为
其中，j为从5-1000的整数；并且其中，r4,r5,r6,r7中的80-100％相互独立地为c1-c10烷基，且r4,r5,r6,r7中的0-20％相互独立地为c3-c12烯基，非取代c1-c4烷基-或c1-c4烷氧基-取代的苯基，氟代(c1-c18烷基)，或氰基(c1-c12烷基)。
优选地，j为从10至300的整数。在具体实施方式中，j为从10至150的整数。
优选地，r4,r5,r6,r7中的90-100％独立地选自具有多达6个碳，特别地，多达4个碳的烷基。
在另一实施方式中，r4,r5,r6,r7中的0-10％独立地选自c3-c8烯基、非经取代的或甲基-、乙基-、甲氧基-或乙氧基-取代的苯基、氟代(c1-c8烷基)或氰基(c1-c4烷基)。
在具体的优选实施方式中，r4,r5,r6,r7全为甲基或全为乙基，即所述疏水聚硅氧烷片段b选自聚二甲基硅氧烷或聚二乙基硅氧烷，其中，优选地，所述片段包括10至150个单体单元。
二价连接基团片段l0提供将疏水聚硅氧烷片段b共价连接至亲水聚-2-噁唑啉共聚物片段a的方式。
可与术语连接(linkage)、连接元素或间隔区互换的术语连接基团(linker)在本文中涉及到聚合物、配体或任何其它化学实体使用时涉及至少两个不同的化学基团之间的共价键合。所述连接基团可为中间基团，充当上述两个基团之间的间隔区，所述中间基团或间隔区也通过一个或一个以上产生共价键合的化学反应形成。在这种情况下，所述连接基团可描述为二价的。在其它情况下，连接基团可为多价的，即作为连接两个以上基团的连接装置起作用。
具体而言，l0通过通式r8(q)u表示，其中，r8为含有多达20个碳原子的亚烷基或亚芳基，且q选自-o-,-s-,-s-s-,-nr9-,-nhc(o)-,-c(o)nh-,-oc(o)nh-,-nhc(o)o-,-oc(o)-,c(o)o-,-nhc(o)nh-,-sc(o)-,-c(o)s-,-nhc(s)nh-,
所述亲水性聚-2-噁唑啉共聚物片段a包括至少两个2-取代的2-噁唑啉单体，即该共聚物可由至少两个2-取代的噁唑啉单体共聚合得到。2-噁唑啉单体可选自经脂类基团或芳香基团取代的2-噁唑啉单体，例如诸如2-甲基-2-噁唑啉、2-乙基-2-噁唑啉、2-丙基-2-噁唑啉之类的2-烷基-2-噁唑啉，或诸如2-苯基-2-噁唑啉之类的2-芳基-2-噁唑啉。进一步优选可用于制备亲水性聚-2-噁唑啉共聚物片段a的2-噁唑啉单元，其为在2-位点由包括诸如胺、叠氮化物、炔烃、醛、缩醛、醇、羧酸、活化的羧酸、氧基胺、酮、缩酮、酯、马来酰亚胺、乙烯砜、邻二硫吡啶或氯甲酸酯之类的可进一步化学修饰并用作与其它化学实体缀合的工具(handle)的官能团的基团取代并官能化的那些2-噁唑啉单元。亲水性聚2-噁唑啉共聚物片段a可通过两个或两个以上这种类型的2-噁唑啉单体共聚合得到。
在具体实施方式中，片段a包括两个或两个以上2-取代的2-噁唑啉单体，其中，所述单体中的至少一个选自2-烷基-2-噁唑啉，例如2-甲基-2-噁唑啉或2-芳基-2-噁唑啉。在这种情况下，片段a可通过至少两个2-取代的2-噁唑啉单体共聚合得到，其中，所述单体中至少一个为2-烷基-2-噁唑啉或2-芳基-2-噁唑啉。
一般而言，本文使用的术语烷基包括主链含有从1到40个碳的直链和支链烃基。该烃链可为饱和的或不饱和的(即包括双键(烯基)和/或三键(炔基))。所述烃链还可为环状的，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基，或者包括环形的部分(也包括多环烷基，例如，但不限于胆甾醇基、金刚烷基、降冰片基、双环[2.2.2]辛基)。所述烷基的烃链中可插入杂原子，所述杂原子选自一个或一个以上诸如氧、氮、硫或硅之类的原子。可选地，每一烷基上可通过可用的碳原子由取代基取代，所述取代基包括，例如烷基、卤素(f、cl、br、i)、卤代烷基(例如，ccl3或cf3)、烷氧基、芳氧基、烷硫基、羟基、甲氧基、羧基、环氧基、烷氧基羰基、烷基羰基氧、氨基、氨甲酰基(例如nh2c(＝o)-或nhrc(＝o)-，其中，r为烷基或芳基)、脲(-nhconh2)、硫脲(-nhsonh2)、烷基脲、芳基、醚、酯、硫酯、腈、硝基、酰胺、羰基、氧基、羧酸盐、巯基、烷基硫化物、芳基硫化物、砜、亚砜、三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基。简单烷基的实例包括，但不限于，丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基和壬基。
如本文所使用的术语芳基是指包括5-和6-元芳香单环的环部分或芳香基团中含有6至12个碳的单环和双环芳香烃基。可选地，芳基上可以通过可用的碳原子用被如上定义的取代基取代。芳香环系统可包括1到4个诸如硫、氧或氮之类的杂原子。上述芳基的实例包括，但不限于苯基、甲苯基、羟苯基、苄基、萘基、联苯、吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、异噻唑、咪唑、三唑、四唑、吡唑、噁唑、异噁唑、三嗪、三嗪、四嗪、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶。
在另一优选的实施方式中，片段a可通过2-甲基-2-噁唑啉和叠氮-官能化的2-噁唑啉单体(尤其是诸如2-(4-叠氮丁基)-2-噁唑啉之类的2-(4-叠氮烷基)-2-噁唑啉)共聚合得到。
另一方面，所述聚-2-噁唑啉共聚物片段a可选自随机聚-2-噁唑啉共聚物、二嵌段聚-2-噁唑啉共聚物和三嵌段聚-2-噁唑啉共聚物。随机聚-2-噁唑啉共聚物包含至少两个不同的2-噁唑啉单体单元，所述2-噁唑啉单体单元随机分布在共聚物中，而嵌段聚-2-噁唑啉共聚物包括至少两个不同的共聚物片段，每一片段独立地包括特定的2-噁唑啉单体。包括两个片段的嵌段共聚物是特别优选的(即二嵌段聚-2-噁唑啉共聚物)，包括三个片段的嵌段共聚物(即三嵌段共聚物)也是特别优选的。随机聚-2-噁唑啉共聚物可通过在共聚合过程中同时加成至少两个聚-2-噁唑啉单体单元得到。相比之下，嵌段共聚物可通过在共聚合过程中按顺序加成聚-2-噁唑啉单体得到。
片段a的骨架是聚-2-噁唑啉共聚物。然而，在一些实施方式中，所述聚-2-噁唑啉共聚物进一步缀合至具有例如治疗功能或诊断功能的化学基团。具体而言，所述自组装颗粒可包括通式(i)的两亲性聚合物，其中，所述亲水性聚-2-噁唑啉共聚物片段a与诊断剂、治疗剂或配体缀合，所述配体例如抗体、抗原结合片段(fab)、单域抗体、寡核苷酸、多肽或碳水化合物。优选的配体为生物素、叶酸或肽。
优选的治疗剂为药学活性成分或药物，例如脂-改良剂、免疫抑制剂、皮质类固醇、消炎剂、抗血栓药、镇痛剂、抗菌剂或用于光动力疗法的药剂。尤其优选的是化疗药剂和抗肿瘤药剂，例如阿霉素或紫杉醇。
优选的诊断剂包括诸如近红外(nir)荧光染料、放射性标记、pet-显像剂、mri显像剂、致敏剂以及光声显像剂之类的荧光染料。诊断剂的实例包括荧光素、罗丹明、青色素、酞菁、bodipy及其衍生物。这些诊断剂还可提供治疗活性；例如，作为用于光动力疗法的药剂起作用。
在本文中，术语缀合(conjugated)是指通过共价键合将药剂或配体连接至聚-2-噁唑啉共聚物片段。优选地，该缀合包括可在生理条件下裂解或水解的共价键合。虽然生理条件可随给定组织的局部微环境、器官或细胞环境在例如ph、氧化还原环境等方面发生改变，但一般理解生理环境是指约生理温度的温度，约20℃至约40℃的温度；特别是，33-37℃的温度，以及ph大约6-8。共价键的水解或裂解还可为酶催化的水解或裂解。为了实现药物递送，就治疗剂与上述共聚物片段的缀合而言，可裂解的或可水解的键合尤其优选。可选地，所述缀合可为在生理条件下或者在任何天然酶作用下不可水解的键合或不易于裂解的键合。
本文使用的术语‘诊断剂’或‘治疗剂’或‘配体’并不限于与聚合物缀合的单一(即单个)化合物。由于所述聚合物包括重复单元，因此，应理解，一个以上单元可与诊断剂或治疗剂或配体缀合。还应理解，并非聚合物的所有重复单元都可与诊断剂、治疗剂或配体缀合。例如，聚-2-噁唑啉聚合物片段重复单元的至少约1％或约10％或约或至少约60％可与诊断剂、治疗剂、配体或其组合缀合。在一种实施方式中，所述聚-2-噁唑啉共聚物片段a可与诊断剂和治疗剂两者缀合。在另一实施方式中，所述聚-2-噁唑啉共聚物片段a可与一种以上治疗剂缀合。
在另一具体实施方式中，所述自组装颗粒包括通式(i)的两亲性聚合物，其中，所述聚-2-噁唑啉共聚物片段a包括通式(ia)的片段，通式(ia)为：
其中，r1和r3独立地选自与选自胺、叠氮化物、炔烃、醛、缩醛、醇、羧酸、活化的羧酸、氧基胺、酮、缩酮、酯、马来酰亚胺、乙烯砜、邻二硫吡啶和氯甲酸酯的官能团缀合的连接基团；以及与治疗剂、诊断剂或配体缀合的连接基团。r2独立地选自c1-c20烷基和芳烷基。此外，e、f为独立地选自0-500的整数，但e和f不同时选为0；p为选自2-500的整数；并且a选自ran和嵌段，其中，ran表示随机共聚物，所述随机共聚物的由e、f和p定义的单元是随机的，而嵌段表示嵌段共聚物，所述嵌段共聚物的由e、f和p定义的单元为有序片段。
所述官能团可作为用于进一步化学修饰或官能团化的工具。在其它情况中，它们可为对最终两亲性聚合物产物而言已经结构相关的官能团并且不再需要进一步修饰。在优选的特定实施方式中，r1和r3独立地选自与胺或叠氮化物缀合的连接基团，优选c1至c30亚烷基或亚芳基。
在更加优选的实施方式中，所述自组装颗粒包括通式(i)的两亲性聚合物，其中，z为末端基团。z直接与聚-2-噁唑啉聚合物片段a的末端连接，并可直接通过亲核试剂衍生得到(或改良得到)，所述亲核试剂用于淬灭或终止聚-2-噁唑啉共聚合反应。优选地，z选自通式-x1-q0的末端基团，其中x1选自-o-,-s-,-nh-,-nr10-,
-n3,
并且其中，q0缺失或选自氢、非经取代的或经取代的烷基、烯基、芳烷基、炔基、杂环或芳基、-c(o)-(ch2)q-cooh,-c(o)o-r10,-(ch2)q-c(o)o-r10,-c(o)r10,-nhc(o)-(ch2)q-n3,-(ch2)q-n3和–sr10，其中，r10选自非经取代的或经取代的烷基、烯基、芳烷基，且q为从1至10的整数。最优选地，z为羟基(-oh)。
可选地，所述自组装颗粒包括通式(i)的两亲性聚合物，其中z为与配体缀合的连接基团，所述配体用于靶向特定细胞和组织。优选地，所述配体为受体-特异性配体(例如，肿瘤受体特异性配体)，其使得所述自组装颗粒能够靶向特定类型的受体、细胞或组织，与特定类型的受体、细胞或组织相互作用并键合。所述配体可选自小分子、抗体、抗原结合片段(fab)、单域抗体、寡核苷酸、肽和碳水化合物。尤其优选的抗体为叶酸及其衍生物、生物素和肽。
配体的实例包括，但不限于，用于靶向表达整合蛋白的细胞的rgd(精氨酰甘氨酰天冬氨酸)和含有rgd的肽及其类似物；egf和靶向egf-受体表达细胞的肽；靶向神经纤毛蛋白1的pd1和肽；靶向柯萨奇腺病毒受体(car)表达细胞的腺病毒纤维蛋白和肽；靶向ldl受体的apoe和肽；靶向暴露胶原的血管性血友病因子和肽；靶向肿瘤的促黑激素(αmsh)肽、转铁蛋白、生长素抑制激素肽和fgf2；靶向内皮细胞的血管内皮细胞生长因子；靶向具有细胞表面受体的肿瘤细胞的叶酸及其类似物，靶向炎症部位的唾液酸化路易斯抗原。
连接基团，除了作为连接配体与所述聚-2-噁唑啉聚合物末端的方式之外，还可有利于将配体定位于自组装颗粒中，并确保充分呈递配体以进行组织和细胞结合。所述连接基团可包括可水解的共价键，或者可选地，不含可水解的共价键。
具体而言，z可为与由通式-l3-r11表示的配体缀合的连接基团，其中，l3选自-s-、-o-、-oc(o)-、-oc(o)nh-、-nhc(o)-、-nhc(o)nh、-nhc(s)nh-、-nhc(o)o-、
其中，q1表示一个或一个以上取代基；
并且其中，r11为配体，所述配体选自小分子、抗体、抗原结合片段(fab)、单域抗体、寡核苷酸、肽和碳水化合物，尤其选自叶酸、生物素或肽。
在特别优选的实施方式中，主要用通式(i)的两亲性聚合物作为主要结构成分形成的自组装颗粒包括通式(i)的两亲性聚合物，其中，b为聚二甲基硅氧烷片段，所述聚-2-噁唑啉共聚物片段a包括至少一种聚-2-甲基噁唑啉嵌段，并且z为末端基团。
在本发明的另一方面，所述自组装颗粒包括通式(ii)的两亲性聚合物，通式(ii)为：
b-(l0-c-z)n
其中，n为1或2；
b为疏水性聚硅氧烷片段；
l0为二价连接片段；
c为亲水性聚-2-噁唑啉同聚物片段；
并且其中，z选自末端基团或与配体缀合的连接基团。
所述疏水性聚硅氧烷b、上述二价连接片段l0和z末端基团或与配体缀合的连接基团如前述针对通式(i)所定义的那样。
亲水性聚-2-噁唑啉同聚物片段c包括可通过任何2-取代的2-噁唑啉单体(特别优选的是2-烷基或2-芳基取代的2-噁唑啉单体)共聚合得到的聚合物。在特别优选的实施方式中，通式(ii)的两亲性聚合物包括聚-2-甲基-噁唑啉片段。此外，可选地，所述聚-2-噁唑啉同聚物片段c可包括至少5个且多达50个或多于50个2-噁唑啉单体的单元。优选地，所述聚-2-噁唑啉同聚物片段c包括5至30个单体单元。
通式(ii)的两亲性聚合物可包括通式(ii-a)的片段c，通式(ii-a)为：
其中，r2选自c1-c20烷基或芳烷基；且p为选自2至500的整数。
在包括通式(ii-a)的片段c的通式(ii)的两亲性聚合物的具体实施方式中，z为如上所述的通式–l3-r11，具体而言，其中l3为三唑连接基团。在这种情况下，所述三唑连接基团由配体或配体衍生物与通式(ii)或(iia)的两亲性聚合物的末端通过叠氮-炔烃1,3-偶极环加成的方式缀合而产生的。
在一种实施方式中，自组装颗粒包括通式(iv)的聚合物，通式(iv)为：
其中，l4为包括c1-c20亚烷基或亚芳基，或者可插入杂原子o、n、s中的一个或一个以上的c1-c20亚烷基或亚芳基(例如，–o-ch2ch2-o-,-ch2nh-,-ch2-s-s-ch2-ch2-o-)；优选地，p在5至100范围内，尤其是20至40范围内；并且其中，b、l0、r2和r11如前所述。优选地，r11为选自小分子、抗体、抗原结合片段(fab)、单域抗体、寡核苷酸、碳水化合物，尤其选自叶酸、生物素或肽的配体。
在本发明的另一具体实施方式中，所述自组装颗粒为胶束，所述胶束包括至少一种通式(ii)的两亲性聚合物，其中，z为末端基团。
在又一实施方式中，优选地，自组装颗粒为胶束并且所述自组装颗粒包括至少一种其中z为末端基团的通式(ii)的两亲性聚合物以及至少一种其中z为与配体缀合的连接基团的通式(ii)的两亲性聚合物。
特征为至少一种其中z为与配体缀合的连接基团的通式(ii)的两亲性聚合物的配体可选自抗体、抗原结合片段(fab)、单域抗体、寡核苷酸、多肽和碳水化合物。优选地，这种配体为受体特异性配体，即这种配体能够特异性地和/或选择性地与细胞或组织受体直接结合，例如肿瘤受体特异性配体。优选的受体特异性配体为叶酸受体配体。
这些通式(ii)的两亲性聚合物的受体特异性配体还可为小分子。这种小分子配体可为天然的，或者可为半合成的或完全合成的有机化合物。优选的小分子配体为诸如叶酸或其衍生物或甲氨蝶呤之类的叶酸受体配体。
在一种优选的实施方式中，本发明涉及包括至少一种其中z为末端基团的通式(ii)的两亲性聚合物的自组装颗粒，其中，所述自组装颗粒为胶束；并且其中，所述自组装颗粒包括至少一种其中z为与叶酸受体配体(优选叶酸或其衍生物)缀合的连接基团的通式(ii)的两亲性聚合物。
在另一实施方式中，所述胶束可进一步包括其中z为与治疗剂或诊断剂缀合的连接基团的通式(ii)的两亲性聚合物。
在本发明的另一实施方式中，所述自组装颗粒包括至少一种其中z为末端基团的通式(ii)的两亲性聚合物以及至少一种其中z为与配体缀合的连接基团的通式(ii)的两亲性聚合物，其中，所述配体为受体特异性配体，例如叶酸或其衍生物、肽、以及作为受体特异性配体的其它小分子；或者所述配体选自抗体、抗原结合片段(fab)、单域抗体、寡核苷酸、多肽和碳水化合物。
在以上任何一种实施方式中，进一步优选地，包括至少一种其中z为末端基团的通式(ii)的两亲性聚合物以及至少一种其中z为与配体缀合的连接基团的通式(ii)的两亲性聚合物的这种胶束或自组装颗粒包括其中疏水片段b为聚二甲基硅氧烷且其中亲水片段c为聚-2-甲基-噁唑啉的所述聚合物。优选地，所述聚-2-噁唑啉同聚物c片段包括5至30个单体单元。
在一种实施方式中，包括前述通式(i)的两亲性聚合物的自组装颗粒还包括至少一种通式(ii)的两亲性聚合物。在这些实施方式和其它实施方式中，尤其优选的是包括通式(ii)的两亲性聚合物的自组装颗粒含有其中b为聚二甲基硅氧烷且c为聚-2-甲基噁唑啉的聚合物。
在另一实施方式中，所述自组装颗粒独立地包括治疗剂、诊断剂或寡核苷酸。换言之，所述自组装颗粒合并或者装载有治疗剂、诊断剂、寡核苷酸或其组合，所述治疗剂、诊断剂、寡核苷酸或其组合在物理条件下是独立的，即不与所述自组装颗粒本身共价键合。
通式(i)和通式(ii)的两亲性聚合物各种不同组合可用于生成本发明的自组装颗粒，这属于本发明的范围之内。尤其优选的是通过以下两亲性聚合物的组合制备的自组装颗粒：
(a1)其中z为末端基团(a1)的通式(i)的两亲性聚合物，其与其中z也为末端基团的通式(ii)的两亲性聚合物组合。通式(i)聚合物的重量百分数可为约1％至约99％。
(b1)如上所述的两亲性聚合物的组合(a1)，其额外包括其中z为与配体缀合的连接基团的通式(i)或通式(ii)的两亲性聚合物。优选地，相对于所述两亲性聚合物的总重量，这种额外的缀合有配体的两亲性聚合物的重量百分数为约1％至约20％。
(c1)如上所述的两亲性聚合物的组合(a1)，其中，所生成的自组装颗粒包括不与所述两亲性聚合物中的任何一种共价键合的治疗剂和/或诊断剂。优选地，所述治疗剂相对于自组装颗粒组合物总重量的重量百分数为约1％至50％。优选地，所述诊断剂相对于自组装颗粒组合物总重量的重量百分数为约1％至10％。
(d1)如上所述的组合(b1)，其中，所生成的自组装颗粒还包括不与所述两亲性聚合物中的任何一种共价缀合的治疗剂和/或诊断剂。优选地，与配体缀合的两亲性聚合物相对于两亲性聚合物总重量的重量百分数为约1％至20％。优选地，所述治疗剂相对于自组装颗粒组合物总重量的重量百分数为约1％至50％。优选地，所述诊断剂相对于自组装颗粒组合物总重量的重量百分数为约1％至10％。
优选地，如上所有实施方式中描述的自组装颗粒选自胶束或囊泡。特别优选的是胶束。与囊泡相比，胶束可更易制备并且发现胶束在封装药物之后还可更加稳定，具体而言，胶束在封装疏水性和/或水溶性低或水溶性差的治疗剂之后更加稳定。
可理解胶束为包括疏水性内部和亲水性外部的自组装颗粒。反向胶束(即具有亲水性内部和疏水性外部)可在疏水性溶剂中形成。在主体溶剂为水的给定浓度下(即临界胶束浓度，或cmc)，本发明的两亲性聚合物会开始聚集并自组装以生成定义的胶束结构。该过程是可逆的；低于该浓度时，疏水两亲性聚合物变成大部分非缔合的。虽然各种不同形状和几何排列(例如片晶状、圆柱形)是可行的，但优选地，本发明的胶束为球状或椭圆形。
本文所理解的囊泡为包括封闭的双分子层膜结构和封闭的水性腔室的自组装颗粒。通常，囊泡的外部的朝向溶剂的表面以及囊泡朝向内部腔室的表面主要为所述两亲性聚合物的亲水性片段。所述囊泡可为单层的(即包括一个双分子层)，或者其可为多层的(即包括一个以上双分子层膜)。
如上所述，优选地，本发明的胶束和囊泡的形状大体为球状。这种胶束的平均直径通常为约20nm至约150nm。由两亲性聚合物形成的囊泡的平均直径通常为40nm至250nm。胶束的大小、形状和几何结构可通过本领域公知的常用表征方法来测量，所述方法例如dls或tem分析。
所述胶束和囊泡还可通过本领域公知的方法制备，所述方法包括诸如薄膜水化法或纳米沉淀法之类的方法，这些方法在下文实施例部分进一步详细描述。在另一实施方式中，通过冻干法或本领域公知的用胶态分散体制备固体颗粒的其它方法将所述自组装颗粒转变为固体颗粒或纳米颗粒。
另一方面，本发明涉及通式(i)的两亲性聚合物及其制备方法，即，通式(i)b-(l0-a-z)n的两亲性聚合物，其中，n为1或2，且b为疏水性聚硅氧烷片段；并且其中，l0、z和a如下：
二价连接片段l0由通式r8(q)u表示，其中，r8选自含有1至20个碳原子的亚烷基或亚芳基以及含有插入杂原子o、n、s中的一个或一个以上的1至20个碳原子的亚烷基或亚芳基；q选自-o-,-s-,-s-s-,-nr9-,-nhc(o)-,-c(o)nh-,-oc(o)nh-,-nhc(o)o-,-oc(o),c(o)o-,-nhc(o)nh-,-sc(o)-,-c(o)s-，-nhc(s)nh-
z为通式-x1-q0的末端基团，其中x1选自
-o-、-s-、-nh-、-nr10-、
并且，q0缺失或选自h、非经取代的或经取代的烷基、烯基、芳烷基、炔基、杂环或芳基、-c(o)-(ch2)q-cooh、-c(o)o-r10、-(ch2)q-c(o)o-r10、-c(o)r10,-nhc(o)-(ch2)q-n3、-(ch2)q-n3或–sr10，其中，r10选自非经取代的或经取代的烷基、烯基、芳烷基，且q为从1至10的整数。
可选地，z为与通式–l3-r11缀合的连接基团，其中，l3选自-s-、-o-、-oc(o)-、-oc(o)nh-、-nhc(o)-、-nhc(o)nh、-nhc(s)nh-、-nhc(o)o-、
其中，q1表示一个或一个以上取代基；且r11为配体，所述配体选自小分子、抗体、抗原结合片段(fab)、单域抗体、寡核苷酸、碳水化合物，尤其选自叶酸、生物素或肽；
亲水性聚-2-噁唑啉共聚物片段a表示为通式(i-a)：
其中，r1、r3独立地选自与治疗剂、诊断剂、配体缀合的连接基团，和包括选自胺、叠氮化物、炔烃、醛、缩醛、醇、羧酸、活化的羧酸、氧基胺、酮、缩酮、酯、马来酰亚胺、乙烯砜、邻二硫吡啶和氯甲酸酯的官能团的连接基团；
r2独立地选自c1-c20烷基或芳烷基；
e、f为独立地选自0-500的整数，但e和f不同时选为0；
p为选自2-500的整数；
并且a选自ran或嵌段，其中，ran表示随机共聚物，其中，通过所述整数e、f和p定义的单元是随机的，所述随机共聚物的由e、f和p定义的单元是随机的，所述嵌段表示嵌段共聚物，其中通过整数e、f和p定义的单元为有序片段。
优选地，这种两亲性共聚物的疏水性聚硅氧烷b为通式(iii)的如上所述的聚硅氧烷或相关化合物。
关于基团r1和r3，优选地，这些基团包括与治疗剂、诊断剂或配体缀合的连接基团。在一种实施方式中，所述连接基团包括可水解的共价键，即优选地，在生理条件下，所述共价键可通过水解裂解。在另一实施方式中，所述连接基团只包括不可水解的共价键。可选地，r1和r3可为包括官能团的连接基团，所述官能团可被进一步化学修饰(即在一般反应条件下被亲核试剂或亲电子试剂修饰)并允许附着或连接至诸如治疗剂或诊断剂或配体之类的另一化学实体。在优选的实施方式中，r1和r3基团包括选自胺(其可为仲胺或叔胺或季胺)和叠氮化物的官能团。
另一方面，优选地，r2为化学惰性基团，即不易进行化学反应，例如在r1或r3的化学修饰过程中，并且r2也不与r1或r3的潜在反应性官能团中的任何一个发生化学反应。优选地，r2为c1-c20烷基或芳烷基；具体而言，r2可为诸如甲基或乙基之类的c1-c10烷基。在一种实施方式中，如上所述的通式(i)的两亲性聚合物包括通式(i-b)的聚-2-噁唑啉共聚物片段a，通式(i-b)为：
其中，
l5、l6和l7独立地选自c1-c20亚烷基、c4-c12亚芳基和插入了杂原子o、n、s中的一个或一个以上的c1-c20亚烷基或c4-c12亚芳基；
r12选自-h(h),-(h)r13,-(r13)2或-(r13)2r14x，其中，r13和r14独立地选自经取代的或非经取代的c1-c20烷基和经取代的或非经取代的芳烷基，并且其中x为负平衡离子。
在该具体实施方式中，所述两亲性聚合物还包括选自-oh、-nh2、
优选地，l6和l7独立地选自c1-c20烷基，特别是选自c3-c10烷基。
在另一实施方式中，f为0，因此a为通式(i-c)的亲水性聚-2-噁唑啉共聚物片段，通式(i-c)为：
在这种情况下，所述聚-2-噁唑啉共聚物由两个2-噁唑啉单体衍生得到。
优选地，通式(i-b)或通式(i-c)中的r2为c1-c20烷基或芳烷基；具体而言，r2取代基可为诸如甲基或乙基之类的c1-c10烷基。同样优选的实施方式中，l5为c1-c10亚烷基，尤其是亚甲基，并且其中，r12为-h(h),-(h)r13,-(r13)2或-(r13)2r14x，其中，r13、r14独立地选自非经取代的c1-c5烷基；尤其是甲基。
包括通式(i-a)、(i-b)或(i-c)的亲水性片段的两亲性聚合物的更优选的实例包括其中e选为0且f选自1至20；或者其中f选为0且e选自1至20的实施方式。
发现包括通式(i-b)或通式(i-c)的聚-2-噁唑啉共聚物片段a的两亲性聚合物，以及包括所述两亲性聚合物并由其制备得到的自组装颗粒对于基因输送和基因治疗特别有用。在另一实施方式中，包括这种两亲性聚合物的自组装颗粒还包括基因或基因片段或其衍生物(例如dna、质粒、sirna等)。这种两亲性聚合物中的侧链氨基官能团在正常生理条件下带正电，这对于遗传物质的整合有用。
在又一实施方式中，如上所述的通式(i)的两亲性聚合物包括通式(i-d)的亲水性聚-2-噁唑啉共聚物片段a，通式(i-d)为：
其中，
对于每一单体单元而言，r18和r19独立地选自诊断剂、治疗剂、配体和取代基，优选地，所述取代基选自氢、c1-c20亚烷基、c1-c20亚芳基；条件是对于至少一个单体单元而言，r18和/或r19为诊断剂、治疗剂或配体；
l6和l7独立地选自c1-c20亚烷基、c4-c12亚芳基和插入了杂原子o、n、s中的一个或一个以上的c1-c20亚烷基c4-c12亚芳基；
l8为通式–r20(y)s的二价连接基团，其中r20为c1-c20亚烷基或亚芳基或插入了杂原子o、n、s中的一个或一个以上的c1-c20亚烷基或亚芳基；y为-s-s-,-nhc(o)-,-c(o)nh-,-oc(o)nh-,-nhc(o)o-,-oc(o)-,-oc(o)o-,-c(o)o-,-nhc(o)nh-,-sc(o)-,-c(o)s-,-nhc(s)nh-,-nh-和-c(o)-nh-n＝，且s为0、1或2；
t选自0或1的整数；并且其中
z为选自-oh，-nh2
应当理解的是，对于每一单体单元，涉及r18和r19的独立选择的短语也是指r18和r19基团中的每一个对诊断剂、治疗剂、配体或取代基的独立选择。所述单体单元的r18和r19基团为不同于配体、诊断剂或治疗剂的取代基，特别优选的取代基为氢(h)、c1-c20亚烷基或c1-c20亚芳基。
然而，在优选的实施方式中，由整数e和/或f定义的所有单体单元可由一种或一种以上诊断剂、治疗剂、配体或其组合组成。在通式(i-d)的另一实施方式中，f为0，使得a为通式(i-e)的亲水性聚-2-噁唑啉共聚物片段，通式(i-e)为：
其中，对于每一单体单元而言，r18独立地选自治疗剂、诊断剂或不同于治疗剂或诊断剂的取代基，条件是对于至少一个单体单元而言，r18为诊断剂、治疗剂或配体。优选地，所述取代基选自氢、c1-c20亚烷基和c1-c20亚芳基。优选地，所述治疗剂选自诸如阿霉素或紫杉醇之类的化疗药剂和抗肿瘤药剂。优选地，所述诊断剂选自荧光染料、放射性标记、pet-显像剂、mri显像剂和致敏剂。在一种实施方式中，所述诊断剂选自光声显像剂。
一般而言，诸如药物之类的治疗剂与本发明的两亲性聚合物的共价连接或缀合通过所述聚合物基团上活性化学基团与所述治疗剂上互补的化学官能团反应来完成。可选地，所述共价连接发生在连接基团部分(即l8)。优选地，l8包括可水解的键，其通常可用于体内药物释放。优选的可水解的键包括酯、氨基甲酸酯、酰胺、脲和硫脲键。
在通式(i-d)的又一实施方式中，e为0，因此a为通式(i-f)的亲水性聚-2-噁唑啉共聚物片段，通式(i-f)为：
其中，
对于每一单体单元而言，r19独立地选自治疗剂、诊断剂或取代基，优选地，所述取代基选自氢、c1-c20亚烷基和c1-c20亚芳基，条件是对于至少一个单体单元，r19为治疗剂、诊断剂或配体。优选地，所述治疗剂选自诸如阿霉素或紫杉醇之类的化疗药剂和抗肿瘤药剂。优选地，所述诊断剂选自荧光染料、放射性标记、pet-显像剂、mri显像剂和致敏剂。在一种实施方式中，所述诊断剂选自光声显像剂。
例如，通式(i-d)或(i-e)的共聚物片段可包括其中基团r18为诊断剂的单体单元和其中基团r18为治疗剂的单体单元。同样，通式(i-d)或(i-f)的共聚物片段也可包括其中基团r19为诊断剂的单体单元和其中基团r19为治疗剂的单体单元。在通式(i-d)的共聚物片段的其它实施方式中，由整数e定义的单体单元可包括其中r18为治疗剂的单体单元和由整数f定义的单体单元，由整数f定义的单体单元包括其中r19为不同于诊断剂或治疗剂的取代基，或者其中r19为诊断剂的单体单元。在另一实例中，通式(i-d)或(i-e)的共聚物片段可包括由整数e定义的其中r18为一种治疗剂的单体单元，与其中r18为第二治疗剂的单体单元。
优选地，通式(i-d)的l6和通式(i-f)的l7选自c1-c20烷基，尤其是c3-c10烷基。通式(i)的两亲性聚合物可根据两种常用方法制备。在一种方法中，所述亲水性聚-2-噁唑啉共聚物片段a和所述疏水性聚硅氧烷片段b独立地通过位于聚合物的相应末端的两个活性官能团之间的反应而制备并连接在一起。在该方法的实例中，所述亲水性聚-2-噁唑啉共聚物末端包括叠氮官能团，而所述聚硅氧烷片段b末端包括炔基官能团(或者相反)；片段a和b通过1,3-偶极环加成反应(也称为叠氮化物-炔烃1,3-偶极或[3+2]环加成或称作‘点击’反应)连接。
在制备通式(i)的两亲性聚合物的第二种常用方法中，独立地制备并修饰亲水性片段a或疏水性片段b，以便用作第二片段的聚合反应的合适前体和引发剂。
在本发明的一种实施方式中，通式(i)的两亲性聚合物由疏水性片段b制备，所述疏水性片段b在聚合物链的一端或两端被引发剂基团官能化，所述引发剂基团例如-br,-i,-oms(-o-so2ch3,甲磺酸酯),-ots(-o-so2-c6h4-p-ch3,或甲苯磺酸酯),-otf(-o-so2-cf3,三氟甲烷磺酸酯)。最优选的引发剂基团为三氟甲烷磺酸酯。随后通过活跃的阳离子聚合作用过程的方式由该前体(本文也称为大分子引发剂)制备聚-2-噁唑啉聚合物片段a。这样的过程包括引发步骤和通过向大分子引发剂添加2-噁唑啉单体进行链延伸的步骤，以及终止步骤，例如通过添加亲核试剂(例如，氢氧化物、哌嗪或叠氮化物等)终止。可添加催化剂来促进聚合作用。
这些方法还可应用于通式(ii)的两亲性聚合物的合成。
优选地，这种聚合作用在基本惰性的溶剂或极性非质子溶剂中进行，所述基本惰性的溶剂例如己烷、甲苯、苯、氯仿，所述极性非质子溶剂例如乙酸乙酯、乙腈、dmf、dmso、二氯甲烷或其混合物。优选的用于聚合作用的溶剂为氯仿和乙腈。
如上所述，生成聚-2-噁唑啉聚合物片段的聚合反应过程可通过几种方式进行。在一种实施方式中，两种或多于两种合适的2-噁唑啉单体的混合物与疏水性聚硅氧烷大分子引发剂反应以生成随机共聚物片段。在另一实施方式中，所述聚-2-噁唑啉片段a可通过以下步骤分批合成：引发由合适的聚硅氧烷引发剂引发与第一2-噁唑啉单体的聚合作用，随后当第一批的聚合作用完成时，添加第二2-噁唑啉单体。第二2-噁唑啉单体的添加在聚合物链末端再次引发与活跃阳离子的聚合作用。每一步的反应条件可不同。在两个步骤中，聚合作用过程均通过添加亲核试剂终止。
在优选的实施方式中，本发明提供制备通式(i)的两亲性聚合物的方法，所述方法包括步骤：聚硅氧烷引发剂与至少一种2-(叠氮烷基)-2-噁唑啉单体和至少一种2-烷基-2-噁唑啉或2-芳烷基-2-噁唑啉单体的阳离子开环聚合作用。具体而言，本发明的包括亲水性聚-2-噁唑啉共聚物片段a的两亲性聚合物可使用三氟甲烷磺酸酯官能化的疏水性聚二甲基硅氧烷片段b作为大分子引发剂通过至少两种2-取代的-2-噁唑啉共聚合制备，所述2-取代的-2-噁唑啉优选为2-(叠氮烷基)-2-噁唑啉和2-烷基-2-噁唑啉或2-芳烷基-2-噁唑啉单体。
通过这种聚合作用过程生成的两亲性聚合物在进一步官能化方面高度通用。进而其为本发明自组装颗粒的制备和特性调整提供了简易的模块化方法。例如，可修饰所述聚-2-噁唑啉片段，例如，添加连接基团和/或诸如诊断剂、配体或治疗剂之类的活性剂。
如上所述的通式(i)的两亲性聚合物的制备方法还可包括叠氮化物还原步骤和/或利用炔基化合物进行的1,3偶极环加成步骤。
一般而言，包括叠氮官能团的两亲性聚合物可用作具有氨基官能团的两亲性聚合物的前体。虽然可预见本领域公知的任何叠氮化物还原反应或反应条件可用于本发明的目的，但是优选温和的且与所述两亲性聚合物的结构元素(尤其是酸不稳定的聚硅氧烷片段)兼容的方法。已发现硫醇为用于还原本发明两亲性聚合物中的叠氮官能团的特别适合的试剂。
叠氮官能团还可用作与包括炔基官能团的实体进行1,3偶极环加成的参与物。生成的三唑加合物可用作共价连接两亲性聚合物与例如活性治疗剂或配体的选择性方式。这些反应的反应条件一般为温和的，由此特别适合选择性偶联两亲性聚合物与化合物和包含灵敏的或反应性官能团组成的分子。在一种实施方式中，1,3-偶极环加成反应为铜催化的。催化剂可选自cu+,cu++，例如cui,cubr,cuso4.5h2o、铜复合物。可用于这些反应的助剂包括，但不限于，抗坏血酸钠、三乙胺、dipea、tbta(三[(1-苄基-1h-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺)、pmedta(n,n,n′,n″,n″-五甲基二亚乙基三胺)。
发明人已经发现通过包括如前所述的官能团的2-噁唑啉单体将叠氮化物引入至共聚合作用过程为通式(i),b-(l0-a-z)n的两亲性聚合物的进一步官能化和多样化提供通用的处理方法。这种两亲性聚合物的叠氮官能团可如前所述进行还原和/或1,3-偶极环加成反应。例如，如下文实施例8中所例示的，将包括通式(i-d)的片段的两亲性聚合物进行包括首先进行1,3-偶极环加成步骤，随后进行叠氮化物还原步骤的反应提供包括三唑和氨基两种官能团的两亲性聚合物加合物。
此外，如前所述的包括通式(i-b)或通式(i-c)的聚-2-噁唑啉共聚物片段a的通式(i)的两亲性聚合物可由包括通式(i-g)的聚-2-噁唑啉共聚物片段a的前体两亲性聚合物制备，通式(i-g)为：
其中，
l6和l7独立地选自c1-c20亚烷基、c4-c12亚芳基和插入了杂原子o、n、s的c1-c20亚烷基或c4-c12亚芳基；
并且r21选自h(h),h(r22),(r22)2和(r22)2r23x，其中，r22和r23独立地选自经取代的或非经取代的c1-c20烷基和经取代的或非经取代的芳烷基，且x为负平衡离子。
在一种具体实施方式中，f为0，由此所述两亲性聚合物包括通式(i-h)的亲水性聚-2-噁唑啉共聚物片段，通式(i-h)为：
并且其中，z为选自-oh，-n3，-nh2，
例如，所述两亲性聚合物的叠氮官能团可用作将治疗剂直接共价连接至本发明的两亲性聚合物的直接手段，从而生成包括通式(i-e)的亲水性聚-2-噁唑啉共聚物片段a的两亲性聚合物。在这种情况下，修饰为含有炔基官能团的治疗剂可通过1,3偶极环加成点击反应直接与所述两亲性聚合物缀合。
在包括通式(i-g)的聚-2-噁唑啉共聚物片段a的两亲性聚合物的另一实施方式中，e为0，且r21为h(h)，由此a为通式(i-i)的亲水性聚-2-噁唑啉共聚物片段，通式(i-i)为：
且其中，z为选自-oh，-n3，-nh2，
包括通式(i-i)的片段的两亲性聚合物的侧链游离伯胺(pendantfreeprimaryamine)可在与诊断剂或光动力治疗剂的偶联反应中用作亲核试剂。适合偶联的不需要化学修饰的商业试剂可直接使用(例如异氰酸荧光素(fitc)、异氰酸罗丹明)，可选地，可化学修饰诊断试剂或光动力疗法试剂是提供用于与所述两亲性聚合物的侧链伯胺基团偶联的另一手段。
如上所述，本发明的两亲性聚合物可在聚合物的末端包括基团z。当该末端基团选为-oh、-nh2或仲胺时，这些基团可在与配体进行的试剂辅助的偶联反应中进一步用作亲核性参与物。可替代地，在该末端基团为叠氮的情况下，修饰成包括炔基官能团的配体可通过1,3偶极环加成点击反应与两亲性聚合物末端缀合。
其它实施方式、选择和/或优选方案通过以下实例和图举例说明。
实施例
两亲性聚合物的合成
实施例1
2-(4-叠氮丁基)-噁唑啉(1)的制备
将固体叠氮化钠(3.0g,48mmol)加至5-溴戊酸(5.7g，32mmol)的dmf溶液(40ml)中。加热反应混合物至70℃，并在同一温度下搅拌12h。在高真空条件下除去溶剂，得到残留物。用二氯甲烷稀释残留物并用0.1nhcl洗涤残留物。用二氯甲烷萃取水相两次。用盐水洗合并的有机相，通过na2so4干燥并浓缩得到2.75g黄色油状物5-叠氮戊酸。产量：61％1hnmr(400mhz,cdcl3):δ9.30(br,1h),3.29(t,2h,j＝6.5hz),2.37(t,2h,j＝7.1hz),1.66(m,4h)ppm。
在氩气条件下在冰浴中将5-叠氮戊酸(2.75g,19.2mmol)和痕量无水dmf的二氯甲烷溶液(40ml)冷却至0℃至4℃。随后滴加草酰氯(4.84g,38.4mmol)的无水二氯甲烷溶液。在同一温度下搅拌反应混合物1h。加入另一2-氯乙胺盐酸盐(6.68g,57.6mmol)的无水吡啶溶液(10ml)。添加后，移开冰浴。将混合物转移到分液漏斗中并分别用10％盐酸水溶液和水洗。通过na2so4干燥有机相并通过蒸发浓缩，生成1.95g黄色油状物5-叠氮-n-(2-氯乙基)戊酰胺。产量：50％1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.95(br,1h),3.60(m,4h),3.30(t,2h,j＝6.5hz),2.25(t,2h,j＝7.4hz),1.73(m,2h),1.65(m,2h)ppm。
将固体碳酸钾(2.56g,18.6mmol)加至5-叠氮-n-(2-氯乙基)戊酰胺(1.9g,9.3mmol)的无水dmf溶液(20ml)中。在55℃下搅拌反应混合物30h。通过蒸发除去溶剂得到残留物。将此残留物溶于乙酸乙酯并过滤，用乙酸乙酯洗涤固体几次。蒸发合并的有机相并通过高真空干燥过夜，得到1.55g浅黄色油状化合物(1)。产量：99％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.25(t,2h,j＝9.4hz),3.83(t,2h,j＝9.4hz),3.30(t,2h,j＝6.4hz),2.33(t,2h,j＝7.2hz),1.71(m,2h),1.66(m,2h)ppm.
实施例2
向双(羟烷基)封端的聚(二甲基硅氧烷)(5.6g,1mmol)的甲苯溶液(25ml)中加入2,6-卢剔啶(0.35ml,3mmol)，然后在氩气保护下在冰浴中滴加三氟甲磺酸酐(0.4ml,2.4mmol)的己烷溶液(2.5ml)。在同一温度下搅拌反应混合物3h。随后在真空下除去溶剂以生成黄色油状活性中间产物。将该油状物溶于氯仿(15ml)和乙腈(20ml)的混合溶剂中。在室温下加入第一单体，2-(4-叠氮丁基)-噁唑(1.03g,6.1mmol)。加热反应混合物并在60℃下搅拌43h。随后将其冷却至室温并加入第二单体2-甲基-噁唑啉(1.7ml,20mmol)。再次将反应混合物加热至60℃并在同一温度下搅拌48h，随后在室温下用三乙胺的水溶液淬灭。通过蒸发除去溶剂以得到残留物。使用乙醇/水(80:20，v/v，至少四次。在第一次加入5ml饱和nahco3溶液)作为洗脱剂用纤维素再生膜(截留分子量为5000道尔顿)超滤纯化残留物，生成6.5g浅黄色固体化合物(2)。产量：78％,1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.30-3.75(m,128h),2.30-2.50(m,12h),2.05-2.21(m,60h),1.50-1.75(m,28h),0.50(m,4h),0.02-0.09(m,444h)ppm。
实施例3
化合物(3)的制备类似于化合物(2)的合成。产量：75％.1hnmr(400mhz,cd3od)δ3.40-3.75(m,212h),3.37(m,24h),2.30-2.57(m,20h),2.05-2.19(m,120h),1.58-1.75(m,44h),0.56(m,4h),0.03-0.17(m,444h)ppm。
实施例4
在室温下向化合物(2)(840mg,0.1mmol)的甲醇溶液(5ml)中加入三乙胺(0.56mg,4.0mmol)，随后加入1,3-丙二硫醇(0.40ml,4.0mmol)。在室温下搅拌反应混合物12h。在真空条件下除去溶剂得到残留物。使用乙醇/水(80:20，v/v，至少四次)作为洗脱剂用纤维素再生膜(截留分子量为5000道尔顿)超滤纯化残留物，生成560mg浅黄色化合物(2)。产量：67％.1hnmr(400mhz,cd3od)δ3.38-3.79(m,116h),2.68(m,12h),2.30-2.53(m,12h),2.05-2.15(m,60h),1.45-1.70(m,28h),0.57(m,4h),0.03-0.17(m,444h)ppm。
实施例5
与化合物(4)的制备类似，由化合物(3)制备化合物(5)。产量：70％.1hnmr(400mhz,cd3od)δ3.38-3.75(m,212h),2.68(m,20h),2.30-2.53(m,20h),2.05-2.15(m,120h),1.45-1.70(m,44h),0.57(m,4h),0.03-0.17(m,444h)ppm。
实施例6
在室温下向化合物(2)(840mg,0.1mmol)的thf溶液(6ml，使用前用氩气除气)中加入3-二甲基氨基-1-丙炔(83mg,1.0ml)。在同一温度下搅拌混合物5min。加入l-抗坏血酸钠(15mg,0.08mmol)水溶液(0.5ml)，随后加入cuso4.5h2o(7.5mg,0.03mmol)水溶液(0.5ml)。在室温下搅拌反应混合物24h。通过蒸发除去溶剂得到残留物。使用乙醇/水(80:20，v/v，至少四次)作为洗脱剂用纤维素再生膜(截留分子量为5000道尔顿)超滤纯化残留物，生成780mg浅黄色固体化合物(2)。产量：88％.1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.93(m,6h),4.45(m,12h),3.38-3.75(m,128h),2.30-2.53(m,12h),2.27(s,36h),2.05-2.15(m,60h),1.95(m,12h),1.59(m,16h),0.59(m,4h),0.05-0.11(m,444h)ppm。
实施例7
在氩气下在室温向化合物(6)(100mg,0.011mmol)的thf溶液(2ml)中加入碘甲烷(14.2mg,0.10mmol)。室温下搅拌混合物12h。通过蒸发除去溶剂得到残留物。用己烷洗残留物两次。随后在高真空下干燥得到110mg黄色固体化合物(7)。产量100％.1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.30-8.50(m,6h),4.50-4.80(m,24h),3.38-3.75(m,116h),2.94-3.20(m,54h),2.40-2.60(s,12h),2.05-2.18(m,60h),2.00(m,12h),1.60(m,16h),0.56(m,4h),0.05-0.11(m,444h)ppm。
实施例8
在室温下将所述中间产物溶于meoh(3ml)中，依次加入tea(0.2ml,1.44mmol)和1,3-丙二硫醇(0.15,1.44mmol)。搅拌得到的混合物过夜。通过蒸发除去溶剂得到残留物。使用乙醇/水(80:20，v/v，至少四次)作为洗脱剂用纤维素再生膜(截留分子量为5000道尔顿)超滤纯化残留物，生成445mg浅黄色固体化合物(8)。产量：89％.1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.93(m,2h),4.43(m,4h),3.40-3.70(m,216h),2.60-2.80(m,16h),2.30-2.55(m,20h),2.25(s,12h),2.05-2.18(m,120h),1.90-2.00(m,4h),1.50-1.70(m,40h),0.59(m,4h),0.05-0.15(m,444h)ppm。
实施例9
(9)的制备
向聚合物(3)(550mg,0.05mmol)的thf溶液(除气的，4ml)中加入4-戊炔酸甲酯(84mg,0.75mg)的叔丁醇溶液(0.5ml)。在室温下搅拌反应混合物5min。依次加入l-抗坏血酸钠(7.5mg,0.04mmol)水溶液(0.25ml)和cuso4.5h2o(3.75mg,0.015mmol)水溶液。在室温下搅拌得到的混合物12h。然后通过蒸发除去溶剂得到残留物。使用乙醇/水(80:20，v/v，至少四次)作为洗脱剂用纤维素再生膜(截留分子量为5000道尔顿)超滤纯化残留物，生成430mg浅黄色固体中间产物。产量：71％.1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.78(m,10h),4.38(m,20h),3.64(s,30h),3.40-3.70(m,212h),2.97(m,20h),2.70(m,20h),2.30-2.55(m,20h),2.05-2.18(m,120h),1.91(m,20h),1.57(m,24h),0.54(m,4h),0.05-0.15(m,444h)ppm。
在室温下向中间聚合物(430mg,0.036mmol)的乙醇溶液(5ml)中加入nh2nh2.h2o(50-60％,1ml)水溶液。加热反应混合物至回流并继续搅拌12h。之后，将反应冷却至室温，可使用乙醇/水(80:20，v/v，至少四次)作为洗脱剂超滤直接纯化反应物，生成310mg浅黄色固体联氨中间产物。产量71％.1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.75(m,10h),4.37(m,20h),3.40-3.70(m,212h),2.98(t,20h,j＝7.60hz),2.50(t,20h,j＝7.60hz),2.30-2.60(m,20h),2.05-2.18(m,120h),1.90(m,20h),1.54(m,24h),0.56(m,4h),0.05-0.14(m,444h)ppm。
在室温下在氩气条件下向联氨中间产物(50mg)的甲醇溶液(1.5ml)中加入固体阿霉素(12mg)。搅拌反应混合物2min。随后加入催化量的tfa。在室温下搅拌反应混合物48h。通过蒸发除去溶剂得到残留物。将残留物溶于乙醇(10ml)并将溶液离心。收集上清液并通过ppt
实施例10
(10)的制备
向聚合物(4)(82.0mg,0.01mmol)的乙腈溶液(2ml)中加入dipea(0.04ml,0.3mmol)，随后加入化合物(10a)(60mg,0.09mmol)
将反应混合物加热至80℃并在相同温度下搅拌2h。然后通过蒸发除去溶剂得到残留物。使用乙醇/水(80:20，v/v，至少四次)作为洗脱剂用纤维素再生膜(截留分子量为10000道尔顿)超滤纯化残留物，生成72mg深绿色固体化合物(10)。产量：60％。测得化合物(10)的最大荧光发射波长(激发波长635nm)为705nm。
实施例11
向双(羟烷基)封端的聚(二甲基硅氧烷)(5.6g,1mmol)的甲苯溶液(25ml)中加入2,6-卢剔啶(0.35ml,3mmol)，然后在氩气下在冰浴中滴加三氟甲磺酸酐(0.4ml,2.4mmol)的己烷溶液(2.5ml)。在同一温度下搅拌反应混合物3h。随后在真空下除去溶剂生成黄色油状活性中间产物。将该油状物溶于氯仿(15ml)和乙腈(20ml)的混合溶剂中。在室温下加入单体2-甲基-噁唑啉(3.4ml,40mmol)。再次将反应混合物加热至60℃并在同一温度下搅拌48h。随后在室温下用叠氮化钠(2.6g,40mmol)淬灭。通过蒸发除去溶剂得到残留物。使用乙醇/水(80:20，v/v，至少四次。在第一次加入5ml饱和nahco3溶液)作为洗脱剂用纤维素再生膜(截留分子量为5000道尔顿)超滤纯化残留物，生成6.5g浅黄色固体化合物(11)。产量：72％,1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.25-3.70(m,160h),2.05-2.21(m,120h),1.56(m,4h),0.50(m,4h),-0.02-0.20(m,444h)ppm。
实施例12
(12)的制备
向聚合物(11)(440mg,0.05mmol)的dmf溶液(5ml)中加入n,n,n′,n″,n″-五甲基二亚乙基三胺(pmdeta，17.3mg，0.1mmol)，随后在氩气下在室温依次加入叶酸衍生物(12a)(59mg,0.12mmol)
和cubr(14.3mg,0.1mmol)。在室温下搅拌反应混合物24h。然后将其暴露在空气中，并使溶液通过中性氧化铝柱。在真空下除去dmf以得到残留物。使用乙醇/水(80:20，v/v，至少四次)作为洗脱剂用纤维素再生膜(截留分子量为5000道尔顿)超滤纯化残留物，生成245mg浅黄色固体化合物(12)。产量：50％.1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.72(m,2h),7.90(m,2h),7.71(m,4h),6,74(m,4h),4.20-4.90(m,14h),3.35-3.70(m,160h),1.90-2.25(m,128h),1.61(m,4h),0.58(m,4h),0.05-0.14(m,444h)ppm。
自组装颗粒的制备
制备的一般方法
本发明的两亲性聚合物(即通式(i)-(ii))做为组成成分来制备自组装颗粒，尤其是胶束和囊泡。在一些实施方式中，所述自组装颗粒包括独立的治疗剂或诊断剂，或寡核苷酸。所述自组装颗粒可通过以下方法获得：
a.纳米沉淀法
在搅拌的条件下，将一种或一种以上两亲性聚合物成分溶于有机溶剂(例如，乙醇)。随后向该溶液滴加水性溶液(例如pbs)。连续搅拌2h至24h后，通过指定孔径的过滤器(例如millex-gv,0.22μm；millipore)过滤溶液，生成均质自组装颗粒群。就胶束的制备而言该方法是特别优选的。通过蒸发除去有机溶剂。通过尺寸排阻柱(例如sepharose2b)进行进一步纯化。
自组装颗粒溶液中的两亲性聚合物组分的最终浓度为cmc(临界胶束浓度)至约50mg/ml。
上述方法中使用的有机溶剂可选自，但不限于，诸如极性质子性溶剂或极性非质子性溶剂之类的水溶性有机溶剂，所述极性质子性溶剂例如诸如甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇之类的醇，所述极性质子非质子性溶剂例如thf、dmf、1,4-二氧六环、dmso、丙酮、乙腈、二甲氧乙烷dme。上述方法中使用的水溶液可选自，但不限于重蒸馏水；氯化钠溶液(例如重量百分数9％)；诸如pbs缓冲液、tris缓冲液之类的生物缓冲液；和诸如氯化铵溶液之类的其它无机盐溶液。
b.膜再水化法
将一种或一种以上两亲性聚合物溶于有机溶剂。在高真空下蒸发溶剂，并在水性溶液中将得到的聚合物膜再水化，随后通过聚碳酸酯过滤器(例如0.2mm孔径)挤出，然后通过尺寸排阻柱(例如sepharose2b)纯化。对于囊泡的制备而言，这种方法特别优选。
自组装颗粒溶液中的两亲性聚合物的最终浓度为cmc(临界胶束浓度)至约50mg/ml。
该方法中使用的有机溶剂可选自，但不限于，诸如二氯甲烷、丙酮、氯仿、thf、乙醇、甲醇之类的挥发性有机溶剂。该方法中使用的水性溶液可选自，但不限于重蒸馏水；氯化钠溶液(例如重量百分数9％)；诸如pbs缓冲液、tris缓冲液之类的生物缓冲液；以及诸如氯化铵溶液之类的其它无机盐溶液。
在a和b两种方法中，独立的治疗诊断剂或寡核苷酸可如下并入自组装颗粒中：将可溶于有机溶剂(例如，诸如紫杉醇之类的疏水药物)的药剂溶于用于溶解两亲性聚合物的同一溶剂中。将诸如寡核苷酸之类的可溶于水的药剂预先溶于水性溶液。
c.固体再水化法(松散膨胀法)
将松散粉末形式的两亲性聚合物中的一种或一种以上直接加入水性溶液。持续搅拌混合物直至观察到聚合物完全水合。随后将得到的混合物挤压通过聚碳酸酯过滤器(例如0.2mm孔径过滤器)并且随后通过尺寸排阻柱(例如sepharose2b)纯化。
本发明的自组装颗粒通过本领域公知的方法表征。例如，可使用动态光散射(dls)检测和透射电子显微(tem)分析来确定颗粒粒径。颗粒的平均粒径可通过dls确定并进一步通过tem检测来确认。在25℃在malevernzetasizernanos(zen1600)上对自组装颗粒样品进行dls检测。使用在加速电压为200kv下运行的feicm200显微镜获取tem结果。对于tem分析而言，首先将自组装颗粒的样品溶于蒸馏水(水中重量百分数1wt％)，随后放置于铜网上，所述铜网由涂有碳的硝酸甘油膜覆盖。然后加入染色剂(2％乙酸双氧铀)。
实施例13-包括两亲性聚合物(6)的胶束
在搅拌条件下将5mg两亲性聚合物(6)溶于50ul乙醇以制备胶束。向该溶液中滴加0.95ml磷酸盐缓冲盐水(pbs)。持续搅拌2h后，使溶液通过指定孔径的滤膜(millex-gv,0.22μm；millipore)进行过滤以生成均质胶束群。
实施例14-包括两亲性聚合物(6)和(13)的胶束
在搅拌条件下将5mg两亲性聚合物(13)和5mg两亲性聚合物(6)溶于50ul乙醇以制备胶束。向该溶液中滴加0.95ml磷酸盐缓冲盐水(pbs)。持续搅拌4h后，使溶液通过指定孔径的滤膜(millex-gv,0.22μm；millipore)进行过滤以生成均质胶束群。
实施例15-包括两亲性聚合物(6)和(13)的囊泡
将10mg聚合物(6)和10mg聚合物(13)溶于10ml氯仿以制备囊泡。在高真空下蒸发溶剂以生成干燥聚合物膜，并在搅拌条件下在20ml1×pbs缓冲液(ph＝7.4)中将得到的聚合物膜再水化12h，随后挤压通过聚碳酸酯滤膜(0.2mm孔径)，以生成囊泡。
实施例16-包括两亲性聚合物(13)和(12)的胶束
在搅拌条件下将5mg两亲性聚合物(13)和0.5mg两亲性聚合物(12)溶于50ul乙醇以制备胶束。向该溶液中滴加0.95ml磷酸盐缓冲盐水(pbs)。持续搅拌6h后，使溶液通过指定孔径的滤膜(millex-gv,0.22μm；millipore)进行过滤以生成均质胶束群。
实施例17-封装紫杉醇的包括两亲性聚合物(13)和(12)的胶束
在搅拌条件下将5mg两亲性聚合物(13)、0.5mg两亲性聚合物(12)和1.5mg紫杉醇溶于50ul乙醇以制备胶束。向该溶液中滴加0.95ml磷酸盐缓冲盐水(pbs)。持续搅拌6h后，使溶液通过指定孔径的滤膜(millex-gv,0.22μm；millipore)进行过滤以生成均质胶束群。用pbs作为洗脱剂通过尺寸排阻柱进一步纯化胶束以除去未封装的紫杉醇。冻干得到的溶液，生成固体纳米颗粒。
实施例18-包括两亲性聚合物(9)和(12)的胶束
在搅拌条件下将5mg聚合物(9)(与阿霉素缀合)、0.5mg聚合物(12)溶于50ul乙醇以制备胶束。向该溶液中滴加0.95ml磷酸盐缓冲盐水(pbs)。持续搅拌5h后，使溶液通过指定孔径的滤膜(millex-gv,0.22μm；millipore)进行过滤以生成均质胶束群。
实施例19-封装盐酸阿霉素的包括两亲性聚合物(14)和(12)的胶束
在搅拌条件下将5mg聚合物(14)、0.5mg聚合物(12)和1.5mg盐酸阿霉素溶于50ul乙醇以制备胶束。向该溶液中滴加0.95ml磷酸盐缓冲盐水(pbs)。持续搅拌6h后，使溶液通过指定孔径的滤膜(millex-gv,0.22μm；millipore)进行过滤以生成均质胶束群。用pbs作为洗脱剂通过尺寸排阻柱进一步纯化胶束以除去未包裹的阿霉素。随后冻干得到的溶液以生成固体纳米颗粒。
实施例20-包裹罗丹明b衍生物的包括两亲性聚合物(12)和(13)的胶束
在搅拌条件下将5mg聚合物(13)、0.5mg聚合物(12)和0.1mg罗丹明b衍生物溶于50ul乙醇以制备胶束。向该溶液中滴加0.95ml磷酸盐缓冲盐水(pbs)。持续搅拌6h后，使溶液通过指定孔径的滤膜(millex-gv,0.22μm；millipore)进行过滤以生成均质胶束群。
实施例21-包裹sirna的包括两亲性聚合物(4)和(12)的胶束
通过水性自组装制备基于两亲性聚合物(4)和(12)的装载sirna的胶束。在搅拌条件下将所述聚合物各自溶于200μl乙醇以生成2.5％(w/v)溶液。随后将两种聚合物溶液合并以便得到预期的n/p比(聚合物(4)的胺基与寡核苷酸的磷酸基团的摩尔比)，同时，该两亲性聚合物混合物还含有0.5mol％的聚合物(12)。将预期量的该混合物加至100μl含有40pmolsirna的10mmpbs缓冲液中。涡旋震荡得到的混合物2min，然后在室温下温和搅拌1h。
实施例22-靶向基因输送模型的包裹sirna的含有两亲性聚合物(4)和(12)的胶束
以类似于实施例21描述的方法制备基于两亲性聚合物(5)和(12)的装载sirna的胶束。将两种聚合物溶于乙醇并与100μl含有40pmolsirna的10mmpbsph7.4温和地混合，得到预期n/p比5。在室温下进一步孵化生成的混合物。
用于胶束包裹的sirna为cy3荧光标记的抗-gfpsirna、抗-gfpsirna和随机序列的sirna(microsynth,balgach,瑞士)。靶向gfp的sirna序列为5-gcagcacgacuucuucaag-3’(正向)和5-cgucgugcugaagaaguuc-3’(反向)。
生成的胶束(“靶向胶束”)的ζ电势通过检测电泳迁移率确定。添加(未标记的)sirna之前形成的胶束的颗粒表面也被确定为弱阳性(+4mv)，其说明大多数正电荷被外部pmoxa壳屏蔽。测得在n/p为5条件下制备的包括sirna的胶束具有少许正电荷(+4mv)且粒径较小(粒径为21±3nm)。表面电荷几乎中性(ζ电势在﹣10至﹢10mv之间)的纳米颗粒一般不太可能影响体内的免疫反应。为了评估长期稳定性，在37℃下将这些胶束在pbs(ph＝7.4)中储存4天并检测尺寸和ζ电势。在该研究中没有观察到胶束粒径的显著变化。
在癌症叶酸受体(fr)阳性(hela)细胞或正常fr-阴性(hek293)细胞上对装载cy3荧光标记的sirna的靶向胶束(包括两亲性聚合物(5)和(12))和非靶向胶束(只包括两亲性聚合物(5)的胶束)的细胞摄取效率进行了研究。使用所制备的胶束在24孔板(corning)中转染表达绿色荧光蛋白(gfp)的hela细胞，使用根据操作指南制备的lipofectamintmrnaimax作为阳性对照。在孔中制备复合物，之后加入细胞(10’000细胞/孔)和培养基。24h后用pbs洗涤细胞并加入新鲜的生长培养基，在37℃再孵育48h。通过免疫印迹分析法分析靶基因表达的下调量。
免疫印迹分析结果显示在孵育24h后，在用叶酸受体的靶向胶束处理的hela细胞中对cy3荧光标记的sirna细胞摄取明显。在用非靶向复合物处理的hela细胞中观察到较弱的cy3标记的sirna信号(抑制至92±4.2％)。正常fr-阴性hek203细胞显示即使在孵育24h后，对cy3标记的抗gfpsirna也没有明显的细胞摄取。检测到gfp表达被这些靶向胶束抑制至69±5.5％(即大约31％的敲除效率)。
对用不同浓度胶束处理24h和48h的hela细胞进行生存力评估。发现在50μm浓度(即比细胞摄取实验中使用的浓度高10倍)下用胶束孵育48h后细胞生存力仍高于90％(与未处理的对照细胞相比)。
认为两亲性聚合物(5)中存在多个带正电的氨基引起的与带负电的核苷酸物质(即sirna)的相互作用使有效包裹得以实现，并因此保护该遗传物质不受酶降解和其它生理作用影响。这些胶束具有如前所述的净中性电荷、在血清中具有良好的胶体稳定性和低细胞毒性，由此适合用作基因递送的载体。同时，这些还包括配体标记的两亲性聚合物的胶束能够选择性输送sirna并由此提高转染效率。也可预期通过如前文所述的两亲性聚合物(6)、(7)和(8)制备的自组装颗粒具有相似的效果。
实施例23-靶向小鼠中的人移植瘤
类似于所述的一般方法和前文所述实施例(例如实施例20)，通过纳米沉淀法制备包括70wt％的通式(15)的两亲性聚合物和20wt％的通式(16)的两亲性聚合物以及10wt％的通式(17)的两亲性聚合物的靶向胶束，所述通式(16)的两亲性聚合物的末端位置包括肿瘤受体特异性靶向配体，即叶酸，所述通式(17)的两亲性聚合物的末端位置包括罗丹明染料。作为对照，同样使用这些方法制备包括90wt％的通式(15)的两亲性聚合物和10wt％的通式(17)的两亲性聚合物的非靶向胶束。通过dls测得生成的胶束尺寸为直径约20至120nm。
根据既定的实验方案使用植入了人肿瘤细胞的实验室小鼠体内异种移植肿瘤模型(人结肠癌ls174小鼠移植瘤)。在6至8周龄nod.scid小鼠中引入侧腹部移植瘤。收集肿瘤细胞并用pbs缓冲液洗涤。以100μl含有2百万个细胞的量皮下注射小鼠右腹部。当肿瘤体积在任意方向的长度达到0.5cm时，用200μl如上制备的装备有配体并荧光标记的胶束(50mg/kg体重)注射至尾静脉中。作为对照，同样用非-叶酸靶向胶束注射挑选的小鼠。间隔1h、2h、4h、8h和24h通过nighowl对小鼠成像(体内成像)，然后处死该鼠。分离出器官并成像。
结果发现对于包括两亲性聚合物(16)的靶向胶束而言，在肿瘤边缘观察到较强的摄取(图1,1a)；相比之下，观察到不具有叶酸靶向两亲性聚合物组分的对照胶束只有较弱的摄取(图1,1b)。进一步分析荧光图像还发现在非靶向胶束作用下，积聚主要发生在肿瘤的边界区，而在靶向胶束作用下，肿瘤内更深处的摄取能得以提高。