申请人：斯坦福国际研究院
发明人：k·c·布朗和b·j·乌姆劳夫，均来自menlopark,ca。
本申请要求于2014年12月17日提交的第62/093,285号申请的优先权。
本发明是在美国国家卫生研究院国家癌症研究所(thenationalcancerinstituteofthenationalinstitutesofhealth)授予的批准号为r01ca164447和国家科学基金会研究生研究奖学金(thenationalsciencefoundationgraduateresearchfellowship)授予的批准号为146339的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
介绍
设计用于癌症治疗的细胞介导的(cm)免疫疗法以激活身体针对恶性生长的适应性免疫应答(1，2)。通常，cm应答的目的是激活针对肿瘤的细胞毒性t细胞应答以消除癌细胞。这些治疗的原理是直接的，但目前研究肿瘤微环境复杂性的工作(2，3)以及试图直接激活针对肿瘤抗原的t细胞的方法(4-6)证明了与形成针对肿瘤的免疫应答相关的困难。
目前存在几种cm癌症免疫疗法，包括pd-1抑制剂、将活病毒或病毒颗粒注射到肿瘤中和过继性t细胞疗法(1，6-8)。然而，关于功效、安全性和/或成本的担忧已经限制了许多这些治疗的使用。为了解决这些担忧，我们寻求开发基于开发全合成的、最小的递送系统的新的治疗，所述递送系统在不使用活病毒、病毒亚单位或生物来源的材料的情况下，促进人白细胞抗原(hla)i类限制性免疫原性肽在癌细胞上的特异性呈递。
基于这些要求，我们开发了由中性的隐形脂质体组成的基于脂质体的药剂，所述中性的隐形脂质体包封经合成制备的免疫原性hlai类限制性肽。此外，脂质体具有在外表面上的靶向肽，其既在癌细胞中特异性积累，又促进免疫原性肽在hlai类分子中的呈递。因此，设计该治疗以产生特异性针对肿瘤的次级cm免疫应答。
发明概述
本发明提供了纳米颗粒递送系统，其促进免疫原性麻疹抗原在癌细胞中的特异性呈递。该递送系统不包含病毒颗粒、毒素或生物来源的材料。使用该系统的治疗促进针对癌细胞的次级免疫应答的激活，绕过识别肿瘤相关抗原或培训(educate)免疫系统通过初级免疫应答的需求。递送系统是三部分的模块化载体，其仅需要在其外表面上展示癌症特异性靶向肽并且包封免疫原性人白细胞抗原1类限制性肽的隐形脂质体。该靶向纳米颗粒促进肽在主要组织相容性复合体i类分子中的呈递。激活取决于靶向肽、先前的抗原暴露，并且利用新的自噬介导的机制来促进呈递。使用接种的c57bl/6小鼠中的侵袭性llc1模型，采用该脂质体的治疗导致肿瘤生长显著降低。我们展示了新的细胞介导的免疫疗法的原理论证，所述新的细胞介导的免疫疗法是可扩展的、不包含生物来源的材料并且是有效的癌症疗法。
本发明提供了最小的抗原递送系统，其基本上由负载免疫原性人白细胞抗原(hla)1类限制性肽并且用细胞靶向肽表面修饰的peg化的隐形脂质体组成，所述细胞靶向肽介导脂质体结合靶细胞并内化到靶细胞中。因此，该系统由不超过以下三种列举的组分组成或基本上由不超过以下三种列举的组分组成(排除任何会实质上影响系统的基本的和新的可操作性和功能的另外的组分)和/或需要、功能上依赖于或包括不超过以下三种列举的组分：隐形脂质体、靶向肽和hla1类限制性肽。
该系统是模块化的并且可适用于供选择的靶向肽和/或免疫原性肽。多种细胞靶向肽在本领域中是已知的，并且选择靶向多种细胞类型中任一个的适合的肽是容易的，如本文所述，其中优选的靶细胞是致病性的，如癌细胞。类似地，多种免疫原性肽在本领域中是已知的，并且选择供选择的hla类型的适合的肽和具有免疫/接种依赖性的适合的肽是容易的，如本文所述。hla分型在临床实践中是标准化的，并且供选择的免疫的(天然或接种)群体可容易地确定；例如，我们已经类似地测试并验证了源自天花病毒的抗原(h-2kd-限制性牛痘特异性肽，a5275–83，vacv-a52)。
在示例性实施方案中，hla1类限制性肽为麻疹病毒血凝素肽h250，和/或所述细胞靶向肽为癌细胞靶向肽h1299.3。
本发明还提供了制备主题抗原递送系统的方法，其包括以下步骤：通过在1类限制性肽的存在下形成脂质体使peg化的隐形脂质体负载；和/或通过与细胞靶向肽的表面结合对负载hla类限制性肽的peg化的隐形脂质体进行表面修饰。
本发明还提供了使用主题抗原递送系统的方法，其包括以下步骤：将抗原递送系统引入到需要其的宿主中，和/或检测产生的免疫应答或靶细胞的抑制。
本发明具体提供了列举的实施方案的所有组合，如同各自被单独费力地提出一样。
具体实施方案及其实施例的详述
在该概念验证研究中，我们合成了包封h250的脂质体(1)，所述h250为由麻疹血凝素蛋白确定的免疫原性hla1类限制性肽。通过将靶向肽h1299.3展示于外表面上，该脂质体被设计成在癌细胞中特异性内化(10)。h1299.3是使用新的噬菌体展示技术确定的20聚体的癌症特异性靶向肽，所述新的噬菌体展示技术能够选择通过确定的内吞作用机制优先在癌细胞中内化的癌症特异性靶向肽。该肽在赖氨酸核心上二聚化，并且在噬菌体颗粒的语境之外是全功能的。与正常支气管上皮细胞对照细胞系相比，h1299.3肽通过内吞作用的网格蛋白依赖性机制特异性地聚集在一组非小细胞肺癌(nsclc)细胞系中。在该研究中，我们证明h1299.3促进免疫原性抗原在主要组织相容性复合体(mhc)和hlai类分子两者中的功能性呈递，如通过cd8+特异性干扰素(ifn)γ分泌所显示的。此外，h1299.3促进的呈递利用自噬依赖性机制。最后，与使用载体对照的治疗相比，使用包含h250的h1299.3靶向脂质体的治疗显著降低了植入接种的c57bl/6小鼠中的皮下llc1肿瘤的生长速率。
生成靶向脂质体用于病毒抗原在癌细胞中的特异性呈递。该研究的第一个目的是构建适合于将抗原承载物(cargo)特异性递送到癌细胞中的合成的递送系统。载体需要具有高的载荷能力，并且当在hlai类分子中的呈递受到氨基酸残基的尺寸和位置的限制时需要遮蔽免疫原性肽承载物免受修饰(11)。因此，我们决定利用脂质体。脂质体容易由合成材料制备，容易负载合成肽，并且易于使用靶向配体修饰(12)。此外，基于增强的渗透性和保留作用，脂质体在肿瘤中被动积累，潜在地增强了治疗的特异性(13)。我们制备了100-nm的隐形脂质体，其以约60％的负载效率包封经合成制备的9聚体免疫原性肽h250。将用马来酰亚胺修饰的dspepeg2000加入脂质制剂中，以实现包含巯基的靶向配体与脂质体结合(12)。
h1299.3靶向配体在癌症中特异性积累并促进hlai类呈递。为了量化脂质体制剂促进h250免疫原性肽的呈递的能力，我们首先需要开发一个系统来确定h250是否存在于hlai类分子的裂隙(cleft)中。h250是由麻疹感染后对存在于hlaa*0201分子中的肽进行测序而确定的免疫原性肽。因此，我们鉴定了来自hlaa*02阳性的匿名供体的外周血单核细胞(pbmc)，并通过使用游离的h250肽培养供体pbmc并测量ifnγ分泌，确定这些供体是否接种了对抗麻疹的疫苗。我们成功地鉴定了两个供体，其为hlaa*02阳性并先前接种了对抗麻疹病毒的疫苗。来自这两个供体d4和d9的pbmc用于随后的分析中以确定并表征可以促进hla1类呈递的癌症特异性靶向肽。类似地，需要适宜的癌细胞系充当抗原呈递细胞。为此，我们使用人nsclc细胞系h1993，我们确定其为hlaa*02阳性。
接下来，我们筛选已知的癌症特异性靶向肽以鉴定以下靶向肽，所述靶向肽可以促进来自靶向脂质体制剂的h250在细胞外表面上的hlai类中呈递。我们组和其他组已经鉴定了几组癌症靶向肽；因此，我们鉴定了内化到以前公开的h1993中的三种不同的癌症特异性靶向肽：h1299.2、h2009.1和h1299.3。与正常支气管上皮细胞相比，这些肽中的每一种都特异性地内化到nsclc细胞系中(14)。肽通过由靶向肽上的单个巯基的迈克尔加成(michaeladdition)到脂质体上存在的马来酰亚胺而产生的硫酯键结合到脂质体的表面。没有内化到h1993细胞中的肽h460.1用作对照(14)。
为了筛选每种靶向肽，将h1993细胞用含有h250的h1299.2、h2009.1、h460.1或h1299.3靶向脂质体处理3小时。然后洗涤细胞以除去非内化/结合的脂质体，然后与供体pbmc共培养72小时。收集细胞培养物上清液并通过酶联免疫吸附检测(elisa)分析ifnγ分泌，作为t细胞活化的量度。在该检测中游离的h250肽充当阳性对照。仅有包含h250的h1299.3靶向脂质体导致ifnγ(quench)显著增加，并与包含h250的h1299.3靶向脂质体(h1299.3)进行比较。如上所述，将处理的h1993细胞与供体pbmc共培养。再一次，仅有包含h250的h1299.3靶向脂质体导致ifnγ分泌显著增加。这些数据为呈递依赖于h250抗原肽和h1299.3靶向肽二者提供了进一步的支持。使用第二pbmc供体d9重现了这些结果，表明呈递不是患者特异性的。耗尽(depleting)pbmc培养物中的cd8+t细胞导致两种人样品中ifnγ分泌的丧失。这些数据表明h250存在于hlai类分子中，并且含有h250的h1299.3靶向脂质体促进先前接种了对抗麻疹的疫苗的个体的cd8+记忆t细胞应答的激活。
为了进一步表征由该处理产生的免疫应答，我们量化了共培养物上清液中分泌的tnfα的水平。与上述数据相似，我们观察到在两个人供体中，使用包含h250的h1299.3靶向脂质体处理的h1993细胞中的tnfα分泌相对于使用空白脂质体处理的h1993细胞显著增加。一旦耗尽cd8+，在使用包含h250的h1299.3靶向脂质体处理h1993细胞后，观察到tnfα分泌的降低。
为了扩展这些研究的广度，我们鉴定了内化h1299.3靶向肽的源自c57bl/6小鼠的鼠肺癌细胞系，lewis肺癌1(llc1)。我们随后通过使用h250的扩增形式对c57bl/6小鼠接种，并随后收集淋巴细胞作为cd8+t细胞的来源，生成具有tcr的鼠cd8+t细胞，所述tcr识别mhci类负载的h250(1)。使用对照或包含h250的h1299.3靶向脂质体处理llc1细胞，洗涤，然后孵育。耗尽淋巴细胞库中的cd8+t细胞导致与人数据类似的ifnγ分泌的显著丧失。因此，h1299.3靶向脂质体系统能够递送h250用于在mhc和hlai类分子二者中的功能呈递。
促进hlai类呈递的h1299.3需要自噬。为了确定h1299.3促进h250在hlai类分子中呈递的机制，我们表征了h1299.3肽的亚细胞积累。先前的数据表明新鉴定的h1299.3肽与lamp-1(10)共定位，而其他癌症特异性靶向配体h1299.2和h2009.1在核周区域积累(14)。因此，我们推断，亚细胞运输模式对h1299.3促进的呈递是至关重要的(14)。与之前的结果类似，h1299.3和lamp-1在h1993和llc1细胞系二者中共定位，如通过活细胞激光扫描共聚焦显微镜确定的。然而，这些数据不能为呈递的机制提供明确的解释。lamp1是溶酶体和自溶酶体两者的标志物(15)，提高了自噬在该过程中起作用的可能性。为了检验该假设，使用包含gfp-lc3b构建体的llc1和h1993细胞重复成像实验，所述构建体是自噬体的标志物。在两个细胞系中均观察到与lc3b点的清晰共定位，表明h1299.3使自溶酶体积累。重要地，使用h1299.3的错义序列形式处理相应的细胞没有导致显著的肽内化，因此与lamp-1或lc3b没有共定位。总之，数据显示h1299.3肽在自噬体中的序列依赖性共定位。
如果h1299.3在自噬囊泡中积累，则在使用h1299.3靶向脂质体处理后，扰乱自噬应导致h250在mhci类分子中的呈递丧失。在抑制剂氯喹的存在下，使用包含h250的h1299.3靶向脂质体处理llc1细胞，以与上述人共培养物检测类似的方式与小鼠淋巴细胞一起。与人数据类似，使用包含h250的h1299.3靶向脂质体处理导致ifnγ分泌与对照氯丙嗪、制霉菌素和渥曼青霉素相比显著增加。在使得肽运输发生后，如前所述，固定llc1细胞并与淋巴细胞共培养。使用已知的自噬抑制剂，包括渥曼青霉素和氯喹处理，导致ifnγ分泌与对照相比显著降低。氯丙嗪是网格蛋白介导的内吞作用的抑制剂，其降低呈递。这与我们先前的结果一致，表明h1299.3肽通过网格蛋白介导的机制内化，并且在氯丙嗪的存在下肽的细胞摄取降低(10)。胆固醇依赖性内吞作用的抑制剂制霉菌素没有显示作用。
为了进一步验证自噬在h1299.3促进的呈递中的作用，使用靶向自噬相关蛋白7(atg7)的sirna处理llc1细胞。使用β-肌动蛋白作为负载对照，通过蛋白质印迹定量llc1细胞中通过sirna引起的atg7特异性敲低(knockdown)。使用atg7特异性寡核苷酸处理导致atg7蛋白水平降低～80％，而使用对照sirna发夹观察到atg7水平的最小降低(16)。与未用sirna处理的llc1细胞或用对照sirna处理的llc1细胞相比，atg7的敲低显著降低了用包含h250的h1299.3靶向脂质体孵育的llc1细胞中的ifnγ分泌。我们在h1993细胞中重复了atg7沉默检测。与llc1细胞类似，我们通过蛋白质印迹观察到在用靶向atg7的sirna寡核苷酸处理的h1993细胞中，atg7蛋白水平降低～80％。使用对照sirna处理不影响atg7水平。在使用包含h250的h1299.3靶向脂质体处理并与d9pbmc共培养后，h1993细胞中的atg7敲低导致ifnγ分泌与对照相比显著降低。因此，显微镜和表型数据意味着h1299.3通过自噬依赖性机制促进h250的呈递。
包封h250的h1299.3靶向脂质体在体内降低肿瘤负荷。接下来，我们在鼠模型中使用包含h250的h1299.3靶向脂质体以确定该平台作为cm免疫疗法的功效。对c57bl/6小鼠接种对抗h250的疫苗，然后将llc1细胞皮下植入后侧腹。llc1肿瘤生长直到可触及(～150mm3)，此时使用包含h250的h1299.3靶向脂质体或缺乏h250免疫原性肽的载体静脉内(i.v.)处理小鼠六次。在第三次处理后，我们观察到在处理组中llc1肿瘤生长速率显著降低。在分离肿瘤后，我们观察到肿瘤重量和体积降低>2倍。
在肿瘤功效研究期间，在群组之间没有观察到动物体重的显著差异，并且动物没有显示体重减轻。这些数据在一起表明动物未经历来自处理的明显毒性。然而，脂质体通过肝脏清除，提高了肝毒性的可能性。因此，在使用包含h250的h1299.3靶向脂质体或载体对照处理三次后，我们定量了带有皮下llc1肿瘤的未接种小鼠中的ast和alt的血清水平。所有值均在正常范围内，表明有限的肝毒性。此外，收获肝、肾、心和肺组织，切片并用h&e染色。来自这些器官的切片在治疗组或载体组中均未发现明显异常。
最后，为了将体外数据与体内数据关联，将肿瘤切片并针对cd8+细胞染色。观察到在用h1299.3靶向脂质体处理的肿瘤中cd8+细胞与载体处理的肿瘤相比增加10倍，与显示cd8+t细胞应答的体外数据一致。为了进一步支持h1299.3靶向脂质体在体内递送h250，用包含h250的h1299.3靶向脂质体或载体对照处理带有皮下llc1肿瘤的未接种的小鼠三次。然后收获来自这些小鼠的肿瘤和肝组织，并制得肿瘤细胞和肝细胞的单细胞悬浮液。这些原代细胞直接用作抗原呈递细胞(apc)，用于使用来自接种的c57bl/6小鼠的淋巴细胞的上述共培养检测中。使用包含h250的h1299.3靶向脂质体处理的肿瘤细胞与载体处理的肿瘤细胞相比，诱导的ifnγ分泌显著增加。因此，h1299.3脂质体制剂能够将h250递送到肿瘤，并且h250肽在体内在肿瘤上的mhci类分子中呈递。相比之下，使用肝细胞作为apc，两组的ifnγ分泌水平无差异。因此，即使脂质体积累在肝脏中，h250也不在mhci类中呈递，如通过针对肝细胞产生的不足的cm免疫应答所测量的。总之，这些数据意味着采用包含h250的h1299.3靶向脂质体的治疗是无毒的，并且h1299.3可以促进h250在体内优先在肿瘤中呈递。
我们提出了一种基于开发最小的递送系统的新的癌症免疫疗法，以促进hla1类限制性免疫原性肽在癌细胞中的呈递，导致针对肿瘤的次级免疫应答。该方法绕过了癌症疫苗开发中的主要障碍—识别肿瘤相关抗原或产生针对肿瘤的初级免疫应答的需求。与免疫调节剂不同，通过我们的脂质体递送方法产生的免疫应答是抗原特异性的，并且不涉及免疫应答的总体的普遍激活。这将自身免疫和脱靶效应的问题最小化。该方案也不同于目前基于病毒的免疫疗法，因为不使用病毒产品或活病毒，减少了与这些类型的治疗相关的安全性问题。我们的方法的潜在缺点是不可能产生与病毒感染一起发生的炎症状态，潜在地降低免疫应答的效力。该问题部分地通过使用需要较少炎症输入的次级免疫应答产生免疫应答来减轻。此外，证据表明肿瘤微环境显示出炎症状态，在这种情况下，我们的治疗可能使用该状态进行细胞因子输入(3)。
之前已经使用融合到1类限制性免疫原性肽的霍乱或志贺毒素实现使用递送配体促进hlai类呈递(17–19)。然而，这些毒素在细胞中不加选择地积累，并且未特异性靶向癌细胞。h1299.3在癌细胞中选择性积累，并且显示与正常人支气管上皮细胞的有限结合，从而潜在地提供了更大的治疗窗(20，21)。
此外，制备霍乱或志贺毒素需要生物合成，并且关于毒素载体的免疫原性的担心仍然存在。此外，该工作不同于半抗原着色(haptenpainting)或抗体募集(antibodyrecruiting)策略，其中靶向剂将半抗原递送至细胞表面，导致抗体募集。该手册中提出的治疗被设计成经由内化机制，通过hlai类限制性抗原在癌细胞中特异性呈递来直接激活t细胞，而不是由细胞表面上的半抗原固定产生抗体依赖性细胞毒性。22，23。
h1299.3利用自噬依赖性机制来促进免疫原性肽的呈递。结合以前的数据，h1299.3似乎通过网格蛋白介导的内吞作用内化，并运输到溶酶体或自溶酶体。自噬被认为参与经典的ii类呈递，但其在i类抗原呈递中的作用仍然存在。我们这里的数据以及最近的报告表明，自噬也可以参加i类呈递(24，25)。我们假设h250肽随同自溶酶体的内容物一起循环回到细胞溶质，从而实现由tap转运到er中和随后的呈递(15，26)。
多个亚细胞定位进入包括细胞溶质、内质网和分泌网络的hlai类途径。值得注意的是，前面提到的霍乱毒素b呈递策略使用高尔基分泌网络(20，27)。这意味着运输到多个亚细胞定位的配体可能适用于该cm免疫疗法。然而，我们的数据表明免疫原性肽需要进入hla1类呈递途径才有效。例如，与h1993细胞结合并内化到h1993细胞中的其他nsclc靶向肽不促进呈递(14)。
这些肽积累并保持隔绝(sequestered)在核周隔室中；因此抗原肽的细胞内递送不一定导致抗原的呈递。该治疗被设计为引发次级免疫应答，其实现针对肿瘤的更快速的和潜在有效的免疫应答。然而，还必需的是，疗法是hla型和接种状态依赖性的(1，28)。hla分型在临床实践中是标准化的；然而，需要鉴定结合不同hla类型的免疫原性肽。此外，尽管～95％的美国人已经接种了对抗麻疹的疫苗，但对于许多患者可能是多年以前，意味着需要量化针对麻疹病毒的免疫应答以进行有效治疗(29)。虽然这种治疗依赖于几个变量，但是其性质也是模块化的，并且可以应用于供选择的靶向和/或免疫原性肽。
与缺乏h250的h1299.3靶向脂质体相比，用包含h250的h1299.3靶向脂质体处理接种的小鼠导致llc1皮下肿瘤生长显著降低。这是一个侵袭性的癌细胞系，表明有效疗法的潜力很大。在肿瘤切片中存在的cd8+t细胞增加，以及使用来自包含h250的h1299.3靶向脂质体处理的小鼠的apc离体激活cd8+t细胞意味着该疗法通过在体内产生针对llc1肿瘤细胞的细胞毒性t细胞应答起作用，并且与提供的体外小鼠和人数据一致。产生th1样应答和增加cd8+浸润水平的其他cm疗法已经在动物和人试验中都显示功效(4，6，7，30)。因此，与目前的cm疗法相比，这里提出的疗法以更安全和成本有效的方式实现相似的有益的免疫激活。
总之，本研究提出了一种基于开发最小的递送平台来产生假性感染的癌细胞的新的癌症免疫疗法。我们以原理验证的方式证明，包含免疫原性肽的靶向脂质体可以促进hla1类分子中的呈递，并且该疗法可以有效作为新的癌症免疫疗法。
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