本发明涉及一种茶皂素有效部位的制备方法和其抗家畜病毒的新用途，具体涉及一种茶皂素有效部位预防或治疗家畜病毒性感染疾病的应用，属于药物化学领域。
背景技术：
：：目前猪、鸡等家畜养殖是我国广大农民致富的主要途径，但猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(prrsv)、伪狂犬病毒(prv)等是造成妊娠母猪的繁殖障碍和仔猪夭折等多种家畜致病的重要原因，具有较高的发病率和死亡率。然而，有效抑制病毒感染和降低病毒致死率方面的药物比较少，研制出新型、有效、安全的具有预防和治疗家畜病毒感染性疾病功能疗效的药物具有重大意义。茶皂素(teasaponia)是油茶籽饼中提取的一种五环三萜类化合物。随着茶皂素的应用研究工作不断深入，茶皂素在日用化工、轻纺、及医药行业中的应用亦愈来愈广泛。特别是近年来的药理活性研究发现，茶皂素具有杀灭病毒、抗菌消炎、抗氧化、抗高血压、抑制酒精吸收保护肠胃、以及杀虫驱虫等药理学功能。但油茶籽饼中茶皂素类成分极性大，易溶于水，从水溶液中富集困难，且其抗家畜病毒的文献鲜有报道，本发明提供了一种茶皂素有效部位的制备方法和其抗家畜病毒的新用途。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供一种利用胆甾醇或谷甾醇沉淀法精制茶皂素类成分的制备方法。本发明的另一个目的在于提供一种预防和治疗家畜病毒性感染疾病的药物组合物。本发明的目的是通过如下技术方案实现的：油茶籽饼6-10倍量水煎煮提取后，提取液通过d型大孔吸附脂柱，依次用不同比例的乙醇-水溶剂梯度洗脱，将20％乙醇以下的洗脱部位减压浓缩至干，残渣用适量乙醇水溶解，加入胆甾醇或谷甾醇的乙醇溶液至不再析出沉淀。沉淀用丙酮混悬，抽滤，滤饼用少量丙酮润洗后，干燥得到茶皂素有效部位。上述水洗脱液减压蒸干后，残渣用适量乙醇水溶解，乙醇溶度为1％～95％。上述水洗脱液减压蒸干后，残渣用适量乙醇水溶解后，残渣浓度为：1mg/ml～100mg/ml。上述残渣用乙醇水溶解后，加入的胆甾醇或谷甾醇乙醇溶液浓度为：1mg/ml～40mg/ml。进一步，所述应用为预防或治疗家畜病毒性感染疾病。进一步，所述抗病毒性感染疾病的病原微生物主要包括猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(prrsv)和伪狂犬病毒(prv)等。本发明还提供一种预防或治疗家畜病毒性感染疾病的药物组合物，该组合物包括茶皂素有效部位或其盐以及药学上可接受的辅料。进一步，所述抗病毒药为利巴韦林、拉米夫定、阿昔洛韦、阿德福韦酯、奥司他韦、或奈非那韦中的任一一种或几种。本发明进一步提供一种具有抗病毒作用的药剂盒，该药剂盒由治疗有效量的茶皂素有效部位及常规抗病毒药组成。所述常规抗病毒药为利巴韦林、拉米夫定、阿昔洛韦、阿德福韦酯、奥司他韦、或奈非那韦等临床常用一线、二线抗病毒药物。本发明所述“药学上可接受”指用于家畜时生理上可耐受且通常不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。所述“治疗有效量”指用药剂量足以引起宿主中临床显著病症/症状的改善。具体实施方式本发明以下将结合实施例作进一步详述，但并不限制本发明。制备实施例1茶皂素有效部位的制备按重量比取油茶籽饼10份加入到80份水中，倒入容器中浸泡30分钟，煎煮提取40分钟，过滤后得到茶皂素水煎提取液；将提取液通过d型大孔吸附树脂柱(d型大孔吸附树脂先用丙酮处理后装柱)，用90％乙醇、60％乙醇、40％乙醇和水梯度洗脱，收集水洗脱部位，减压浓缩至干，得残渣。取上述残渣100g，溶于50ml70％乙醇，搅拌下加入10mg/ml胆甾醇的乙醇溶液，至不在有絮状沉淀产生，静置抽滤，滤饼适量蒸馏水洗，干燥。取干燥物混悬于适量丙酮中，抽滤，滤饼用少量丙酮润洗，干燥后得到淡褐色粉末64.9g，即为茶皂素有效部位。制备实施例2茶皂素有效部位的制备按重量比取油茶籽饼10份加入到80份水中，倒入容器中浸泡30分钟，煎煮提取40分钟，过滤后得到茶皂素水煎提取液；将提取液通过d型大孔吸附树脂柱(d型大孔吸附树脂先用丙酮处理后装柱)，用90％乙醇、60％乙醇、40％乙醇和水梯度洗脱，收集水洗脱部位，减压浓缩至干，得残渣。取上述残渣100g，溶于50ml70％乙醇，搅拌下加入10mg/ml谷甾醇的乙醇溶液，至不在有絮状沉淀产生，静置抽滤，滤饼适量蒸馏水洗，干燥。取干燥物混悬于适量丙酮中，抽滤，滤饼用少量丙酮润洗，干燥后得到淡褐色粉末64.9g，即为茶皂素有效部位。效果实施例一茶皂素有效部位抗prrsv病毒活性研究1仪器与材料1.1病毒来源prrsv病毒由高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征活疫苗1.2试验药物实验药物：茶皂素有效部位对照药物：利巴韦林1.3仪器thermo3111型co2培养箱；hfsafe生物安全柜；multiskango酶标仪；京立牌ld5-2b型台式低速离心机；olympusix71倒置荧光显微镜改良型；rpmi-1640培养基、胎牛血清、马血清、0.25％胰蛋白酶溶液、噻唑蓝、磷酸盐缓冲液(赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)；amresco二甲基亚砜(dmso)。marc-145细胞衍生于非洲绿猴肾细胞，购于中国兽医药品监察所。2方法2.1细胞传代培养marc-145细胞于37℃、5％co2环境中生长，3-4天后，待细胞长至瓶底面积的90％以上，即可继续传代培养；新复苏的细胞连续传代3次以上才可接种到细胞培养板中进行后续试验。2.2细胞培养板模型建立marc-145细胞密度为2×104个/ml，按试验要求接种到96孔板中，每孔100μl细胞悬液；接种于6孔板中，每孔2ml；接种到384孔板中，每孔20μl；在37℃、5％co2环境培养，待孔内细胞生长达到底壁90％以上备用。2.3prrsv来源高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒活疫苗(jxai-r株)，生产批号为1012001，由广东大华农动物保健品股份有限公司提供。2.3.1prrsv扩增待marc-145细胞培养至单层后，取适量稀释好的病毒液接种到单层细胞上(25cm2细胞培养瓶内约加入2ml)，轻轻转动培养瓶使病毒液完全覆盖住细胞单层。培养2.5h后，弃掉病毒液，pbs冲洗3次，加入2％细胞维持液继续培养，细胞病变率达到80-90％时收集病毒液。2.3.2prrsv收获把病变细胞在-20℃和4℃间反复冻融3次，3000rpm离心细胞培养液30min，收集上清液，经0.22μm微孔滤膜除菌，分装到冻存管内，-80℃过夜，之后转入液氮长期保存。2.4试验方法2.4.1prrsv毒力测定marc-145细胞消化后，将细胞密度调至2×105/ml后接种到96孔板内，每孔100μl，置于37℃5％co2培养箱中培养。待细胞长至单层，每孔分别接种10-1-10-9100μl病毒液，每个滴度重复8次，继续培养120h。每天观察并记录细胞的病变效应(cytopathiceffect，cpe)和病毒的半数感染量(tissuecultureinfectivedose，tcid50)，按照reed-muench公式计算。2.4.2药物的细胞毒性测定首先将供试药品溶于1％的dmso中，配置成dmso储备液用于后续试验。移液枪吸取4μl1％的供试药品储备液放入1.5ep管内，加入396μl细胞维持液，倍比稀释8个梯度，分别加入长成单层的marc-145细胞96孔培养板上，100μl/孔，每个浓度梯度重复3次，同时设置细胞对照组(只加100μl/孔细胞维持液)。置于5％co2培养箱37℃共孵育72h，弃掉孔内的液体，每孔加入20μl的mtt，培养板置于37℃环境中。4h后弃掉，每孔加入150μl的dmso，再放入37℃30min，轻轻振荡，待显微镜下观察结晶完全溶解，孔内颜色均匀后，酶标仪测490nm处的od值(设630nm为参比波长)。以细胞病变程度和所测得的od值为依据，参照公式cr＝(oda-odb)/oda×100％，a为细胞对照组，b为试验组，计算药物致细胞的病变率(cytopaticratio，cr)。通过graphpadprismtm软件可得出半数安全浓度(50％cytotoxicconcentration，cc50)和最大安全浓度(maximumno-cytotoxicconcentration，mntc)。2.4.3药物对prrsv感染细胞的抑制作用药液倍比稀释6个梯度，将50μl待测药物和50μl的prrsv病毒液同时加入已长至单层的marc-145细胞上(药液的终浓度和病毒液的终浓度分别为最大安全浓度和100tcid50)，每个浓度重复3次，同时设置细胞对照组(只加100μl2％的细胞维持液)、病毒对照组(只加100μl的100tcid50病毒液)、利巴韦林对照组(终浓度为0.125mg/ml)，置37℃5％co2的培养箱中，间隔24h显微镜下观察细胞病变并记录，待病毒对照组细胞病变达到80％-90％左右，拍摄各组照片并用mtt法在酶标仪下测得各组od值，通过公式计算得到药物对病毒的抑制率(inhibition，ir)。通过graphpadprismtm软件计算出半数有效浓度(50％effectiveconcentration，ec50)。筛选出药物抑制率高于50％的做后续研究。2.4.4复制抑制试验在已长成单层marc-145细胞的96孔板上，每孔加入100μl为100tcid50的病毒液，置37℃5％co2的培养箱中，使病毒分别吸附1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h，弃掉病毒液，pbs冲洗2遍，加入最大安全浓度的药物，每孔100μl，每组6个重复，在37℃5％co2培养箱中继续培养，当病毒对照组病变率达到80％-90％时，电子显微镜拍照并记录每孔病变状态，mtt测od值。2.4.5吸附抑制试验在已长成单层marc-145细胞的96孔板上，每孔加入100μl最大安全浓度的药物，在37℃分别加入培养15min、30min、1h、2h、4h、6h，每组重复6次，然后将板子放入4℃预冷1h，弃掉药液，pbs冲洗2遍，于每孔在加入100μl100tcid50病毒液，4℃培养2.5h后，在将96孔板放入37℃5％co2培养箱继续培养，眼观病毒对照组病变率达到80％-90％时，弃液，使用mtt测od值。2.4.6直接杀灭试验先将终浓度为最大安全浓度的药液和100tcid50分别在37℃共孵育30min、60min、90min、120min、150min，然又将药液加入96孔板内，每孔100μl，置37℃5％co2培养箱中继续培养，当病毒对照组病变率高达80％-90％时，通过mtt法测定od值。2.4.7药物对prrsv诱导的细胞凋亡的影响将20μl混合液(10μl最大安全浓度的药物和10μl100tcid50prrsv病毒液)加入长满单层细胞的384孔内，每组4个重复样品。包括细胞对照组、病毒对照组、阳性对照组、不同剂量药物组，共6组。培养48h后，预冷pbs冲洗2次，按annexinv-egfp(av)、propidiumiodide(pi)和bindingbuffer以1∶1∶100比例避光混匀，每孔加入20μl荧光液，室温避光反应15min后，倒置荧光显微镜观察细胞凋亡形态并拍照。2.4.8pcr测定目的基因2.4.8.1特异性引物的设计：选取目的基因核酸序列cds区的序列，使用primer3plus引物设计软件设计了以下5对引物(表1)。表1引物序列及pcr产物大小table.1primersequencesandthesizeofpcrproducts2.4.8.2总rna的抽提按照trizol说明书，提取marc-145细胞模型中的rna，并用核酸浓度测定仪检测rna的浓度和完整性。2.4.8.3rt-pcr参照takara反转录试剂盒说明书，构建普通pcr反应体系，并用荧光定量pcr测定目的基因。以质粒为模板，n-f、n-r为引物，实施sybrgreenrt-pcr扩增，然后用allpoints方式采集荧光新号制作出溶解曲线，继而通过溶解曲线验证n基因的特异性。2.4.9westernblot分析茶皂素有效部位对prrsvn蛋白的影响常规总蛋白样品的制备，并应用sds-page电泳，检测不同浓度茶皂素有效部位在不同时间点抑制n蛋白的表达作用。参照北京康为高灵敏度化学发光试剂盒说明书配置好发光液，将发光液均匀涂满整张膜后，室温孵育1-5min，然后再暗室内进行x胶片的曝光。经x光显影机显影、定影并成相，最后扫描胶片，保存并做处理分析。2.4.10细胞凋亡检测茶皂素有效部位对prrsv诱导的细胞凋亡的影响：分别将10μl的不同浓度的待测茶皂素有效部位和利巴韦林与10μl的病毒液同时加入已长至单层的marc-145细胞上，在37℃5％co2培养箱中共孵育48h(病毒液和药物的终浓度分别为100tcid50和最大安全浓度)，同时设置细胞对照组(只加20μl的2％的细胞维持液)、病毒对照组(只加20μl的100tcid50病毒液)，每组重复4次。pbs洗涤2次后，将annexinv-egfp(av)、propidiumiodide(pi)、bindingbuffer按照1∶1∶100的比例避光混匀，每孔加入20μl混合液，室温避光反应15min后，在倒置显微镜下观察细胞凋亡形态并拍照。2.4.11数据分析本试验所有数据及其方差分析均由graphpadprismtm(graphpadsoftware，inc.california，usa)软件计算处理得到，所有数据均以mean±sd表示，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。本试验所有细胞图片的采集均由plus6.0(mediacyberneticsinc.，usa)软件拍摄、处理。所有试验均经过三次独立重复试验，每次试验设置4个重复。3.结果3.1药物的细胞毒性测定结果根据cpe记录情况和mtt法测定od值的结果计算得到细胞病变率，确定供试药物和利巴韦林(ribavirin，rv)的最大安全浓度(maximumnoneytotoxicconcentration，mntc)和cc50(50％cytotoxicconcentrations)(见表2)。不论是从cpe的观察记录结果还是经mtt法测定的结果来看，样品和阳性药在安全范围内对细胞的毒性作用均小于10％，认为在所测试的浓度范围内对细胞没有毒性作用。表2药物的细胞毒性试验汇总table2summaryofcytotoxicityofthedifferentdrugs注：cc50表示为mean±sd，数据由4次重复所得。所有药物的溶解媒介均为1％dmso。note：cc50representasmean±sdoffourreplications.allthedrugsweredissolvedby1％dmso.3.2病毒毒力测定结果病毒毒力的测定结果如表3所示，prrsv在marc-145细胞上的tcid50＝10-7.39，也就是在marc-145细胞上接种病毒浓度为10-7.39的病毒液0.1ml时，可使50％的细胞受到感染。本试验中所使用的病毒毒力均为100tcid50。表3prrsvtcid50测定结果table3theresultsofprrsvtcid503.3药物抗病毒试验结果结果表明(见表4)，茶皂素有效部位具有较强抑制prrsv活性的作用，明显高于利巴韦林(63％)，茶皂素有效部位对prrsv的抑制率高达100％。就si指数而言，茶皂素有效部位的si小于利巴韦林。从量-效曲线上看，茶皂素有效部位呈剂量依赖关系，即随着药物浓度的降低，其对prrsv的抑制率也随之下降。表4药物抗病毒试验结果table4summaryofantiviralassayofthedrugs3.4ts对病毒复制阻断作用的试验结果由表5可以看出，无论是prrsv感染marc-145细胞后的1h还是14h后加药(最大安全浓度)，茶皂素有效部位均表现出较强的抗病毒作用，且各个时间点均表现出显著差异(p＜0.05)。如表5所示，ts在各个时间点的抑制率都高于75％；感染6h-10h后，抑制率最高，达到100％；感染12h后，药物的抑制效果开始下降。结果表明，ts对prrsv的复制有持续抑制作用。表5ts对prrsv复制阻断作用结果table5theresultofanti-prrsvreplicationofts注：相同字母表示组与组之间差异不显著(p＞0.05)，不同字母表示组与组间差异显著(p＜0.05)。3.5荧光定量pcr测定结果(1)ts对prrsvn基因拷贝数的影响：prrsvn基因是最具有免疫原性的蛋白，在病毒的生命周期中起着至关重要的作用。通过荧光定量pcr方法检测茶皂素有效部位对n基因拷贝数的影响，从而来判断茶皂素有效部位影响prrsv复制的强弱。数据表明(见表6)，在病毒感染早期，不同组间n基因mrna水平无显著差异(p＞0.05)；感染20-52h后，茶皂素有效部位组(30μg/ml)极其显著地抑制了n基因的表达(p＜0.001)。表6不用时间点ts对prrsv基因拷贝数的影响fig.4theeffectoftsonngenecopiesatdifferentpoints注：相同字母表示组与组之间差异不显著(p＞0.05)，不同字母表示组与组间差异显著(p＜0.05)。(2)荧光定量pcr检测pabp、pcbp1和pcbp2mrna的表达量：pabp、pcbp1和pcbp2是细胞宿主蛋白，可以影响prrsv复制。选用最佳反应体系，对病毒组和加药组的pabp、pcbp1和pcbp2基因进行定量，通过18srna参照校正，采用2-δδct对目的基因表达量进行分析比较。结果表明，marc-145细胞感染prrsv24h后，茶皂素有效部位显著下调pabp的表达(p＜0.001)，而对pcbp1和pcbp2基本无影响(p＞0.05)。感染48h后，药物处理组与病毒组相比较，pabp、pcbp1和pcbp2的mrna表达量几乎无任何改变(p＞0.05)。结果表明(见表7)，茶皂素有效部位处理组只在细胞感染病毒24h后下调pabp的表达。表7茶皂素有效部位对靶基因mrna表达量的影响table7theeffectoftsonrelativeexpressionlevelsoftargetgenes.注：相同字母表示组与组之间差异不显著(p＞0.05)，不同字母表示组与组间差异显著(p＜0.05)。3.6westernblot的测定结果不同浓度ts处理prrsv感染的细胞，分别在24、48和72h收集样品，试剂盒提取总蛋白，进行sds-page电泳试验，转膜，一抗、二抗孵育，ecl发光试剂盒检测蛋白条带。图1结果表明，ts(30μg/ml)在感染72h后，几乎完全抑制了n蛋白的合成，且抑制率显著高于利巴韦林(125μg/ml)。所有数据都表明，ts能够有效抑制prrsv复制。β-actin为内参对照。通过westernblot分析prrsvn蛋白。结果表明，ts在不同时间点抑制prrsvn蛋白的表达，呈剂量依赖性。3.7药物对prrsv吸附的测定结果无论将ts与细胞共培养15min还是360min，再感染prrsv，其对prrsv的抑制率均在65％以上，结果表明ts能够持续阻止prrsv对marc-145细胞的吸附(见表8)。表8ts对prrsv吸附阻断作用结果fig8theresultofanti-prrsvadsorptionoftreatedwithts注：相同字母表示组与组之间差异不显著(p＞0.05)，不同字母表示组与组间差异显著(p＜0.05)。3.8药物对prrsv直接杀灭的测定结果先将ts于prrsv共孵育不同时间点(30min-150min)，在感染marc-145细胞，发现所有时间点的抑制率均在80％左右，且各时间点之间没有显著差异(p＞0.05)，图2表明ts可以直接灭活prrsv，并不呈现时间依赖性。3.9药物对prrsv诱导细胞凋亡的测定结果采用av-pi双染试剂盒检测了prrsv诱导的细胞凋亡。annexinv-egfp是一种带绿色荧光的ca依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。碘化丙啶(propidiumiodide，pi)是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但在凋亡晚期细胞和坏死细胞，pi能透过细胞膜和细胞核结合呈现红色。从荧光显微镜镜下观察，当marc-145细胞感染prrsv48h时，与细胞对照组相比，prrsv可以诱导宿主细胞的凋亡，且晚期凋亡数量显著增多。相同条件下观察发现不同浓度ts并不影响正常细胞的生长，而不同浓度ts干预感染prrsv得细胞模型后，凋亡细胞数量显著低于prrsv对照组。结果表明ts能够抑制prrsv诱导的细胞凋亡，且效果好于利巴韦林。4.结论ts(茶皂素有效部位)在marc-145细胞上具有抗prrsv作用，且呈剂量依赖关系。其中，ts抑制率最高为100％，ts在病毒复制1-14h间抑制率均高于76％，阻断prrsv吸附于细胞的抑制率均高于65％且对prrsv的直接灭活率高于80％。荧光定量pcr结果显示感染病毒20h-52h后，ts可显著抑制prrsvn基因合成(p＜0.001)，感染24h，ts处理组与病毒对照组做比较，只有pabpmrna表达量下降(p＜0.001)。westernblot结果显示ts处理组对prrsvn蛋白表达呈抑制作用，且呈剂量依赖性。此外，ts处理组的晚期细胞凋亡量明显低于prrsv模型对照组。ts在体外marc-145细胞模型上具有抗prrsv的作用。其抗病毒机制可能是通过直接杀灭prrsv、持续抑制prrsv复制、影响prrsv吸附以及干扰细胞凋亡来实现的。此外，ts处理组可以抑制n基因合成及其蛋白表达，下调pabpmrna的表达量，进一步解释了其抗病毒机制。效果实施例二茶皂素有效部位抗prv(伪狂犬病毒)活性研究1仪器与材料1.1病毒来源prv病毒由高致病性伪狂犬病毒活疫苗1.2试验药物同效果实施事例一。1.3仪器同效果实施事例一。2方法所用细胞为vero细胞；其他实验条件和方法均同效果实施事例一。3结果表1本发明茶皂素有效部位对prv抑制作用4结论本发明茶皂素有效部位具有一定的抗prv感染活性，但对prv抑制作用效果显著弱于其抗prrsv活性，实验结果表明茶皂素有效部位抗病毒活性具有一定的选择性，提示茶皂素有效部位临床应用中不会造成因对不同病毒起效剂量不一致而引起多种病毒感染时对其耐药性的发生。附图说明图1不同浓度的ts在不同时间点抑制prrsvn蛋白的表达图；图2ts对prrsv直接灭活的结果图。当前第1页12当前第1页12