本发明属于纳米生物材料技术领域，具体涉及一种近红外光监控，可控药物释放的介孔二氧化硅微球及其合成方法。
背景技术：
自由的药物分子输运存在很多问题，包括较低的稳定性、较差的选择性和较低的溶解可分散性。而纳米/微米载体的可控药物输运则可以克服这些问题。纳米/微米载体用于可控的药物分子输运和释放的原理是基于内部或外部的驱动，使负载的药物泄露出来。在内部驱动体系中，药物的释放响应于目标组织较之于其他组织的独特的生理性质，如pH、氧化还原性、温度等。因此，利用这些微环境的变化，以实现可控药物输运的纳米/微米载体成为了当今药物载体材料研究的重点。而在这些纳米/微米载体中，介孔二氧化硅受到了极大的关注。这不仅是因为介孔二氧化硅的高稳定性、化学惰性、可控的孔径、光学透明及合成过程简单、可控、可重复性高等优势，而且介孔二氧化硅的存在为后续药物分子的负载、生物大分子的嫁接和纳米颗粒的粘附提供了便利。
近十年以来，近红外生物成像因其在疾病的早期诊断和治疗方面的突出表现而受到了科学研究者的广泛关注。较之于传统的断层层析成像技术（如CT、PET、MRI等），近红外生物成像能实现更高的时间和空间分辨率；而较之于紫外-可见光，近红外光其本身就具有更深的穿透深度（1-2cm）。基于此，科学研究者可以简单地将近红外纳米材料（近红外染料、近红外量子点、近红外稀土纳米晶体、贵金属纳米簇等）嵌入介孔氧化硅的骨架或孔道内，以实现实时跟踪药物载体的目的。然而，当药物载体携带药物进入生物组织后，以往的近红外生物成像往往只能起到跟踪药物载体的作用，而对于药物的释放量和释放速度的监控，就显得无能为力了。在一个合理的给药系统中，药物的释放量和释放速度，对于医生或科研人员来说，将是重要的信息反馈。因此，开发一种近红外监控，可控药物释放的药物载体已经成为了纳米/微米载药领域进一步发展的当务之急。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种近红外光监控，可控药物释放的介孔二氧化硅微球及其合成方法。
本发明所述的近红外光监控、可控药物释放的介孔二氧化硅微球，是一种多层结构纳米/微米材料，具体由最内核、次外层、最外层以及最内核和次外层间的众多近红外纳米晶体组成。其中，所述最内核为一个光滑的二氧化硅纳米颗粒，它用于调节微球粒径和负载近红外纳米晶体；该二氧化硅纳米颗粒可以粘附大量近红外纳米晶体，这些近红外纳米晶体在一定波长的近红外光激发下，可以发生下转换作用，即发出特定波长的近红外光（波长比激发光长）；所述次外层为一层光滑二氧化硅壳层，用于固定和保护内层的近红外纳米晶体；所述最外层为介孔二氧化硅壳层，该层的介孔二氧化硅可以用于负载目标药物与近红外光纳米晶体的淬灭分子，并连接或包覆响应聚合物，以实现可控药物释放。
本发明提供的上述近红外光监控、可控药物释放的介孔二氧化硅微球，不仅可以实现在不同生理环境下的选择性药物释放，并且能够通过活体成像仪中近红外荧光的位置及强度的变化，反应药物载体位置及药物释放量。
本发明中，所述的光滑的二氧化硅纳米颗粒可由传统溶胶-凝胶法制备得到。其中，溶剂可用醇-水体系，醇可以是：甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇；催化剂可用酸或碱，酸可以是：盐酸、醋酸、磷酸或酸性氨基酸，碱可以是：氨水、氢氧化钠、氢氧化钾或三乙胺；硅源可以是：正硅酸乙酯、正硅酸甲酯或正硅酸丙酯。所述的光滑的二氧化硅纳米颗粒的大小可通过改变醇/水/催化剂/硅源的比例或种类进行调节，调节范围为50-2000nm。该法合成出的二氧化硅纳米颗粒表面带大量羟基，中性条件下表面呈负电，是氢键和静电吸附作用的良好位点。
本发明中，所述的近红外纳米晶体是一种稀土掺杂的纳米晶体材料，包括基质和发光中心两部分；其中，基质材料为：氟化物、氧化物、硫氧化物或卤化物；氟化物为：CaF2、BaF2、LaF3、YF3、ZnF2、NaYF4、NaYbF4、LiYF4、KYF4、NaGdF4或NaLuF4；氧化物为：La2O3、Y2O3、Yb2O3、Gd2O3或Lu2O3；硫氧化物为Y2O2S、CaS2或La2S3；卤化物为Cs3Lu2Br9；发光中心为Ce3+、Pr3+、Nd3+、Sm3+、Eu3+、Tb3+、Dy3+、Ho3+、Er3+、Tm3+、Yb3+中的一种或者几种；发光中心的摩尔含量为0.01%-50%。该近红外纳米晶体可以通过静电吸附或氢键作用大量吸附在上述光滑的二氧化硅纳米颗粒上，形成硅球-近红外纳米晶体复合物。
本发明中，所述的次外层为一层光滑二氧化硅壳层，该二氧化硅壳层可以通过传统溶胶-凝胶法包覆在上述光滑的二氧化硅纳米颗粒及其负载的近红外纳米晶体复合物上得到。其中，溶剂可用醇-水体系，醇可以是：甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇；催化剂可用酸或碱，酸可以是：盐酸、醋酸、磷酸或酸性氨基酸，碱可以是：氨水、氢氧化钠、氢氧化钾或三乙胺；硅源可以是：正硅酸乙酯、正硅酸甲酯或正硅酸丙酯。包覆完该层后，近红外纳米晶体将牢牢地嵌在硅酸盐的骨架中，不易脱落，因此，每个颗粒的光学性质也变得稳定了。
本发明中，所述的最外层为介孔二氧化硅壳层，它可以通过传统溶胶-凝胶法或两相法生长在次外层光滑二氧化硅壳层之外得到。其中在传统溶胶-凝胶法中，溶剂可用醇-水体系，醇可以是：甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇；催化剂可用酸或碱，酸可以是：盐酸、醋酸、磷酸或酸性氨基酸，碱可以是：氨水、氢氧化钠、氢氧化钾或三乙胺；硅源可以是：正硅酸乙酯、正硅酸甲酯或正硅酸丙酯；表面活性剂可以是十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或十二烷基三甲基溴化铵。而两相法中，溶剂包括油水两相，其中，油相可以是十氢萘、甲苯、十八烯或环己烷；催化剂可以是三乙胺、三乙醇胺或三甲胺；硅源可以是正硅酸乙酯、正硅酸甲酯或正硅酸丙酯；表面活性剂可以是十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或十二烷基三甲基溴化铵。该介孔呈发散状，孔径可以在2纳米到12纳米的范围内连续调节，孔道深度也可以在20纳米到500纳米的范围内连续调节，有利于大分子药物的负载（如蛋白类药物及基因片段等）及负载量的提升。在负载前，将药物分子与一些可以淬灭近红外光的染料结合，可以使嵌入的近红外纳米晶体起到传感器的作用，从而监测药物分子的释放量及释放速度。另外，该介孔孔道表面还为响应性聚合物（pH敏感、氧化还原敏感、酶响应等）的连接提供了位点，使本发明所述的介孔二氧化硅微球实现可控释放的功能。
本发明提供上述近红外光监控，可控药物释放的介孔二氧化硅微球的合成方法，具体步骤如下：
（1）近红外纳米晶体的制备：
a、采用油酸、油胺、三正辛基氧膦、十八烯、液体石蜡为高温溶剂，稀土原料采用稀土氯化物、稀土三氟乙酸盐、稀土硝酸盐或者稀土醋酸盐；反应物还应包括氟化铵、氟化钠、氟化锂、氟化钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂中的一种或者几种；在200-320摄氏度、氮气气氛下反应，得到分散性和均匀性较好的油溶性的近红外纳米晶体；
b、采用盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸为溶剂，对上一步制备的油溶性的近红外纳米晶体进行洗涤，最终将其分散在水中，得到水溶性近红外纳米晶体；
（2）光滑的二氧化硅纳米颗粒的制备及近红外纳米晶体对其的粘附
a、光滑的二氧化硅纳米颗粒采用传统溶胶-凝胶法制备。其中，溶剂用醇-水体系，醇采用甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇；催化剂用酸或碱，酸可以是：盐酸、醋酸、磷酸或酸性氨基酸，碱可以是：氨水、氢氧化钠、氢氧化钾或三乙胺；硅源采用正硅酸乙酯、正硅酸甲酯或正硅酸丙酯。其大小可通过改变醇/水/催化剂/硅源的比例或种类进行调节，调节范围为50-2000nm；
b、近红外纳米晶体对光滑二氧化硅纳米颗粒的粘附。将上一步所合成的光滑二氧化硅纳米颗粒以一定浓度分散于水中，再将步骤（1）中所合成的水溶性近红外纳米晶体逐滴滴入；每次引入的近红外纳米晶体与光滑二氧化硅纳米颗粒的质量比例为1:1到50:1。所得浑浊溶液搅拌6-12小时后离心或过滤，即可得到硅球-近红外纳米晶体复合物；
（3）次外层（光滑二氧化硅壳层）的包覆
将上一步所得硅球-近红外纳米晶体复合物分散于甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇与水的混合溶剂中；再加入适量浓氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺中的一种或几种作为催化剂；最后逐滴加入适量正硅酸乙酯、正硅酸甲酯或正硅酸丙酯中的一种或几种作为硅源；其中，催化剂和硅源的量均占总质量的0.1%到5%。室温反应6-12小时后离心或过滤；
（4）最外层（介孔二氧化硅壳层）的包覆
最外层（介孔二氧化硅壳层）的包覆可用传统溶胶-凝胶法或两相法。
在此，介绍两相法包覆介孔二氧化硅壳层的操作过程：
a、将上一步所得产品分散于水中，并加入适量浓氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺中的一种或几种作为催化剂；然后加入适量十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵中的一种或几种作为表面活性剂；最后，在该水溶液的表面滴加十氢萘、甲苯、十八烯、环己烷中的一种或几种作为油相，并在油相中混入适量正硅酸乙酯、正硅酸甲酯或正硅酸丙酯中的一种或几种作为硅源；其中，催化剂、表面活性剂和硅源的量均占总质量的0.5%到10%。该反应在40-90摄氏度下进行，6-24小时后离心或过滤；
b、将上一步所得样品分散于体积比为1-5%的盐酸-乙醇溶液中，50-60摄氏度回流10-12小时，然后离心或过滤，重复2-5次。
附图说明
图1近红外光监控，可控药物释放的介孔二氧化硅微球的结构示意图。
图2近红外光监控，可控药物释放的介孔二氧化硅微球的透射电子显微镜照片（低放大倍数）。
图3近红外光监控，可控药物释放的介孔二氧化硅微球的透射电子显微镜照片（高放大倍数）。
图4近红外纳米晶体与四磺酸酞菁镍的吸收光谱对比。
图5近红外光监控，可控药物释放的介孔二氧化硅微球在模拟体液（pH=1.2，6.0，7.4）下的药物释放情况与近红外荧光的恢复情况；其中药物释放情况由紫外-可见光谱仪监测所得，近红外荧光恢复情况由荧光光谱仪监测所得。
具体实施方式
实施例1：
（1）近红外纳米晶体的制备：
a、取50mL三口圆底烧瓶为反应容器，首先加入0.95mmolGdCl3，0.5mmolNdCl3随后加入6mL油酸（OA），15mL十八烯（ODE）。将上述混合物搅拌加热至140℃，真空脱水脱氧60分钟，最终得到透明混合溶液。待该透明溶液冷却至室温后，将2.5mmolNaOH和4mmolNH4F溶解于10mL甲醇溶液中混合并且注入上述反应溶液中进行反应。连续搅拌20分钟后，将反应物在高纯氩气保护下以10℃/min的速度升温至285摄氏度并保温反应100分钟。待反应结束后，将反应母液冷却至50℃后加入乙醇使产物从溶液中沉淀析出，随后离心，使用无水乙醇反复洗涤3-5次后得到产物；
b、在上述产物中加入100mL稀盐酸溶液（pH=3）室温搅拌12h，过滤弃去沉淀，将滤液进行超速离心（15000rpm）10min，得到固体产品，并用无水乙醇反复洗涤3-5次后分散于10mL去离子水中，即为水溶性近红外纳米晶体。
（2）光滑的二氧化硅纳米颗粒及近红外纳米晶体对其的粘附
a、取两个100mL单口烧瓶，在其中一个烧瓶中加入10mL去离子水、10mL乙醇和2mL浓氨水；另一个烧瓶加入20mL乙醇和2mL正硅酸乙酯，两个烧瓶同时于室温搅拌0.5h后迅速混合。室温反应2h后离心，使用无水乙醇反复洗涤3-5次后得到光滑的二氧化硅纳米颗粒；
b、将上述光滑的二氧化硅纳米颗粒分散于10mL去离子水中，取1mL加入20mL烧杯中，一边缓慢磁力搅拌一边将5mL水溶性近红外纳米晶体逐滴加入，室温缓慢磁力搅拌8h后离心，使用去离子水反复洗涤3-5次后得到产物。
（3）次外层（光滑二氧化硅壳层）的包覆
将上步所得硅球-近红外纳米晶体复合物分散于4mL去离子水与6mL乙醇的混合溶剂中，再加入0.2mL浓氨水，室温搅拌0.5h后加入0.2mL正硅酸乙酯，室温反应6h后离心，使用无水乙醇反复洗涤3-5次后得到产物。
（4）最外层（介孔二氧化硅壳层）的包覆
a、将上步产物分散于20mL去离子水中，加入到50mL单口烧瓶中，加入1g十六烷基三甲基氯化铵和0.24mL三乙胺，60℃下缓慢搅拌溶解，再将溶有0.3mL正硅酸乙酯的10mL环己烷缓慢滴在该水溶液的表面，将瓶口密封后在60℃下反应12h。反应结束后将其冷却至室温并离心，使用无水乙醇反复洗涤3-5次后得到产物；
b、将上步产物分散于20mL体积比为2%的盐酸-乙醇溶液中，70摄氏度回流12小时后离心或过滤，重复三次。
该实施例中所制备的介孔微球拥有较大的孔径（8-9nm）和较大的比表面积（200-300m2/g），可以满足很多大分子药物的负载与释放。在730nm或808nm的近红外光激发下，该介孔微球可以发出1060nm的近红外荧光，而在负载的药物中复合一些可以吸收近红外光的染料，就可以淬灭该荧光，从而赋予该载体监控药物释放的功能，而在孔道外修饰响应性的聚合物材料，就能实现药物的可控释放功能，达到近红外监控，可控药物释放的目的。
实施例2：
以蛋白类药物的pH敏感型释放为例，选用四磺酸酞菁镍为被复合的近红外染料。四磺酸酞菁镍与蛋白的疏水区由较紧密的结合，并且其吸收峰可以覆盖700-750nm的区域；因此，在730nm的激发光下，可以利用其吸收系数远远强于近红外纳米晶体的性质（约1000倍），达到淬灭近红外荧光的效果，而在808nm的激发光下，四磺酸酞菁镍吸收很小，因此没有淬灭效果。综上，我们可以选择808nm激发光用于药物载体的跟踪，730nm激发光用于药物释放情况的监控。
（1）四磺酸酞菁镍-牛血清白蛋白复合物的制备
选用牛血清白蛋白作为模拟蛋白类药物。取200mg牛血清白蛋白，溶解于10mL水中，一边缓慢搅拌一边逐滴滴入0.2mL四磺酸酞菁镍的水溶液（1mg/mL），室温搅拌0.5h即可；
（2）四磺酸酞菁镍-牛血清白蛋白复合物的负载与pH响应性聚合物的包覆
选用大豆提取物为pH响应性聚合物，该提取物在pH<7时呈疏水状，倾向于聚集，可用于堵住介孔，而pH>7时呈亲水状，倾向于膨胀，因此可用作pH响应性可控释药。具体操作如下：取实例1中终产物0.5g，分散于1mL水中，逐滴滴加上一步的四磺酸酞菁镍-牛血清白蛋白复合物，室温搅拌12h，离心后将沉淀重新分散在1mL缓冲液（pH=5.5）中，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺各5mg，搅拌1h后加入2mg大豆提取物，室温反应2h后离心，用缓冲液（pH=5.5）洗涤3-5次，最终产物就是近红外光监控，可控药物释放的介孔二氧化硅微球。
本实例中的近红外光监控，可控药物释放的介孔二氧化硅微球可以在弱碱性条件下释放出蛋白类药物，最外层的大豆提取物，不仅可以控制药物的pH选择性释放，而且能够避免较低pH下的体液对孔道内药物的破坏；比如在口服给药的情况下，可以实现肠道的选择性给药。而该给药过程中药物的释放情况可以通过近红外荧光的恢复比例得到监控，而药物载体的代谢情况也能通过近红外荧光的位置得到实时追踪。