蟾毒灵在制备靶向抑制胰腺癌干细胞制剂中的用途的制作方法

本发明属医药技术领域，涉及中药制剂蟾毒灵新的药用用途，具体涉及蟾毒灵在制备靶向抑制胰腺癌干细胞制剂中的用途，所述的制剂抑制肿瘤干细胞自我更新，逆转胰腺癌的耐药。

背景技术：

现有技术公开了胰腺癌作为肿瘤患者死亡原因的第四位，5年生存率仅为5％，调查显示胰腺癌患者中大部分在发现时已失去手术机会，即使其中部分患者有机会接受手术治疗，但仍有大部分患者会出现局部病灶复发或转移。因此，寻求新的治疗策略以抑制胰腺癌的发生发展显得十分必要。有研究公开了肿瘤干细胞在肿瘤的发生发展中起重要作用；研究显示，在胰腺癌中，约有0.2％-0.8％的肿瘤细胞属于肿瘤干细胞，其在胰腺癌细胞生长、侵袭转移和复发中扮演关键角色；有研究发现在胰腺癌干细胞中，cd44、cd24和esa有明显的表达上调；然而，目前临床实践中尚无有效的药物能抑制胰腺癌干细胞的分布。

蟾毒灵是从中医药蟾酥中提取的一种强心苷类药，研究显示，蟾毒灵具有明显的抗肝癌，肺癌，前列腺癌等癌症，广泛应用于临床抗肿瘤的治疗；迄今，未见蟾毒灵抑制胰腺癌干细胞的报道。

2007年li等首次报道了胰腺癌csc的分离和鉴定，他们将手术获得的人胰腺癌标本分离出了一类表型为cd44⁺cd24⁺esa⁺的癌细胞，成瘤率高达50％，比cd44^-cd24^-esa^-癌细胞致瘤能力至少提高了100倍，证实了胰腺癌肿瘤干细胞的存在。目前流式细胞分选系统是比较成熟和公认的胰腺csc分离方法，其中，将人胰腺癌sw1990/gem耐药细胞株制备成单细胞悬液，加入cd44⁺cd24⁺esa⁺相应的荧光标记抗体孵育后，流式细胞分离系统分选胰腺癌csc；裸鼠肿瘤移植实验是较理想的鉴定肿瘤干细胞体内增殖能力的方法，有研究经nod/scid鼠成瘤实验表明，cd44⁺cd24⁺esa⁺细胞较阴性细胞具有更强的成瘤能力，且能分化出cd44⁺cd24⁺esa⁺亚群细胞，表明胰腺癌中cd44⁺cd24⁺esa⁺亚群细胞具有自我更新和分化的干细胞样特性；有研究通过体外实验，显示无血清悬浮培养法培养sw1990/gem细胞株成球率低。

基于现有技术的基础，本申请的发明人拟提供中药制剂蟾毒灵新的药用用途，具体涉及蟾毒灵在制备靶向抑制胰腺癌干细胞制剂中的用途，该制剂能抑制肿瘤干细胞自我更新，达到逆转胰腺癌的耐药状况。

与本发明相关的现有技术有：

1.pandols,gukovskayaa,edderkaouim,dawsond,eiblg,lugeaa.epidemiology,riskfactors,andthepromotionofpancreaticcancer:roleofthestellatecell.jgastroenterolhepatol2:127-134,2012.

2.onkendie.o.,boostroms.y.,sarrm.g.15-yearexperiencewithsurgicaltreatmentofduodenalcarcinoma:acomparisonofperiampullaryandextra-ampullaryduodenalcarcinomas.jgastrointestsurg16:682-69,2012.

3.liy,kongd,ahmada,baob,sarkarfh.pancreaticcancerstemcells:emergingtargetfordesigningnoveltherapy.cancerlett338:94-100,2013.

4.lic,heidtdg,dalerbap,burantcf,zhangl,adsayv,wicham,clarkemf,simeonedm.identificationofpancreaticcancerstemcells.cancerres67:1030-1037,2007.。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷与不足，提供中药制剂蟾毒灵新的药用用途，具体涉及蟾毒灵在制备靶向抑制胰腺癌干细胞制剂中的用途，该制剂能抑制肿瘤干细胞自我更新，达到逆转胰腺癌的耐药状况。

本发明还提供了采用无血清悬浮培养法培养miapaca2/gem，获得较高的干细胞球比例的方法。

本发明进行了体外实验和体内试验，实验结果显示，所述的蟾毒灵能抑制胰腺癌耐药细胞系的干细胞球形成比例，以及蟾毒灵可明显抑制miapaca2/gem移植瘤裸小鼠的肿瘤生长；以及抑制胰腺癌miapaca2/gem裸小鼠皮下移植瘤体内的转移，以及抑制移植瘤组织肿瘤干细胞标记蛋白的表达和影响hedgehog信号通路相关蛋白的表达。

本发明从肿瘤干细胞角度，经试验表明了蟾毒灵可抑制胰腺癌耐药细胞系miapaca2/gem中肿瘤干细胞的比例，在一定程度上证实了蟾毒灵抗胰腺癌的潜在机制，所述实验结果不但为研发有效抗胰腺癌药物提供了科学的实验依据，而且为蟾毒灵进入临床应用提供了重要的实验基础。

本发明的目地通过下述技术方案实现，

1)采用无血清悬浮培养法培养miapaca2/gem，获得较高的干细胞球比例，利于后续实验；

2)采用体内外试验明确蟾毒灵对胰腺癌干细胞表达率的影响；

3)实验证实hedgehog信号通路在蟾毒灵抑制胰腺癌干细胞自我更新的调控作用，

本发明中通过应用rt-pcr方法检测cd44⁺cd24⁺esa⁺细胞亚群中hedgehog信号通路重要基因ptch，shh，gii-1和smoh的表达情况，提供蟾毒灵抑制胰腺癌干细胞自我更新的实验基础。

本发明从肿瘤干细胞角度，经试验显示，中药制剂蟾毒灵在制备靶向抑制胰腺癌干细胞制剂中的用途，所述制剂能抑制肿瘤干细胞自我更新，尤其抑制胰腺癌耐药细胞系miapaca2/gem中肿瘤干细胞的比例，从而达到逆转胰腺癌的耐药状况。

附图说明

图1显示了富集的球细胞具有肿瘤干细胞的特征。

图2显示了胰腺癌干细胞标记蛋白cd24和esa明显下调，

其中，(a)cck8实验筛选蟾毒灵作用浓度；(b)成球比例明显下降；(c,d)胰腺癌干细胞标记蛋白cd24和esa明显下调。

图3显示了建立的裸小鼠皮下移植瘤模型，

其中，(a，b)为腹腔给药蟾毒灵，裸小鼠的肿瘤体积明显变小，(c)显示了蟾毒灵延长了肿瘤形成时间(d)显示两组裸小鼠体重没有明显变化。

图4显示了胰腺癌耐药细胞具有更高的肿瘤干细胞比例，

其中，(a)蟾毒灵预处理组中肠道转移，(b)蟾毒灵预处理组中肺转移，(c)显示对照组中蟾毒灵预处理组没有发现。

图5显示蟾毒灵用药后，胰腺癌干细胞标记蛋白cd24和esa表达下调(a，b)。

图6显示了蟾毒灵预处理胰腺癌耐药细胞系后，hedgehog信号通路的相关蛋白受到影响。

具体实施方式

实施例1用无血清悬浮培养富集胰腺癌干细胞

实验方法：

1).常规培养人胰腺癌miapaca2/gem细胞，

0.25％胰酶消化对数生长期细胞，制成单细胞悬液，pbs冲洗2次，接种于含碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bfgf)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,egf)和白血病抑制因子(leukaemiainhibitoryfactor,lif)生长因子的无血清dmem/f12培养基(csc培养液)培养，25cm²低粘附培养瓶添加上述培养基10ml，调节细胞浓度至1x10⁵/ml.37℃恒温、5％c02培养箱中培养，24h轻晃1次，每3天采用半量换液法换液，两周后基本可以看到成球的细胞；

2).胰腺癌干细胞球干性鉴定：

流式筛选鉴定

用0.25％胰蛋白酶消化佐加机械消化的方法消化miapaca2/gem干细胞球细胞，制备单细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清，5ml无菌hanks液洗两次，1000rpm离心10min，弃上清重悬于300ul的hanks液中，加入相应的荧光标记抗体cd44、cd24和esa，震荡3秒后置于4℃冰箱20min，加入3ml无菌hanks液洗两次，1000rpm离心10min，弃上清重悬于5ml无菌hanks液中开始流式细胞仪检测胰腺癌干细胞比例；

克隆形成实验

用0.25％胰蛋白酶消化佐加机械消化的方法消化miapaca2/gem干细胞球细胞，制备单细胞悬液.六孔培养皿每孔接种2000个细胞，两周后观察克隆形成能力；

球分化实验

将富集得到的miapaca2/gem干细胞球细胞接种到常规培养基中，半小时后球细胞贴壁，每日观察球细胞分化能力；

nod/scid裸鼠肿瘤移植实验

将正常的miapaca2/gem细胞以及富集出的球细胞，分别制成不同浓度(5×10⁶ml～5×10³/ml)的单细胞悬液，各取0.1ml接种于裸鼠(雌性，6～8周龄，体重20±2g)双侧腋下的皮下，共接种3只小鼠。两周后观察成瘤能力；

实验结果显示：采用无血清悬浮培养的方法成功富集了胰腺癌干细胞球(a)，并通过克隆形成实验(b)，动物成瘤实验(c)，流式细胞实验(d)，westernblot实验(e)以及肿瘤细胞球分化实验(f)进行了验证，证明了富集的球细胞具有肿瘤干细胞的特征(如图1所示)；

本发明中采用无血清悬浮培养的方法筛选胰腺癌中干细胞，较现有技术的方法，能较快较多的得到较纯的干细胞，本方法能克服现有技术存在的胰腺癌中干细胞比例十分低，大约0.1％左右，用流式细胞仪筛选耗时费力等缺陷。

实施例2蟾毒灵抑制胰腺癌耐药细胞系的干细胞球形成比例实验

将胰腺癌细胞制成5x10³/ml细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μl。根据课题组前期体外实验结果，蟾毒灵组设1000nm，500nm，100nm，50，10nm，0nm共4个浓度，每个浓度设5个复孔；将96孔板置于37℃、5％co2饱和湿度培养箱分别培养24，48，72h，按照cck8实验说明书测定细胞增殖曲线，取平均值计算药物的中效浓度(即ic50)。计算细胞存活率(％)＝(a1—a)/(a0-a)×100％，a1为蟾毒灵组od值，a为空白对照组od值，a0为阴性对照组od值。取ic50作为后续干预浓度。并预处理胰腺癌耐药细胞株后，用无血清悬浮培养的方法培养干细胞球，并统计比例，同时用westernblot以及免疫荧光的方法进行干细胞标记蛋白的观察；

实验结果显示：用cck8实验筛选蟾毒灵作用浓度(a)，然后用蟾毒灵对胰腺癌耐药细胞系miapaca2/gem预处理，然后用无血清悬浮培养法重新富集干细胞球，结果显示其成球比例明显下降(b)，westernblot和免疫荧光实验进一步证明胰腺癌干细胞标记蛋白cd24和esa明显下调(c,d)(如图2所示)；

本实施例中，用蟾毒灵预先处理胰腺癌耐药细胞株miapaca2/gem，这是由于，如果蟾毒灵可以对干细胞有抑制作用，那么采用无血清悬浮培养的方法培养干细胞球后，成球比例应该会更低；在本实验中，没有采用在培养基中直接加药的方法来验证蟾毒灵对胰腺癌耐药细胞株中干细胞的抑制作用，因为如果在实验过程中直接加药，可能会造成细胞数量的不一致，导致实验结果的不严密；另外，由于用流式细胞仪对干细胞球进行验证后，发现耐药细胞株miapaca2/gem以及富集的干细胞球细胞中cd44阳性的比例基本一致，所以在后续的实验中选择cd24以及esa去验证蟾毒灵的效果。

实施例3蟾毒灵明显抑制miapaca2/gem移植瘤裸小鼠的肿瘤生长实验

将胰腺癌耐药细胞株miapaca2/gem，制成浓度为1×10⁶/ml的单细胞悬液，各取0.1ml接种于裸鼠(雌性，6～8周龄，体重20±2g)，右侧腋下的皮下。在接种的第二天根据体重随机分为2组，每组6只：对照组，蟾毒灵组。蟾毒灵组(1.5mg/kg/d)腹腔注射蟾毒灵0.2ml，d1-28，每日1次；对照组：腹腔注射生理盐水0.2ml，d1-28，每日1次；(以上腹腔注射均每日固定时间9∶00am)。末次用药结束后次日脱椎处死裸小鼠，分离皮下肿瘤。每隔三天用游标卡尺测量肿瘤最大直径和横径，估算肿瘤体积(v)，取各组平均值，绘制生长曲线：v＝1/2(直径×横径²)。治疗结束后次日处死裸小鼠，称量体重和瘤重。计算实体肿瘤生长抑制率(ir)：ir(％)＝(1－治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。

实验结果显示：建立的裸小鼠皮下移植瘤模型，腹腔给药蟾毒灵(1.5mg/kg)，发现裸小鼠的肿瘤体积明显变小(a，b)，并且发现蟾毒灵延长了肿瘤形成时间(c)。另外，在实验中还发现，两组裸小鼠体重并没有明显变化(d)(如图3所示)；由于胰腺癌干细胞具有更高的成瘤能力，因此接种后显示蟾毒灵组的成瘤时间明显长于对照组，验证了蟾毒灵对胰腺癌干细胞的抑制作用。

实施例4蟾毒灵抑制胰腺癌miapaca2/gem裸小鼠皮下移植瘤体内的转移实验

将胰腺癌耐药细胞株miapaca2/gem，制成浓度为1×10⁶/ml的单细胞悬液，然后尾静脉注射的方法，每只0.1ml接种于雌性，6～8周龄，体重20±2g，)。在接种的第二天根据体重随机分为2组，每组6只：对照组、蟾毒灵组。蟾毒灵组为蟾毒灵体外预处理胰腺癌耐药细胞miapaca2/gem。四周后用取裸小鼠肺组织，肠道组织进行肿瘤转移灶的统计并行病理验证；

实验结果显示：由于胰腺癌耐药细胞具有更高的肿瘤干细胞比例，因此更容易形成肿瘤转移，本实验中通过尾静脉注射胰腺癌耐药细胞miapaca2/gem发现，蟾毒灵预处理组中肠道转移(a)和肺转移(b)的情况较少；在对照组中的一只裸小鼠出现了肌肉转移，而蟾毒灵预处理组没有发现(c)(如图4所示)；

本发明经体外研究显示蟾毒灵对胰腺癌干细胞的抑制作用，由于肿瘤干细胞具有更强的转移能力，因此，进一步采用体外预先给予蟾毒灵处理的胰腺癌耐药细胞通过尾静脉注射于裸小鼠，实验结果证实蟾毒灵组中的裸小鼠出现肺转移以及肠道转移的情况更低，其中在对照组的一只裸小鼠出现了肌肉转移。

实施例5蟾毒灵抑制移植瘤组织肿瘤干细胞标记蛋白的表达试验

免疫组织化学以及免疫荧光实验：按照实验试说明书的要求，经常规病理组织切片，脱蜡、水化、抗原修复后，一抗过夜，二抗再结合反应，dab显色，苏木素复染后，显微镜检分析；

实验结果显示：在之前的裸小鼠皮下移植瘤模型中，取下移植瘤组织并行免疫组织化学染色，结果显示蟾毒灵用药后，胰腺癌干细胞标记蛋白cd24和esa表达下调(a，b)(如图5所示)；在体外实验已经证实蟾毒灵用药后胰腺癌干细胞标记蛋白cd24，esa降低的基础上，对取下移植瘤组织行免疫组织化学及免疫荧光实验验证。结果显示在组织层面上，蟾毒灵用药后，胰腺癌干细胞标记蛋白cd24，esa同样会降低，体内外实验的结果基本一致。

实施例6蟾毒灵影响hedgehog信号通路相关蛋白的表达实验

以用胰腺癌干细胞及裸鼠移植瘤组织为研究对象，细胞裂解后提取细胞总蛋白，取变性样品进行sds-page蛋白电泳，通过电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜，50g/l脱脂奶粉封闭1h，tbst洗3次，每次5min；50g/l脱脂奶粉稀释一抗(1:300)，4℃孵育过夜，tbst洗3次，每次5min；50g/lbsa稀释二抗(1:100)，孵育1h，tbst洗3次，hrp-avidin(1:200)室温孵育1h；化学发光法(ecl)显影检测。实验步骤按照eclwestern免疫印迹分析说明书进行；

实验结果显示：hedgehog信号通路在胰腺癌干细胞中扮演重要作用，用蟾毒灵预处理胰腺癌耐药细胞系后，发现hedgehog信号通路的相关蛋白受到影响(如图6所示)；本实验采用westernblot的实验方法结果显示hedgehog信号通路的相关蛋白受到不同程度的上调和下调，表明蟾毒灵可以通过调控hedgehog信号通路以达到抗胰腺癌干细胞的作用。