一种用于干细胞治疗的水凝胶敷料的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药领域，特别涉及一种用于干细胞治疗的水凝胶敷料。
【背景技术】
[0002]皮肤是人体最大的器官，总表面积约为1.5-2.0m2，起到保护和支持机体的作用。一旦皮肤因为烧伤、创伤、溃疡等出现损伤破坏，机体便会失去大量水分、电解质、蛋白质等，与此同时容易受到细菌及外界环境的伤害。
[0003]近年来，具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能的干细胞已逐渐成为创面愈合修复研究的焦点。干细胞(如骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞等)是一类具有自我更新、多向分化和高度增殖能力的细胞，它能有有效感受周围微环境，并根据微环境进行准确分化并分泌相应的调控因子，促进组织的修复与再生。因此，将干细胞应用于皮肤创面修复能够有效的加快创面的愈合，达到更好的修复效果。
[0004]目前，常用的干细胞治疗通常采用直接注射、载体或生物支架植入体内，干细胞直接与人体接触并参与组织修复过程。然而，《癌症研究》报告的西班牙和丹麦科学家发现显示:在体外增殖过程中，有部分干细胞可能发生癌变，这意味着干细胞直接与机体接触用于组织修复具有潜在的危险性。干细胞的安全应用逐渐引起了科学家的广泛关注与重视。如何能够更安全的利用干细胞促进皮肤修复的同时，又避免干细胞与机体直接接触所带来的潜在危险成为医学研究的热点。
[0005]水凝胶类创面敷料作为一种理想的创面敷料，具有维持创面足够湿度，并吸收大量渗出液和有毒物质的优点。与此同时，水凝胶的孔隙结构又利于创面的气体交换，保证创面良好的透气性。而且，许多水凝胶类敷料(如PVA)由于其光滑的表面结构，创面组织不易于发生黏连，减轻了更换敷料的二次损伤。鉴于水凝胶敷料良好的通透性及物质交换性能，将干细胞接种于水凝胶的表面，干细胞所释放的促进皮肤组织修复的生长因子(如VEGF，bFGF)等活性因子通过水凝胶的多孔结构渗透到创口表面，而干细胞不能穿过水凝胶直接与创面接触，从而利用干细胞分泌的活性因子的同时，避免了干细胞与机体直接接触，实现更安全的干细胞应用。因此，水凝胶类创面敷料在创面修复上发挥重要作用，它具有应用简便、迅速、造价较低的优点，适用于大面积创伤修复与急救。然而，水凝胶不利于细胞粘附是把“双刃剑”，它既能避免与创面黏连减少更换敷料的二次损伤，但又不利于在其上表面接种干细胞，以利用干细胞分泌的活性因子促进创面修复。
[0006]目前，有研究将干细胞混入水凝胶，直接敷于创面进行修复治疗。该技术由于水凝胶内部空间限制，同时细胞以游离的状态存在，既不能保持干细胞良好的状态，同时不利于干细胞增殖分化，以更好地释放促进创面修复的活性因子。同时，这种方法干细胞不可避免的会与皮肤直接接触，仍然存在着潜在的安全风险性。因此，提供一种有利于干细胞粘附的、安全的水凝胶敷料具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0007]有鉴于此，本发明提供了一种用于干细胞治疗的水凝胶敷料。该水凝胶敷料有利于干细胞的粘附和增殖，同时可实现干细胞的安全应用。
[0008]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
[0009]本发明提供了一种用于干细胞治疗的水凝胶敷料，该水凝胶敷料包括水凝胶层和水凝胶改性层，水凝胶改性层所用材料为含有光活性基团的明胶。
[0010]本发明通过紫外交联技术将含有光活性基团的明胶固定于水凝胶敷料的一面，实现对水凝胶敷料的表面改性，以利于干细胞的粘附和增殖，将干细胞接种于水凝胶的改性的上表面，使干细胞与创面隔绝，干细胞分泌的活性因子可透过水凝胶敷料渗透到创面，从而达到促进创面愈合效果的同时，避免了干细胞与创面的直接接触，实现干细胞安全应用。
[0011]作为优选，含有光活性基团的明胶为经4-叠氮苯甲酸修饰的明胶。4-叠氮苯甲酸在紫外的激发下，产生活性氮，从而将明胶接枝到水凝胶碳链上。
[0012]作为优选，水凝胶敷料的制备方法为:通过紫外交联技术将水凝胶改性层固定于水凝胶层上。
[0013]作为优选，紫外交联的时间为10?60s。
[0014]在本发明提供的一些实施例中，紫外交联的时间为20s。
[0015]作为优选，水凝胶层所用材料为水凝胶，水凝胶为聚乙烯醇和/或壳聚糖。但本发明并非限定于此，本领域技术人员认为可行的水凝胶材料均在本发明的保护范围之内。
[0016]作为优选，含有光活性基团的明胶的浓度为0.0I?I Omg/mL。
[0017]在本发明提供的一些实施例中，含有光活性基团的明胶的浓度为lmg/mL。
[0018]作为优选，水凝胶层上与水凝胶改性层相接触的表面设置有凹陷结构。这种凹陷结构一方面有利于干细胞在凹陷结构内生存、生长和繁殖，形成细胞集落，保持细胞活性和生物活性物质的表达和释放；另一方面，接种于凹陷结构内的干细胞通过水凝胶完全与皮肤隔离，避免了干细胞与人体直接接触而带来的安全性问题。同时，干细胞分泌的生长因子等生物活性物质可以通过水凝胶的网络结构释放于伤口表面，促进伤口的修复。而干细胞集落的形成，由于细胞之间存在彼此的接触性刺激，能够更好地分泌各种细胞因子，提高皮肤修复的效率。水凝胶下表面仍然保持其不利于细胞粘附的特性，敷料不会发生粘连，便于敷料的更换。
[0019]在本发明提供的一些实施例中，凹陷结构为孔和/或槽。但本发明并非限定于此，本领域技术人员认为可行的凹陷结构均在本发明的保护范围之内。
[0020]在本发明提供的一些实施例中，还包括干细胞，干细胞接种于水凝胶改性层上。
[0021]在本发明提供的一些实施例中，干细胞的培养时间为I?14天。
[0022]本发明提供了一种用于干细胞治疗的水凝胶敷料，该水凝胶敷料包括水凝胶层和水凝胶改性层，水凝胶改性层所用材料为含有光活性基团的明胶。本发明至少具有如下优势之一:
[0023]1、本发明通过紫外交联技术将含有光活性基团的明胶固定于水凝胶敷料的一面，实现对水凝胶敷料的表面改性，以利于干细胞的粘附和增殖；
[0024]2、将干细胞接种于水凝胶的改性的上表面，使干细胞与创面隔绝，干细胞分泌的活性因子可透过水凝胶敷料渗透到创面，从而达到促进创面愈合效果的同时，避免了干细胞与创面的直接接触，实现干细胞安全应用；
[0025]3、水凝胶层上与水凝胶改性层相接触的表面设置有凹陷结构，这种凹陷结构一方面有利于干细胞在凹陷结构内生存、生长和繁殖，形成细胞集落，保持细胞活性和生物活性物质的表达和释放;另一方面，接种于凹陷结构内的干细胞通过水凝胶完全与皮肤隔离，避免了干细胞与人体直接接触而带来的安全性问题。而干细胞集落的形成，由于细胞之间存在彼此的接触性刺激，能够更好地分泌各种细胞因子，提高皮肤修复的效率；
[0026]4、水凝胶敷料下表面仍然保持其不利于细胞粘附的特性，敷料不会发生粘连，便于敷料的更换。
【附图说明】
[0027]图1示孔型水凝胶敷料结构示意图；其中，a为孔型水凝胶敷料俯视图，I示水凝胶层，2示水凝胶改性层;b为孔型水凝胶敷料切面图，I示水凝胶层，2示水凝胶改性层；
[0028]图2示干细胞接种水凝胶敷料的示意图；
[0029]图3示干细胞在敷料表面的生长粘附情况;其中，a示对照组，b示试验组；
[0030]图4示成纤维细胞增殖情况；
[0031 ]图5示槽型水凝胶敷料俯视图；I示水凝胶层，2示水凝胶改性层；
【具体实施方式】
[0032]本发明公开了一种用于干细胞治疗的水凝胶敷料，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0033]本发明提供的用于干细胞治疗的水凝胶敷料中所用生物材料均可由市场购得。
[0034]下面结合实施例，进一步阐述本发明:
[0035]实施例1
[0036]水凝胶敷料(壳聚糖)的结构示意图见图1。其中，图Ι-a示孔型水凝胶敷料的俯视图，图Ι-b示孔型水凝胶敷料的切面图。在水凝胶上表面制造微孔，孔的底部仍保留一层水凝胶，使其与创面隔绝。在敷料使用前，只需将干细胞接种于水凝胶的上表面，即可应用于创面修复。该孔型水凝胶敷料一方面有利于干细胞在孔内生存、生长和繁殖，形成细胞集落，保持细胞活性和生物活性物质的表达和释放;另一方面，接种于孔内的干细胞通过水凝胶完全与皮肤隔离，避免了干细胞与人体直接接触而带来的安全性问题。
[0037]对水凝胶敷料进行表面改性:配置一定浓度(lmg/mL)的含有光活性基团(该光活性基团为四叠氮苯甲酸通过共价结合方式与明胶的氨基结合后获得)的明胶。将所得光活性明胶溶液平铺于水凝胶的表面，静置12h。将水凝胶置于紫外交联仪进行紫外交联20s，获得改性后的水凝胶敷料。本发明通过光活性明胶对水凝胶上表面进行光固化改性，既能够使水凝胶敷料上表面的孔有利于干细胞的粘附增殖，同时水凝胶下表面仍然保持其不利于细胞粘附的特性，敷料不会发生粘连，便于敷料的更换。
[0038]接种干细胞:改性后的水凝胶敷料经过消毒处理，将干细胞接种于水凝胶的改性面，干细胞的接种密度为14个/cm2，培养10天，干细胞接种后的水凝胶敷料的示意图见图2，干细胞分泌的生长因子等生物活性物质可以通过水凝胶的网络结构与表皮细胞相接触；同时设置对照组，对照组采用未改性的水凝胶敷料按上述相同的方法接种干细胞，并进行细胞培养。通过荧光染色观察干细胞在不同的敷料表面的生长粘附情况(图3)。
[0039]由图3可知，水凝胶敷料经改性后，可促进干细胞的增殖。可见，水凝胶敷料的改性有利于细胞的粘附和增殖，干细胞分泌的生长因子等生物活性物质可以通过水凝胶的网络结构释放于伤口表面，促进伤口的修复。而干细胞集落的形成，由于细胞之间存在彼此的接触性刺激，能够更好地分泌各种细胞因子，提高皮肤修复的效率。
[0040]体外修复实验:
[0041 ]该试验为皮肤成纤维细胞的增殖试验，具体试验操作为:将皮肤成纤维细胞接种于培养板中，待细胞贴壁后，将实施例1获得的培养有干细胞的水凝胶敷料置于贴壁细胞上表面，培养3天后，将水凝胶敷料取出。同时，设置对照组，对照组采用上述未改性的、经接种干细胞后的水凝胶敷料。向培养有成纤维细胞的孔内加入MTT，37 °C孵育4h，弃掉培养液，加入二甲基砜(DMSO)，490nm检测吸光度值，分析不同敷料覆盖下成纤维细胞增殖情况。结果见图4。
[0042]由图4可知，本发明实施例1的水凝胶敷料可显著促进皮肤成纤维细胞的增殖。
[0043]实施例2
[0044]水凝胶敷料(聚乙烯醇)的结构为槽型水凝胶敷料，结构示意图见图5(俯视图)。在水凝胶上表面制造微槽，槽的底部仍保留一层水凝胶，使其与创面隔绝。在敷料使用前，只需将干细胞接种于水凝胶的上表面，即可应用于创面修复。该槽型水凝胶敷料一方面有利于干细胞在槽内生存、生长和繁殖，形成细胞集落，保持细胞活性和生物活性物质的表达和释放;另一方面，接种于槽内的干细胞通过水凝胶完全与皮肤隔离，避免了干细胞与人体直接接触而带来的安全性问题。
[0045]对水凝胶敷料进行表面改性:配置一定浓度(10mg/mL)的含有光活性基团(该光活性基团为四叠氮苯甲酸通过共价结合方式与明胶的氨基结合后获得)的明胶。将所得光活性明胶溶液平铺于水凝胶的表面，静置24h。将水凝胶置于紫外交联仪进行紫外交联20s，获得改性后的水凝胶敷料。本发明通过光活性明胶对水凝胶上表面进行光固化改性，既能够使水凝胶敷料上表面的孔有利于干细胞的粘附增殖，同时水凝胶下表面仍然保持其不利于细胞粘附的特性，敷料不会发生粘连，便于敷料的更换。
[0046]接种干细胞:改性后的水凝胶敷料经过消毒处理，将干细胞接种于水凝胶的改性面，干细胞的接种密度为14个/cm2，培养14天，干细胞分泌的生长因子等生物活性物质可以通过水凝胶的网络结构与表皮细胞相接触；同时设置对照组，对照组采用未改性的水凝胶敷料按上述相同的方法接种干细胞，并进行细胞培养。通过荧光染色观察干细胞在不同的敷料表面的生长粘附情况(与图3相近)。
[0047]由实验结果可知，水凝胶敷料经改性后，可促进干细胞的增殖。可见，水凝胶敷料的改性有利于细胞的粘附和增殖，干细胞分泌的生长因子等生物活性物质可以通过水凝胶的网络结构释放于伤口表面，促进伤口的修复。而干细胞集落的形成，由于细胞之间存在彼此的接触性刺激，能够更好地分泌各种细胞因子，提高皮肤修复的效率。
[0048]体外修复实验:
[0049]该试验为皮肤成纤维细胞的增殖试验，具体试验操作为:将皮肤成纤维细胞接种于培养板中，待细胞贴壁后，将实施例2获得的培养有干细胞的水凝胶敷料置于贴壁细胞上表面，培养3天后，将水凝胶敷料取出。同时，设置对照组，对照组采用上述未改性的、经接种干细胞后的水凝胶敷料。向培养有成纤维细胞的孔内加入MTT，37 °C孵育4h，弃掉培养液，加入二甲基砜(DMSO)，490nm检测吸光度值，分析不同敷料覆盖下成纤维细胞增殖情况。结果与图4相近。
[0050]由上述试验结果可知，本发明实施例2的水凝胶敷料可显著促进皮肤成纤维细胞的增殖。
[0051]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种用于干细胞治疗的水凝胶敷料，其特征在于，所述水凝胶敷料包括水凝胶层和水凝胶改性层，所述水凝胶改性层所用材料为含有光活性基团的明胶。2.根据权利要求1所述的水凝胶敷料，其特征在于，所述含有光活性基团的明胶为经4-叠氮苯甲酸修饰的明胶。3.根据权利要求1所述的水凝胶敷料，其特征在于，所述水凝胶敷料的制备方法为:通过紫外交联技术将所述水凝胶改性层固定于水凝胶层上。4.根据权利要求3所述的水凝胶敷料，其特征在于，所述紫外交联的时间为10?60s。5.根据权利要求1所述的水凝胶敷料，其特征在于，所述水凝胶层所用材料为水凝胶，所述水凝胶为聚乙烯醇和/或壳聚糖。6.根据权利要求5所述的水凝胶敷料，其特征在于，所述含有光活性基团的明胶的浓度为0.01?10mg/mL。7.根据权利要求1所述的水凝胶敷料，其特征在于，所述水凝胶层上与水凝胶改性层相接触的表面设置有凹陷结构。8.根据权利要求7所述的水凝胶敷料，其特征在于，所述凹陷结构为孔和/或槽。9.根据权利要求1所述的水凝胶敷料，其特征在于，还包括干细胞，所述干细胞接种于所述水凝胶改性层上。10.根据权利要求9所述的水凝胶敷料，其特征在于，所述干细胞的培养时间为I?14天。
【专利摘要】本发明提供了一种用于干细胞治疗的水凝胶敷料。本发明提供的水凝胶敷料包括水凝胶层和水凝胶改性层，水凝胶改性层所用材料为含有光活性基团的明胶。本发明水凝胶敷料有利于干细胞的粘附和增殖，通过该结构干细胞能将促进创面生长修复的活性因子释放到创面，同时避免了干细胞与创面的直接接触，实现干细胞的安全应用。
【IPC分类】A61L26/00
【公开号】CN105709270
【申请号】CN201610156699
【发明人】章培标, 高田林, 崔巍巍, 王宗良, 王宇, 李林龙
【申请人】中国科学院长春应用化学研究所